BRPI0719003A2 - Micro-organismos como veículos de sequências de nucleotídeo que codificam para antígenos e toxinasde proteínas, processo de fabricação e usos dos mesmos - Google Patents

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Ivaylo Gentschev
Joachim Fensterle
Ulf R Rapp
Werner Goebel
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Aeterna Zentaris Gmbh
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MICRO- ORGANISMOS COMO VEÍCULOS DE SEQÜÊNCIAS DE NUCLEOTÍDEO QUE CODIFICAM PARA ANTÍGENOS E TOXINAS DE PROTEÍNA, PRO- CESSO DE FABRICAÇÃO E USOS DOS MESMOS".
Descrição
Campo Técnico
A presente invenção refere-se a micro-organismos como veícu- los de seqüências de nucleotídeo heterogêneas que codificam para antíge- nos e toxinas de proteína, um processo de fabricação os mesmos como também vetores de expressão ou plasmídeos correspondentes. Estes micro- organismos podem ser usados como medicamentos, em particular como vacinas de tumor para o tratamento de vários tumores. Técnica Anterior
A imunoterapia de câncer representa uma opção promissora de tratamento de tumor. Uma multiplicidade de exames clínicos usando méto- dos diferentes se concentra em sua eficiência em pacientes. Em princípio, uma distinção é tirada entre imunoterapia passiva e ativa.
A imunoterapia ativa visa a indução de uma resposta imune es- pecífica de tumor relacionada com a vacina. O último está atualmente sendo clinicamente investigado usando diversos métodos diferentes. Por exemplo, no contexto, são assim chamadas vacinas de células inteiras, cuja matéria- prima de alimentação são células de tumor que são ou diretamente obtidas do paciente (autólogo) ou derivadas de linhagens de célula apropriadas (he- terólogas). Estas células são então normalmente inativadas, diferencialmen- te manipuladas e (re)aplicadas ao paciente.
Em contraste, as vacinas específicas de antígeno contêm um (ou mais) antígeno específico de tumor, partes do antígeno ou o DNA de codificação de antígeno específico como também as assim chamadas, vaci- nas anti-idiótipas. Normalmente estas vacinas não são isoladas, porém inje- tadas em combinação com um veículo apropriado. Consequentemente, por um lado adjuvantes clássicos diferentes são utilizados, porém igualmente combinações com imunoestimulantes biológicos tal como citocinas. Com a finalidade de imunoestimulação, os métodos estão sendo aplicados, os quais contêm antígeno associado com imuno-estimulantes, tais como toxina de tétano. Além disso, existem tentativas, aplicando antígenos em combinação com células dendríticas. E finalmente há várias tentativas com vacinas vivas recombinantes com veículos virais ou bacterianos.
As proteínas de fusão de toxinas bacterianas, tais como toxina de tétano, toxina de shiga, toxina letal ou toxina de cólera, como adjuvantes com um antígeno são utilizadas como vacinas especialmente contra infec- ções durante algum tempo (Freytag e Clements1 1999). Adicionalmente, as toxinas nativas, freqüentemente fundidas com uma molécula específica de célula-alvo, tal como uma molécula de superfície de célula de células de tu- mor, também são usadas para destruir as células-alvo.
A isto, proteínas de fusão com a toxina nativa, que geralmente compreende uma unidade enzimática e um domínio de ligação de proteína, desenvolvem seu efeito ideal em uso como adjuvantes (Freytag e Clements, 1999). Por meio destas vacinas, uma resposta imune adequada é obtida até mesmo após a imunização mucosal e particularmente após a imunização oral. A dificuldade com estas proteínas de fusão é que, as toxinas nativas são altamente tóxicas e então não podem ser estabelecidas em seres hu- manos (Holmgren e outros, 2005).
Uma série inteira de pesquisa é desse modo ocupada com a de- sintoxicação de toxinas que ao mesmo tempo preservam o efeito adjuvante. Porém, uma vez que na maioria dos casos o efeito adjuvante coincide com a atividade enzimática, que é responsável pelo efeito tóxico (Lycke e outros, 1992), a desintoxicação não pode ser realizada de um modo direto, até mesmo se parece ser possível para algumas toxinas que não perdem sua atividade enzimática adjuvante (Hormozi e outros, 1999; Lycke e outros, 1992).
No caso de toxina de cólera (CT) várias tentativas de desintoxi- cação são pesquisadas (Agren e outros, 1999; Byun e outros, 2001; Eriks- son e outros, 2004; Kweon e outros, 2002; Sanchez e outros, 2002), para que, porém, o uso como adjuvante mucosal prevaleça (Freytag e Clements). Então, acima de tudo, a indução eficiente de uma resposta de anticorpo (principalmente IgA mucosal), que recebe um suporte de célula T restrito de classe Il de MHC relacionado com a toxina aumentada, é o pré-requisito principal para um adjuvante mucosal para uma vacina que consiste em pro- teína-antígeno e uma toxina fundida ou coaplicada (Freytag e Clements).
Como para toxina de cólera, especialmente sua subunidade B (CtxB) é testada como adjuvante uma vez que é responsável pela ligação ao receptor GM-1 e não mostra efeitos tóxicos quando isolada (Holmgren e ou- tros). As proteínas de fusão com CtxB são caracterizadas através de indu- ção primária das assim chamadas respostas imunes de Th2. Estas são res- postas de célula T, que são principalmente caracterizadas por citocinas, tais como IL-4 ou IL-6, e que principalmente causam indução de anticorpos, po- rém que de modo algum ou no máximo restritamente iniciam uma resposta imune celular, particularmente de células T citotóxicas (CTL) (Holmgren e outros).
Além disso, CtxB como adjuvante mucosal induz tolerância sis- têmica de proteína-antígeno. A tolerância sistêmica descreve a depleção ou inativação de linfócitos específicos de antígeno, em particular, células T ou células B. Este tipo de método é então inaplicável para a indução de uma resposta imune sistêmica (Holmgren e outros).
Em contraste com a aplicação de mucosal, a aplicação intraperi- toneal ou subcutânea de uma proteína de fusão de toxina-antígeno pode levar à resposta sistêmica como também respostas citotóxicas baixas. Isto realmente foi utilizado para vacinação de tumor em sistemas-modelo (refere- se a, por exemplo, (Becerra e outros, 2003)). Porém, tal resposta também é obtida com o próprio antígeno purificado e é principalmente dependente do adjuvante usado. A parte do fato que as respostas de CTL medidas no mo- delo são bastante baixas, não houve nenhuma evidência que a proteção te- nha sido mesmo dependente destes efeitos. Além disso, o antígeno não foi aplicado oralmente, porém somente por injeção direta (s.c, i.d., i.m., i.p.) do antígeno.
As proteínas de antígeno fundidas a uma toxina desintoxicada são geralmente ineficazes se aplicadas como vacina de tumor oral. As ra- zões principais são, se não todas presentes, somente baixa indução de uma resposta imune sistêmica ou até mesmo, no caso de CtxB, indução de tole- rância sistêmica como também indução de anticorpo mucosalmente restrito e respostas imunes do tipo de Th2.
McSorIey e outros, por exemplo, mostraram que a imunização nasal com uma proteína de fusão de antígeno CtxB (o qual para uma vacina de tumor representa o modo preferido de induzir uma resposta sistêmica) preferivelmente tolera e então inativa as células Th1, considerando que as células Th2 não são influenciadas (McSorIey e outros, 1998). As respostas de Th2 são caracterizadas por células T auxiliares que predominantemente produzem IL-4 ou IL-6. Estas citocinas são particularmente responsáveis pela iniciação de produção de anticorpo por células B, que fornecem prote- ção no caso da maioria das vacinas convencionais. Em contraste, as células T de Th 1 na maioria das vezes segregam IL-2 e IFN-gama, desse modo ci- tocinas, que desempenham um papel na resposta imune celular. Dependen- do do objetivo de uma estratégia de imunização é de importância crucial se uma resposta imune de Th2 dominada por anticorpo (então chamada ten- dência de Th2) ou uma resposta de Th 1 dominada por célula (então chama- da tendência de Th 1) é iniciada.
Em contraste, a indução sistêmica de uma resposta imune celu- lar dominada por Th1 com células T auxiliares produtoras de IFN-gama e indução de células T citotóxicas (CTL) é indispensável para imunoterapia de tumor.
A técnica anterior mostra que as toxinas podem funcionar como
adjuvantes. Especialmente a toxina de cólera (CT) mostra um forte efeito adjuvante. Porém, este efeito se atenua significativamente assim que a toxi- na é desintoxicada. Relativo à sua subunidade CtxB, aplicação oral de fato induz tolerância sistêmica. Este problema pode ser parcialmente evitado a- través de aplicação nasal. Porém, se administração nasal é aplicada, outros problemas surgem, em particular como aqueles associados com a subuni- dade de CtxB relativo à expressão de receptor de GM-1 no cérebro (van Ginkel e outros, 2000), que são refletidos em um risco crescente de efeitos colaterais graves particulares (Mutsch e outros, 2004).
Para superar estes problemas, pode ser possível gerar vacinas vivas recombinantes que coexpressam toxinas e antígenos (heterólogos). Esta opção já foi procurada com respeito às vacinas de infecção, isto é, va- cinas que são direcionadas contra um patógeno específico, por exemplo, o patógeno de tuberculose, e são pretendidas induzir imunidade contra tal pa- tógeno.
No decorrer do desenvolvimento de tais vacinas de infecção, as toxinas recombinantes fundidas aos antígenos apropriados (heterólogos) já foram geradas, usando várias cepas bacterianas recombinantes que são administradas oralmente, ou como uma vacina viva ou inativa. Na maioria dos casos, as cepas geradas somente expressaram uma toxina recombinan- te. Consequentemente, estes métodos apontaram principalmente em so- mente imunizar contra a própria toxina (indução de uma resposta de anticor- po) e, por conseguinte, a toxina que expressa a cepa (patógeno). Estes tipos de vacinas não são adequados para uso como vacinas de tumor potenciais em terapia de tumor e, não surpreendentemente, exames correspondentes não mencionam nenhuma tal possível aplicação (Reveneau e outros, 2002) (Vertiev e outros, 2001) (Freytag e Clements, 1999; Jackson e outros, 1996).
Com respeito a tais vacinas de infecção, no curso de indução de uma resposta de anticorpo a toxina não funciona como adjuvante, é a indu- ção de uma resposta imune de anticorpo mucosal que prevalece. Estes e- xames de vacina de infecção incluem nenhum ou somente uma resposta imune sistêmica muito fraca. Em contraste com vacinas de tumor, tais vaci- nas não procuram uma indução de resposta imune celular, especialmente de células T citotóxicas. Os patógenos bacterianos que expressam a toxina normalmente mostram um padrão vivo extracelular e então não contribuem com uma ativação de CTL, isto é, a proteção conferida por tais vacinas de infecção é independente de CTL.
As seguintes cepas bacterianas foram usadas nos exames de vacina de infecção mencionados: Lactobacilli recombinante (Reveneau e outros, 2002), Listeria (Vertiev e outros, 2001), Bacillus anthracis (Mendelson e outros, 2005; Mesnage e outros, 1999), Shigellae (Anderson e outros, 2000; Tzschaschel e outros, 1996b), E. coli (Walker e outros, 1992), Vibrio (Butterton e outros, 1995; Chen e outros, 1998; Thungapathra e outros, 1999) e Salmonella (Jackson e outros, 1996).
Além disso, foi tentado aumentar as respostas imunes mucosais através de apresentação de superfície (Konieczny e outros, 2000) ou secre- ção da toxina como antígeno heterólogo (Salmonella, Shigellae: (Garmory e outros, 2003; Orr e outros, 1999; Su e outros, 1992; Tzschaschel e outros, 1996a; Tzschaschel e outros, 1996b), Yersinia: (Sory e Cornelis, 1990), Vi- brio (Ryan e outros, 1997a), E. coli: (Zhu e outros, 2006)). Porém, nestes casos adicionais as toxinas representam os antígenos para os quais a res- posta imune está voltada.
Desse modo, tem que ser notado que as toxinas não funcionam como adjuvantes nem os estudos as descrevendo pretenderam expressar toxinas como proteínas de fusão com um antígeno separado adicional (hete- rólogos). Além disso, as proteínas de fusões com CT ou CtxB não foram ge- radas com estes sistemas nem foram sugeridas.
Por conseguinte, as proteínas de fusão mencionadas nos docu- mentos citados acima são proteínas de fusão de um sinal de secreção pep- tídico, tal como HIyA, e uma proteína de toxina, porém não proteínas de fu- são, consistindo em uma toxina e um antígeno (heterólogos).
O objetivo principal destes estudos foi somente obter uma res- posta imune mucosal ideal (Tzschaschel e outros, 1996a). A indução de uma resposta imune sistêmica não foi procurada. Todavia, se modo algum medi- da, as análises de respostas imunes sistêmicas foram restritas aos anticor- pos (particularmente IgA sistêmico) somente, uma vez que a proteção neste tipo de modelo é principalmente mediada através de anticorpos (compare, por exemplo [31 ]). A indução de uma resposta imune celular sistêmica, em particular uma resposta de célula T citotóxica, não é descrita. A fusão com um sinal de secreção foi principalmente usada para aumentar a solubilidade das toxinas e realçar sua estabilidade, respectivamente, uma vez que uma mera expressão citoplasmática forte, freqüentemente resulta na produção de agregados insolúveis (Gentschev e outros, 2002a).
Neste sentido, alguns autores observam que as proteínas de fusão com um sinal de secreção causam uma degradação citoplasmática rápida (Tzschaschel e outros, 1996a), considerando que outros observam uma estabilização (Orr e outros, 1999). A técnica anterior, portanto, é con- traditória neste ponto. Até agora, as experiências anteriores com toxinas se- gregadas (toxina + sinal de secreção) estão acima de tudo visando estabili- dade crescente que obviamente não foi obtida em todos os casos. Uma razão certamente é encontrada em intensidade de expres-
são variável e estabilidade de plasmídeo. Tzschaschel e outros descrevem que o sistema de plasmídeo usado é altamente instável e acima de tudo, sem seleção, é somente encontrado em algumas bactérias. Como uma pos- sível solução os autores usam integração cromossômica através de um mini- transposon (Tzschaschel e outros, 1996a; Tzschaschel e outros, 1996b).
Porém, um tal sistema possui várias desvantagens. Por um lado, o ponto de integração não é definido, o que pode levar a uma alteração de fenótipo indesejada da cepa hospedeira (por exemplo, expressão aumenta- da/diminuída de genes de flanqueamento). Por outro lado, o nível de expres- são esperado usando uma única cópia genômica é somente baixo, o que tem um efeito negativo na imunogenicidade. Afinal, a integração de transpo- son cromossômico é relativamente instável, para isto induz bastante fre- qüentemente a excisões espontâneas nos lados dos elementos repetitivos.
Como mencionado acima, a técnica anterior é contraditória rela- tivo à estabilidade de uma toxina heteróloga segregada.
Garmory e outros ainda assumem que a secreção de um antíge- no heterólogo não tem benefício especial com respeito a imunogenicidade (Garmory e outros, 2002; Roland e outros, 2005). Em outros casos resposta de anticorpo sistêmica aumentada a uma toxina segregada depois de admi- nistração intravenosa realmente foi observada, porém não depois de aplica- ção oral. Ao contrário, a aplicação oral é até mesmo indiretamente posta em questão (Roland e outros, 2005). Eventualmente, estudos com uma cepa gram-positiva (Lactoba- cillus plantarum) que produz toxina de tétano não mostraram nenhuma dife- rença significante em indução de uma resposta de anticorpo sistêmica com- parada às cepas que segregam a toxina, apresentam ligação a sua mem- brana ou contêm a toxina citoplasmaticamente (Reveneau e outros, 2002).
As respostas imunes celulares sistêmicas, em respostas de célu- la T citotóxicas particulares, e a proteção resultante, não foram estudadas nem descritas.
A técnica anterior citada acima de vacinas de infecção com base em toxina desse modo não pode declarar se uma secreção de toxina usada como adjuvante representa uma vantagem, relativo à indução de uma res- posta imune sistêmica (celular). Ao contrário, os estudos citados acima de preferência apontam para o problema de estabilidade externa e mencionam o benefício perdido de uma toxina heteróloga segregada. As proteínas de fusão, que consistem em sinal de secreção, toxina e antígeno heterólogo, são nem todas descritas ou sugeridas.
Nas passagens acima, a técnica anterior foi apresentada, a qual descreve os veículos bacterianos que expressam toxinas heterologamente e podem ser usados como vacinas de infecção. Nos exemplos citados princi- palmente modificações relativas a expressão ou estabilidade de toxinas e a sua solubilidade foram realizadas, por exemplo inserção de promotor de ex- pressão forte ou fusão de uma toxina a um sinal de secreção.
Outros autores também estudaram fusões genéticas de toxinas a antígenos heterólogos em vacinas vivas. Nestes casos, a toxina foi princi- palmente usada como adjuvante. Em alguns casos (por exemplo, (Brossier e outros, 2000)), o antígeno heterólogo funcionou como adjuvante e a toxina como antígeno apropriado.
Porém, é importante notar, que nos casos mencionados, a ex- pressão da construção de fusão de gene de toxina-antígeno exclusivamente ocorre citoplasmaticamente ou periplasmaticamente. A construção de toxina- antígeno não foi fundida a um sinal de secreção adicional (que conduziria a sua secreção completa) nem foi diretamente segregada. No curso destas construções de fusão de gene de toxina- antígeno, as cepas de E. coli recombinante (Clemens e outros, 2004), Bacil- Ius anthracis (Brossier e outros, 2000), Shigella (Koprowski e outros, 2000; Ranallo e outros, 2005; Zheng e outros, 2005) e Vibrio (Silva e outros, 2003) são usadas. Para Salmonella (resumido em (Garmory e outros, 2002)), tam- bém, fusões de variantes de CT com antígenos (Hajishengallis e outros, 1996; Huang e outros, 2000) ou outras toxinas com antígenos (Barry e ou- tros, 1996; Cardenas e Clements, 1993; Chabalgoity e outros, 1997; Chabal- goity e outros, 1996; Chabalgoity e outros, 2000; Chabalgoity e outros, 1995; Chacon e outros, 1996; Jagusztyn-Krynicka e outros, 1993; Khan e outros, 1994a; Khan e outros, 1994b; Lee e outros, 2000; Pogonka e outros, 2003; Schodel e outros, 1990; Smerdou e outros, 1996; Ward e outros, 1999; Wu e outros, 2000) foram descritas.
Na maioria destes casos, o foco principal foi sobre a indução de uma resposta imune mucosal (anticorpo) e para a indução de uma resposta imune sistêmica, somente subcutânea, porém nenhuma aplicação oral foi escolhida [36],
Alguns trabalhos com Salmonella como cepa-suporte são limita- dos a uma mera caracterização da cepa (Gomez-Duarte e outros, 1995; Ja- gusztyn-Krynicka e outros, 1993), outros somente analisam a resposta e/ou proteção de anticorpo mucosal e/ou sistêmico (Barry e outros, 1996; Carde- nas e Clements, 1993; Dunstan e outros, 2003; Hajishengallis e outros, 1996; Harokopakis e outros, 1997; Khan e outros, 1994a; Khan e outros, 1994b; Pogonka e outros, 2003; Smerdou e outros, 1996; Somner e outros, 1999). Em todos estes casos, em que incidentemente uma fusão entre antí- geno e toxina de tétano foi usada e que são exclusivamente usados como vacinas de infecção, respostas imunes celulares sistêmicas, particularmente respostas de célula T citotóxicas, não foram estudadas.
Então, de um ponto de vista imunológico, nenhuma conclusão sobre um uso potencial como uma vacina de tumor pode ser tirada desses estudos, uma vez que seus focos foram fixados em efeitos mediados por anticorpos como vacinas de infecção. As investigações que incluem uma análise de isótipo da resposta imune estudada parecem ser mais relevantes. Na realidade, as respostas imunes celulares não são diretamente medidas nestes casos, porém o perfil de isótipo da resposta de anticorpo permite uma conclusão na tendência de Th1/Th2 da resposta imune. Os isótipos de anticorpo como IgGI são associ- ados com respostas de Th2 e isótipos como lgG2a são associados com res- postas de Th1. Como já mencionado, as respostas de Th1 são respostas imunes dominadas celulares, considerando que as respostas de Th2 princi- palmente representam respostas reguladas por anticorpo humoral. Além dis- so, esses estudos não descrevem vacinas de tumor nem sugerem qualquer uso como agente antitumor.
Um estudo de vacina de infecção com base em Salmonella co- mo veículo, que expressa uma proteína de fusão de antígeno de tétano- toxina foi feito em cachorros. As baixas respostas de anticorpo que foram induzidas em cachorros, mostram uma tendência de Th 1, relativo ao perfil de anticorpo, consequentemente, uma resposta que de preferência se correla- ciona com uma resposta imune do tipo celular (Chabalgoity e outros, 2000). Admitidamente, a imunologia de cachorro só é pesquisada escassamente, e então não fica claro até que ponto o perfil de anticorpo de um cachorro pode dar informação sobre uma tendência de Th1.
Estudos em camundongos, realizados pelo mesmo grupo, usan- do construções comparáveis, entretanto mostraram um perfil de anticorpo com o mesmo nível para IgGI como para lgG2a, o que indicaria uma respos- ta de Th1/Th2 misturada. De forma interessante, uma imunidade existente contra toxina de
tétano, como é encontrada na maioria dos seres humanos devido a imuniza- ções prévias, causa outra indução relativamente forte de IgGI, considerando que lgG2a quase não é induzido. Isto indica claramente uma tendência de Th2 distinta (Chabalgoity e outros, 1995). Por esta razão, uma vacina viva com base em toxina de tétano como vacina de tumor é bastante prejudicial para uso humano. Para isto pode ser esperado que uma resposta dominada por anti-corpo de Th2 forte seja induzida na maioria destes pacientes, os quais mostram uma resposta específica a toxina de tétano.
Somente alguns estudos também analisam a resposta imune celular e comparam construções genéticas com e sem fusão de toxina. Em um caso, por exemplo, uma fusão de um antígeno com e sem toxina de té- tano foi comparada em Salmonella (Lee e outros). Nesse aspecto, a cons- trução de fusão de antígeno de toxina de tétano principalmente aumentou o nível de anticorpo total, considerando que os perfis de Th1/Th2 quase não foram alterados. Até mesmo a secreção de célula T CD4+ específica de an- tígeno de citocinas de Th1 típicas, tais como IFN-gama e IL-2, respectiva- mente, somente mostrou divergência fraca. Em um estudo mais recente pelo mesmo grupo, os níveis de IFN-gama celular foram medidos, também. Po- rém, nenhuma comparação foi estabelecida com construção sem toxina de tétano (Chabalgoity e outros). Outros estudos com veículos bacterianos gram-negativos diferentes, tais como Shigella (Koprowski e outros; Ranallo e outros; Zheng e outros) ou Vibrio (Campos e outros; Ryan e outros), não a- nalisam isótipos e respostas imunes celulares, respectivamente, também.
Em resumo, pode ser declarado, que os estudos mencionados focam claramente na indução de uma resposta imune regulada por anticorpo humoral. Realmente, as construções de antígeno de toxina genético são u- sadas, porém estas não são fornecidas com um sinal de secreção nem são segregadas diretamente. Em hipótese alguma, porém, as respostas imunes celulares sistêmicas, em particular respostas de célula T citotóxica, foram analisadas. Além disso, tais respostas de célula T citotóxicas celulares não podem ser concluídas de resposta de anticorpo humoral e não podem ser detectadas se a resposta de anticorpo for composta de Th1/Th2.
Porém, são exatamente estas respostas imunes de célula T cito- tóxicas celulares que são cruciais para uso em terapia de vacinação de tu- mor.
Consequentemente, em termos de fusões de toxina-antígeno que são restritas às vacinas de infecção mucosal somente, o estado da téc- nica não permite nenhuma declaração sobre possível uso de qualquer tal construção como vacinas de tumor. Como já mencionada, a expressão das construções de fusão genética é realizada sem assistência de um sistema de secreção. As toxinas e construções de antígeno de toxina, respectivamente, são normalmente citoplasmaticamente localizados como também periplasmaticamente, isto é, entre as duas membranas. Para induzir uma resposta imune celular eficien- te, a toxina deve ser livremente acessível pela célula de apresentação de antígeno (APC). Normalmente, a toxina nativa é produzida no periplasma de bactérias gram-negativas. Isto é suficiente para meras respostas imunes mucosais, porque as toxinas periplasmáticas podem escapar do periplasma no cólon e, por conseguinte, podem ser acessíveis, também (Hunt e Hardy, 1991). Porém, isto não conta se o veículo alveja células de apresentação de antígeno fora do cólon, tais como, por exemplo, manchas de Peyer ou ór- gãos linfáticos como Iinfonodos ou baço.
Em princípio, dois fatores são cruciais para a eficiência de uma vacina de tumor: indução de uma resposta imune celular do tipo de Th1 e participação de componentes do sistema imune inato, tal como células NK, células NKT e células T gama-delta que desempenham um papel importante para a eficiência de terapia de tumor (Dunn e outros, 2004).
A importância destes componentes dos sistemas imunes inatos se encontra em múltiplos níveis. As células T gama-delta e NK corretamente ativadas podem localmente produzir quantidades grandes de IFN-gama. Es- te interferon, que também é produzido por células T polarizadas Th1 especí- ficas, tem funções múltiplas, relevantes para terapia de tumor. Uma de suas funções centrais é a inibição de angiogênese que corta o fornecimento de nutrientes e oxigênio do tumor e de fato priva de alimento o tumor. Além dis- so, as células NK possuem receptores, que reconhecem as moléculas de classe I de MHC. Se estas moléculas estão presentes em uma célula, as células NK são inibidas.
Como para uma vacina, que induz células T citotóxicas específi- cas, as células de tumor podem ser mortas por estes CTLs. Se a célula de tumor perde sua capacidade de expressar as moléculas de classe I de MHC, o que acontece muito freqüentemente em tumores, as células T citotóxicas específicas são ineficazes. Consequentemente, neste caso, a inibição de células NK é parada, e elas podem eliminar as células de tumor diretamente.
Por conseguinte, seria ideal se uma vacina de tumor induzisse ambos os componentes eficazmente. Há dados contraditórios relativos à tendência de Th1-Th2 de um adjuvante de toxina fundido. Como descrito anteriormente, as construções de fusão de antígeno de toxina aplicadas de um modo isolado obviamente induzem uma resposta imune polarizada de Th2 forte. Alguns autores ainda descrevem uma baixa tendência de Th2 pa- ra veículos vivo; outros autores vêem uma leve tendência de Th1.
Porém, estes dados são novamente exclusivamente com base em construções não-segregadas. A indução de imunidade inata por meio de tais tipos de vacinas de infecção nunca foi comparada nem foi contemplada.
Como já mencionada, a razão principal é que as vacinas existen- tes são vacinas de infecção mucosal, não vacinas de tumor. Então, a indu- ção de respostas imunes de Th1, respostas imunes de CTL e respostas do sistema imune inato não foram no foco. Em contraste, relativo às vacinas de tumor, a indução destas respostas imunes é indispensável.
De forma interessante, em biologia de célula as toxinas nativas são geralmente usadas como inibidores de série de reações de sinalização. E então entre outros foi mostrado que a toxina da coqueluche nativa, porém não a toxina de cólera, pode inibir um padrão de apoptose particular de célu- las NK (Ramirez e outros, 1994). Um estudo de pesquisa diferente pôde mostrar que a toxina de cólera, porém não sua subunidade B, bloqueia fun- ções de célula NK específicas (Poggi e outros, 1996). A toxina de coquelu- che nativa é usada para inibir quimiotaxia de linfócitos (Spangrude e outros, 1985). Mesmo que estes estudos não lidem com vacinação de tumor, al- guém versado na técnica concluiria que o uso de toxinas como vacinas de tumor seria prejudicial, porque a resposta do sistema imune inato, crucial para terapia de tumor, é inibida ao invés de induzida.
Outros estudos de pesquisa puderam mostrar que as toxinas como toxina de coqueluche nativa (porém não toxina de coqueluche inativa) eficazmente induzem componentes do sistema imune inato. Relativo à imu- noterapia contra tumores, isto significaria que, se não todas, as toxinas nati- vas precisariam ser empregadas. Porém, devido a razões de toxicidade, tal tipo de administração é impraticável. Além disso, tal indução inevitavelmente levaria a uma resposta imune secundária direcionada por Th2, que por sua vez seria danoso para terapia de tumor (Boyd e outros, 2005). Por conse- guinte, relativo à indução de uma resposta imune inata, a técnica anterior não descreve nem contempla vacinação de tumor. Ao contrário, análise críti- ca da literatura ainda milita contra o uso de toxinas em terapia de tumor.
Interessante, entretanto, é uma análise do efeito sinérgico de toxinas ou suas subunidades com outros estimulantes, tais como oligonucle- otídeos de DNA estimulantes imunes com motivos de CpG hipometilados (CpG ODN) (Holmgren e outros, 2005) ou lipossacarídeos (LPS). No caso de LPS principalmente a indução de monócitos parece ser aumentada princi- palmente pela subunidade B das toxinas, considerando que ela é inibida pe- la toxina como um todo (holotoxina) (Hajishengallis e outros, 2004). Porém, estes estudos exclusivamente confiam no uso de construções de toxina- antígeno-fusão purificadas, para que substâncias como LPS ou CpG sejam adicionadas como adjuvantes. Além disso, a análise é nesse sentido somen- te realizada em macrófagos, que induzem uma resposta imune adaptável, porém não atacam tumores diretamente. Consequentemente, estes estudos não têm nenhuma significância com respeito à indução de componentes do sistema imune inato, em particular células de NK, que possa atacar os tumo- res diretamente.
Outros estudos, porém, mostram que as células de NK podem ser ativadas e quimiotaticamente atraídas por toxinas como Exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa (Muhlen e outros, 2004). Dependendo do sistema experimental, as respostas de Th1 também podem ser induzidas, embora uma supressão de células NK e respostas de Th1 desse modo ocorram ge- ralmente (Michalkiewicz e outros, 1999). Porém, estes ensaios principalmen- te apontam na análise da hepatotoxicidade de Enterotoxina A e não se refe- rem à vacinação de tumor. De forma interessante, os efeitos são altamente dependentes da dose, e somente uma mudança leve de dose pode inverter os efeitos. Alem disso, os autores não puderam revelar qual resposta efeti- vamente ocorre in vivo. Como uma conseqüência, os dados não fornecem uma predição que efeitos podem ocorrer se uma toxina ou até mesmo uma toxina desintoxicada for usada como adjuvante.
De modo geral, a resposta imune depende fortemente do siste- ma particular aplicado. Na maioria dos casos, uma vacina anti-infecção mu- cosal aponta para a manipulação local do sistema imune na mucosa, para induzir uma resposta imune mucosal eficiente (Lycke, 2005). Porém, estes estudos não incluem o desenvolvimento de uma vacina de tumor. Além dis- so, esses estudos faltam informação sobre a indução de respostas imunes celulares sistêmicas, particularmente respostas de células T citotóxicas, que são essenciais para vacinação de tumor.
Para isto já foi mostrado que a secreção de um antígeno heteró- Iogo confere vantagens para uma resposta imune sistêmica (Hess e outros, 1996). Porém, os antígenos segregados não foram construções de toxina- antígeno segregadas; toxinas ou subunidades dos mesmos não foram usa- das. As respostas imunes assim atingíveis em um modelo de tumor transgê- nico foram altamente limitadas, também (Gentschev e outros, 2005). Real- mente, as respostas de célula T citotóxica e anticorpo fracas poderiam ser induzidas neste caso, as quais parcialmente protegeram de uma progressão de tumor. Porém, não somente as próprias respostas imunes, mas a própria proteção foi limitada. Igualmente, estes estudos de vacinação de tumor ne- cessitam de uma comparação com as construções não segregadas. Além disso, os estudos comparativos não foram realizados no contexto de vacina- ção de tumor (Hess e outros, 1996) e estão em contraste com estudos adi- cionais, que não vêem vantagem com respeito à secreção (Garmory e ou- tros, 2002; Roland e outros, 2005).
Em resumo e como previamente mencionado, a técnica anterior é altamente contraditória relativo à secreção e, de modo geral, não dá ne- nhuma sugestão para vantagens potenciais de construção de toxina- antígeno segregada em terapia de tumor. Ao contrário, a análise crítica da literatura existente de preferência discorda com tal tipo de uso. As toxinas bacterianas (Todar, 2002): em um nível químico, há dois tipos de toxinas bacterianas, lipopolissacarídeos, que são associados com as paredes de célula de bactérias gram-negativas, e proteínas, que são libertadas de células bacterianas e podem agir em sítios de tecido remotos do local de crescimento bacteriano. As toxinas de lipopolissacarídeo (LPS) associadas à célula são chamadas de endotoxinas e as toxinas difusíveis extracelulares são chamadas exotoxinas.
As exotoxinas são tipicamente proteínas solúveis segregadas por bactérias vivas durante o crescimento exponencial, porém em alguns casos elas são libertadas por Iise da célula bacteriana. A produção da toxina é geralmente específica a uma espécie bacteriana particular que produza doença associada com a toxina (por exemplo, somente Clostridium tetani produz toxina de tétano; somente Corynebacterium diphtheriae produz a to- xina de difteria). Ambas as bactérias gram-positivas e gram-negativas pro- duzem toxinas de proteína solúveis.
Em geral, nesse aspecto, existem três classes de (exo -) toxinas de proteína: (i) toxinas tipo I (super-antígenos), que se ligam a superfície de célula hospedeira e modulam a resposta imune, porém não são translocadas na célula, (ii) toxinas tipo Il (toxinas de formação de poro), que agem na membrana de célula hospedeira e faz com que a célula hospedeira vaze e morra, e (iii) toxinas tipo Ill (toxinas A-B), que se ligam a célula hospedeira por um receptor específico, são translocadas na célula, ficam ativas nestas e modificam as proteínas ou outros componentes da célula hospedeira.
Como indicado acima, as toxinas tipo III, que agem intracelular- mente com respeito às células hospedeira, consistem em dois componentes: um componente (subunidade A) é responsável pela atividade enzimática da toxina; o outro componente (subunidade B) é responsável pela ligação a um receptor específico na membrana de célula hospedeira e transferência da enzima pela membrana. O componente enzimático não é ativo até que seja liberado da toxina nativa (A+B). As subunidades A isoladas são enzimatica- mente ativas, porém, necessitam de ligação e capacidade de entrada de cé- lula. As subunidades B isoladas podem se ligar às células-alvo (e até mesmo bloquear a ligação da toxina nativa), porém elas são não-tóxicas.
Há uma variedade de modos dos quais as subunidades de toxi- na podem ser sintetizadas e podem ser dispostas: A + B indica que a toxina é sintetizada e segregada como duas subunidades de proteína separadas que interagem na superfície de célula-alvo; A-B ou A-5B ou AB5 indica que as subunidades AeB são sintetizadas separadamente, porém associadas através de ligações não covalentes durante a secreção e ligação ao seu al- vo; 5B ou B5 indica que o domínio de ligação da proteína é composto de 5 subunidades idênticas. AB ou A/B denota uma toxina sintetizada como um único polipeptídeo, dividida em domínios AeB, que podem ser separados através de divisão proteolítica. Os exemplos de toxinas AB ou A/B são Toxi- na de Difteria1 Exotoxina A, toxina botulínica e Toxina de Tétano. Os exem- plos de toxinas de A-5B ou AB5 são Toxina de Cólera e Toxina de Shiga, considerando que Toxina de Antrax LF e Toxina de Antrax EF são exemplos de toxinas A-B.
Outros documentos relevantes da técnica anterior incluem os
seguintes:
Michl e outros descrevem o uso de bactérias e toxinas bacteria- nas como agentes terapêuticos para tumores sólidos. As construções de fusão de toxina-antígeno são descritas como também direcionamento bacte- riano de tal construção. O uso de toxina de difteria (DT)1 exotoxina A de pseudomonas (PE) e enterotoxina de Clostridium perfringens (CPE) é estu- dado. Porém, os autores não mencionam o uso de toxina de cólera nem mostram ou tornam óbvia a secreção de construções de fusão de toxina- antígeno liberadas por bactéria (Michl e Gress, 2004).
Lahiri dá uma avaliação sobre toxinas bacterianas diferentes e discute os seus múltiplos usos. Embora o autor mencione as proteínas de fusão de toxina-antígeno, ele se cala sobre a toxina de cólera e direciona- mento bacteriano de construções de fusão de toxina-antígeno segregadas
(Lahiri, 2000).
Lavelle e outros descrevem as moléculas de agentes infecciosos como fármacos imunomoduladores. Os autores também mencionam proteí- nas de fusão de toxina de cólera-antigeno, porém tais construções são so- mente diretamente aplicadas como proteínas e não por meio de vacinas vi- vas geneticamente modificadas (Lavelle e outros, 2004).
WO 01/74383 está voltado aos imunógenos mucosais de antí- 5 geno-enterotoxina quiméricos e também menciona o uso de subunidades de toxina de cólera A2 e B. Tais imunógenos quiméricos, porém, compreendem sempre subunidades de A2 e B ao mesmo tempo e são pretendidos para uso em imunização mucosal porém não em terapia de tumor.
WO 02/077249 descreve cepas mutantes de Yersinia enterocoíi- tica não-virulentas para a liberação de proteínas heterólogas para células- alvo mutadas específicas. O uso de subunidade A1 de toxina de cólera tam- bém é mencionado, porém o documento de patente se cala sobre a secre- ção e se refere somente ao tratamento de infecções e estados infecciosos.
WO 2004/018630 descreve fagos de RNA de fita dupla recombi- nantes que codificam um cassete de expressão eucariótico de fita dupla. Embora a subunidade A de toxina de cólera seja mencionada, o documento não é de relevância adicional.
Holmgren e outros proporcionam uma avaliação breve sobre o campo de imunização e adjuvantes mucosais. Eles discutem entre outros os efeitos de toxina de cólera como adjuvantes mucosais, porém, não descre- vem informação sobre os sistemas de expressão genéticos ou vacinas vivas e também se calam sobre a terapia de tumor (Holmgren e outros, 2003).
Holmgren e Czerkinsky também dão uma avaliação sobre as vacinas e imunidade mucosais. Porém, este artigo é restrito a anti- infecciosos somente e não discute ou torna óbvios possíveis usos no campo de terapia de tumor (Holmgren e Czerkinsky, 2005).
Outra revisão por Freytag e Clements descreve os adjuvantes mucosais para aplicação em imunoterapia anti-infecciosa. Embora a toxina de cólera seja mencionada como adjuvantes mucosais, os autores se calam sobre construção toxina-antígeno segregada e terapia de tumor como um possível campo de administração (Freytag e Clements, 2005).
Shaw e Starnbach descrevem o uso de toxinas bacterianas mo- dificadas para liberar antigenos de vacina. Porém, o artigo não menciona toxina de cólera e também está limitado a direcionar a aplicação de proteí- nas de fusão de toxina-antígeno por razões de vacinação (Shaw e Starnba- ch, 2003).
WO 03/072789 está voltado aos micro-organismos como veícu-
los de seqüências de nucleotídeo que codificam para antigenos de célula usados para o tratamento de tumores. Embora o documento de patente mencione a secreção e uso no campo de terapia de tumor, ele se cala sobre toxinas bacterianas e proteínas de fusão de modo geral.
Gentschev, Dietrich e Goebel como também Gentschev e outros
descrevem direcionamento bacteriano e seu uso em desenvolvimento de vacina de tumor. Porém, estes dois documentos não mencionam o uso de toxinas bacterianas e proteínas de fusão em terapia de tumor (Gentschev e outros, 2002a; Gentschev e outros, 2002b).
WO 98/23763 descreve as células de Vibrio cholerae que ex-
pressam as subunidades B e de D de hemolisina de E.coli junto com um po- lipeptídeo de fusão que inclui um antígeno heterólogo fundido a hylA. Tam- bém é descrita uma cepa de vacina de Vibrio cholerae que expressa subuni- dade B de toxina de cólera e um polipeptídeo de fusão de uma seqüência de 20 sinal secretória, antígeno heterólogo e subunidade A2 de coleratoxina. Fi- nalmente, um polipeptídeo de fusão que inclui subunidade B de toxina de cólera fundida a uma porção antigênica de subunidade A de toxina de C. difficile ou B de toxina é descrito. Porém, o pedido de patente não menciona uso de uma proteína de fusão de toxina de proteína mais um antígeno de 25 toxina de não-proteína heterólogo em terapia de tumor.
Dietrich e colaboradores discutem duas ferramentas de liberação de vacina - hemolisina A e Iisteriolisina - que possam ser usadas para imu- nidade mediada por célula. Porém, nenhuma proteína de fusão de toxina de proteína-antígeno heterólogo ou coexpressão é mencionada (Dietrich e ou- tros, 2003).
Gentschev e outros descrevem o uso do sistema de secreção de alfa-hemolisina de Escherichia coli para liberação de antígeno nas cepas de vacina Ty21a de Salmonella typhi. Entretanto, os autores não mencionam o uso de toxinas bacterianas e proteínas de fusão em terapia de tumor (Gentschev e outros, 2004).
WO 02/47727 está voltado aos agentes terapêuticos que com- preendem uma subunidade B de uma toxina de proteína. O documento so- mente descreve as proteínas de fusão de CtxB e EtxB com antígeno viral. Nenhuma vacina bacteriana ou liberação de vacina bacteriana é menciona- da.
Cheng-hua S e colaboradores descrevem uma fusão de gene de subunidade B de toxina de cólera e epitopo PreS2 de HBV e a antigenicida- de da proteína de fusão em estudos de imunização direta. Porém, nenhuma vacina bacteriana ou liberação de vacina bacteriana é mencionada (Cheng- hua e outros, 1995).
Sanchez e outros descrevem que o gene de subunidade B de 15 toxina de cólera realça a imunoglobulina A mucosal, respostas citotóxicas de CD8+ e do tipo de Th1 quando coadministrado intradermicamente com uma vacina de DNA (Sanchez e outros, 2004). Porém, neste método os autores usam DNA como um veículo que age como um adjuvante de promoção de Th1 sozinho. Além disso, as proteínas são produzidas através de células 20 hospedeiras e não são liberadas diretamente ou por um veículo bacteriano e está então diretamente disponível para células eucarióticas.
WO 01/29233 está direcionado a composições imunogênicas quiméricas e ácidos nucléicos que as codificam. Porém, nenhuma vacina bacteriana ou liberação de vacina bacteriana é mencionada.
WO 2007/044406 se refere aos métodos para estimular uma
resposta imune usando um sistema de liberação de antígeno bacteriano que é com base em um sinal de secreção do tipo Ill transportando SopE. Porém, o pedido de patente não menciona o uso de toxinas bacterianas e proteínas de fusão em terapia de tumor.
Em resumo, pode ser concluído da técnica anterior que toxinas
nativas não podem ser estabelecidas para uso em seres humanos devido à sua toxicidade forte. Além disso, a sua aplicação em terapia de tumor seria prejudicial porque a resposta do sistema imune inato, em particular o de cé- lulas de NK, seria inibida. Porém, é esta resposta imune que é um compo- nente crucial para uma terapia de tumor próspera uma vez que as células de tumor muito frequentemente perdem a sua capacidade de expressar molécu- 5 Ias da classe I de MHC e então são resistentes ao reconhecimento e ataque de CTL.
Uso das subunidades de toxina desintoxicadas, por outro lado, sozinhas ou fundidas às (heterólogas) proteínas de antígeno resulta em um efeito adjuvante fortemente atenuado e/ou até mesmo uma tolerância sistê- mica induzida do sistema imune como também anti-corpo mucosalmente restrito e respostas imunes do tipo de Th2.
Além disso, a secreção de proteínas de fusão de antígeno-toxina (heterólogos), que é somente descrita no curso de vacinas anti-infecção (isto é, direcionando o antígeno ou até mesmo a própria toxina), é dito não so- mente exibir nenhuma vantagem sobre a expressão citoplasmática, porém ser geralmente bastante inadequado.
De modo geral, nem um método terapêutico de tumor é apresen- tado nem houve uma indução sistêmica de uma resposta imune celular do- minada por Th1 com células T auxiliadoras de produção de IFN-gama, uma indução de CTL nem a ativação do sistema imune inato descrito ou obtido, todos dos quais são indispensáveis para terapia de tumor.
Descrição da Invenção
A presente invenção tem o objetivo de fornecer novas vacinas de tumor por meio das quais uma forte resposta de sistema imune celular sistêmico seja induzida e uma terapia de tumor eficiente possa ser obtida.
O objetivo da presente invenção foi surpreendentemente resolvi- do em um aspecto fornecendo um micro-organismo como um veículo de se- qüências de nucleotídeo que codificam para antigenos e toxinas de proteína que compreendem os seguintes componentes:
I. pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para
pelo menos um antígeno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou transformada; e II. pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos uma toxina de proteína e/ou pelo menos uma subunidade de toxina de proteína; e
III. a) pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos um sistema de transporte que permite a expressão dos
produtos de expressão do componente (I) e componente (II) na superfície externa do micro-organismo e/ou permite a secreção dos produtos de ex- pressão do componente (I) e componente (II); e/ou que codifica para pelo menos uma seqüência de sinal que permite a secreção dos produtos de ex- pressão do componente (I) e componente (II); e/ou
b) opcionalmente, pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos uma proteína para Iisar o micro-organismo no citosol de células mamífero e para intracelularmente liberar os plasmídeos ou vetores de expressão, que estão contidos no micro-organismo lisado; e IV. pelo menos uma seqüência de nucleotídeo para pelo menos
uma seqüência de ativação para a expressão de um ou mais de componen- tes (I) a (III), em que a referida seqüência de ativação pode ser ativada no micro-organismo e/ou de é específica de célula de tecido, específica de célu- la de tumor, específica de macrófago, específica de dendrito, específica de linfócito, específica de função ou não específica de célula";
em que quaisquer dos componentes (I) a (IV) podem estar presentes uma vez ou várias vezes e se um componente dos componentes (I) a (IV) estiver várias vezes presente ele pode independentemente um do outro ser idêntico ou diferente.
Em uma modalidade preferida, um micro-organismo que com-
preende os componentes acima (I) a (IV) é fornecido, em que o componente
(I) e componente (II) não são idênticos, isto é, o componente (I) não codifica para pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo me- nos uma toxina de proteína e/ou pelo menos uma subunidade de toxina de proteína.
O termo "específico de célula de tecido" em relação ao compo- nente (IV) no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativa- ção que são especificamente ativadas em células de tecido-alvo, tais como promotores dependentes de hormônio em tecidos prostáticos, por exemplo.
O termo "específico de célula de tumor" com relação ao compo- nente (IV) no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativa- 5 ção que são especificamente ativadas em células de tumor, tais como ele- mentos promotores ativados pela ação de oncogenes específicos de tumor.
O termo "específico de macrófago" com relação ao componente (IV) no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativação que são especificamente ativadas em macrófago, como elementos promotores que codificam para genes específicos de macrófago, por exemplo, o gene que codifica para F4/80.
O termo "específico de dendrito" com relação ao componente (IV) no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativação que são especificamente ativadas em células dendríticas, tais como elementos 15 promotores que controlam a expressão de B7.1. Os termos "específico de dendrito" e "específico de célula dendrítica" são equivalentes, isto é, eles têm o mesmo significado e ambos se referem às células dendríticas.
O termo "específico de linfócito" com relação ao componente (IV) no curso da presente invenção se refere aos elementos que são especi- 20 ficamente ativados em células da linhagem linfocítica como elementos pro- motores que regulam a expressão de moléculas CD3 em células T ou ele- mentos promotores que regulam a expressão de CD20 em celúlas B madu- ras.
O termo "específico de função" com relação ao componente (IV) 25 no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativação que são especificamente ativadas no contexto celular, por exemplo, em células de tumor que perderam a expressão de p53, ou seqüências de ativação que são ativadas em bactérias que dependem do contexto, por exemplo, locali- zação celular ou pressão de oxigênio.
O termo "célula não-específica" com relação ao componente (IV)
no curso da presente invenção se refere às seqüências de ativação que são ubiquamente ativas, tal como promotores bacterianos constitutivamente ati- vos.
O termo "seqüência de nucleotídeo" no curso da presente inven- ção se refere aos híbridos de dsDNA, ssDNA, dsRNA, ssRNA ou dsD- NA/RNA. O preferido é dsDNA.
5 O termo "antígeno" no curso da presente invenção se refere às
moléculas que reagem com anticorpos, isto é, que são capazes de gerar anticorpos. Alguns antigenos, sozinhos, não obtêm produção de anticorpo; somente aqueles que podem induzir a produção de anticorpo são chamados imunógenos. Com a finalidade da presente invenção, todos os tipos de antí- 10 genos conhecidos são pretendidos a serem compreendidos. Está dentro do conhecimento de uma pessoa versada na técnica recuperar a informação necessária sobre antigenos potenciais por meio de bancos de dados e/ou avaliação experimental sem sobrecarga indevida. Os exemplos de antigenos são entre outros antigenos de célula, antigenos específicos de célula de te- 15 cido (por exemplo, células de tecido das quais o tumor deriva), antigenos de proteína de célula, antigenos virais, antigenos de proteína virais e similares. Preferidos são os antigenos de proteína. Também preferidos são antigenos heterólogos ou antigenos estranhos, isto é, antigenos que não são endóge- nos ao micro-organismo respectivo da invenção ou antigenos que não são 20 expressos por natureza pelo respectivo micro-organismo da invenção, porém são introduzidos neste por meio de métodos biotecnológicos moleculares padrões.
O termo "antígeno completo" no curso da presente invenção se refere às moléculas completas que reagem com anticorpos de acordo com a definição acima. Os exemplos de antigenos completos são, por exemplo, proteínas de tamanho natural, que também são preferidas.
O termo "antígeno parcial" no curso da presente invenção se refere às partes específicas de moléculas que reagem com anticorpos de acordo com a definição. Os antigenos parciais podem ser, por exemplo, mo- 30 tivos de proteína tais como, alças de aminoácido dentro de proteínas, domí- nios de proteína cinase, epitopos e similares. Preferidos são os domínios de proteína cinase e epitopos, o último dos quais sendo sítios específicos de um antígeno reconhecido por um anticorpo (também referido como determi- nantes antigênicos).
Os termos "do tipo selvagem" e "mutado" com relação à "proteí- na" no curso da presente invenção se refere às proteínas que consistem em 5 quaisquer de suas seqüências de aminoácido de domínio "natural" (codifica- da pela seqüência de nucleotídeo respectiva) e proteínas que têm um ou mais mutações em sua seqüência de aminoácido (codificadas pela seqüên- cia de nucleotídeo respectiva) comparadas à seqüência do tipo selvagem, respectivamente. Preferivelmente, as proteínas do tipo selvagem e/ou muta- 10 das são derivadas de células de tumor. Como para antigenos parciais, é também preferido que a seqüência abranja mutações, isto é, um epitopo é escolhido o qual preferivelmente contém uma ou mais mutações, por exem- plo, o epitopo de B-Raf V600E.
Os micro-organismos no significado da invenção são bactérias, 15 bactérias gram-positivas, bactérias gram-negativas e células eucarióticas, as últimas das quais incluem parasitas unicelulares, leveduras, células de tumor e células de linhagem de célula, tais como Sacharomyces cerevisiae, Leish- mania spp., células de tumor derivadas de paciente autólogo e linhagens de célula de tumor. Tais micro-organismos são normalmente usados como veí- 20 culos para a transferência de seqüências de nucleotídeo que sejam estra- nhas (heterólogas ou heterogêneas) para o micro-organismo. Preferivelmen- te, as bactérias são usadas, as quais são atenuadas em sua virulência, por exemplo, bactérias que carregam um gene aroA, aro, asd, gal, pur, cya, crp, phoP/Q, omp deletado ou inativado ou que sejam mutantes sensíveis a tem- 25 peratura ou mutantes dependentes de antibiótico (Cardenas e Clements, 1992). Também preferido como um micro-organismo que compreende os componentes acima (I) a (IV) é uma bactéria de intracelular facultativa gram- negativa, atenuada, como um veículo, que pode superar a mucosa intestinal (por exemplo, Salmonella spp. ou Shigella spp.).
Em uma modalidade preferida, um micro-organismo que inclui os
componentes (I) a (IV) acima é fornecido, no qual o micro-organismo é sele- cionado do grupo que consiste em "bactéria, bactéria gram-positiva, bactéria gram-negativa, célula eucariótica" e preferivelmente é selecionado do grupo que consiste em "Escherichia spp., Escheriehia eoli, Salmonella spp., Sal- monella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia spp., Yersinia enteroeolitiea, Vibrio spp., Vibrio cholerae, Listeria spp., monocitógenos de Listeria, Shigella 5 spp., Shigella fíexnerí', em que preferivelmente a virulência do micro- organismo é atenuada. Também preferido, Vibrio cholerae é excluído dos micro-organismos definidos acima.
O termo "spp." com relação a qualquer micro-organismo é pre- tendido compreender com a finalidade da presente invenção todos os mem- bros de um determinado gênero, incluindo espécies, subespécie e outros. O termo ''Salmonella spp.", por exemplo, é pretendido incluir todos os membros do gênero Salmonella, tais como Salmonella typhi e Salmonella typhimurium.
Em outra modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o pelo menos um antígeno 15 completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou muta- da de acordo com o componente (I) é selecionado do grupo que consiste nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mutantes: "receptor; parte extracelular, intracelular ou transmembrânica de um receptor; molécula de adesão; parte extracelular, transmembrânica ou intracellular de uma molécu- 20 Ia de adesão; proteína de transdução de sinal; proteína de ciclo de célula; fator de transcrição; proteína de diferenciação; proteína embrionária; proteí- na viral; alérgeno; proteína de patógeno microbiano; proteína de patógeno eucariótico; proteína de antígeno de câncer de testículo; proteína de antíge- no de tumor; e/ou proteína específica de célula de tecido", em que a célula 25 de tecido é selecionada do grupo que consiste em "glândula de tiróide, glân- dula mamária, glândula salivar, linfonodos, glândula mamária, túnicas muco- sas do estômago, rim, ovário, próstata, cerviz, túnicas serosas da bexiga e nervosa".
Como para a proteína mutada, a mutação pode ter sido oncogê- nica e pode ter causado uma perda ou um ganho de suas funções celulares originais.
Tais antigenos desempenham na célula o controle do cresci- mento de célula e da divisão de célula e estão presentes na membrana de célula de células normais, por exemplo, pela molécula de classe I de MHC. Em células de tumor, estes antigenos são frequentemente superexpressos ou especificamente mutados. Tais mutações podem ter limitações de função 5 de supressores de oncogene ou a ativação de proto-oncogenes para onco- genes como uma conseqüência e podem estar envolvidas sozinhas ou ge- ralmente com a superexpressões no crescimento de tumor. Tais antigenos de célula são apresentados na membrana de células de tumor e desse modo representam antigenos em células de tumor, sem, porém causar uma reação 10 imune que afete a doença de tumor do paciente. Rapp (EUA 5.156.841) já descreveu o uso de oncoproteínas, isto é, produtos de expressão dos onco- genes, como um imunógeno para vacinas de tumor.
Os exemplos para antigenos e suas mutações (oncogênicas) de acordo com a invenção são i) receptores, tais como Her-2/neu, receptor de andrógeno, receptor de estrogênio, receptor de lactoferrina, receptor de mid- quine, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor de TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta; ii) proteínas de transdução de sinal, tais como c-Raf (Raf-1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, domínio de B -Raf V600E cinase, B-Raf V600E KD, domínio KD de B-Raf V600E cinase, domínio de B-Raf cinase, domínio KD de B - Raf cinase, Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bf 1-1, Brag-1, Mcl -1, Al, Bax, RUIM, Bak, Bcl-Xs, Bid, Bik, Hrk, que Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IA02, XIAP, ML-IAP LIVIN, survivi- na, APAF-1; iii) proteínas do controle de ciclo de célula, tais como ciclina D(1 -3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk- 7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1 -5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, p53 e homólogos; iv) fatores de transcrição, tais como C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Spl; v) proteínas embrio- nárias, tais como antígeno carcinoembrionário, alfa-fetoproteína, MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA; vi) antigenos de diferenciação, tais como MART, GP 100, tirosinase, GRP, TCF-4, mielina básico, alfa- lactalbumina, GFAP, antígeno específico de próstata (PSA), proteína de áci- do fibrilar, tirosinase, EGR-1, MUC1; vii) antigenos virais, tais como dos se- guintes vírus: HIV1 HPV1 HCV1 HPV1 EBV1 CMV, HSV1 vírus de gripe, tipos de vírus de gripe A, tipo de vírus de gripe A (H5N1) e (H3N2), tipo de vírus de gripe B, tipo de vírus de gripe C; hemaglutininas, hemaglutinina, H1, he- maglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferivelmente de 5 vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferivelmente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), he- maglutinina HA12C (preferivelmente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-
1 )2004(H5N1), neuramidase, antigenos microbianos: p60, LLO, urease etc. Os antigenos de patógenos eucarióticos: CSP (malária), calflagina (tripanos- soma), CPB (Leishmania principal) etc.
Em ainda outra modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o pelo menos um antí- geno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada de acordo com componente (I) é selecionada do grupo que consiste 15 nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mutantes conhecidos: "Her-2/neu, receptor de andrógeno, receptor de estrogênio, receptor de mid- quine, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor de TRAIL, FAS, receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta, receptor de lactoferrina, mielina básica, alfa-lactalbumina, GFAP, proteína de ácida fibrilar, tirosinase, EGR-1, MUC1, 20 c-Raf (Raf 1), A-Raf, B-Raf, B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf KD, domínio de B-Raf V600E cinase, B-Raf V600E KD, domínio KD de B-Raf V600E ci- nase, domínio de B-Raf cinase, domínio KD de B-Raf cinase, N-Ras, K-Ras, H-Ras, Bcl-2, Bcl-X, Bcl-W, Bf 1-1, Brag-1, Mcl-1, Al, Bax, BAD, Bak, Bcl- Xs1 Bid, Bik, Hrk, que Bcr/abl, Myb, C-Met, IAP1, IA02, XIAP, ML-IAP LIVIN1 25 survivina, APAF-1, ciclina D(1 -3), ciclina E, ciclina A, ciclina B, ciclina H, Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1 -5), GAAD45, MDM2, PCNA, ARF, PTEN, APC, BRCA, Akt, PI3K, mTOR, p53 e homólogos, C-Myc, NFkB, c-Jun, ATF-2, Sp1, antí- geno específico de próstata (PSA), antígeno carcinoembrionário, alfa- 30 fetoproteína, PAP; PSMA; STEAP; MAGE, MAGE-1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA, MART, GP 100, tirosinase, GRP, TCF-4, antigenos virais dos vírus HIV, HPV, HCV, HPV, EBV, CMV, HSV, vírus de gripe, vírus de gripe tipo A, vírus de gripe tipo A (H5N1) e (H3N2), vírus de gripe tipo B, vírus de gripe tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglutinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferivelmente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1) 2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferivelmente de vírus de gripe 5 A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferivelmen- te de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), neuramidase, p60, LLO1 urease, CSP, calflagina e/ou CPB".
Em ainda outra modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o pelo menos um antí- geno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada de acordo com o componente (I) é selecionado do grupo de cinases que consiste nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mutantes co- nhecidos (número de acessão em parênteses): AAK1 (NM 014911), AATK (NM 004920), ABL1 (NM 005157), ABL2 (NM 005158), ACK1 (NM 005781), ACVR1 (NM 001105), ACVR1 B (NM 020328), ACVR2 (NM 001616), AC- VR2B (NM 001106), ACVRL1 (NM 000020), ADCK1 (NM 020421 ), ADCK2 (NM 052853), ADCK4 (NM 024876), ADCK5 (NM 174922), ADRBK1 (NM 001619), ADRBK2 (NM 005160), AKT1 (NM 005163), AKT2 (NM 001626), AKT3 (NM 005465), ALK (NM 004304), ALK7 (NM 145259), ALS2CR2 (NM 018571), ALS2CR7 (NM 139158), AMHR2 (NM 020547), ANKK1 (NM 178510), ANKRD3 (NM 020639), APEG1 (NM 005876), ARAF (NM 001654), ARK5 (NM 014840), ATM (NM 000051), ATR (NM 001184), AURKA (NM 003600), AURKB (NM 004217), AURKC (NM 003160), AXL (NM 001699), BCKDK (NM 005881), BCR (NM 004327), BIKE (NM 017593), BLK (NM 001715), BMPR1 A (NM 004329), BMPR1 B (NM 001203), BMPR2 (NM 001204), BMX (NM 001721), BRAF (NM 004333), BRD2 (NM 005104), BRD3 (NM 007371), BRD4 (NM 014299), BRDT (NM 001726), BRSK1 (NM 032430), BRSK2 (NM 003957), BTK (NM 000061), BUB1 (NM 004336), BUB1 B (NM 001211), CABC1 (NM 020247), CAMK1 (NM 003656), CaMKI b (NM 198452), CAMK1 D (NM 020397), CAMK1 G (NM 020439), CAMK2A (NM 015981), CAMK2B (NM 001220), CAMK2D (NM 001221), CAMK2G (NM 001222), CAMK4 (NM 001744), CAMKK1 (NM 032294), CAMKK2 (NM 006549), CASK (NM 003688), CCRK (NM 012119), CDC2 (NM 001786), CDC2L1 (NM 001787), CDC2L5 (NM 003718), CDC42BPA (NM 014826), CDC42BPB (NM 006035), CDC7L1 (NM 003503), CDK10 (NM 003674), CDK11 (NM 015076), CDK2 (NM 001798), CDK3 (NM 001258), CDK4 (NM 5 000075), CDK5 (NM 004935), CDK6 (NM 001259), CDK7 (NM 001799), CDK8 (NM 001260), CDK9 (NM 001261), CDKL1 (NM 004196), CDKL2 (NM 003948), CDKL3 (NM 016508), CDKL4 (NM 001009565), CDKL5 (NM 003159), CHEK1 (NM 001274), CHUK (NM 001278), CIT (NM 007174), CLK1 (NM 004071), CLK2 (NM 003993), CLK3 (NM 003992), CLK4 (NM 10 020666), CRK7 (NM 016507), CSF1 R (NM 005211), CSK (NM 004383), CSNK1 Al (NM 001892), CSNK1 D (NM 001893), CSNK1 E (NM 001894), CSNK1 G1 (NM 022048), CSNK1 G2 (NM 001319), CSNK1 G3 (NM 004384), CSNK2A1 (NM 001895), CSNK2A2 (NM 001896), DAPK1 (NM 004938), DAPK2 (NM 014326), DAPK3 (NM 001348), DCAMKL1 (NM 15 004734), DCAMKL2 (NM 152619), DCAMKL3 (XM 047355), DDR1 (NM 013993), DDR2 (NM 006182), DMPK (NM 004409), DMPK2 (NM 017525.1 ), DYRK1 A (NM 001396), DYRK1 B (NM 006484), DYRK2 (NM 006482), D- YRK3 (NM 003582), DYRK4 (NM 003845), EEF2K (NM 013302), EGFR (NM 005228), EIF2AK3 (NM 004836), EIF2AK4 (NM_001013703), EPHA1 (NM 20 005232), EPHA10 (NM 001004338), EPHA2 (NM 004431 ), EPHA3 (NM 005233), EPHA4 (NM 004438), EPHA5 (NM 004439), EPHA6 (XM 1 14973), EPHA7 (NM 004440), EPHA8 (NM 020526), EPHB1 (NM 004441 ), EPHB2 (NM 017449), EPHB3 (NM 004443), EPHB4 (NM 004444), EPHB6 (NM 004445), ERBB2 (NM 004448), ERBB3 (NM 001982), ERBB4 (NM 005235), 25 ERK8 (NM 139021 ), ERN1 (NM 001433), ERN2 (NM 033266), FASTK (NM 025096), FER (NM 005246), FES (NM 002005), FGFR1 (NM 000604), FG- FR2 (NM 022970), FGFR3 (NM 000142), FGFR4 (NM 022963), FGR (NM 005248), FLJ23074 (NM 025052), FLJ231 19 (NM 024652), FLJ23356 (NM 032237), FLT1 (NM 002019), FLT3 (NM 0041 19), FLT4 (NM 002020), 30 FRAP1 (NM 004958), FRK (NM 002031 ), FYN (NM 002037), GAK (NM 005255), GPRK5 (NM 005308), GPRK6 (NM 002082), GPRK7 (NM 139209), GRK4 (NM 005307), GSG2 (NM 031965), GSK3A (NM 019884), GSK3B (NM 002093), GUCY2C (NM 004963), GUCY2D (NM 000180), GUCY2F (NM 001522), Η1 1 (NM 014365), HAK (NM 052947), HCK (NM 0021 10), ΗΙΡΚ1 (NM 152696), ΗΙΡΚ2 (NM 022740), ΗΙΡΚ3 (NM 005734), ΗΙΡΚ4 (NM 144685), HRI (NM 014413), HUNK (NM 014586), ICK (NM 016513), IGF1 R 5 (NM 000875), IKBKB (NM 001556), IKBKE (NM 014002), ILK (NM 004517), INSR (NM 000208), INSRR (NM 014215), IRAKI (NM 001569), IRAK2 (NM 001570), IRAK3 (NM 007199), IRAK4 (NM 016123), ITK (NM 005546), JAK1 (NM 002227), JAK2 (NM 004972), JAK3 (NM 000215), KDR (NM 002253), KIS (NM 144624), KIT (NM 000222), KSR (XM 290793), KSR2 (NM 173598), 10 LAK (NM 025144), LATS1 (NM 004690), LATS2 (NM 014572), LCK (NM 005356), LIMK1 (NM 016735), LIMK2 (NM 005569), LMR3 (XM 055866), LMTK2 (NM 014916), LOC149420 (NM 152835), LOC51086 (NM 015978), LRRK2 (XM 058513), LTK (NM 002344), LYN (NM 002350), MAK (NM 005906), ΜΑΡ2Κ1 (NM 002755), ΜΑΡ2Κ2 (NM 030662), ΜΑΡ2Κ3 (NM 15 002756), ΜΑΡ2Κ4 (NM 003010), ΜΑΡ2Κ5 (NM 002757), ΜΑΡ2Κ6 (NM 002758), ΜΑΡ2Κ7 (NM 005043), ΜΑΡ3Κ1 (XM 042066), ΜΑΡ3Κ10 (NM 002446), ΜΑΡ3Κ11 (NM 002419), ΜΑΡ3Κ12 (NM 006301 ), ΜΑΡ3Κ13 (NM 004721 ), ΜΑΡ3Κ14 (NM 003954), ΜΑΡ3Κ2 (NM 006609), ΜΑΡ3Κ3 (NM 002401 ), ΜΑΡ3Κ4 (NM 005922), ΜΑΡ3Κ5 (NM 005923), ΜΑΡ3Κ6 (NM 20 004672), ΜΑΡ3Κ7 (NM 003188), ΜΑΡ3Κ8 (NM 005204), ΜΑΡ3Κ9 (NM 033141 ), ΜΑΡ4Κ1 (NM 007181 ), ΜΑΡ4Κ2 (NM 004579), ΜΑΡ4Κ3 (NM 003618), ΜΑΡ4Κ4 (NM 145686), ΜΑΡ4Κ5 (NM 006575), ΜΑΡΚ1 (NM 002745), ΜΑΡΚ10 (NM 002753), ΜΑΡΚ11 (NM 002751 ), ΜΑΡΚ12 (NM 002969), ΜΑΡΚ13 (NM 002754), ΜΑΡΚ14 (NM 001315), ΜΑΡΚ3 (NM 25 002746), ΜΑΡΚ4 (NM 002747), ΜΑΡΚ6 (NM 002748), ΜΑΡΚ7 (NM 002749), ΜΑΡΚ8 (NM 002750), ΜΑΡΚ9 (NM 002752), ΜΑΡΚΑΡΚ2 (NM 032960), ΜΑΡΚΑΡΚ3 (NM 004635), ΜΑΡΚΑΡΚ5 (NM 003668), MARK (NM 018650), MARK2 (NM 017490), MARK3 (NM 002376), MARK4 (NM 031417), MAST1 (NM 014975), MAST205 (NM 0151 12), MAST3 (XM 038150), MAST4 (XM 30 291 141 ), MASTL (NM 032844), MATK (NM 139355), MELK (NM 014791 ), MERTK (NM 006343), MET (NM 000245), MGC33182 (NM 145203), MGC42105 (NM 153361), MGC43306 (C9orf96), MGC8407 (NM 024046), MIDORI (NM 020778), MINK (NM 015716), ΜΚΝΚ1 (NM 003684), ΜΚΝΚ2 (NM 017572), MLCK (NM 182493), MLK4 (NM 032435), MLKL (NM 152649), MOS (NM 005372), MST1 R (NM 002447), MST4 (NM 016542), MUSK (NM 005592), MYLK (NM 053025), MYLK2 (NM 0331 18), ΜΥ03Α (NM 017433), 5 ΜΥ03Β (NM 138995), ΝΕΚ1 (NM 012224), ΝΕΚ10 (NM 152534), ΝΕΚ11 (NM 024800), ΝΕΚ2 (NM 002497), ΝΕΚ3 (NM 002498), ΝΕΚ4 (NM 003157), ΝΕΚ5 (MGC75495), ΝΕΚ6 (NM 014397), ΝΕΚ7 (NM 133494), ΝΕΚ8 (NM 178170), ΝΕΚ9 (NM 0331 16), NLK (NM 016231 ), NPR1 (NM 000906), N- PR2 (NM 003995), NRBP (NM 013392), NRBP2 (NM 178564), NRK (NM 10 198465), NTRK1 (NM 002529), NTRK2 (NM 006180), NTRK3 (NM 002530), OBSCN (NM 052843), 0SR1 (NM 005109), PACE-1 (NM 020423), PAK1 (NM 002576), PAK2 (NM 002577), PAK3 (NM 002578), PAK4 (NM 005884), PAK6 (NM 020168), PAK7 (NM 020341 ), PASK (NM 015148), PCTK1 (NM 006201 ), PCTK2 (NM 002595), PCTK3 (NM 212503), PDGFRA (NM 15 006206), PDGFRB (NM 002609), PDK1 (NM 002610), PDK2 (NM 00261 1 ), PDK3 (NM 005391 ), PDK4 (NM 002612), PDPK1 (NM 002613), PFTK1 (NM 012395), PHKG1 (NM 006213), PHKG2 (NM 000294), PIK3R4 (NM 014602), PIM1 (NM 002648), PIM2 (NM 006875), PIM3 (NM 001001852), PINK1 (NM 032409), PKE (NM 173575), PKMYT1 (NM 004203), pknbeta (NM 013355), 20 PLK (NM 005030), PLK3 (NM 004073), PRKAA1 (NM 006251 ), PRKAA2 (NM 006252), PRKACA (NM 002730), PRKACB (NM 002731 ), PRKACG (NM 002732), PRKCA (NM 002737), PRKCB1 (NM 002738), PRKCD (NM
006254), PRKCE (NM 005400), PRKCG (NM 002739), PRKCH (NM
006255), PRKCI (NM 002740), PRKCL1 (NM 002741 ), PRKCL2 (NM 006256), PRKCM (NM 002742), PRKCN (NM 005813), PRKCQ (NM
006257), PRKCZ (NM 002744), PRKD2 (NM 016457), PRKDC (NM 006904), PRKG1 (NM 006258), PRKG2 (NM 006259), PRKR (NM 002759), PRKWNK1 (NM 018979), PRKWNK2 (NM 006648), PRKWNK3 (NM 020922), PRKWNK4 (NM 032387), PRKX (NM 005044), PRKY (NM 30 002760), PRPF4B (NM 003913), PSKH1 (NM 006742), PSKH2 (NM 033126), PTK2 (NM 005607), PTK2B (NM 004103), PTK6 (NM 005975), PTK7 (NM 002821 ), PTK9 (NM 002822), PTK9L (NM 007284), PXK (NM 017771 ), QSK (NM 025164), RAD53 (NM 007194), RAF1 (NM 002880), RAGE (NM 014226), RET (NM 020975), RHOK (NM 002929), RIOK1 (NM 031480), RIOK2 (NM 018343), RIPK1 (NM 003804), RIPK2 (NM 003821 ), RIPK3 (NM 006871 ), RIPK5 (NM 015375), RNASEL (NM 021 133), ROCK1 5 (NM 005406), ROCK2 (NM 004850), ROR1 (NM 005012), ROR2 (NM 004560), ROS1 (NM 002944), RPS6KA1 (NM 002953), RPS6KA2 (NM 021 135), RPS6KA3 (NM 004586), RPS6KA4 (NM 003942), RPS6KA5 (NM 004755), RPS6KA6 (NM 014496), RPS6KB1 (NM 003161 ), RPS6KB2 (NM 003952), RPS6KC1 (NM 012424), RPS6KL1 (NM 031464), RYK (NM 10 002958), SBK (XM 370948), SCYL1 (NM 020680), SCYL2 (NM 017988), SGK (NM 005627), SgK069 (SU SgK069), SgK085 (XM 373109), SgK1 10 (SU SgKH O), SGK2 (NM 016276), SgK223 (XM 291277), SgK269 (XM 370878), SgK424 (CGP SgK424), SgK493 (SU_SgK493), SgK494 (NM 144610), SgK495 (NM 032017), SGKL (NM 013257), SK681 (NM 001001671 15 ), SLK (NM 014720), SMG1 (NM 015092), SNARK (NM 030952), SNF1 LK (NM 173354), SNF1 LK2 (NM 015191 ), SNK (NM 006622), SNRK (NM 017719), SRC (NM 005417), SRMS (NM 080823), SRPK1 (NM 003137), SRPK2 (NM 003138), SSTK (NM 032037), STK10 (NM 005990), STK11 (NM 000455), STK16 (NM 003691 ), STK17A (NM 004760), STK17B (NM
004226), STK18 (NM 014264), STK19 (NM 032454), STK22B (NM 053006), STK22C (NM 052841 ), STK22D (NM 032028), STK23 (NM 014370), STK24 (NM 003576), STK25 (NM 006374), STK3 (NM 006281 ), STK31 (NM 031414), STK32B (NM 018401 ), STK33 (NM 030906), STK35 (NM 080836), STK36 (NM 015690), STK38 (NM 007271 ), STK38L (NM 015000), STK39 25 (NM 013233), STK4 (NM 006282), STLK5 (NM 001003787), STYK1 (NM 018423), SUDD (NM 003831 ), SYK (NM 003177), TAF1 (NM 138923), TAF1 L (NM 153809), TA01 (NM 004783), TAOK1 (NM 020791 ), TAOK3 (NM 016281 ), TBCK (NM 0331 15), TBK1 (NM 013254), TEC (NM 003215), TEK (NM 000459), TESK1 (NM 006285), TESK2 (NM 007170), TEX14 (NM 30 031272), TGFBR1 (NM 004612), TGFBR2 (NM 003242), TIE (NM 005424), TIF1 (NM 003852), TLK1 (NM 012290), TLK2 (NM 006852), TNIK (NM 015028), TNK1 (NM 003985), TOPK (NM 018492), TP53RK (NM 033550), TRAD (NM 007064), TRIB1 (NM 025195), TRIB2 (NM 021643), TRIB3 (NM
021 158), TRIM28 (NM 005762), TRIM33 (NM 015906), TRIO (NM 0071 18), TRPM6 (NM 017662), TRPM7 (NM 017672), TRRAP (NM 003496), TSSK4 (NM 174944), TTBK1 (NM 032538), TTBK2 (NM 173500), TTK (NM 003318), 5 TTN (NM 003319), TXK (NM 003328), TYK2 (NM 003331 ), TYR03 (NM 006293), ULK1 (NM 003565), ULK2 (NM 014683), ULK3 (NM 015518), ULK4 (NM 017886), VRK1 (NM 003384), VRK2 (NM 006296), VRK3 (NM 016440), WEE1 (NM 003390), Weel B (NM 173677), YANK1 (NM 145001 ), YES1 (NM 005433), ZAK (NM 016653), e/ou ZAP70 (NM 001079)".
O termo "alérgeno" no curso da presente invenção se refere aos
antigenos completos ou parciais como definidos aqui, os quais obtêm hiper- sensibilidade e/ou reações alérgicas. Os exemplos são Der p 5 (mite), Bet v
1 (pólen de vidoeiro), Phl p 1 (pólen de grama), Asp f l/a (Aspergillus), PLA 2 (abelha), Hev b (látex) (Schmid-Grendelmeier e Crameri, 2001).
Os antigenos de patógenos microbianos e eucarióticos e de an-
tigenos de câncer de testículo são inclusos na lista acima.
No curso da presente invenção, as toxinas de proteína e/ou suas subunidades de acordo com componente (II) são preferivelmente toxinas de proteína bacteriana, mais preferivelmente exotoxinas. Os exemplos de exo- toxinas bacterianas são toxinas tipo I (superantígenos), toxinas tipo Il (toxi- nas de formação de poro) e (iii) toxinas tipo Ill (toxinas A-B).
Em uma modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o componente (II) é seleciona- do do grupo que consiste em "toxina bacteriana, enterotoxina, exotoxina, 25 toxina tipo I, toxina tipo II, toxina tipo III, toxina tipo IV, toxina tipo V, toxina de RTX, toxina de AB, toxina A-B, toxina de A/B, toxina de A+B, toxina A-5B e/ou toxina de AB5.
Em ainda uma outra modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o componente (II) é selecionado do grupo que consiste em "toxina de Adenilato ciclase, toxina de Antraz, toxina de Antraz (EF), toxina de Antraz (LF), toxina de botulina, toxi- na de Cólera (CT, Ctx), subunidade de toxina de Cólera B (CTB, CtxB), toxi- na de Difteria (DT, Dtx), toxina LT de E. coli, enterotoxina termolábil de E. coli (LT)1 subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), toxina ST de E. coli, enterotoxina termoestável de E. coli (ST), toxina eritrogênica, toxi- na Exfoliatina1 Exotoxina A, enterotoxina de Perfringens, toxina de Coquelu- 5 che (PT, Ptx), toxina de Shiga (ST, Stx), subunidade B de toxina de Shiga (STB, StxB), toxina do tipo de Shiga, enterotoxinas de Staphylococcus, toxi- na de Tétano (TT), toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina de Vero (VT)1 Toxina A (TA) e Toxina B (TB) de Clostridium difficile, Toxina Le- tal (LT) e Toxina Hemorrágica (HT) de Clostridium sordellii, Toxina alfa (A) 10 de Clostridium novyi'.
Porém, se a Toxina de Cólera ou sua subunidade CtxB é usada como toxinas de acordo com componente (II) da invenção, é preferido não empregar Vibrio cholerae como veículo bacteriano (micro-organismo).
Em uma modalidade preferida, um micro-organismo de acordo 15 com as definições acima é fornecido, em que o componente (I) e componen- te (II) são ligados um ao outro para permitir a expressão e/ou secreção de uma proteína de fusão codificada por ambos os componentes. Mais preferi- velmente, esta proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD (inativado por cinase), domínio de CtxB- 20 B-Raf V600E cinase, domínio KD de CtxB-B-Raf V600E cinase (inativado por cinase), CtxB-B-Raf, CtxB-B-Raf KD (inativado por cinase), domínio KD de CtxB B - Raf cinase (inativado por cinase), CtxB-HAI (subunidade 1 de uma hemaglutinina de um vírus de gripe), CtxB-HAI2C".
A secreção é o processo de segregar, elaborar, e liberar as 25 substâncias químicas de uma célula, ou uma substância química segregada ou quantidade de substância. A secreção não é única para eucariotas so- mente; está também presente em bactérias e archaea também. Os transpor- tadores do tipo de cassete de ligação de ATP (ABC) são comuns a todos os três domínios de vida. O sistema Sec também é outro sistema de secreção 30 conservado que é homólogo ao translocon no retículo endoplásmico eucarió- tico que consiste em complexo de translocon Sec 61 em levedura e comple- xo de Sec Y-E-G em bactérias. As bactérias gram-negativas têm duas mem- branas, desse modo tornando a secreção topological mais complexa. Então há pelo menos cinco sistemas de secreção especializados em bactérias Gram-negativas:
(1) sistema de secreção tipo I: é o mesmo como os transportado- res de cassete de ligação de ATP mencionados acima.
(2) sistema de secreção tipo II: depende do sistema de Sec para uma proteína cruzar a membrana interna e outro sistema especial para cru- zar a membrana externa. As hastes bacterianas usam modificações do sis- tema sec, porém são diferentes do sistema tipo I.
(3) sistema de secreção tipo Ill (T3SS): é homólogo ao corpo
basal bacteriano flagelar. Está como uma seringa molecular pela qual uma bactéria (por exemplo, Shigella ou Yersinia) pode injetar proteínas em célu- las eucarióticas. A baixa concentração de Ca2+ no citosol abre a passagem que regula T3SS. O sistema de Hrp em patógenos de planta injeta grampos por mecanismos semelhantes em plantas.
(4) sistema de secreção tipo IV: é homólogo a maquinaria de conjugação de bactérias (e flagelo archaeal). É capaz de transportar tanto o DNA quanto as proteínas. Isto foi descoberto em Agrobacterium tumefacien- sl, que usa este sistema para introduzir o plasmídeo Ti e proteínas no hos-
pedeiro que desenvolve o "crown gall" (tumor). Helicobaeter pylori usa um sistema de secreção tipo IV para injetar Cag A em células de epiteliais gás- tricas. Bordetella pertussis, o agente causador da coqueluche, segrega a toxina de coqueluche parcialmente pelo sistema tipo IV.
(5) sistema de secreção tipo V, também chamado sistema auto- transportador: Este usa o sistema sec para cruzar a membrana interna. As
proteínas que usam este caminho têm a capacidade de formar um beta tam- bor em seu terminal de C e se inserir na membrana externa para transportar o resto do peptídeo para fora. Finalmente o beta tambor pode ser clivado e deixado atrás da membrana externa. Algumas pessoas acreditam que estas 30 sobras dos autotransportadores deram origem às protinas que são beta tam- bores similares.
As bactérias como também as mitocôndrias e cloroplastos tam- bém usam muitos outros sistemas de transporte especiais tais como as sé- ries de reações de translocação de arginina dupla (Tat) que, em contraste com exportação dependente de sec, transporta proteínas completamente dobradas pela membrana. O nome do sistema vem da exigência de duas 5 argininas sucessivas na seqüência de sinal requerida por alvejar para este sistema. A secreção em bactérias gram-negativas envolve superar a mem- brana interna e externa a caminho de um sistema de secreção adequado, como, por exemplo, o sistema de secreção tipo I ou tipo NI Hly ou autotrans- portador de Al DA. Em bactérias gram-positivas o sistema de secreção teve 10 que superar a membrana interna e a parede celular, que, na maioria das ce- pas, pode ser obtida através de fusão com um sinal de secreção adequado.
O componente (III) a) é pelo menos uma seqüência de nucleotí- deo que codifica para pelo menos um sistema de transporte que permite a expressão dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II) 15 na superfície externa do micro-organismo e/ou permite a secreção dos pro- dutos de expressão de componente (I) e componente (II). O componente respectivo pode como uma opção ser ou segregado ou expresso na mem- brana do micro-organismo, isto é, está ligado à membrana. Tais sistemas de transporte são, por exemplo, i) sistema de secreção tipo I, sistema de secre- 20 ção tipo II, sistema de secreção tipo III, sistema de secreção tipo IV, sistema de secreção tipo V, ii) o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de E. coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o controle do promotor hly-específico); os seguintes sinais de transporte serão usados: para a secreção - o sinal de transporte HIyA de terminal de C, na presença 25 de proteínas HIyB e HIyD; para a expressão de membrana ligada - o sinal de transporte de HIyA de terminal de C, na presença de proteína de HIyB, iii) o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de E. coli (seqüências de nucleo- tídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD no controle de um promotor bacteriano não-específico de hly), iv) o sinal de transporte para a proteína de camada S 30 (Rsa A) de Caulobacter crescentus; os seguintes sinais de transporte serão usados: para a secreção e a expressão de membrana-ligada - o sinal de transporte de terminal de C RsaA, v) o sinal de transporte para a proteína de ToIC de Escherichia colr, os seguintes sinais de transporte serão usados: para a expressão ligada à membrana - o sinal de transporte de terminal de N de ToIC (a proteína de membrana integral ToIC de E. coli é uma proteína de formação de poro multi-funcional da membrana externa de E coli, que serve 5 - além das funções tais como a recepção de colicina E1 (Morona e outros, 1983) e a secreção de colicina V (Fath e outros, 1991) também como um receptor para o fago U3 (Austin e outros, 1990); esta proteína não é somente encontrada em E. coli, porém também em uma multidão de bactérias gram- negativas (Wiener, 2000); a localização na membrana externa e a ampla 10 ocorrência torna ToIC um candidato ideal para apresentar antigenos heteró- logos, para, por exemplo, causar uma reação imune.
As bactérias gram-positivas não abrangem uma membrana ex- terna. A secreção nestes casos é mais simples e normalmente não requer maquinaria de secreção dedicada para transporte pela membrana de célula 15 e parede celular. No caso de bactérias gram-positivas, os sinais de secreção fundidos N terminalmente à proteína heteróloga são normalmente necessá- rios e suficientes para secreção. As proteínas, para as quais estas seqüên- cias de sinal foram descritas, compreendem principalmente todas proteínas bacterianas segregadas. Os exemplos para Iisteria são os sinais de secre- 20 ção derivados de Listeriolysin, p60 ou ActA. Em geral, um método similar aplica as células eucarióticas, onde uma seqüência de sinal (por exemplo, o sinal de secreção ubíquo Vtgss) direcionando a proteína para o retículo en- doplasmático na ausência de um sinal de retenção é necessário e suficiente para secreção.
O componente opcional (III) b) é pelo menos uma seqüência de
nucleotídeo que codifica para pelo menos uma proteína para Iisar o micro- organismo no citosol de células de mamífero e para plasmídeos de liberação intracelular ou vetores de expressão, que estão contidos no micro-organismo lisado. Tais proteínas líticas (endolisinas) são, por exemplo, proteínas de Iise 30 específicas de Listeria, tal como PLY551 (Loessner e outros, 1995) e/ou o holin específico de Listeria sob o controle de um promotor listeriano. Uma modalidade preferida desta invenção é a combinação de diferentes compo- nentes (III) b), por exemplo, a combinação de uma proteína de Iise e a holin.
Ambos os componentes (III) a) e/ou (III) b) podem ser indepen- dentemente um do outro constitutivamente ativos.
Em uma modalidade preferida, um micro-organismo de acordo 5 com as definições acima, é fornecido, em que o componente (III) a) é sele- cionado do grupo que consiste em "sistema de secreção tipo I, sistema de secreção tipo II, sistema de secreção tipo III, sistema de secreção tipo IV, sistema de secreção tipo V, sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD 10 sob o controle do promotor específico de hly), sistema de transporte de he- molisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o controle de um promotor bacteriano não-específico de hly), sinal de transporte para a proteína de camada S (Rsa A) de Caulo- bacter crescentus, sinal de transporte para a proteína de ToIC de Escheri- 15 chia coli, sinais secreção de Vtgss e/ou sinais de secreção derivados de Iis- teriolisina, p60 e/ou de ActA" e em que o componente (III) b) é selecionado do grupo que consiste em "endolisinas, proteína lítica de bactérias gram- positivas, proteína lítica de monocitógenos de Listeria, PLY551 de monocitó- genos de Listeria e/ou holin de monocitógenos de Listeria".
Em uma outra modalidade preferida, o mesmo componente (III)
a) permite a expressão dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II) na superfície externa do micro-organismo e/ou permite a secreção dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II). Isto é, nesta modalidade preferida o componente de (III) a) é pelo menos 25 uma seqüência de nucleotídeo que codifica para somente um sistema de transporte, que permite a expressão concomitante dos produtos de expres- são do componente (I) e componente (II) na superfície externa do micro- organismo e/ou permite a secreção concomitante dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II), em que tal componente preferido (III) 30 a) é pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucle- otídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o controle do promotor específico de hly) ou o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA1 HIyB e HIyD sob o controle de um promotor bacteriano não-específico de hly).
Em ainda outra modalidade preferida, um micro-organismo de 5 acordo com as definições acima é fornecido, em que de acordo com compo- nente (III) a) os produtos de expressão dos componentes (I) e componente
(II) são segregados. Mais preferivelmente, o componente (I) e componente
(II) são ligados um ao outro, expressos juntos e segregados como uma pro- teína de fusão codificada por ambos os componentes. Mais preferivelmente, 10 esta proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em "CtxB-PSA, CtxB-B-Raf V600E KD (inativado por cinase), domínio de CtxB-B-Raf V600E cinase, domínio KD de CtxB-B-Raf V600E cinase (inativado por cinase), CtxB-B - Raf, CtxB-B-Raf KD (inativado por cinase), domínio KD de CtxB B- Raf cinase (inativado por cinase), CtxB - HA1 (subunidade 1 de uma hema- 15 glutinina de um vírus da gripe), CtxB-HAI 2C".
No curso da presente invenção, o termo "secreção" se refere à secreção de um antígeno de proteína, toxina de proteína e/ou proteína de fusão de toxina-antígeno por ambas as membranas de uma bactéria gram- negativa ou pela membrana interna e parede celular de uma bactéria gram- 20 positiva no ambiente vizinho, pelos meios de um sistema de secreção apro- priado, tais como aqueles ilustrados acima.
Como é conhecido que ao usar um sistema de secreção, tal co- mo o sistema de secreção tipo I de hemolisina de E. coli, o produto de se- creção é normalmente encontrado em todas frações celulares: citoplasmati- 25 camente, associado a membrana, localizado em vesículas de automembra- na e completamente segregadas no ambiente vizinho (Balsalobre e outros, 2006), a secreção no curso da presente invenção não precisa estar comple- ta. Porém, uma secreção completa ou quase completa, isto é, uma quanti- dade de maioria de produto de secreção completamente segregado, é dese- 30 jada e preferida.
O componente (IV) representa pelo menos uma seqüência de nucleotídeo para pelo menos uma seqüência de ativação para a expressão de um ou mais dos componentes (I) a (III), em que a referida seqüência de ativação pode ser ativada no micro-organismo e/ou é específico de célula de tecido, específico de célula de tumor, específico de macrófago, específico de dendrito, específico de linfócito, específico de função ou célula não- 5 específica.
Se a expressão for ligada a membrana na superfície externa do micro-organismo, a seqüência de ativação preferivelmente tem que ser sele- cionada tal que seja capaz de ser ativada no micro-organismo. Tais seqüên- cias de ativação são, por exemplo: i) regiões de promotor constitutivamente 10 ativas, tal como a região promotora com "sítio de ligação ribossômica" (RBS) do gene beta-lactamase de E. coli ou do gene tetA (Busby e Ebright, 1994), promotor de endógeno do local de hly de E. coli\ ii) promotores, que são ca- pazes de ser induzidos, preferivelmente promotores que se tornam ativos após na recepção na célula. A estes pertence o promotor de actA de L. mo- 15 nocitógenos (Dietrich e outros, 1998) ou o promotor de pagC de S. typhimu- rium (Bumann, 2001).
Se os plasmídeos são liberados do micro-organismo após sua Iise no citosol da célula mamífera, a seqüência de ativação é de célula não específica, porém específica de célula de tecido, específica de ciclo de célu- 20 Ia ou específica de função. Preferivelmente, tais seqüências de ativação são selecionadas, as quais são particularmente ativadas em macrófago, células dendríticas e linfócitos.
Em uma outra modalidade preferida, um micro-organismo de acordo com as definições acima é fornecido, em que o componente (I) é se- 25 lecionado do grupo que consiste em B-Raf V600E, domínio de B-Raf V600E cinase, B-Raf V600E KD (inativado por cinase), domínio KD de B-Raf V600E cinase (inativado por cinase), B-Raf KD (inativado por cinase), domínio de B- Raf cinase, domínio KD de B-Raf cinase (inativado por cinase), antígeno es- pecífico de próstata (PSA), hemaglutinina HA1 (preferivelmente do vírus da 30 Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferi- velmente do vírus da Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemagluti- nina HA12C (preferivelmente do vírus da Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1) 2004(Η5Ν1)";
componente (II) é selecionado do grupo que consiste em "subu- nidade B de toxina de cólera (CTB, CtxB), subunidade B de enterotoxina de E. coli termolábil (LTB), toxina de tétano (TT)";
componente (III) a) é selecionado do grupo que consiste em "si-
nal de transporte de hemolisina de HIyA de Escherichia coli junto com com- ponentes do sistema de secreção de Hly (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA1 HIyB e HIyD sob o controle do promotor específico de hly-)";
componente (IV) é selecionado do grupo que consiste em "pro- motor endógeno do local de hly de E. coli";
em que componente (I) e componente (II) estão ligados um ao outro para permitir a expressão de uma proteína de fusão codificada por ambos com- ponentes e em que a proteína de fusão é segregada.
Os micro-organismos ilustrados acima de acordo com os com- ponentes (I) a (IV) como também as modalidades preferidas são a seguir referidos como micro-organismos da invenção.
Os micro-organismos da invenção são vantajosamente adequa- dos para uso na terapia de tumor, como vacinas vivas no curso de direcio- namento de tumor. Isto é, por meio de micro-organismos da invenção, que 20 funcionam como veículos de informação genética, antigenos de heterólogos junto com toxinas de proteína são transportados para o sítio de tumor, são expressos como proteínas de fusão e são segregados in situ.
Os micro-organismos da invenção são surpreendentemente e vantajosamente caracterizados por uma expressão eficiente e superior e secreção das proteínas de fusão de toxina-antígeno transportadas, codifica- das e expressadas, isto é, nenhum agregado citoplasmático e/ou periplas- mático ocorre.
Além disso, por administração dos micro-organismos da inven- ção uma resposta de sistema imune celular sistêmica forte é surpreenden- temente obtida comparadas às vacinas de proteína oralmente administradas que em contraste induzem uma tolerância sistêmica do sistema imune.
Notavelmente, ao lado da indução de uma resposta de sistema imune celular sistêmica de tipo de Th1, os micro-organismos da invenção induzem a ativação de células T citotóxicas CD8+ restritas de classe I de MHC (CTL) e fortemente realça esta resposta imune de CTL.
Além disso, além da indução e/ou realce de respostas de siste- 5 ma imune de Th1 e CTL sistêmica celular forte, o sistema imune inato, por exemplo, células NK, células NKT e/ou células T gama-delta, também é sur- preendentemente ativado pelos micro-organismos da invenção de uma ma- neira sinérgica.
Se a toxina de cólera for usada como componente de toxina, os 10 micro-organismos da invenção possuem a vantagem que em humanos ne- nhuma imunidade preexistente contra a toxina regularmente existe (em con- traste com toxina de tétano, por exemplo, devido a vacinações antitétano durante infância). O uso toxina de cólera e/ou suas subunidades, em particu- lar CtxB, é então preferido.
Os micro-organismos da invenção são particularmente adequa-
dos para administração oral em terapia de tumor alvejado (imune) com base em vacina viva. Desse modo, uma complacência de paciente melhorada po- de ser realizada.
Porém, os micro-organismos da invenção não estão limitados 20 somente ao uso em terapia de tumor. Principalmente, os micro-organismos da invenção também são adequados para o tratamento e/ou profilaxia de todas estas doenças que requerem uma terapia na qual a indução de uma resposta do sistema imune de Th1 celular sistêmica é obrigatória. Os exem- plos de tais doenças infecciosas incluem, porém não estão limitados a, HIV, 25 gripe, HCV e outras doenças virais, tuberculose de Mycobacterium, monoci- tógenos de Listeria e outras doenças bacterianas.
Os micro-organismos da invenção são perfeitamente adequados para o tratamento de doenças como gripe, que requer uma proteção ideal pela combinação de resposta de sistema imune mucosal e resposta imune 30 celular sistêmica. Além disso, eles poderiam ser úteis para indução específi- ca de imunidade do tipo de Th1 em doenças alérgicas, por exemplo, rinite alérgica. Em tal um caso, o antígeno seria um alérgeno que é fundido ao componente de toxina de proteína e o princípio de ação da vacina respectiva seria a troca da resposta imune de uma resposta imune dominada de Th2 contra o alérgeno em reações alérgicas (doenças) para uma resposta imune de Th1.
5 Um modo preferido de aplicação é aplicação oral. Em uma mo-
dalidade preferida, uma cepa de Salmonella de acordo com esta invenção é fermentada em meio apropriado, é colhida e é lavada através de centrifuga- ção e subsequentemente formulada e estabilizada usando substâncias a- propriadas e liofilizadas. A substância de Iiofilizada é cheia em cápsulas re- 10 sistentes ao estômago que contêm numerosas células de vida preferivel- mente entre 109 a 1010 bactérias. As cápsulas são oralmente absorvidas com líquido.
Alternativamente, as bactérias de Iiofilizada como descrito acima são distribuídas junto com sachês que contêm tampão que pode neutralizar 15 o ácido do estômago (kit farmacêutico). Em uma modalidade preferida, este tampão é um tampão de carbonato. Imediatamente antes de uso, o tampão é preparado com água e absorvido, imediatamente depois das bactérias liofi- lizadas terem sido absorvidas misturadas com água.
Ainda outra alternativa é o uso de bactérias congeladas. Neste 20 caso, após a lavagem, as bactérias são estabilizadas por um estabilizador, preferivelmente sacarose ou glicerina, e subsequentemente congeladas e armazenadas a -80°C preferivelmente em concentrações entre 109 a 1010 bactérias por dose. Esta preparação é preferivelmente usada em um kit far- macêutico como descrito acima junto com tampão de carbonato.
Em uma modalidade preferida, uma composição farmacêutica é
fornecida compreendendo pelo menos um micro-organismo da invenção, preferivelmente pelo menos um micro-organismo Iiofilizado da invenção, e um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente cápsulas.
Os componentes (I) a (IV) de acordo com a presente invenção são introduzidos nos micro-organismos da invenção por métodos bem co- nhecidos pelo homem versado na técnica. Se os micro-organismos repre- sentam bactérias, os componentes são inseridos em plasmídeos ou vetores de expressão, e os plasmídeos ou vetores de expressão são transferidos nas bactérias. A clonagem biológica molecular e técnicas de transformação adequadas para a fabricação dos plasmídeos, vetores de expressão e micro- organismos da invenção são bem conhecidos por pessoas versadas na téc- nica e representam trabalho experimental rotineiro.
Outro assunto da invenção é a administração de uma prepara- ção de medicamento que contém os micro-organismos da invenção. A admi- nistração é feita localmente ou sistemicamente, por exemplo, oralmente, pe- roralmente, retalmente, na epiderme, na subcútis, na musculatura, em uma cavidade do corpo, em um órgão, no tumor ou na circulação sanguínea.
Tais preparações de medicamento são, por exemplo, suspen- sões dos micro-organismos da invenção em soluções familiares ao farma- cêutico, adequadas para injeção.
Um assunto particular desta invenção é a administração peroral 15 ou retal de um medicamento de acordo com a invenção para o tratamento e/ou profilaxia de doenças. A administração pode ser feita uma vez ou várias vezes. Em cada administração aproximadamente, 10 a 1011 micro- organismos da invenção são administrados. Se a administração deste núme- ro de micro-organismos da invenção não causa uma reação imune suficien- 20 te, o número a ser injetado tem que ser aumentado.
Após a administração dos micro-organismos da invenção, a tole- rância a uma célula que apresenta componente (I), por exemplo, uma célula de tumor, ou uma célula de tecido, da qual o tumor se origina, é quebrada, e uma resposta imune sistêmica forte dirigida contra o tumor e/ou suas células 25 de tecido é ativada. Dependendo da seleção de componente (I), esta reação imune celular é voltada ou exclusivamente contra o tumor ou também contra células de tumor incluindo as células de tecido, das quais as células de tu- mor se originam.
Em outro aspecto, o objetivo da presente invenção foi resolvido fornecendo-se um medicamento que compreende pelo menos um micro- organismo da invenção que compreende os componentes genéticos ilustra- dos acima (I) a (IV) ou pelo menos uma composição farmacêutica como de- finido aqui.
Em uma modalidade preferida, os micro-organismos da invenção podem ser usados para a produção de um medicamento para o tratamento e/ou profilaxia de condições fisiológicas e/ou patofisiológicas selecionadas 5 do grupo que consiste em "divisão de célula descontrolada, tumores malig- nos, tumores benignos, tumores sólidos, sarcomas, carcinomas, distúrbios hiperproliferativos, carcinóides, sarcomas de Ewing, sarcomas de Kaposi, tumores cerebrais, tumores que se originam do cérebro e/ou do sistema ner- voso e/ou as meninges, gliomas, neuroblastomas, câncer de estômago, cân- 10 cer de rim, carcinomas de célula de rim, câncer de próstata, carcinomas de próstata, tumores de tecido conjuntivo, sarcomas de tecido macio, tumores de pâncreas, tumores do fígado, tumores de cabeça, tumores de pescoço, câncer esofágico, câncer da tiróide, osteossarcomas, retinoblastomas, timo- ma, câncer testicular, câncer do pulmão, carcinomas bronquiais, câncer de 15 peito, carcinomas de mama, câncer intestinal, tumores colorretais, carcino- mas de cólon, carcinomas de reto, tumores ginecológicos, tumores de ová- rio/tumores ovarianos, câncer uterino, câncer cervical, carcinomas de cerviz, câncer de corpo de útero, carcinomas de corpo, carcinomas endometriais, câncer de bexiga urinário, câncer de bexiga, câncer de pele, basaliomas, 20 spinaliomas, melanomas, melanomas intraoculares, leucemia, leucemia crô- nica, leucemia aguda, linfomas, infecção, infecção viral ou bacteriana, gripe, inflamação crônica, rejeição de órgão e/ou doenças autoimunes".
As infecções bacterianas incluem, mas não é limitado, antraz, meningites bacterianas, botulismo, brucelose, campilobacteriosi, doença de
arranhão de gato, cólera, difteria, tifo epidêmico, impetigo, legionelose, lepra (doença de Hansen), leptospirose, listeriose, doença de Lyme, melioidose, infecção de MRSA, nocardiose, coqueluche (tosse gritante), praga, pneumo- nia pneumocócica, psitacose, febre Q, febre maculosa das montanhas ro- chosas (RMSF), salmonelose, escarlatina, shigelose, sífilis, tétano, tracoma, 30 tuberculose, tularemia, febre tifóide, tifo, infecções do trato urinário, doenças cardíacas bacterialmente causadas.
As infecções virais incluem, porém não estão limitadas a, AIDS, a complexos relacionados com AIDS relacionou (ARC), catapora (varicella), resfriado comum, infecção de citomegalovírus, febre de carrapato do Colo- rado, febre de Dengue, febre hemorrágica de Ebola, doenças de mão, pé e boca, hepatite, herpes simples, Herpes zoster, HPV, gripe (influenza), febre 5 de Lassa, sarampo, febre hemorrágica de Marburg, mononucleose infeccio- so, caxumbas, poliomielites, Ieucencefalopatia multifocal progressiva, raivas, rubéola, SARS, varíola (varíola), encefalites virais, gastroenterite viral, me- ningites virais, pneumonia viral, doença de Nilo Ocidental, febre amarela.
As inflamações crônicas ou doenças inflamatórias crônicas in- cluem, porém não estão limitadas a, colecistite crônica, bronquiectasia, artri- te reumática, tiroidite de Hashimoto, doença de intestino inflamatória (colite ulcerative e a doença de Crohn), silicose e outras pneumoconioses.
As doenças autoimunes incluem, porém não estão limitadas a, síndromes sistêmicas, tais como SLE, síndrome de Sjogren, escleroderma, 15 artrite reumatóide e polimiosite como também síndromes locais, como IDDM, tiroidite de Hashimoto, doença de Addison, pênfigo vulgar, psoríase, dermati- te atópica, síndrome atópica, asma, anemia hemolítica autoimune, esclerose múltipla.
Os medicamentos correspondentes que incluem pelo menos um 20 micro-organismo como definida aqui ou pelo menos uma composição farma- cêutica como definido aqui de acordo com todas as modalidades descritas aqui para uso no tratamento e/ou profilaxia de condições fisiológicas e/ou patofisiológicas como descrito e definido aqui também são compreendidos pela presente invenção.
Em outro aspecto, o objetivo da presente invenção foi resolvido
fornecendo plasmídeo ou vetor de expressão que compreende os compo- nentes (I) a (IV) como ilustrado aqui. Preferidos são os micro-organismos da invenção que carregam pelo menos um plasmídeo ou vetor de expressão que compreende os componentes (I) a (IV) como ilustrado aqui.
Em outro aspecto, o objetivo da presente invenção foi resolvido
fornecendo um processo para a produção de um micro-organismo da inven- ção, em que um plasmídeo ou vetor de expressão como ilustrado aqui é produzido, e um micro-organismo é transformado com este plasmídeo ou vetor de expressão.
Em outro aspecto, o objetivo da presente invenção foi resolvido fornecendo um kit farmacêutico que compreende pelo menos um micro- organismo da invenção ou uma composição farmacêutica como descrito a- cima ou um medicamento como descrito acima e um tampão farmacologi- camente aceitável, preferivelmente um tampão de carbonato.
Breve Descrição dos Desenhos
Figura 1 descreve a seqüência de nucleotídeo (5'—>3') de sinal de secreção de hemolisina A de E. coli (hlyA). O sítio de Nsil está sublinha- do.
Figura 2 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') de he- molisina B de E. coli (hlyB) do sistema de transporte tipo I de hemolisina de E. coli.
Figura 3 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') de he-
molisina D de E. coli (hlyD) do sistema de transporte do tipo I de hemolisina de E. coli.
Figura 4 descreve a seqüência de nucleotídeo (5'-3') de antíge- no específico de próstata humana (PSA) sem peptídeo de sinal, número de acesso M26663 (mRNA de antígeno específico de próstata de Homo sapi- ens, cds completo), região 100-807 (peptídeo correspondente: AA 26 - 261).
Figura 5 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') de subu- nidade B de Toxina de Cólera (CtxB) sem peptídeo de sinal que cerca região 204-494, número de acesso K01170 (Vibrio cholerae toxA e genes de toxB para subunidades de enterotoxina de cólera A2 (gama).
Figura 6 descreve a seqüência de nucleotídeo (5-3') de domínio de B-Raf cinase (B-Raf KD) de proteína de B-raf humana (BRAF), número de acesso M95712 (mRNA de proteína de B-raf de Homo sapiens (BRAF), cds completo), região 1403-2359 sem região 1448-1477 (peptídeo corres- pondente: AA 448-766 sem AA 463-472) contendo a mutação V600E.
Figura 7 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') do epito- po B-Raf V600E restrito B27 de HLA humano. Figura 8 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') do cons- tructo de fusão genético de CtxB - PSA - HIyA.
Figura 9 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —►3') do cons- tructo de fusão genético de Ctx - B-Raf V600E - HIyA.
Figura 10 descreve a seqüência de nucleotídeo (5' —>3') do
constructo de fusão genético de CtxB - domínio KD de B-Raf V600E cinase - HIyA
Figura 11 descreve a expressão funcional e secreção de proteí- nas de fusão de PSA-CtxB em diferentes espécies bacterianas recombinan- tes para pMKhly-PSA-CtxB.
Figura 12 descreve esplenócitos de segregação de IFN-gama como uma medição para célula T CD8+ e respostas de sistema imune inato (célula NK) em camundongos imunizados com veículos de vacina viva dife- rentes.
Figura 13 descreve a redução de volume de tumor com respeito
à imunização com veículos de vacina viva diferentes.
Figura 14 descreve esplenócitos de segregação de IFN-gama como uma medição para célula T CD8+ e respostas de sistema imune inato (célula NK) em camundongos imunizados com vacinas vivas diferentes que carregam adjuvantes imunológicos diferentes com constructos de fusão de CtxB-OVA.
Figura 15 descreve a expressão eficiente e secreção funcional de proteínas de fusão de hemaglutinina de gripe de galinha H1 - CtxB em uma cepa de vacina veterinária abrangendo a seqüência completa de hema- 25 glutinina de H5N1 (HA1 +HA2, descrito, HA12), sem a região de transmem- brana (HA12c). vacT de Typhimurium de sorovar de Salmonella enterica a- tenuado vivo (gyrA D87G) e vacE de Enteritidis de sorovar de Salmonella enterica atenuado vivo, (cepa Rif12/Ssq), ambos de LOHMANN ANIMAL HEALTH GMBH & CO 30 Figura 16 descreve a seqüência de nucleotídeo que codifica pa-
ra a proteína de fusão CtxB-HAI2c-HlyA.
Figura 17 descreve a expressão e secreção da proteína de fu- são que usa o vetor pMBKDC eletroporado na cepa Ty21a de Salmonella typhi um e outras cepas bacterianas:
A) faixas A1 - A3: Análise de sobrenadante de acordo com TP StMoBKDC usando anticorpo anti-B-Raf para detecção. Faixa A1: pMoBKDC 5 de Ty21a de S. typhi, A2: Ty21a de S. typhi, A3: aroA de S. typhimurium. A proteína de fusão BRaf-V600E KD-CtxB é marcada com a seta superior e tem o tamanho esperado de aproximadamente 48 kDa. Marcador de proteí- na: proteína de variação crescente Invitrogen Bench-Mark Pre-Stained1 #10748-010,
B) análise equivalente como em A, usando o anticorpo anti-HlyA
recentemente produzido como anticorpo de detecção. Faixa 1, 2: constructos de StMoPC, faixa 3: MoBKDC de Ty21a de S. typhi; faixa 4: MoBKDC de E. coli, faixa 5: Ty21a de S. typhi, faixa 6: aroA de S. typhimurium. Marcador de proteína: Proteína de variação crescente Invitrogen BenchMark Pre-Stained, #10748-010, Lote 1315592
Figura 18 descreve a seqüência de nucleotídeo completa (5'—>-3') do vetor vazio pMKhlyi.
Os conteúdos de todas as referências e patentes citadas estão, desse modo, incorporados por referência em sua totalidade. A invenção é explicada em maiores detalhes por meio dos seguintes exemplos sem, po- rém, estar restrita a estes.
Exemplos
Exemplo 1: Construção, expressão e secreção de proteínas de fusão de PSA-CtxB em cepas de veículo bacterianas diferentes
Para provar a viabilidade e demonstrar a eficácia do sistema de
secreção de hemolisina do tipo I de E. coli para segregar proteínas de fusão de antígenos de tumor, aqui o antígeno específico de próstata (PSA), e componentes de toxina de proteína, aqui CtxB, como adjuvante, uma proteí- na de fusão de PSA-CtxB foi construída como descrito aqui. A expressão e 30 secreção foram testadas em cepas bacterianas gram-negativas diferentes, que são potencialmente úteis como cepas de vacina viva em terapia de tu- mor. A clonagem biológica molecular é com base no plasmídeo/vetor de ex- pressão pMOhlyl, que foi previamente descrito (Gentschev e outros, 2005; Gentschev e outros, 1996, WO 03/072789).
1A Construção de derivado de vetor de expressão- pMOhlyl resistente à canamicina
A substituição do cassete de resistência à ampicilina de pMOhlyl
foi realizada como descrito em (Datsenko e Wanner, 2000).
Em sumário, um iniciador de sense P1 (5'-
GGAGCTGCTTC-3’) e um iniciador de antissense P2 (5- 10 GCGAT CT GT CT ATTTCGTT CAT CCAT AGTTGCCT GACT CCCCATAT GAAT ATCCTCCTTA-3’) e pKD4 de plasmídeo como modelo foram usados para PCR para produzir um fragmento que carrega o gene de resistência à cana- micina (KanR) flanqueado por regiões homólogas ao gene de resistência à ampicilina (sublinhado).
A cepa BW25114 de E. coli, abrigando o plasmídeo pKD46 e o
plasmídeo alvo pMOhlyl foi desenvolvida a 37°C em meio LB (Difco) suple- mentado com 0,2% de L-(+)-arabinose durante 3-4 horas antes da transfor- mação do fragmento de PCR.
Após a transformação as células bacterianas foram espalhadas 20 em placas de ágar de LB contendo 25pg/mL de canamicina e incubadas du- rante a noite a 37°C. No dia seguinte, os clones de KanR foram separados e incubados durante um adicional de 48h em meio LB contendo 50pg/mL de canamicina para livrar-se de todos os plasmídeos que concedem resistência à ampicilina.
Finalmente, os clones foram selecionados com um fenótipo sen-
sível à ampicilina e KanR. A substituição do gene de ApR pelo cassete de KanR foi confirmada por PCR e sequenciamento. O plasmídeo resultante foi chamado pMKhlyl.
1 B Clonagem de plasmídeo pMKhly-PSA O iniciador de sense PSA-NsiI (5’ - GATTGGTGATG-
CATCCCTCAT-3’; os sítios de restrição Nsil estão sublinhados) e iniciador de antissense PSA-Nsi2 (5’-GGTGCTCATGCATTGGCCACG - 3') foram u- sados para ampliar um fragmento de DNA de codificação de PSA por PCR. Os PCRs foram realizados em um Circulador Térmico 60 (Biometra, Gõttingen, Alemanha) durante 30 ciclos a 94°C durante 1 min, 54°C durante 1 min, e 72°C durante 2 min.
5 Após a digestão com a enzima de restrição Nsil1 o fragmento de
DNA1 carregando o gene de psa, foi inserido no único sítio de Nsil do vetor de exportação de pMKhlyl O plasmídeo pMKhly-PSA resultante foi isolado de DH5alfa de E. coli (Invitrogene, Alemanha), analisado por análise de res- trição e sequenciado.
1C Clonagem de plasmídeo pMKhly-PSA/CtxB
O iniciador de sense Ptac-Sall (5- AAAAAAGTCGACGGCTGTGCAGGTCGTAAATCACTGC - 3') e Iniciador de antissense Ptac-Notl (5'-AAAAAAGCGGCCGCGAAATTGTTATCCGCT CA- CAATTCC-3) foram usados para ampliar por PCR um Ptac-promotor de co- 15 dificação de fragmento de DNA de 201 pb de pGEX-6p-1 -Plasmídeo (Amer- sham Bioscience, Alemanha). A PCR foi realizada em termocirculador T3 (Biometra, Alemanha): durante 30 ciclos a 95°C durante 30 s, 55°C durante 30s, e 72°C durante 90s. O iniciador de sense Rbs-Notl-dianteiro (5- AAAAAAGCGGCC GCTAAGGATGAATTATGATTAAATTAAAATTTGG-3’) e 20 iniciador de antissense ctb-Sall-reverso (5-
TTTATAGT CGACTTAATTT GCCATACTAATTG CG GCAAT CGC-3') foram usados para ampliar por PCR o fragmento de DNA de 413 pb codificando o sítio de ligação de ribossoma e a seqüência de codificação total de CtxB de El tor de V. cholerae. A PCR foi executada em um termocirculador T3 (Bio- 25 metra, Alemanha): etapa 1: 30 ciclos a 95°C durante 30 s, 50°C durante 30 s, e 72°C durante 2 min. Após a purificação com o Kit de Purificação Qia- quick PCR (Qiagen, Alemanha) e a digestão de ambos os fragmentos com a enzima de restrição Notl1 os dois fragmentos foram ligados resultando no Ptac-ctxB-fragmento de 594 bp. O fragmento resultante também foi purifica- 30 do e após a digestão com a enzima de restrição de Sa//, o Ptac-ctxB- fragmento foi inserido no sítio Sall único do vetor de exportação pMKhly- PSA. O plasmídeo resultante pMKhly-PSA/CtxB foi isolado de DH5alfa de E. coli (Invitrogene, Alemanha), analisado e sequenciado.
1 D Clonagem de Constructo de Fusão de PSA-CtxB-HIyAs
O iniciador de sense 5'ctxB Nsil (5'- GCATATGCACATGCATCACCTCAAAATATTACTGAT - 3‘) e iniciador de antisense 3' CtxB Srfl Nsil (5' - GGCTTTTTTATATCTTATGCATGCCC GGGCATTGCGGCAATCGC-3) (sítio Srfl está em negrito) foram usados pa- ra ampliar por PCR um fragmento de DNA de ~300bp representando o gene de ctxB de El tor de V. cholerae. Após a purificação com o kit de purificação de PCR QIAquick (Qiagen, Alemanha) e digestão com a enzima de restrição Nsil, o fragmento de DNA, carregando o gene de ctxB total sem a seqüência de sinal de terminal de N, foi inserido no sítio de Nsil único do vetor de ex- portação pMKhlyl. O plasmídeo pMKhly-CtxB resultante foi isolado de DH5alfa de E. coli (Life Technologies), analisado e sequenciado. O gene de psa humano foi ampliado de plasmídeo pCDNA3PSA por PCR com iniciado- res 5-PSA-cegos (5’-GTGGGAGGC TGGGAGTGC-3’) e 3-PSA-cego (5’ - GGGGTTGGCCACGATGGT-S). PCR foi realizada em um Circulador Térmi- co 60 (Biometra, Góttingen, Alemanha) durante 30 ciclos a 94°C durante 1 min, 56°C durante 1 min, e 72°C durante 2 min. O produto de DNA de 0,7 kb foi subsequentemente clonado no sítio de Srfl de pMKhIy-CtxB. O plasmídeo pMKhly-CtxB-PSA resultante foi verificado por análise de restrição e se- quenciamento.
1E Expressão e secreção de proteínas de fusão em espécies bacterianas diferentes
Ao usar os procedimentos de eletroporação padrão, o plasmídeo 25 pMKhly-CtxB-PSA foi transformado em cepas bacterianas eletrocompetentes diferentes. As colônias únicas resistentes à canamicina foram selecionadas e desenvolvidas em meio de BHI (Beckton Dickinson, USA: Cérebros de Be- zerro, Infusão de 200g, 6,0g/L; Coração de Carne de boi, Infusão de 250g, 9,8g/L; Proteose Peptona 10,0g/L; Cloreto de sódio 5,0g/L; Dextrose 2,0g/L; 30 Fosfato de Dissódio 2,5g/L) a uma densidade de 1x109 células por ml. Se- guinte o desenvolvimento 20 ml de cultura foram centrifugados durante 30 min a 4000 rpm (3000 g) em uma centrífuga Heraeus a 4°C. 18 ml do sobre- nadante foram transferidos em um tubo fresco. Subsequentemente, 1,8 ml de TCA (ácido tricloroacético, Applichem, Alemanha) foi adicionado, o líquido foi misturado e incubado durante pelo menos 1 hora no gelo. Após a incuba- ção, a suspensão foi centrifugada durante 30 min a 4000 rpm (3000 g) em uma centrífuga Heraeus a 4°C. O sobrenadante foi decantado e a pélete foi lavado com 1 ml de acetona p.a. (Applichem, Alemanha). O precipitado foi centrifugado durante 10 min a 4000 rpm (3000 g) em uma centrífuga Hera- eus a 4°C. O pélete foi secado a ar e absorvido em 150μΙ de 5x de tampão de Laemmli (70 mM de Tris-HCI, pH 6,8, 40% (v/v) de glicerol, 3% (v/v) de dodecil sulfato de sódio, 5% (v/v) de 2-mercaptoetanol e 0,05% (p/v) de bromofenol azul) com ou sem beta-mercaptoetanol (Laemmli, 1970). 20 μΙ de solução foram usados para cada faixa em SDS PAGE. As proteínas se- paradas foram eletroforeticamente transferidas (western blot) para membra- na de nitrocelulose Hybond ECL (Amersham-Pharmacia, Little Chalfont, REINO UNIDO) e bloqueadas durante a noite com PBS (cloreto de Potássio
0,20 g/l, di-hidrogeno fosfato de potássio 0,20 g/l, cloreto de sódio 8,00 g/l, di-hidrogeno fosfato de dissódio anidro 1,15g/l) contendo 1% de BSA. A membrana foi lavada em PBS-Tween 0,05%, incubada com anticorpo anti- PSA de coelho policlonal (1 :750, DAKO, Dinamarca), anticorpo CtxB (1 20 :1000, Zytomed, Berlim, Alemanha) ou anticorpo HIyAs (Gentschev e outros, 1996)) e subsequentemente incubada com IgG anticoelho acoplado a HRP (1/2,000; Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante 1 h. O western blot foi de- senvolvido com o kit de quimioluminescência realçado (GE Healthcare Life Science, Alemanha).
Figura 11 descreve a expressão funcional e secreção de proteí-
nas de fusão PSA-CtxB em uma variedade de cepas bacterianas, incluindo Escherichia coli spp., Salmonella dublin, Citrobacter spp, Salmonella typhi de Ty21a, Salmonella typhimurium spp, Erwinia spp e Shigella fIexneri spp.
A cepa de Ty21a de Salmonella typhi expressando e segregan- do a proteína de fusão PSA-CtxB foi depositada em Coleção Alemã de Mi- cro-organismos e Culturas de Célula (DSMZ) sob DSM 19244.
Exemplo 2: Resposta imune e proteção contra desafio de célula de tu- mor em camundongos imunizados com cepas de Salmonella segre- gando proteínas de fusão de antígenos de tumor e CtxB ou CtxB sozi- nho
Pelas seguintes experiências a eficácia protetora superior de 5 proteínas de fusão segregadas de antígenos de tumor e toxinas de proteína foi demonstrada em um modelo de tumor animal. Para este modelo, a cepa Salmonella typhimurium aroA (SL7207) pMKhly-CtxB-PSA, expressando e segregando a proteína de fusão CtxB-PSA foi comparada com outras cepas de controle.
2A Procedimentos de Imunização
Os camundongos de DBA/2 foram imunizados três vezes com um intervalo de 3 semanas. Para a imunização com bactérias, os animais foram pré-tratados aplicando-se 50 μΙ de NaHCO3 a 7% intragastricamente para aumentar o pH intragástrico. 5 a 10 minutos após o pré-tratamento, 15 5x108 bactérias insensíveis à canamicina vivas foram aplicadas em um vo- lume de 100 μ( de PBS intragastricamente. Como um controle, os camun- dongos foram imunizados intramuscularmente com PSA de codificação de DNA de plasmídeo nu (pcDNA-PSA) como descrito em (Fensterle e outros, 2005).
2B Respostas de célula T
Sete dias após a última imunização, os esplenócitos de camun- dongos imunizados foram preparados como previamente publicado (Fenster- le e outros, 1999) passando-se o baço por uma malha, seguido por Iise de eritrócitos. A análise de ELISPOT para a detecção de células T CD8+ especí- 25 ficas de PSA foi realizada de acordo com um protocolo publicado em (Fens- terle e outros, 1999).
Em sumário, para a análise ex-vivo de células T CD8+ específi- cas de PSA placas de nitrocellulose de 96 cavidades (Millititer HA; Millipore, Bedford, MA) foram revestidas com 5pg/ml do anticorpo monoclonal de IFN- 30 gama anticamundongo (mAb) R4 (PharMingen) em 100 μΙ de tampão de carbonato (Fensterle e outros, 1999), pH 9,6. Após a incubação durante a noite a 4°C e bloqueio com 1% de BSA em PBS, 1x105 esplenócitos de ca- mundongos vacinados foram adicionados em 100 μΙ de RP10 (Fensterle e outros, 1999) por cavidade.
Para análise da resposta de célula T CD8+ o clone de célula P815 que expressa PSA, PPSA 24, foi usado; em sumário, este clone ex- pressa o PSA de tamanho natural por um promotor de CMV codificado pelo plasmídeo pCDNA3 (Fensterle e outros, 2005). Após a incubação durante 20-22 h a 37°C, 5% de CO2 na presença de 30 U/ml de IL-2, as placas foram lavadas e incubadas durante adicional de 2h com 100 μΙ de mAb XMB1.2 de IFN-gama anti-camundongo biotinilado (0,25pg/ml, PharMingen). As placas foram lavadas e incubadas durante 1 h a 37°C na presença de 100 μΙ de uma diluição de 1/20.000 de estreptavidina acoplada a alcalino fosfatase (PharMingen). As manchas foram contadas visualizadas adicionado 50 μΙ do substrato pronto para uso BCIP/NBT (Sigma, St. Louis, MO) dissolvido em água. As manchas foram contadas sob um microscópio de dissecação em ampliação de 3-vezes.
A frequência de células T específicas de peptídeo (CTL) é ex- pressa como o número de células de segregação de IFN-gama por 105 de esplenócitos. Para a análise de respostas de célula T após a re-estimulação, 2,5 x 107 esplenócitos foram re-estimulados com 2x106 de células P815 de 20 expressão de PSA irradiadas (Fensterle e outros, 2005) em meio de RP10 (Fensterle e outros, 1999) em uma presença de 60 U/ml de IL-2 recombinan- te durante 5 dias. A análise de ELISPOT foi realizada como descrito acima usando várias quantidades de células re-estimuladas (105, 3x104, 104 ou 3x103 por cavidade) misturadas com 4x105 células alimentadoras (= esple- 25 nócitos recentemente preparados de camundongos DBA/2 não sensibiliza- dos a fármacos) e 105 células de PPSA24.
A indução de uma resposta imune celular, especialmente de cé- lulas T CD8+ citotóxicas, desempenha um papel importante para a eficiência de terapia de tumor (Boon e outros, 2006; Rosenberg, 2001). Então, a eficá- 30 cia da cepa bacteriana recombinante de Salmonella typhimurium (SL7207) carregando um vetor de expressão de pMKhly-CtxB-PSA para induzir uma resposta imune de célula T CD8+ específica de PSA foi testada primeiro. Para este propósito, 64 camundongos DBA-2 fêmeas de idade de 10-14 semanas de idade foram imunizados p.o. com SL7207/pMKhly- CtxB (n=10), SL7207/pMKhly-CtxB-PSA (n=10), SL7207/pMKhly-PSA (n=10), SL7207/pMKhly-PSA/CxtB (n=10), SL7207/pMKhly1 (n=7) e pcD- 5 NA3-PSA recombinante não sensibilizado à fármacos (n=10) como um con- trole positivo como descrito aqui.
Figura 12 mostra os dados de ELISPOT que revelam que os camundongos imunizados com DNA mostraram respostas de célula T CD8+ profundas. Após a reestimulação, as respostas imunes marcadas foram de- tectadas em animais vacinados com proteína de PSA de segregação de Sal- monella fundida a CtxB, mas não em cepas que segregam PSA sozinho ou PSA e CtxB separadamente. De forma interessante, animais vacinados com toxina de CtxB de segregação de Salmonella sozinha também mostraram respostas imunes significantes depois de reestimulação. Estas respostas são mais prováveis devido às células NK ou outras células do sistema imune inato, que não especificamente reconhecem a linhagem de célula-alvo. Con- sequentemente, dos dados para CtxB segregado sozinho pode ser concluído que a resposta imune observada para proteína de fusão CtxB-PSA segrega- da (Esplenócitos de segregação de IFN-gama) é composta de uma resposta de célula T CD8+ como também uma resposta profunda do sistema imune inato (mais provavelmente células NK).
2C Proteção contra desafio de célula de tumor Para analisar a capacidade protetora da imunização, 6-7 ca- mundongos por grupo foram imunizados de acordo com o esquema acima. Duas semanas depois da terceira imunização, os camundongos foram desa- fiados com PPSA 24 (vide acima) por duas injeções s.c. de 1x106 células em cada flanco de pele abdominal raspada. Os camundongos foram monitora- dos durante um período de 14 dias quanto ao aparecimento de tumor e o volume de tumor foi avaliado medindo-se o maior (a) e menor (b) diâmetro de tumor. Volume de tumor foi calculado como elipsóide de rotação usando a seguinte fórmula: j/ π ■ . - :
V ~ — * α * />
, a > b.
Os resultados foram analisados quanto à significância através de ANOVA unidirecional e pós-teste de comparação múltipla de Dunnett usando o software Graph Pad Prism. O pós-teste foi somente realizado quando A- NOVA revelou significância.
5 Figura 13 exibe os resultados como meios ± SD. Nos dias 6, 9,
12 e 14 efeitos protetores significantes foram observados. Como esperado, a vacinação de DNA nua incluída como um camundongo protegido completa- mente por controle de crescimento de tumor. Porém, a vacinação de DNA nua mostra eficiência no máximo moderada em seres humanos. Relativo aos 10 constructos bacterianos, a cepa de vacina SL7207/pMKhly-CtxB-PSA (ex- pressando e segregando a proteína de fusão CtxB-PSA) mostrou ser muito eficiente. Isto significativamente reduziu o volume de tumor nos dias 9, 12 e
14 depois do desafio de tumor. De nota, também a cepa SL7207/pMKhly- CtxB reduziu o crescimento de tumor com valores comparáveis para 15 SL7207/pMKhly-CtxB-PSA no dia 14. Embora não significante, este efeito demorado é bem compatível com a resposta celular que foi medida no en- saio de ELISPOT. Além disso, também a cepa SL7207/pMKhly -PSA alcan- çou proteção significante no dia 14 que indica, que também esta cepa indu- ziu uma resposta de célula T que ficou abaixo do limiar de detecção. Em 20 contraste, a cepa de SL7207/pMKhly-PSA/CxtB não induziu um efeito rele- vante e permaneceu na mesma faixa como SL7207/pMKhly1 sozinho. Exemplo 3: Expressão e secreção de uma proteína de fusão de onco- gene-toxina em Ty21a de S. typhi
Análogo ao exemplo 1, outro antígeno de tumor, o domínio de 25 cinase do oncogene B - Raf V600E com uma deleção de 10 aa no domínio de cinase foi usado (morte de cinase de domínio de BRaf V600E cinase (KD), ou resumidamente BRaf * KD, mais resumidamente BKD). Estes com- ponentes de toxina de proteína e oncogene, aqui CtxB, como adjuvante, uma proteína de fusão de BKD-CtxB foi construída como descrito aqui. A 30 expressão e secreção foram demonstradas no Ty21a de S. typhi de cepa de vacina humana. A clonagem molecular é com base no plasmídeo/vetor de expressão pMOhlyl, que foi previamente descrito (Gentschev e outros, 2005; Gentschev e outros, 1996) e o procedimento de clonagem é análogo ao E- xemplo 1 nesta aplicação. O vetor resultante é chamado pMBKDC. A se- quência da proteína de fusão é determinada na Figura 10.
Figura 17 descreve a expressão e secreção da proteína de fu- são usando o vetor pMBKDC eletroporado na cepa de Ty21a de Salmonella typhi e outras cepas bacterianas.
A proteína de fusão BKD-CtxB expressando e segregando cepa Ty21a de Salmonella typhi foi depositada em Coleção Alemã de Micro- organismos e Culturas de Célula (DSMZ) sob DSM 19245.
Exemplo 4: Comparação de uma constructo de fusão de OVA-CtxB com adjuvantes imunológicos geneticamente codificados diferentes
Para comparar a eficácia imunológica de proteínas de fusão de toxina-antígeno segregadas por vacinas vivas, uma proteína de fusão que abrange um antígeno amplamente usado para estudos imunológicos, oval- bumina de galinha (OVA) e CtxB foi construída.
O iniciador de sense Nsil-OVA-dianteiro 5' -CAT GTA TGC ATT AGC CAT GGT ATA CCT GG - 3' e iniciador de antisense Nsil - OVA- rever- 20 so 5' - TTT TTT ATG CAT AAG GG AAA CAC CAC ATC TGC C - 3' foram usados para ampliar por PCR um fragmento de DNA de 1033 bp que repre- senta o gene ova (NM205152). Depois de purificação com Kit de Purificação de PCR QIAquick (Qiagen, Alemanha) e digestão com a enzima de restrição Nsil, o fragmento de DNA, carregando o gene ova inteiro sem a seqüência 25 de sinal de terminal de N, foi inserido no sítio Nsil único do pMKhlyl de vetor de exportação. O plasmídeo resultante pMKhly-Ova foi isolado de DH5alfa de E. coli (Life Technologies), analisado e sequenciado.
O iniciador de sense 5' ctxB Nsil (5'- GCATATGCACATGCAICACCTCAAAATATTACTGAT - 3') e iniciador de antissense 3' ctxB Srfl Nsil (5' - GGCTTTTTTATATCTTATGCATGCCC GGGÇATTGCGGCAATCGC-3’) (sítio de Srfl está em negrito) foram usados para ampliar por PCR um fragmento de DNA de ~300bp representando o gene de ctxB de V. cholerae Eltor. Depois de purificação com o Kit de Purifi- cação de PCR QIAquick (Qiagen, Alemanha) e digestão com a enzima de restrição Nsil, o fragmento de DNA, carregando o gene de ctxB inteiro sem a seqüência de sinal de terminal de N1 foi inserido no sítio de Nsil único do 5 pMKhlyl de vetor de exportação. O plasmídeo resultante pMKhly-CtxB foi isolado de DHõalpha de E. coli (Life Technologies), analisado e sequencia- do. O gene ova foi ampliado do plasmídeo pCI-OVA por PCR que usa inicia- dores 5-OVA-Sfrl GCC ATC ATG TCA GCT CTA e 3-OVA-Sfrl AGG GGA AAC ACA TCT GCC. A PCR foi realizada em um Circulador Térmico 60 (Bi- 10 ometra, Gõttingen, Alemanha) durante 30 ciclos de 1 min a 94°C, de 1 min a 49°C, e de 2 min 30 segundos a 72°C. O produto de DNA de 1,1-kb foi sub- sequentemente clonado no sítio de Srfl de pMKhly-CtxB. O plasmídeo pMK- hly-CtxB-OVA resultante foi examinado por análise de restrição e sequenci- amento.
A capacidade desta proteína de fusão obter respostas imunes de
Th1 foi comparada com aquela de OVA segregada codificada por vetor pM- Khly sozinha em combinação com plasmídeos de liberação de DNA (codifi- cando para proteínas sob o controle de um promotor eucariótico) codificando para interferons (IFN-gama), interleucinas (IL-12) e quimiocinas (IP-10).
Os procedimentos de imunização e análise de ELISPOT foram
realizados como descrito acima. Em sumário, os camundongos C57BL/6 foram imunizados oralmente três vezes com as cepas diferentes. 7 dias de- pois da imunização final, os esplenócitos foram removidos, reestimulados durante 5 dias e analisados em um ensaio de ELISPOT. Para reestimulação 25 de esplenócitos, as células pulsadas com o peptídeo SIINFEKL (as letras representam aminoácidos), o epitopo MHC-I restrito a H-2b de ovalbumina, foram usadas.
Figura 14 mostra a eficácia superior da ovalbumina de galinha compreendendo proteína de fusão (OVA) e CtxB na indução de respostas de célula T CD8+ específicas de OVA e respostas do sistema imune potencial- mente inato) comparadas com os constructos de coliberação de IFN-gama ou IP-10. Isto exibe uma eficácia similar como a cepa com constructo de IL- 12 coliberado.
Exemplo 5: Expressão e secreção de antígenos virais
A adequadabilidade dos micro-organismos da invenção para a expressão e secreção de qualquer (não tumor) antígeno foi demonstrada 5 pela expressão de proteína de H1 de hemaglutinina do vírus de gripe de ga- linha H5N1 fundido a CtxB em uma cepa de vacina veterinária, VacT de Salmonella typhimurium.
O iniciador de sense 5'-HA-G: 5' - ATC TGT CAA ATG GAG AAA -3' e iniciador de antissense 3-HA12C: 5'-TAC TCC ACT TAT TTC CTC TCT-3 foram usados em PCR, ampliando um fragmento de DNA codificando ο H5 sem o domínio de membrana de terminal de C (H12C). O produto de PCR foi subsequentemente clonado no sítio de Srfl de pMKhly-CtxB. O plasmídeo de pMKhly-CtxB-H12C resultante foi examinado por análise de restrição e sequenciamento. A cepa VacT de S. typhimurium/pMKhly-CtxB- H12C eficazmente expressou e segregou a H5-proteína híbrida, como mos- trado por "imunoblotting" com anticorpos policlonais elevados contra CtxB e HIyA (Figura 2). A quantidade de H5 segregado foi 2-3 pg de proteína/ml de sobrenadante sob as condições experimentais. As bactérias foram desen- volvidas em meio BHI a uma densidade de 1 x109 células por ml. 20 ml da cultura foram centrifugados durante 30' a 4000 rpm (3000 g) e 4°C em uma centrífuga Hereaus. 18 ml do sobrenadante foram transferidos em um tubo fresco. Subsequentemente, 1,8 ml de TCA (ácido tricloracético, Applichem, Alemanha) foi adicionado; o líquido foi misturado e incubado em gelo duran- te pelo menos 1 hora. Após a incubação, a suspensão foi centrifugada du- rante 30' a 4000 rpm (3000 g) e 4°C em uma centrífuga Hereaus. O sobre- nadante foi decantado e o pélete foi lavado com 1 ml de Acetona p.a. (Appli- chem, Alemanha); o precipitado foi centrifugado durante 10' a 4000 rpm (3000 g) e 4°C em uma centrífuga Hereaus. O pélete foi secado a ar e ab- sorvido em 150 μΙ de 5x de tampão Laemmli. 20μΙ da solução foram usados para cada faixa em SDS PAGE. As proteínas separadas foram eletroforeti- camente transferidas para membrana de nitrocelulose de Hybond ECL (A- mersham-Pharmacia, Little Chalfont, REINO UNIDO) e bloqueadas durante a noite com PBS contendo 1% de BSA. A membrana foi lavada em PBS- Tween a 0,05%, incubada com anticorpo anti-CtxB de coelho policlonal (1:1000, Zytomed, Berlim, Alemanha) ou anticorpo HIyAs (Gentschev e ou- tros, 1996) e subsequentemente incubada com IgG anticoelho acoplado a 5 HRP (1/2.000; Dianova1 Hamburgo, Alemanha) durante 1 h. O western blot foi realizado usando o kit de quimioluminescência realçado (GE Healthcare Life Science, Alemanha).
Figura 15 descreve a expressão eficiente e secreção funcional de proteína de fusão HA12C-CtxB na cepa de vacina veterinária, VacT de Salmonella typhimurium.
Exemplo 6: Expressão e secreção de proteínas de fusão de adjuvantes de toxina e antígenos de tumor por sistemas de secreção tipo Ill
Várias bactérias gram-negativas carregam os sistemas de se- creção tipo Ill que podem ser explorados para secreção de antígeno. Nor- 15 malmente, estes sistemas podem ser explorados para injetar antígenos hete- rólogos diretamente em células. Neste exemplo, um componente de toxina de Yersinia que serve como sinal de secreção (YopE) é fundido genetica- mente ao fragmento de subunidade B de enterotoxina termolábil (LT-B) ser- vindo como um adjuvante e um antígeno de tumor, PSA. Este constructo 20 deve ser expresso em cepas de Yersinia adequadas, preferivelmente atenu- adas que levam a secreção da proteína de fusão pela maquinaria secreção tipo Ill endógena pela seqüência de sinal YopE.
Neste exemplo, a fusão genética YopEI8-LT-B-PSA é clonada no sítio de EcoRI do plasmídeo paCYCI 84, para usar o constructo com a 25 mesma orientação como o gene cat que é usado na produção de um produto expresso pelo promotor cat codificado por plasmídeo (http://www.fermentas.com/techinfo/nucleicacids/mappacyc184.htm). Para expressão realçada, qualquer promotor adequado pode ser usado.
No seguinte, um procedimento de clonagem é exemplificado. O DNA cromossômico de E. coli que abrange a subunidade B de enterotoxina termolábil ou um vetor que abrange esta seqüência (GenBank número de acesso AF242418) é ampliado usando os seguintes iniciadores em uma rea- ção de PCR:
Eco-yope18-f (abrangendo sítio EcoRI + seqüência de sinal YopEI8): 5'- CT GAATT CAT GAAAAT AT CAT CATTTATTT CTACAT CACT GCCCCTGCCG GCA TCAGTGTCAAATAAAGTAAAATGTTATGTTTTAT3’ (5’ região preta: 5 sítio EcoRI +3 bases 5', vermelha: seqüência que codifica para sinal de se- creção para secreção tipo Ill de proteína YopE (aa 1 -18), Acesso de Gen- Bank M92066; região em itálico: região de homologia de gene de LT-B (a- cesso de GB AF242418), bases 4-28). Iniciador reverso fosforilado LT-B-r:
5' GTTTTCCATACTGATTGCCGCAATTGAATTGG-3’ (cepa reversa 372-341 de GB AF242418).
Em paralelo, a seqüência de PSA como descrito nesta aplicação do vetor pMK CtxB-PSA é ampliada usando os seguintes iniciadores: iniciador dianteiro fosforilado psa-f: 5' - GTGGGAGGCTGGGAGTGCGAG-3’ iniciador reverso psa-eco-r: 5' CCTGAATTCTT AGACGTGAT ACCTTGA- 15 AGCAC (5' preto: sítio EcoRI +3 bases 5', azul: códon de interrupção, preto: 3' região de seqüência PSA, esta aplicação)
Subsequentemente, os dois fragmentos são ligados com um DNA Ligase sob as condições apropriadas. Depois da ligação, o fragmento novo é ampliado em uma segunda reação de PCR usando os iniciadores Eco-yope18-f e PSA-Eco-R descritos acima.
O fragmento resultante é purificado usando um Kit de purificação PCR adequado para remover tampão e oligonucleotídeos e subsequente- mente digerido com enzima de EcoRI em condições de reação adequadas. O fragmento de 1040 bp resultando é purificado usando eletroforese em gel 25 de agarose ligado no vetor paCYC184 digerido por EcoRI. Após o sequenci- amento dos clones sensíveis a cm resistentes à tetraciclina, um clone que tem a seqüência correta integrada com a mesma orientação do que o gene cm é escolhido e transformado em uma cepa de Yersinia adequada usando eletroporação. Esta cepa de vacina segregará a fusão de LT-B-PSA por seu 30 sistema de secreção tipo Ill endógeno.
Exemplo 7: Expressão e secreção de fusões de toxina-antígeno em bactérias gram-positivas As bactérias gram-positivas e negativas têm condições pré- requisitos diferentes para secreção. As bactérias gram-negativas possuem duas membranas e então uma maquinaria de secreção além de sinais de secreção é obrigatória para secreção completa. No caso de bactérias gram- 5 positivas, uma seqüência de sinal de secreção é suficiente.
Neste exemplo um sistema para secreção de uma fusão de PSA de Tétano-toxóide em Listeria que usa o sinal de secreção de p60 é descrito.
Em uma primeira etapa, o vetor pUC18(PS)actAOVATinlA (Loef- fler e outros, 2006) é digerido usando Nsil e subsequentemente tratado com 3'-5' Exonuclease nas condições apropriadas. Finalmente, o fragmento é purificado através de eletroforese em gel de agarose.
Em paralelo, o fragmento C de toxóide de tétano (acesso de GenBank no. M12739) é amplificado de uma fonte adequada, por exemplo, DNA genômico de cepa de Clostridium tetanii usando os seguintes iniciado- res fosforilados:
tetc dianteiro: 5' - TAAAAATCTGGATTGTTGGGTTG - 3', considerando que a base adicional sublinhada é para garantir a estrutura correta da fusão, tetc reverso: 5' - ATCATTTGTCCATCCTTCATCTG - 3.’
O fragmento BRAF KD é ampliado do plasmídeo pMO BKDC descrito neste pedido usando os seguintes fosforilados iniciadores: br dianteiro: 5’ - GATTGGGAGATTCCTGATG - 3' br reverso 5' - CCCGTGG ACAGG AAACGCACC - 3.'
Ambos os fragmentos são purificados usando um kit de purifica- ção por PCR adequado e subsequentemente ligado com DNA Iigase sob 25 condições adequadas. Após a ligação, o fragmento é purificado novamente usando um kit de purificação PCR adequado e ampliado usando os iniciado- res tetc dianteiro e o br reverso. Depois da amplificação, o fragmento de 2280 bp resultante é purificado por eletroforese em gel de agarose e ligado no fragmento de Nsil - 3'-5' exonuclease purificado de 30 pUC18(PS)actAOVATinlA. Após a ligação e transformação em E.coli, um clone é selecionado carregando o fragmento na estrutura. Subsequentemen- te, o plasmídeo é cortado usando Pstl e Sacl e o fragmento de 2837 bp é purificado usando eletroforese em gel e ligado no vetor pSP118 adequada- mente digeridos e purificados Pstl e Sacl (Loeffler e outros, 2006). O vetor resultante, pSP118 - act-TetC-BRaf*KD é transformado em uma cepa Liste- ria carregando uma deleção trpS, por exemplo, monocitógenos de Listeria 5 delta trps delta aroA/B (Loeffler e outros, 2006). Nesta colocação, o plasmí- deo é estabilizado pelo plasmídeo com base em trpS ("Sistema letal equili- brado") e o plasmídeo codifica para um Iisina de fago que leva à Iise intracel- Iular da cepa. O cassete act-TetC-BRaf*KD é expresso principalmente em células hospedeiras eucarióticas sob o controle do promotor actA, que tem 10 algum vazamento extracelular (Loeffler e outros, 2006). A seqüência de sinal actA do cassete leva à secreção da proteína de fusão de TetC-BRafcKD. Exemplo 8: Células eucarióticas que segregam fusões de toxina- antígeno
Neste exemplo, uma linhagem de célula eucariótica, por exem- 15 pio, linhagem de célula de tumor, é construída a qual segrega uma proteína de fusão CtxB-PSA. Para este propósito, um sinal de secreção universal é empregado (US 6.733.997), o qual, em princípio, permite a secreção do cas- sete de expressão correspondente em células de origem diferente, incluindo células de mamífero, células de levedura e procarióticas.
Em uma primeira etapa, a fusão de CtxB-BRaf * KD é ampliada
do plasmídeo pMO BKDC (esta aplicação) usando os seguintes iniciadores: CB-dianteiro: 5'-atcGGATCCTCAAAATATTACTGATTTGTGTGC - 3' (minúscula: espaçador, sublinhado: sítio de BamHI, maiúscula: CtxB 5') CB-reverso: 5' - taqGGATCCTTAGTGGACAGGAAACGCAC- CATATCC - 3' (minúscula: espaçador, sublinhado: sítio de BamHI, itálico: códon de interrupção, maiúscula: BRaf * KD 3').
Subsequentemente, o produto de PCR é purificado usando um kit de purificação de PCR adequado e subsequentemente parcialmente dige- rido (fragmento contém sítio BamHI interno) com BamHI. O fragmento de 30 1231 bp da digestão parcial é isolado por eletroforese em gel de agarose e subsequentemente ligado no plasmídeo pVtgEGFP purificado por gel e dige- rido por BamHI (Pedido de Patente U.S. 6733997). Subsequentemente, um clone que carrega a orientação de estrutura com Vtgss é selecionado e chamado pVtgCtxBRAf. Este plasmídeo pode ser transformado por eletropo- ração em uma linhagem de célula eucariótica que pode ser selecionada pelo cassete de seleção de kan/neo. As linhagens de célula podem ser estabele- 5 cidas em linhagens de célula como linhagens de célula de câncer para uso como vacina de câncer heteróloga ou células de tumor derivadas do pacien- te para uso como vacinas de câncer autólogas.
Em todo caso, o Vtgss de sinal de secreção codificado pelo vetor pVtgEGFP geneticamente fundido a CtxB-BRaf * KD resultará na secreção da proteína de fusão.
Ao usar um método similar, as proteínas de fusão também po- dem ser expressas em levedura. Como um exemplo, uma estratégia de clo- nagem modificada como descrito na figura 11 de US 6.733.997 é demons- trada. Na primeira etapa, o cassete que contém a fusão de Vtgss-CtxB- 15 BRafrKD de plasmídeo pVtgCtxBRAf descrito acima é cortado por Eagl e Eco47lll e inserido no vetor pBSPGK (US 6.733.997, figura 11). Subsequen- temente, o vetor resultante é digerido com Sacl e Hindlll e o fragmento que abrange o elemento de PGK e a fusão de Vtgss-CtxB-BRaf*KD é integrado na região correspondente do vetor pYEX-S1 análogo à descrição de US 20 6.733.997 (figura 11). O plasmídeo resultante pode ser transformado através de eletroporação em cepas de levedura tipo Saccharomyces cerevisiae. A levedura expressará e segregará a proteína de fusão e pode ser usada para propósitos de vacinação.
Abreviações:
ABC cassete de ligação de ATP
AIDA adesina envolvida na aderência difusa
APC célula de apresentação de antígeno
aroA gene aroA
AT alfa toxina
ATP trifosfato de adenosina
B-Raf KD domínio de B-Raf cinase
BSA albumina de soro bovino Cag A proteína de virulência associada à doença principal de Helicobacter pylori
CPE enterotoxina de Clostridium perfringens
CpG seqüências de DNA contendo seqüências de DNA
imunestimuladoras
hipometiladas abrangendo os motivos de CpG
CT/Ctx Toxina de Cólera
CTB/CtxB subunidade B de Toxina de Cólera
CTL células de T CD8+ citotóxicas (células T exterminadoras)
CMV Citomegalovirus
DNA ácido desoxirribonucléico
ds fita dupla
DT/Dtx Toxina de Difteria
E. coli Eseheriehia coli
EBV vírus de Ebstein Barr
receptor GM-1 receptor 1 de monosialogangliosídeo
HA Hemaglutinina
HCV vírus da Hepatite C
HIV vírus da imunodeficiência humana
Hly Hemolisina
HPV vírus de Papilloma Humano
HT Toxina Hemorrágica
i.d. intramuscular
i.m. intradermicamente
i.p. intraperetonealmente
IFN Interferon
IgA isótipo A de Imunoglobulina
IgG isótipo G de Imunoglobulina
IL interleucina
KD morte por cinase
LPS Lipopolissacarídeo
LT enterotoxina termolábil de E. coli LT toxina letal LTB subunidade B de enterotoxin termolábil de E. coli mAb anticorpo monoclonal MHC complexo de histocompatibilidade principal Célula NK célula exterminadora natural Cela NKT célula T exterminadora natural PAGE eletroforese em gel de poliacrilamida PBS solução salina tamponada de fosfato PCR Reação em Cadeia de Polimerase PE Exotoxina A de Pseudomonas PSA antígeno específico de próstata PT/Ptx Toxina de coqueluche RNA ácido ribonucléico s. c. subcutâneo SDS dodecilsulfato de sódio Sec série de reações secretoras gerais (Sec) SS fita única ST enterotoxina termoestável de E. coli ST/Stx Toxina de Shiga STB/StxB subunidade B de Toxina de Shiga T3SS sistema de secreção do Tipo Ill Tat translocação de arginina dupla TCA ácido tricloroacético Th1 (célula) células T CD4+ inflamatórias Th2 (célula) células T CD4+ ajudantes TSST-1 toxina de síndrome de choque tóxico TT Toxina de Tétano VT toxina de Vero Literatura Agren, L. C, Ekman, L, Lowenadler, B., Nedrud, J. G., e Lycke,
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cctggagatt ttagcccaat accataacgt ctctgttaac ccggaagaaa ttaaacatag 3480
atttgataca gacgggacag gtctgggatt aacgtcatgg ttgcttgctg cgaaatcttt 3540
agaactaaag gtaaaacagg taaaaaaaac aattgatcga ttaaacttta tttttctgcc 3600
cgcattagtc tggagagagg atggacgtca ttttattctg actaaaatca gcaaagaagt 3660
aaacagatat cttatttttg atttggagca gcgaaatccc cgtgttctcg aacagtctga 3720
gtttgaggcg ttatatcagg ggcatattat tcttattact tcccgttctt ctgttaccgg 3780
gaaactggca aaatttgact ttacctggtt tattcctgcc attataaaat acaggagaat 3840
atttattgaa acccttgttg tatctgtttt tttacaatta tttgcattaa taacccccct 3900
ttttttccag gtggttatgg acaaagtatt agtgcacagg gggttttcaa cccttaatgt 3960
tattactgtt gcattatctg ttgtagtggt gtttgagatt atactcagcg gtttaagaac 4020
ttacattttt gcacatagta caagtcggat tgatgttgag ttgggtgcca aactcttccg 4080
gcatttactg gcgctaccga tctcttattt tgagagtcgt cgtgttggtg atactgttgc 4140
gagggtaaga gaattagacc agatccgtaa ttttctgaca ggacaggcat taacatctgt 4200
tttggactta ttattttcac tcatattttt tgcggtaatg tggtattaca gcccaaagct 4260
tactctggtg atcttatttt cgctgccttg ttatgctgca tggtctgttt ttattagccc 4320
cattttgcga cgtcgccttg atgataagtt ttcacggaat gcggataatc aatctttcct 4380
ggtggaatca gtaacggcga ttaacactat aaaagctatg gcagtctcac ctcagatgac 4440
gaacatatgg gacaaacaat tggcaggata tgttgctgca ggctttaaag tgacagtatt 4500
agcaaccatt ggtcaacaag gaatacagtt aatacaaaag actgttatga tcatcaacct 4560
atggttggga gcacacctgg ttatttccgg ggatttaagt attggtcagt taattgcttt 4620
taatatgctt gctggtcaga ttgttgcacc ggttattcgc cttgcacaaa tctggcagga 4680
tttccagcag gttggtatat cagttacccg ccttggtgat gtgcttaact ctccaactga 4740
aagttatcat gggaaactga cattgccgga aattaatggt gatatcactt ttcgtaatat 4800
ccggtttcgc tataaacctg attctccggt tattttggac aatatcaatc ttagtattaa 4860
gcagggggag gttattggta ttgtcggacg ttctggttca ggaaaaagca cattaactaa 4920
attaattcaa cgtttttata ttcctgaaaa tggccaggta ttaattgatg gacatgatct 4980
tgcgttggct gatcctaact ggttacgtcg tcaggtgggg gttgtgttgc aggacaatgt 5040
gctgcttaat cgcagtatta ttgataatat ttcactggct aatcctggca tgtccgtcga 5100 aaaagttatt tatgcagcga aattagcagg cgctcatgat tttatttctg atttgcgtga 5160
ggggtataac accattgtcg gggaacaggg ggcaggatta tccggaggtc aacgtcaacg 5220
catcgcaatt gcaagggcgc tggtgaacaa ccctaaaata ctcatttttg atgaagcaac 5280
cagtgctctg gattatgagt cggagcatgt catcatgcgc aatatgcaca aaatatgtaa 5340
gggcagaacg gttataatca ttgctcatcg tctgtctaca gtaaaaaatg cagaccgcat 5400
tattgtcatg gaaaaaggga aaattgttga acagggtaaa cataaggagc tgctttctga 5460
accggaaagt ttatacagtt acttatatca gttacagtca gactaacaga aagaacagaa 5520
gaatatgaaa acatggttaa tggggttcag cgagttcctg ttgcgctata aacttgtctg 5580
gagtgaaaca tggaaaatcc ggaagcaatt agatactccg gtacgtgaaa aggacgaaaa 5640
tgaattctta cccgctcatc tggaattaat tgaaacgcca gtatccagac ggccgcgtct 5700
ggttgcttat tttattatgg ggtttctggt tattgctttt attttatctg ttttaggcca 5760
agtggaaatt gttgccactg caaatgggaa attaacacac agtgggcgta gtaaagaaat 5820
taaacctatt gaaaactcaa tagttaaaga aattatcgta aaagaaggag agtcagtccg 5880
gaaaggggat gtgttattaa agcttacagc actgggagct gaagctgata cgttaaaaac 5940
acagtcatca ctgttacagg ccaggctgga acaaactcgg tatcaaattc tgagcaggtc 6000
aattgaatta aataaactac ctgaactaaa gcttcctgat gagccttatt ttcagaatgt 6060
atctgaagag gaagtactgc gtttaacttc tttgataaaa gaacagtttt ccacatggca 6120
aaatcagaag tatcaaaaag aactgaattt ggataagaaa agagcagagc gattaacagt 6180
acttgcccgt ataaaccgtt atgaaaattt atcaagggtt gaaaaaagcc gtctggatga 6240
tttcagtagt ttattgcata aacaggcaat tgcaaaacat gctgtacttg agcaggagaa 6300
taaatatgtc gaagcagtaa atgaattacg agtttataaa tcacaactgg agcaaattga 6360
gagtgagata ttgtctgcaa aagaagaata tcagcttgtt acgcagcttt ttaaaaatga 6420
aattttagat aagctaagac aaacaacaga caacattggg ttattaactc tggaattagc 6480
gaaaaatgaa gagcgtcaac aggcttcagt aatcagggcc ccagtttcgg gaaaagttca 654 0
gcaactgaag gttcatactg aaggtggggt tgttacaaca gcggaaacac tgatggtcat 6600
cgttccggaa gatgacacgc tggaggttac tgctctggta caaaataaag atattggttt 6660
tattaacgtc gggcagaatg ccatcattaa agtggaggca tttccttata cacgatatgg 6720
ttatctggtg ggtaaggtga aaaatataaa tttagatgca atagaagacc agagactggg 6780
acttgttttt aatgttatta tttctattga agagaattgt ttgtcaaccg ggaataaaaa 6840
cattccatta agctcgggta tggcagtcac tgcagaaata aagacaggta tgcgaagtgt 6900
aatcagttat cttcttagtc ctttagaaga gtcagtaaca gaaagtttac gtgagcgtta 6960
agtttcagaa gtccagtatt tgctgctata cgtgctgcgt ggcacttgcc gtctgaacgg 7020 cattgatccg gaagccaagt caaacaacag cgtgatgagc gtcagggcaa aacaccaagg 7080
ctctctcgat gacaccagaa caaattgaaa tacgtgagct gaggaaaaag ctaccgagtt 7140
cttgatgttg gactccctga acagttctct gtaatcggga aactcaggac gcgttatcct 7200
gtggtcacac tctgccatgt gtttagggtt catcacagca gctacagata ctggtaaaac 7260
cgtcctgaaa aaccagacgg cagacgggct gtattacgta gtcaggtact tgagctacat 7320
ggcatcagtc acggtttggc cggagcaaga cgtatcacca caatggcaac ccggagaggt 7380
gtcagcgcca gtgatataag acggttaacg gttaaaaatc gtggcgttga caacatccca 7440
gtggactgag gtcacacagg cctggcagca ttcctcttcc ggccggatga cccggatttc 7500
acggggaaag tacgccgata acagtttacg ggctgaagat tggcgtaggg aggatagcag 7560
acgttttgcc gcccccattg tctggagttg ggtgagaagg catcatttca ccaacaccaa 7620
catttcacag ttacacccca cagctacatg aagcgcttcc atgaattatc gctttgattt 7680
atcatgttaa aatagctcta cacggttggt tcaggattgc gcaccgaaac cctctaaaat 7740
ccactgacgc gcctgcgaat tatccagcac cgcgcctttc gagatcctct acgccggacg 7800
catcgtggcc ggcatcaccg gcgccacagg tgcggttgct ggcgcctata tcgccgacat 7860
caccgatggg gaagatcggg ctcgccactt cgggctcatg agcgcttgtt tcggcgtggg 7 920
tatggtggca ggccccgtgg ccgggggact gttgggcgcc atctccttgc atgcaccatt 7980
ccttgcggcg gcggtgctca acggcctcaa cctactactg ggctgcttcc taatgcagga 8040
gtcgcataag ggagagcgtc gaccgatgcc cttgagagcc ttcaacccag tcagctcctt 8100
ccggtgggcg cggggcatga ctatcgtcgc cgcacttatg actgtcttct ttatcatgca 8160
actcgtagga caggtgccgg cagcgctctg ggtcattttc ggcgaggacc gctttcgctg 8220
gagcgcgacg atgatcggcc tgtcgcttgc ggtattcgga atcttgcacg ccctcgctca 8280
agccttcgtc actggtcccg ccaccaaacg tttcggcgag aagcaggcca ttatcgccgg 8340
catggcggcc gacgcgctgg gctacgtctt gctggcgttc gcgacgcgag gctggatggc 8400
cttccccatt atgattcttc tcgcttccgg cggcatcggg atgcccgcgt tgcaggccat 8460
gctgtccagg caggtagatg acgaccatca gggacagctt caaggatcgc tcgcggctct 8520
taccagccta acttcgatca ttggaccgct gatcgtcacg gcgatttatg ccgcctcggc 8580
gagcacatgg aacgggttgg catggattgt aggcgccgcc ctataccttg tctgcctccc 8640
cgcgttgcgt cgcggtgcat ggagccgggc cacctcgacc tgaatggaag ccggcggcac 8700
ctcgctaacg gattcaccac tccaagaatt ggagccaatc aattcttgcg gagaactgtg 8760
aatgcgcaaa ccaacccttg gcagaacata tccatcgcgt ccgccatctc cagcagccgc 8820
acgcggcgca tctcgggcag cgttgggtcc tggccacggg tgcgcatgat cgtgctcctg 8880
tcgttgagga cccggctagg ctggcggggt tgccttactg gttagcagaa tgaatcaccg 8940 atacgcgagc gaacgtgaag cgactgctgc tgaatggtct tcggtttccg tgtttcgtaa accattatgt tccggatctg catcgcagga tctgtattaa cgaagcgctg gcattgaccc cataccgcca gttgtttacc ctcacaacgt acccgtatcg tgagcatcct ctctcgtttc cccccttaca cggaggcatc agtgaccaaa tttatcagaa gccagacatt aacgcttctg caggcagaca tctgtgaatc gcttcacgac gcgcgtttcg gtgatgacgg tgaaaacctc gcttgtctgt aagcggatgc cgggagcaga ggcgggtgtc ggggcgcagc catgacccag ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac cgcacagatg cgtaaggaga aaataccgca actcgctgcg ctcggtcgtt cggctgcggc tacggttatc cacagaatca ggggataacg aaaaggccag gaaccgtaaa aaggccgcgt ctgacgagca tcacaaaaat cgacgctcaa aaagatacca ggcgtttccc cctggaagct cgcttaccgg atacctgtcc gcctttctcc cacgctgtag gtatctcagt tcggtgtagg aaccccccgt tcagcccgac cgctgcgcct cggtaagaca cgacttatcg ccactggcag ggtatgtagg cggtgctaca gagttcttga ggacagtatt tggtatctgc gctctgctga gctcttgatc cggcaaacaa accaccgctg agattacgcg cagaaaaaaa ggatctcaag acgctcagtg gaacgaaaac tcacgttaag tcttcaccta gatcctttta aattaaaaat agtaaacttg gtctgacagt taccaatgct gtctatttcg ttcatccata gttgcctgac ttccgaagtt cctattctct agaaagtata
tgcaaaacgt ctgcgacctg agcaacaaca 9000
agtctggaaa cgcggaagtc agcgccctgc 9060
tgctgctggc taccctgtgg aacacctaca 9120
tgagtgattt ttctctggtc ccgccgcatc 9180
tccagtaacc gggcatgttc atcatcagta 9240
atcggtatca ttacccccat gaacagaaat 9300
caggaaaaaa ccgcccttaa catggcccgc 9360
gagaaactca acgagctgga cgcggatgaa 9420
cacgctgatg agctttaccg cagctgcctc 9480
tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca 9540
caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt 9600
tcacgtagcg atagcggagt gtatactggc 9660
tgagagtgca ccatatgcgg tgtgaaatac 9720
tcaggcgctc ttccgcttcc tcgctcactg 9780
gagcggtatc agctcactca aaggcggtaa 9840
caggaaagaa catgtgagca aaaggccagc 9900
tgctggcgtt tttccatagg ctccgccccc 9960
gtcagaggtg gcgaaacccg acaggactat 10020
ccctcgtgcg ctctcctgtt ccgaccctgc 10080
cttcgggaag cgtggcgctt tctcatagct 10140
tcgttcgctc caagctgggc tgtgtgcacg 10200
tatccggtaa ctatcgtctt gagtccaacc 10260
cagccactgg taacaggatt agcagagcga 10320
agtggtggcc taactacggc tacactagaa 10380
agccagttac cttcggaaaa agagttggta 10440
gtagcggtgg tttttttgtt tgcaagcagc 10500
aagatccttt gatcttttct acggggtctg 10560
ggattttggt catgagatta tcaaaaagga 10620
gaagttttaa atcaatctaa agtatatatg 10680
taatcagtga ggcacctatc tcagcgatct 10740
tccccatatg aatatcctcc ttagttccta 10800
ggaacttcag agcgcttttg aagctggggt 10860 gggcgaagaa ctccagcatg agatccccgc gctggaggat catccagccg gcgtcccgga 10920
aaacgattcc gaagcccaac ctttcataga aggcggcggt ggaatcgaaa tctcgtgatg 10980
gcaggttggg cgtcgcttgg tcggtcattt cgaaccccag agtcccgctc agaagaactc 11040
gtcaagaagg cgatagaagg cgatgcgctg cgaatcggga gcggcgatac cgtaaagcac 11100
gaggaagcgg tcagcccatt cgccgccaag ctcttcagca atatcacggg tagccaacgc 11160
tatgtcctga tagcggtccg ccacacccag ccggccacag tcgatgaatc cagaaaagcg 11220
gccattttcc accatgatat tcggcaagca ggcatcgcca tgggtcacga cgagatcctc 11280
gccgtcgggc atgcgcgcct tgagcctggc gaacagttcg gctggcgcga gcccctgatg 11340
ctcttcgtcc agatcatcct gatcgacaag accggcttcc atccgagtac gtgctcgctc 11400
gatgcgatgt ttcgcttggt ggtcgaatgg gcaggtagcc ggatcaagcg tatgcagccg 114 60
ccgcattgca tcagccatga tggatacttt ctcggcagga gcaaggtgag atgacaggag 11520
atcctgcccc ggcacttcgc ccaatagcag ccagtccctt cccgcttcag tgacaacgtc 11580
gagcacagct gcgcaaggaa cgcccgtcgt ggccagccac gatagccgcg ctgcctcgtc 11640
ctgcagttca ttcagggcac cggacaggtc ggtcttgaca aaaagaaccg ggcgcccctg 11700
cgctgacagc cggaacacgg cggcatcaga gcagccgatt gtctgttgtg cccagtcata 11760
gccgaatagc ctctccaccc aagcggccgg agaacctgcg tgcaatccat cttgttcaat 11820
catgcgaaac gatcctcatc ctgtctcttg atcagatctt gatcccctgc gccatcagat 11880
ccttggcggc aagaaagcca tccagtttac tttgcagggc ttcccaacct taccagaggg 11940
cgccccagct ggcaattccg gttcgcttgc tgtccataaa accgcccagt ctagctatcg 12000
ccatgtaagc ccactgcaag ctacctgctt tctctttgcg cttgcgtttt cccttgtcca 12060
gatagcccag tagctgacat tcatccgggg tcagcaccgt ttctgcggac tggctttcta 12120
cgtgttccgc ttcctttagc agcccttgcg ccctgagtgc ttgcggcagc gtgggggatc 12180
ttgaagttcc tattccgaag ttcctattct ctagaaagta taggaacttc gaagcagctc 12240
cagcctacac caaaaaaggg aataagggcg acacggaaat gttgaatact catactcttc 12300
ctttttcaat attattgaag catttatcag ggttattgtc tcatgagcgg atacatattt 12360
gaatgtattt agaaaaataa acaaataggg gttccgcgca catttccccg aaaagtgcca 12420
cctgacgtct aagaaaccat tattatcatg acattaacct ataaaaatag gcgtatcacg 12480
aggccctttc gtcttcaaga attctcatgt ttgacagctt atcatcgatg gacattattt 12540
ttgtggagcc ggaggaaaca gaccagacgg ttcagatgag gcgcttacca ccagaaccgc 12600
tgttgtccca ccattctggc gattcccaaa cgctatttgg ataaaaagta gccttaacgt 12660
ggtttatttt cc 12672

Claims (19)

1. Micro-organismo como veículo de seqüências de nucleotídeo que codificam para antígenos e toxinas de proteína que compreendem os seguintes componentes. (I) pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos um antígeno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada; e (II) pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos uma toxina de proteína e/ou pelo menos uma subunidade de toxina de proteína; e (III) a) pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos um sistema de transporte que permite a expressão dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II) na superfície externa do micro-organismo e/ou permite a secreção dos produtos de ex- pressão do componente (I) e componente (II); e/ou que codifica para pelo menos uma seqüência de sinal que permite a secreção dos produtos de ex- pressão do componente (I) e componente (II); e/ou b) opcionalmente, pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos uma proteína para Iisar o micro-organismo no citosol de células de mamífero e para intracelularmente liberar os plasmí- deos ou vetores de expressão, que estão contidos no micro-organismo Iisa- do; e (IV) pelo menos uma seqüência de nucleotídeo para pelo menos uma seqüência de ativação para a expressão de um ou mais de componen- tes (I) a (III), em que a referida seqüência de ativação pode ser ativada no micro-organismo e/ou de é específica de célula de tecido, específica de célu- la de tumor, específica de macrófago, específica de dendrito, específica de linfócito, específica de função ou não-específica de célula"; em que qualquer um dos componentes (I) a (IV) podem estar presente uma vez ou várias vezes e se um componente dos componentes (I) a (IV) estiver várias vezes presente ele pode independentemente um do outro ser idêntico ou diferente; e em que o componente (I) e componente (II) não são idênticos, isto é, o com- ponente (I) não codifica para pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos uma toxina de proteína e/ou pelo menos uma su- bunidade de toxina de proteína.
2. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 1, em que o micro-organismo é selecionado do grupo que consiste em "bactéria, bactéria gram-positiva, bactéria gram-negativa, "célula eucariótica e preferivelmente é selecionado do grupo que consiste em " Escherichia spp., Escherichia coli, Salmonella spp., Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Yersinia spp., Yersinia Enterocolitica, Vibrio spp., Vibrio Cholerae, Listeria spp., Monocitó- genos de Listeria, Shigeila spp., Shigella Flexneri, Yersinia spp, " Pseudo- monas spp, em que preferivelmente a virulência do micro-organismo é ate- nuada.
3. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 2, em que Vibrio cholerae é excluído como micro-organismo.
4. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 3, em que o pelo menos um antígeno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada de acordo com componen- te (I) é selecionado do grupo que consiste nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mutantes conhecidos: "receptor; parte extracelular, trans- membrânica ou intracelular de um receptor; molécula de adesão; parte ex- tracelular, transmembrânica ou intracellular de uma molécula de adesão; proteína de transdução de sinal; proteína de ciclo de célula; fator de transcri- ção; proteína de diferenciação; proteína embrionária; proteína viral; alérge- no; proteína de patógeno microbiano; proteína de patógeno eucariótico; pro- teína de antígeno de câncer de testículo; proteína de antígeno de tumor; e/ou proteína específica de célula de tecido", em que a célula de tecido é selecionada do grupo que consiste em "glândula de tiróide, glândula mamá- ria, glândula salivar, linfonodos, glândula mamária, túnicas mucosas do es- tômago, rim, ovário, próstata, cérvix, túnicas serosas da bexiga e nervosa".
5. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 4, em que o pelo menos um antígeno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada de acordo com componente (I) é selecionado do grupo que consiste nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mu- tantes conhecidos: "Her-2/neu, receptor de andrógeno, receptor de estrogê- nio, receptor de midquine, receptor de EGF, ERBB2, ERBB4, receptor de TRAIL, FAS1 receptor de TNFalfa, receptor de TGF-beta, receptor de Iacto- ferrina, mielina básica, alfa-lactalbumina, GFAP, proteína de ácida fibrilar, tirosinase, EGR-1, MUC1, c-Raf (Raf 1), A-Raf1 B-Raf1 B-Raf V599E, B-Raf V600E, B-Raf1 domínio de cinase B-Raf V600E KD1 B-Raf V600E KD1 domí- nio de cinase B-Raf V600E KD1 domínio de cinase B-Raf1 domínio de cinase B-Raf KD1 N-Ras1 K-Ras1 H-Ras1 Bcl-2, Bcl-X1 Bcl-W1 Bf 1-1, Brag-1, Mcl-1, A1, Bax1 BAD1 Bak1 Bcl-Xs1 Bid1 Bik1 Hrk1 que Bcr/abl, Myb1 C-Met1 IAP1, IA02, XIAP1 ML-IAP LIVIN1 survivina, APAF-1, ciclina D(1 -3), ciclina E1 cicli- na A1 ciclina B1 ciclina H1 Cdk-1, Cdk-2, Cdk-4, Cdk-6, Cdk-7, Cdc25C, p16, p15, p21, p27, p18, pRb, p107, p130, E2F(1 -5), GAAD45, MDM2, PCNA1 ARF1 PTEN1 APC1 BRCA1 Akt1 PI3K, mTOR, p53 e homólogos, C-Myc1 NFkB1 c-Jun, ATF-2, Spl1 antígeno específico de próstata (PSA)1 antígeno carcinoembrionário, alfa-fetoproteína, PAP; PSMA; STEAP; MAGE, MAGE- 1, MAGE-3, NY-ESO-1, PSCA1 MART, GP 100, tirosinase, GRP1 TCF-4, an- tígenos virais dos vírus HIV, HPV1 HCV1 HPV1 EBV1 CMV1 HSV1 vírus de gri- pe, vírus de gripe tipo A1 vírus de gripe tipo A (H5N1) e (H3N2), vírus de gri- pe tipo B, vírus de gripe tipo C; hemaglutininas, hemaglutinina H1, hemaglu- tinina H5, hemaglutinina H7, hemaglutinina HA1 (preferivelmente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1) 2004(H5N1), hemaglutinina HA12 (preferivel- mente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferivelmente de vírus de gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), neuramidase, p60, LLO1 urease, CSP1 calflagina e/ou CPB" ou em que o pelo menos um antígeno completo ou parcial de pelo menos uma proteína do tipo selvagem ou mutada de acordo com o componente (I) é se- lecionado do grupo de cinases que consiste nas seguintes proteínas do tipo selvagem e seus mutantes conhecidos (número de acessão em parêntese): AAK1 (NM 01491 1 ), AATK (NM 004920), ABL1 (NM 005157), ABL2 (NM 005158), ACK1 (NM 005781 ), ACVR1 (NM 001 105), ACVR1 B (NM .020328), ACVR2 (NM 001616), ACVR2B (NM 001 106), ACVRL1 (NM000020), ADCK1 (NM 020421 ), ADCK2 (NM 052853), ADCK4 (NM 024876), ADCK5 (NM 174922), ADRBK1 (NM 001619), ADRBK2 (NM 005160), ΑΚΤ1 (NM 005163), ΑΚΤ2 (NM 001626), ΑΚΤ3 (NM 005465), ALK (NM 004304), ALK7 (NM 145259), ALS2CR2 (NM 018571 ), ALS2CR7 (NM 139158), AM- HR2 (NM 020547), ΑΝΚΚ1 (NM 178510), ANKRD3 (NM 020639), APEG1 (NM 005876), ARAF (NM 001654), ARK5 (ΝΜ014840), ATM (NM 000051 ), ATR (NM 001 184), AURKA (NM 003600), AURKB (NM 004217), AURKC (NM 003160), AXL (NM 001699), BCKDK (NM 005881 ), BCR (NM 004327), BIKE (NM 017593), BLK (NM 001715), BMPR1 A (NM 004329), BMPR1 B (NM 001203), BMPR2 (NM 001204), BMX (NM 001721 ), BRAF (NM004333), BRD2 (NM 005104), BRD3 (NM 007371 ), BRD4 (NM 014299), BRDT (NM 001726), BRSK1 (NM 032430), BRSK2 (NM 003957), BTK (NM000061 ), BUB1 (NM 004336), BUB1 B (NM 00121 1 ), CABC1 (NM 020247), CAMK1 (NM 003656), CaMKI b (NM 198452), CAMK1 D (NM020397), CAMK1 G (NM 020439), CAMK2A (NM 015981 ), CAMK2B (NM001220), CAMK2D (NM 001221 ), CAMK2G (NM 001222), CAMK4 (NM001744), CAMKK1 (NM 032294), CAMKK2 (NM 006549), CASK (NM003688), CCRK (NM 0121 19), CDC2 (NM 001786), CDC2L1 (NM 001787), CDC2L5 (NM 003718), CDC42BPA (NM 014826), CDC42BPB (NM 006035), CDC7L1 (NM 003503), CDK10 (NM 003674), CDK11 (NM 015076), CDK2 (NM 001798), CDK3 (NM 001258), CDK4 (NM 000075), CDK5 (NM 004935), CDK6 (NM 001259), CDK7 (NM 001799), CDK8 (NM 001260), CDK9 (NM001261 ), CDKL1 (NM 004196), CDKL2 (NM 003948), CDKL3 (NM 016508), CDKL4 (NM 001009565), CDKL5 (NM 003159), CHEK1 (NM 001274), CHUK (NM 001278), CIT (NM 007174), CLK1 (NM 004071 ), CLK2 (NM003993), CLK3 (NM 003992), CLK4 (NM 020666), CRK7 (NM 016507), CSF1 R (NM 00521 1 ), CSK (NM 004383), CSNK1 Α1 (NM 001892), CSNK1 D (NM 001893), CSNK1 E (NM 001894), CSNK1 G1 (NM 022048), CSNK1 G2 (NM 001319), CSNK1 G3 (NM 004384), CSNK2A1 (NM 001895), CSNK2A2 (NM 001896), DAPK1 (NM 004938), DAPK2 (NM 014326), DAPK3 (NM 001348), DCAMKL1 (NM 004734), DCAMKL2 (NM 152619), DCAMKL3 (ΧΜ 047355), DDR1 (NM 013993), DDR2 (NM 006182), DMPK (NM 004409), DMPK2 (NM 017525.1 ), DYRK1 A (NM 001396), DYRK1 B (NM 006484), DYRK2 (NM 006482), DYRK3 (NM 003582), DYRK4 (NM 003845), EEF2K (NM 013302), EGFR (NM 005228), EIF2AK3 (NM 004836), EIF2AK4 (ΝΜ_001013703), EPHA1 (NM 005232), ΕΡΗΑ10 (NM 001004338), ΕΡΗΑ2 (NM 004431 ), ΕΡΗΑ3 (NM 005233), ΕΡΗΑ4 (NM 004438), ΕΡΗΑ5 (NM 004439), ΕΡΗΑ6 (ΧΜ 1 14973), ΕΡΗΑ7 (NM 004440), ΕΡΗΑ8 (NM 020526), ΕΡΗΒ1 (NM 004441 ), ΕΡΗΒ2 (NM 017449), ΕΡΗΒ3 (NM 004443), ΕΡΗΒ4 (NM 004444), ΕΡΗΒ6 (NM 004445), ERBB2 (NM 004448), ERBB3 (NM 001982), ERBB4 (NM 005235), ERK8 (NM 139021 ), ERN1 (NM 001433), ERN2 (NM 033266), FASTK (NM 025096), FER (NM 005246), FES (NM 002005), FGFR1 (NM 000604), FGFR2 (NM 022970), FGFR3 (NM 000142), FGFR4 (NM 022963), FGR (NM 005248), FLJ23074 (NM 025052), FLJ231 19 (NM 024652), FLJ23356 (NM 032237), FLT1 (NM 002019), FLT3 (NM 0041 19), FLT4 (NM 002020), FRAP1 (NM 004958), FRK (NM 002031 ), FYN (NM 002037), GAK (NM 005255), GPRK5 (NM 005308), GPRK6 (NM 002082), GPRK7 (NM 139209), GRK4 (NM 005307), GSG2 (NM 031965), GSK3A (NM 019884), GSK3B (NM 002093), GUCY2C (NM 004963), GUCY2D (NM 000180), GUCY2F (NM 001522), Η1 1 (NM 014365), HAK (NM 052947), HCK (NM 0021 10), ΗΙΡΚ1 (NM 152696), ΗΙΡΚ2 (NM 022740), ΗΙΡΚ3 (NM 005734), ΗΙΡΚ4 (NM 144685), HRI (NM 014413), HUNK (NM 014586), ICK (NM 016513), IGF1 R (NM 000875), IKBKB (NM 001556), IKBKE (NM 014002), ILK (NM 004517), INSR (NM 000208), INSRR (NM 014215), IRAKI (NM 001569), IRAK2 (NM 001570), IRAK3 (NM 007199), IRAK4 (NM 016123), ITK (NM 005546), JAK1 (NM 002227), JAK2 (NM 004972), JAK3 (NM 000215), KDR (NM 002253), KIS (NM 144624), KIT (NM 000222), KSR (ΧΜ 290793), KSR2 (NM 173598), LAK (NM 025144), LATS1 (NM 004690), LATS2 (NM 014572), LCK (NM 005356), LIMK1 (NM 016735), LIMK2 (NM 005569), LMR3 (ΧΜ 055866), LMTK2 (NM 014916), LOC149420 (NM 152835), LOC51086 (NM 015978), LRRK2 (ΧΜ 058513), LTK (NM 002344), LYN (NM 002350), MAK (NM 005906), ΜΑΡ2Κ1 (NM 002755), ΜΑΡ2Κ2 (NM 030662), ΜΑΡ2Κ3 (NM .002756), ΜΑΡ2Κ4 (NM 003010), ΜΑΡ2Κ5 (NM 002757), ΜΑΡ2Κ6 (NM 002758), ΜΑΡ2Κ7 (NM 005043), ΜΑΡ3Κ1 (ΧΜ 042066), ΜΑΡ3Κ10 (NM 002446), ΜΑΡ3Κ1 1 (NM 002419), ΜΑΡ3Κ12 (NM 006301 ), ΜΑΡ3Κ13 (NM 004721 ), ΜΑΡ3Κ14 (NM 003954), ΜΑΡ3Κ2 (NM 006609), ΜΑΡ3Κ3 (NM 002401 ), ΜΑΡ3Κ4 (NM 005922), ΜΑΡ3Κ5 (NM 005923), ΜΑΡ3Κ6 (NM 004672), ΜΑΡ3Κ7 (NM 003188), ΜΑΡ3Κ8 (NM 005204), ΜΑΡ3Κ9 (NM 033141 ), ΜΑΡ4Κ1 (NM 007181 ), ΜΑΡ4Κ2 (NM 004579), ΜΑΡ4Κ3 (NM 003618), ΜΑΡ4Κ4 (NM 145686), ΜΑΡ4Κ5 (NM 006575), ΜΑΡΚ1 (NM002745), ΜΑΡΚ10 (NM 002753), ΜΑΡΚ11 (NM002751 ), ΜΑΡΚ12 (NM 002969), ΜΑΡΚ13 (NM 002754), ΜΑΡΚ14 (NM 001315), ΜΑΡΚ3 (NM 002746), ΜΑΡΚ4 (NM 002747), ΜΑΡΚ6 (NM 002748), ΜΑΡΚ7 (NM 002749), ΜΑΡΚ8 (NM 002750), ΜΑΡΚ9 (NM 002752), ΜΑΡΚΑΡΚ2 (NM 032960), ΜΑΡΚΑΡΚ3 (NM 004635), ΜΑΡΚΑΡΚ5 (NM 003668), MARK (NM 018650), MARK2 (NM 017490), MARK3 (NM 002376), MARK4 (NM 031417), MAST1 (NM 014975), MAST205 (NM 0151 12), MAST3 (ΧΜ 038150), MAST4 (ΧΜ 291 141 ), MASTL (NM 032844), MATK (NM 139355), MELK (NM 014791 ), MERTK (NM 006343), MET (NM 000245), MGC33182 (NM 145203), MGC42105 (NM 153361), MGC43306 (C9orf96), MGC8407 (NM 024046), MIDORI (NM 020778), MINK (NM 015716), ΜΚΝΚ1 (NM 003684), ΜΚΝΚ2 (NM 017572), MLCK (NM 182493), MLK4 (NM 032435), MLKL (NM 152649), MOS (NM 005372), MST1 R (NM 002447), MST4 (NM 016542), MUSK (NM 005592), MYLK (NM 053025), MYLK2 (NM 0331 18), ΜΥ03Α (NM 017433), ΜΥ03Β (NM 138995), ΝΕΚ1 (NM 012224), ΝΕΚ10 (NM 152534), ΝΕΚ11 (NM 024800), ΝΕΚ2 (NM 002497), ΝΕΚ3 (NM 002498), ΝΕΚ4 (NM 003157), ΝΕΚ5 (MGC75495), ΝΕΚ6 (NM 014397), ΝΕΚ7 (NM 133494), ΝΕΚ8 (NM 178170), ΝΕΚ9 (NM 0331 16), NLK (NM 016231 ), NPR1 (NM 000906), N- PR2 (NM 003995), NRBP (NM 013392), NRBP2 (NM 178564), NRK (NM 198465), NTRK1 (NM 002529), NTRK2 (NM 006180), NTRK3 (NM 002530), OBSCN (NM 052843), OSR1 (NM 005109), PACE-1 (NM 020423), PAK1 (NM 002576), ΡΑΚ2 (NM 002577), ΡΑΚ3 (NM 002578), ΡΑΚ4 (NM 005884), ΡΑΚ6 (NM 020168), ΡΑΚ7 (NM 020341 ), PASK (NM 015148), PCTK1 (NM006201 ), PCTK2 (NM 002595), PCTK3 (NM 21 2503), PDGFRA (NM .006206), PDGFRB (NM 002609), PDK1 (NM 002610), PDK2 (NM 00261 1 ), PDK3 (NM 005391 ), PDK4 (NM 002612), PDPK1 (NM 002613), PFTK1 (NM 012395), PHKG1 (NM 006213), PHKG2 (NM 000294), PIK3R4 (NM 014602), ΡΙΜ1 (NM 002648), ΡΙΜ2 (NM 006875), ΡΙΜ3 (NM 001001852), ΡΙΝΚ1 (NM 032409), PKE (NM 173575), PKMYT1 (NM 004203), pknbeta (NM 013355), PLK (NM 005030), PLK3 (NM 004073), PRKAA1 (NM 006251 ), PRKAA2 (NM 006252), PRKACA (NM 002730), PRKACB (NM 002731 ), PRKACG (NM 002732), PRKCA (NM 002737), PRKCB1 (NM 002738), PRKCD (NM 006254), PRKCE (NM 005400), PRKCG (NM 002739), PRKCH (NM 006255), PRKCI (NM 002740), PRKCL1 (NM 002741 ), PRKCL2 (NM 006256), PRKCM (NM 002742), PRKCN (NM 005813), PRKCQ (NM 006257), PRKCZ (NM 002744), PRKD2 (NM 016457), PRKDC (NM 006904), PRKG1 (NM 006258), PRKG2 (NM 006259), PRKR (NM 002759), PRKWNK1 (NM 018979), PRKWNK2 (NM 006648), PRKWNK3 (NM 020922), PRKWNK4 (NM 032387), PRKX (NM 005044), PRKY (NM 002760), PRPF4B (NM 003913), PSKH1 (NM 006742), PSKH2 (NM 033126), ΡΤΚ2 (NM 005607), ΡΤΚ2Β (NM 004103), ΡΤΚ6 (NM 005975), ΡΤΚ7 (NM 002821 ), ΡΤΚ9 (NM 002822), PTK9L (NM 007284), PXK (NM 017771 ), QSK (NM 025164), RAD53 (NM 007194), RAF1 (NM 002880), RAGE (NM 014226), RET (NM 020975), RHOK (NM 002929), RIOK1 (NM 031480), RIOK2 (NM 018343), RIPK1 (NM 003804), RIPK2 (NM 003821 ), RIPK3 (NM 006871 ), RIPK5 (NM 015375), RNASEL (NM 021 133), ROCK1 (NM 005406), ROCK2 (NM 004850), ROR1 (NM 005012), ROR2 (NM 004560), ROS1 (NM 002944), RPS6KA1 (NM 002953), RPS6KA2 (NM 021 135), RPS6KA3 (NM 004586), RPS6KA4 (NM 003942), RPS6KA5 (NM 004755), RPS6KA6 (NM 014496), RPS6KB1 (NM 003161 ), RPS6KB2 (NM 003952), RPS6KC1 (NM 012424), RPS6KL1 (NM 031464), RYK (NM 002958), SBK (ΧΜ 370948), SCYL1 (NM 020680), SCYL2 (NM 017988), SGK (NM 005627), SgK069 (SU SgK069), SgK085 (ΧΜ 373109), SgK1 10 (SU SgKH O), SGK2 (NM 016276), SgK223 (XM 291277), SgK269 (XM 370878), SgK424 (CGP SgK424), SgK493 (SU_SgK493), SgK494(NM 144610), SgK495 (NM 032017), SGKL (NM 013257), SK681 (NM 001001671 ), SLK (NM 014720), SMG1 (NM 015092), SNARK (NM 030952), SNF1 LK (NM 173354), SNF1 LK2 (NM 015191 ), SNK (NM 006622), SNRK (NM017719), SRC (NM 005417), SRMS (NM 080823), SRPK1 (NM 003137), SRPK2 (NM 003138), SSTK (NM 032037), STK10 (NM 005990), STK11 (NM 000455), STK16 (NM 003691 ), STK17A (NM 004760), STK17B (NM004226), STK18 (NM 014264), STK19 (NM 032454), STK22B (NM 053006), STK22C (NM 052841 ), STK22D (NM 032028), STK23 (NM 014370), STK24 (NM 003576), STK25 (NM 006374), STK3 (NM 006281 ), STK31 (NM031414), STK32B (NM 018401 ), STK33 (NM 030906), STK35 (NM 080836), STK36 (NM 015690), STK38 (NM 007271 ), STK38L (NM 015000), STK39 (NM 013233), STK4 (NM 006282), STLK5 (NM 001003787), STYK1 (NM018423), SUDD (NM 003831 ), SYK (NM 003177), TAF1 (NM 138923), TAF1 L (NM 153809), ΤΑ01 (NM 004783), TAOK1 (NM 020791 ), ΤΑΟΚ3 (NM016281 ), TBCK (NM 0331 15), ΤΒΚ1 (NM 013254), TEC (NM 003215), TEK (NM 000459), TESK1 (NM 006285), TESK2 (NM 007170), TEX14 (NM031272), TGFBR1 (NM 004612), TGFBR2 (NM 003242), TIE (NM 005424), TIF1 (NM 003852), TLK1 (NM 012290), TLK2 (NM 006852), TNIK (NM015028), ΤΝΚ1 (NM 003985), TOPK (NM 018492), TP53RK (NM 033550), TRAD (NM 007064), TRIB1 (NM 025195), TRIB2 (NM 021643), TRIB3 (NM 021 158), TRIM28 (NM 005762), TRIM33 (NM 015906), TRIO (NM 0071 18), TRPM6 (NM 017662), TRPM7 (NM 017672), TRRAP (NM 003496), TSSK4 (NM 174944), TTBK1 (NM 032538), TTBK2 (NM 173500), TTK (NM 003318), TTN (NM 003319), TXK (NM 003328), TYK2 (NM 003331 ), TYR03 (NM006293), ULK1 (NM 003565), ULK2 (NM 014683), ULK3 (NM 015518), ULK4 (NM 017886), VRK1 (NM 003384), VRK2 (NM 006296), VRK3 (NM 016440), WEE1 (NM 003390), Weel B (NM 173677), YANK1 (NM 145001 ), YES1 (NM 005433), ZAK (NM 016653), e/ou ZAP70 (NM 001079)"
6. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 5, em que componente (II) é selecionado do grupo que consiste em "toxina bacteriana, enterotoxina, exotoxina, toxina tipo I, toxina tipo II, toxina tipo III, toxina tipo IV, toxina tipo V, toxina de RTX, toxina AB, toxina A-B, toxina A/B, toxina A+B, toxina A-5B e/ou toxina AB5".
7. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 6, em que o componente (II) é selecionado do grupo que consiste em "Adenilato ciclase, toxina de Antraz, toxina de Antraz (EF)1 toxina de Antraz (LF), toxina de bo- tulina, toxina de Cólera (CT, Ctx), subunidade de toxina de Cólera B (CTB, CtxB), toxina de Difteria (DT, Dtx), toxina LT de E. coli, enterotoxina termolá- bil de E. coli (LT), subunidade B de enterotoxina termolábil de E. coli (LTB), toxina ST de E. coli, enterotoxina termoestável de E. coli (ST), toxina eritro- gênica, toxina Exfoliatina, Exotoxina A, enterotoxina de Perfringens, toxina de Coqueluche (PT, Ptx), toxina de Shiga (ST, Stx), subunidade B de toxina de Shiga (STB, StxB), toxina do tipo de Shiga, enterotoxinas de Staphylo- coccus, toxina de Tétano (TT)1 toxina de síndrome de choque tóxico (TSST-1), toxina de Vero (VT), Toxina A (TA) e Toxina B (TB) de Clostridium diffici- le, Toxina Letal (LT) e Toxina Hemorrágica (HT) de Clostridium sordellii, To- xina alfa (A) de Clostridium novyi".
8. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 7, em que o componente (I) e componente (II) estão ligados um ao outro para permitir a expressão e/ou secreção de uma proteína de fusão codificada por ambos os componentes.
9. Micro-organismo, de acordo com a reivindicação 8, em que a proteína de fusão é selecionada do grupo que consiste em" CtxB-PSA, CtxB- B-Raf V600E KD, domínio de CtxB-B-Raf V600E cinase, domínio KD de CtxB-B-Raf V600E cinase, CtxB-B-Raf, CtxB - B-Raf KD, domínio KD de CtxB B-Raf cinase, CtxB-HAI, CtxB-HAI2C".
10. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 9, em que o componente (III) a) é selecionado do grupo que con- siste em "sistema de secreção tipo I, sistema de secreção tipo II, sistema de secreção tipo III, sistema de secreção tipo IV, sistema de secreção tipo V, sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o controle do promotor específico de hly), sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o contro- le de um promotor bacteriano não-específico de hly), sinal de transporte para a proteína de camada S (Rsa A) de Caulobacter crescentus, sinal de trans- porte para a proteína de ToIC de Escherichia coli, sinais secreção de Vtgss e/ou sinais de secreção derivados de listeriolisina, p60 e/ou de ActA" e em que o componente (III) b) é selecionado do grupo que consiste em "endolisi- nas, proteína lítica de bactérias gram-positivas, proteína lítica de monocitó- genos de Listeria, PLY551 de monocitógenos de Listeria e/ou holin de mo- nocitógenos de Listeria".
11. Microorganismo de acordo com a reivindicação 10, em que o componente (III) a) é pelo menos uma seqüência de nucleotídeo que codifica para pelo menos um sistema de transporte que permite a expressão dos produtos de expressão do componente (I) e componente (II) na superfície externa do microorganismo e/ou permite a secreção dos produtos de ex- pressão de componente (I) e componente (II), em que o dito componente (III) a) é pelo menos uma seqüência de nucleotídeo codificando para o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escherichia coli (seqüências de nucle- otídeo que contêm HIyA, HIyB e HIyD sob o controle do promotor hly- específico) ou o sistema de transporte de hemolisina (sinal) de Escheriehia coli (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA1 HIyB e HIyD sob o contro- le do promotor bacteriano hly-não-específico).
12. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 11, em que de acordo com componente (III) a) os produtos de expressão do componente (I) e componente (II) é segregado.
13. Micro-organismo, de acordo com qualquer uma das reivindi- cações 1 a 12, em que componente (I) é selecionado do grupo que consiste em B-Raf V600E, domínio de cinase B-Raf V600E, B-Raf V600E KD, domínio de cina- se B-Raf V600E KD, B-Raf, domínio de cinase B-Raf, domínio de cinase B- Raf KD, antígeno específico de próstata (PSA), hemaglutinina HA1 (preferi- veImente do vírus da Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1), hemagluti- nina HA12 (preferivelmente do vírus da Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1)2004(H5N1), hemaglutinina HA12C (preferivelmente do vírus da Gripe A (A/Thailand/1 (KAN-1 )2004(H5N1)"; componente (II) é selecionado do grupo que consiste em "subu- nidade B de toxina de cólera (CTB, CtxB), subunidade B de enterotoxina de E. coli termolábil (LTB), toxina de tétano (TT)"; componente (III) a) é selecionado do grupo que consiste em "si- nal de transporte de hemolisina de HIyA de Escherichia coli junto com com- ponentes do sistema de secreção de Hly (seqüências de nucleotídeo que contêm HIyA1 HIyB e HIyD sob o controle do promotor específico de hly)"; componente (IV) é selecionado do grupo que consiste em "pro- motor endógeno do local de hly de E. coli"; em que componente (I) e componente (II) estão ligados um ao outro para permitir a expressão de uma proteína de fusão codificada por ambos com- ponentes e em que a proteína de fusão é secretada.
14. Composição farmacêutica que compreende pelo menos um micro-organismo, preferivelmente pelo menos um micro-organismo Iiofiliza- do, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 e um veículo farmaceuticamente aceitável, preferivelmente cápsulas.
15. Medicamento que compreende pelo menos um micro- organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 ou pe- lo menos uma composição farmacêutica como definido na reivindicação 14.
16. Uso de um micro-organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a produção de um medicamento para o tra- tamento e/ou profilaxia de condições de fisiológicas e/ou patofisiológicas se- lecionadas do grupo que consiste em "divisão de célula descontrolada, tu- mores malignos, tumores benignos, tumores sólidos, sarcomas, carcinomas, distúrbios hiperproliferativos, carcinóides, sarcomas de Ewing, sarcomas de Kaposi, tumores cerebrais, tumores que se originam do cérebro e/ou do sis- tema nervoso e/ou as meninges, gliomas, neuroblastomas, câncer de estô- mago, câncer de rim, carcinomas de célula de rim, câncer de próstata, carci- nomas de próstata, tumores de tecido conjuntivo, sarcomas de tecido macio, tumores de pâncreas, tumores do fígado, tumores de cabeça, tumores de pescoço, câncer esofágico, câncer da tiróide, osteossarcomas, retinoblasto- mas, timoma, câncer testicular, câncer do pulmão, carcinomas bronquiais, câncer de peito, carcinomas de mama, câncer intestinal, tumores colorretais, carcinomas de cólon, carcinomas de reto, tumores ginecológicos, tumores de ovário/tumores ovarianos, câncer uterino, câncer cervical, carcinomas de cérvix, câncer de corpo de útero, carcinomas de corpo, carcinomas endome- triais, câncer de bexiga urinário, câncer de bexiga, câncer de pele, basalio- mas, spinaliomas, melanomas, melanomas intraoculares, leucemia, leuce- mia crônica, leucemia aguda, linfomas, infecção, infecção viral ou bacteria- na, gripe, inflamação crônica, rejeição de órgão e/ou doenças autoimunes".
17. Plasmídeo ou vetor de expressão, compreendendo os com- ponentes (I) a (IV) como definidos em qualquer uma das reivindicações 1 a 13.
18. Processo para a produção de um micro-organismo, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, em que um plasmídeo ou vetor de expressão como definidos na reivindicação 17 são produzidos, e um micro-organismo é transformado com este plasmídeo ou vetor de ex- pressão.
19. Kit farmacêutico, compreendendo pelo menos um micro- organismo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, ou uma composição farmacêutica como definido na reivindicação 14 ou um me- dicamento como definido na reivindicação 15 e um tampão farmacologica- mente aceitável, preferivelmente um tampão de carbonato.
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