CN104168912A - 促进剂-dna组合疫苗 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种包含疫苗促进剂和编码用以引发抗原特异性抗体反应的抗原的DNA构建体的疫苗，其中所述疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂。相较于不含有所述疫苗促进剂的其它疫苗，DNA进入细胞得以加速。

Description

促进剂-DNA组合疫苗
序列表
本申请含有已以ASCII格式提交且据此以引用的方式整体并入的序列表。于2011年9月22日创建的所述ASCII拷贝命名为VGX0127W.txt.。
发明领域
本发明涉及一种含有疫苗促进剂和编码抗原性肽的DNA的疫苗。所述疫苗可进一步含有抗原性肽。
背景
许多疫苗依赖‘预测和产生(predict and produce)’方法。举例而言，流感疫苗是基于在流感季节期间最可能蔓延全球的病毒株的血凝素(hemagglutinin)和神经氨酸苷酶(neuraminidase)序列而产生。然而，循环病毒的变化或其糖蛋白具有重大变化的大流行性病毒株的出现将致使所述疫苗无效。此外，当前卵基流感疫苗(egg-based influenzavaccine)制造技术取决于流感病毒株在卵中复制的能力且会花费至少6个月来制造足以用于季节性疫苗接种活动的剂量。
当前疫苗的生产能力据估计低于对目前全球人口接种疫苗所需的生产能力。此外，疫苗(如DNA疫苗)已长久遭受通过基于注射器的递送对宿主细胞的转染低效的缺点。因此，与用于增加疫苗剂量产生的手段有限相关的缺点以及缺乏用于增加疫苗转染的新型技术已引起健康护理专业人员的关注。
不知如何增加DNA疫苗转染。此外，不知如何设计用于抗原呈递以使对适当免疫反应的诱导最大化的抗原性表位或疫苗。更快且简化疫苗制造技术为流感和非流感相关疫苗策略所需以成为在未来大流行的情况下的可行解决方案。因此，对用于抗原基疫苗的更好抗原选择和设计方法存在需要，所述方法可高效转染宿主靶细胞且有效对抗各种疾病。
发明概述
本文提供一种包含疫苗促进剂和编码抗原性肽的DNA的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(amiloride)(EIPA)、苯扎明(benzamil)或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。疫苗也可含有抗原性肽。DNA可为环状质粒或载体，或它可为线性表达盒(LEC)。LEC可不具有磷酸骨架。疫苗可被电穿孔至有需要的受试者中。抗原可为例如M2、LACK、HBV、HIV、肿瘤相关抗原(TAA)、神经氨酸苷酶、血凝素或其变体或其共有序列。DNA可包含启动子，如CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒(Roussarcoma virus)启动子或多角体蛋白(polyhedrin)启动子。LEC可为pcrNP或pcrM2。
本文也提供一种包括所述疫苗的疫苗接种试剂盒。所述试剂盒可进一步包括电穿孔装置。所述电穿孔装置可为微创性电穿孔装置。
本文也提供一种疫苗接种方法。所述方法可包括向有需要的受试者施用所述提供的疫苗。疫苗可通过电穿孔施用。电穿孔途径可为皮内或肌肉内途径。微创性电穿孔装置可用于将疫苗电穿孔。
附图简述
图1.阿米洛利在体外加速质粒进入。在有或无1mM阿米洛利的情况下Cy5-pEGFP进入细胞系被监测为在第3天RAW264.7(A、B、C)、JAWSII(D、E)和DC2.4(F、G)的2小时Cy5+％和EGFP+Cy5+％。添加LipofactamineTM2000(Lipo2000)作为阳性对照。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。
图2.阿米洛利在体内加速质粒进入。在有或无阿米洛利的情况下，用Cy5-pEGFP在后足垫中皮下免疫首次接受试验的C57小鼠。在4小时之后，收集淋巴结以测试Cy5+细胞的比例(B)和亚型(C)。n＝3。B中的*，在所有组之间具有统计显著性。
图3.阿米洛利加速脂筏和胞膜窖依赖性质粒进入。脂筏抑制剂MβCD或胞膜窖抑制剂菲律宾菌素(fillipin)与阿米洛利一起添加来阻断细胞系RAW264.7(A、B)、JAWSII(C、D)和DC2.4(E、F)的胞吞途径。接着添加Cy5-pEGFP以测定2小时内的进入和3天内的表达。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。
图4.阿米洛利增强APC成熟和先天性细胞因子分泌。在有或无1mM阿米洛利的情况下将10μg/ml pcD-S2添加至细胞培养物中以进行刺激。在第3天测试RAW264.7(A、B、C)、JAWSII(D、E)、DC2.4(F、G)、腹膜巨噬细胞(H、I)和脾DC(J、K)的表面成熟标记物CD40、CD80、CD83、CD86、MHC I、MHC II以及分泌至上清液中的先天性细胞因子IL-6、TNF-α、IL-1β、IFN-γ。显示的是具有类似结果的三次独立实验之一。对于腹膜巨噬细胞和脾DC，n＝3。*和**，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。
图5.阿米洛利增强针对HBV S2的适应性免疫。A，免疫常规程序。B，抗S2IgG抗体滴度。C，在用1μg sAg在后足垫中皮下再刺激24小时之后的延迟过敏(DTH)反应。添加PBS作为阴性对照。*，在所有组之间具有统计显著性。D和E，体外(D)和体内(E)HBVS208-215特异性溶解，*，在+/-阿米洛利之间具有统计显著性。F和G，体外(F)和体内(G)HBVAlb1转基因小鼠肝溶解。A-G，n＝3。
图6.阿米洛利增加IFN-γ+穿孔素+粒酶B+CD8T细胞的比例。来自pcD-S2+/-阿米洛利免疫的小鼠的脾细胞用10μg/ml S208-215体外再刺激12小时(A-C)或用10μg/ml sAg体外再刺激24小时(D)，接着进行多色细胞内染色。添加PMA和离子霉素作为阳性对照。A，CD8T细胞中的IFN-γ、穿孔素或粒酶B阳性细胞被计算为反应性细胞。B，在+/-阿米洛利之间，反应性CD8T细胞中的细胞因子表达样式。C，阿米洛利剂量对IFN-γ+穿孔素+粒酶B+细胞的比例的影响。D，响应于sAg再刺激的IFN-γ+穿孔素+粒酶B+细胞的比例。E和F，与腹膜巨噬细胞(E)或脾DC(F)共培养，接着用S208-215再刺激，且染色的CD8T细胞中的IFN-γ+穿孔素+粒酶B+。n>3。
图7.尽管是IFN-γ-/-受损的CTL，但阿米洛利仍然增加双阳性细胞和CTL。特异性溶解被计算为体外(A)和体内(B)S208-215涂布的初始脾细胞(靶细胞)对初始脾细胞(对照细胞)、或体外(C)和体内(D)Alb1肝细胞(靶细胞)对初始C57肝细胞(对照细胞)，其中WT或IFN-γ-/-小鼠用pcD-S2+/-阿米洛利免疫作为效应CTL。计算所有组之间或+/-阿米洛利之间的差异。n＝3。E，WT与IFN-γ-/-之间的反应性CD8T细胞比例。F，在S208-215再刺激之后的IFN-γ-/-小鼠细胞因子样式。G，在HBsAg再刺激之后的穿孔素+粒酶B+双阳性细胞比例。n＝3。
图8.显示编码流感核蛋白(“NP”)和M2抗原的质粒表达载体以及相应线性表达盒的图。线性表达盒pcrNP或pcrM2含有CMV启动子、用于拼接的内含子、具有终止密码子和聚腺苷酸化信号的NP或M2的全长基因。
详述
本发明者已惊人地发现基于促进剂的DNA疫苗可向有需要的受试者高效递送抗原以实现免疫刺激。可通过施用疫苗促进剂与编码抗原的DNA的组合来使受试者的免疫系统针对特定抗原而加以高效诱导。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。可含有编码抗原的环状质粒或线性核酸的DNA疫苗在高效递送至受试者中时可引发抗原特异性抗体反应，相较于基于质粒的疫苗，所述反应可维持更长时期。疫苗可进一步含有可为肽的抗原。
本文所述的疫苗可向受试者施用以提供由受试者群体良好耐受的较长久持续的抗原特异性免疫反应。本发明也涉及可自DNA表达的许多抗原。
1.定义
本文所用的术语仅是出于描述特定实施方案的目的而并不旨在限制。如在说明书和随附权利要求中所用，除非上下文另外明确规定，否则单数形式“一个(a/an)”和“所述(the)”包括复数个指示物。
a.共有或共有序列
如本文所用的“共有”或“共有序列”可指基于对特定抗原的多个亚型的比对的分析而构建的合成核酸序列或相应多肽序列。序列可用于诱导针对特定抗原的多个亚型或血清型的广泛免疫性。合成抗原，如融合蛋白，可操作为共有序列(或共有抗原)。
b.变体
如本文所用的“变体”可指因氨基酸的插入、缺失或保守性取代而在氨基酸序列方面不同，但保留至少一种生物活性的肽或多肽。“生物活性”的代表性实例包括由特异性抗体结合的能力或促进免疫反应的能力。变体也可指氨基酸序列大致上与具有某一氨基酸序列的参照蛋白相同的保留至少一种生物活性的蛋白质。氨基酸的保守性取代，即，用具有类似性质(例如，亲水性、带电区域的程度和分布)的不同氨基酸置换某一氨基酸，在本领域中被认为通常涉及微小变化。这些微小变化可部分地通过考虑如本领域中所了解的氨基酸的亲疏水性指数来鉴定。Kyte等，J.Mol.Biol.157：105-132(1982)。氨基酸的亲疏水性指数是基于对它的疏水性和电荷的考虑。本领域已知的是具有类似亲疏水性指数的氨基酸可被取代且仍然保留蛋白质功能。在一个方面，亲疏水性指数为土2的氨基酸被取代。氨基酸的亲水性也可用于揭示将产生保留生物功能的蛋白质的取代。在肽的情形下考虑氨基酸的亲水性允许计算该肽的最大局部平均亲水性，这是已报道与抗原性和免疫原性良好关联的适用度量。美国专利号4,554,101以引用的方式完全并入本文。如本领域中所了解，取代具有类似亲水性值的氨基酸可产生保留生物活性，例如免疫原性的肽。可用亲水性值在彼此的土2内的氨基酸进行取代。氨基酸的疏水性指数与亲水性值两者均受该氨基酸的特定侧链影响。与那个观察一致的是，可与生物功能相容的氨基酸取代被理解为取决于所述氨基酸的相对类似性，且特别是那些氨基酸的侧链的相对类似性，如通过疏水性、亲水性、电荷、大小及其它性质所揭示。
关于对本文数值范围的叙述，明确涵盖在其之间的具有相同精度的各插入数值。举例而言，对于范围6-9，除6和9之外也涵盖数值7和8，且对于范围6.0-7.0，明确涵盖数值6.0、6.1、6.2、6.3、6.4、6.5、6.6、6.7、6.8、6.9和7.0。
2.疫苗
本文提供包含疫苗促进剂和编码抗原的DNA的疫苗。优选地，疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。靶细胞由DNA高效转导，借此疫苗诱导抗原特异性免疫反应。疫苗可进一步包含呈肽形式的抗原。
a.钠(Na)/钾(K)泵抑制剂-
本文提供一种在体外和在体内促进DNA进入细胞中的化合物。该化合物可为钠(Na)/钾(K)泵抑制剂。Na/K泵抑制剂化合物可为3，4二氯苯扎明盐酸盐、3，4，5，6-四羟基氧杂蒽酮(3，4，5,6-tetrahydroxxanthone)、巴伐洛霉素(bafilomycin)、布美他尼(bumetanide)、刀豆素A(concanamycin A)、二氢乌本箭毒苷(dihydroouabain)、埃索美拉唑(esomeprazole)、呋塞米(furosemide)、兰素拉唑(lansoprazole)、奥美拉唑(omeprazole)、乌本箭毒苷八水合物(ouabain octahydrate)、泮托拉唑钠(pantoprazole sodium)、盐酸丙胺卡因(prilocaine hydrochloride)、氯化血根碱(sanguinarine chloride)、甜菊苷水合物(stevioside hydrate)、托塞米(torsemide)、5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利。优选地，疫苗促进剂是5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利，且更优选是阿米洛利。化合物可为阿米洛利，其常用于管理高血压和充血性心脏衰竭。阿米洛利具有以下结构：
钠/钾泵调控细胞中的钾和钠离子的浓度。钠-钾泵使这两种离子以相反方向跨越质膜移动。这个机制是通过观察放射性标记离子跨越某些细胞的质膜的通道来研究。数据表明相同载体转运两种离子。所述载体是ATP酶，对于每两个泵送至细胞中的钾离子，所述酶将三个钠离子泵送至细胞外。在使用Na/K泵抑制剂下，DNA由细胞更高效摄取。
阿米洛利具有适用于用DNA抗原转染细胞的若干功能性衍生物。功能性衍生物可通过修饰嘧啶环(在3位处)或三胺上的氨基部分来形成。阿米洛利的功能性衍生物可为苯扎明或5-(N-乙基-N-异丙基)阿米洛利(EIPA)。
阿米洛利可以能够促进DNA摄取至细胞中的量存在。由细胞摄取DNA的适合有效增加包括相较于无任何阿米洛利的相同疫苗组合物，增加5％以上、优选增加25％以上、且特别是增加50％以上。
抗原可影响哺乳动物，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、母牛、小鼠或大鼠。抗原可以来自哺乳动物的蛋白质形式被含有，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、母牛、猪、绵羊、小鼠或大鼠。
b.抗原
本文提供一种抗原，其可由任何DNA和/或RNA序列编码。抗原可为引起免疫反应的肽或蛋白质。抗原可触发由免疫系统产生抗体。抗体可接着杀伤或中和被识别为外来且潜在有害侵入物的抗原。抗原可为可由主要组织相容性复合体(MHC)结合且呈递至T细胞受体的任何分子或分子片段。抗原可为免疫原，其可为如果独立注射，那么能够激起适应性免疫反应的分子。
抗原可与流感、人乳头状瘤病毒、丙型肝炎病毒、内脏利什曼病(visceral leishmaniasis)、心肌炎、类风湿性关节炎、甲状腺炎或重症肌无力相关。抗原可为例如人端粒酶逆转录酶抗原(hTERT)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)、前列腺干细胞抗原(PSCA)、口蹄疫抗原、M2、LACK、HBV、神经氨酸苷酶、血凝素或其共有序列、其片段或其变体。
抗原可影响哺乳动物，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、母牛、小鼠或大鼠。抗原可以来自哺乳动物的蛋白质形式被含有，所述哺乳动物可为人、黑猩猩、狗、猫、马、母牛、猪、绵羊、小鼠或大鼠。
本文也提供一种编码抗原的DNA。DNA可包括编码抗原的编码序列。DNA也可包括编码通过肽键连接于抗原的接头或标签序列的其它序列。
(a)流感
本文提供能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型的免疫反应的抗原。抗原可能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型，包括针对一种或多种大流行性病毒株，如209H1N1猪源性流感的免疫反应。抗原可能够在哺乳动物中引发针对一种或多种流感血清型，包括针对猪源性人流感的一种或多种病毒株的免疫反应。抗原可包含使它特别有效作为可诱导抗流感免疫反应所针对的免疫原的表位。
抗原可为由流感病毒编码的肽或其变体或片段或共有序列。抗原可为重组抗原。抗原可为M2、神经氨酸苷酶、血凝素或其变体或共有序列或片段。神经氨酸苷酶抗原可为NP147，其具有氨基酸序列：TYQRTRALV(SEQ ID NO：1)。神经氨酸苷酶抗原可为PR/8IIMR-274)，其为一种重组序列且可自Imgenex(San Diego，CA，USA)购买。M2抗原可为M2e，其具有氨基酸序列：SLLTEVETPIRNEWGCRCNDSSD(SEQ ID NO：2)。流感抗原可来自下表。
SEQ ID NO：3-36的任一者都可包含IgE前导序列：Met Asp TrpThr Trp Ile Leu Phe Leu Val Ala Ala Ala Thr Arg Val His Ser(SEQ IDNO：37)。
(b)人乳头状瘤病毒(HPV)
抗原可由人乳头状瘤病毒(HPV)序列编码。核酸和/或肽/蛋白质序列可为孤立序列或共有序列。HPV抗原性序列可来自下表。
抗原性HPV序列 SEQ ID NO
HPV基因型16E6-E7DNA序列 38
HPV基因型16E6-E7蛋白质序列 39
HPV E6免疫显性表位蛋白质序列 40
HPV E7免疫显性表位蛋白质序列 41
HPV E6共有蛋白质序列 42
HPV E7共有蛋白质序列 43
(c)丙型肝炎病毒
抗原可由丙型肝炎病毒(HCV)序列编码。核酸和/或肽/蛋白质序列可为孤立序列或共有序列。HCV抗原性序列可来自下表。
抗原性HCV序列 SEQ ID NO.
HCV基因型1a和1b共有E1-E2DNA序列 44
HCV基因型1a和1b共有E1-E2蛋白质序列 45
HCV E1共有蛋白质序列 46
HCV E2共有蛋白质序列 47
(d)其它抗原
抗原也可为如美国专利申请公布号20100143401中公开的抗原，所述公布的内容以引用的方式并入本文。其它抗原可包括LACK抗原(活化C激酶的受体的利什曼原虫(Leishmania)类似物)(36kDa)，其在利什曼原虫物种间高度保守且由寄生虫的前鞭毛体形式与无鞭毛体形式两者表达。其它抗原可包括人端粒酶逆转录酶抗原(hTERT)、前列腺特异性抗原(PSA)、前列腺特异性膜抗原(PSMA)、前列腺的六跨膜上皮抗原(STEAP)、前列腺干细胞抗原(PSCA)和/或口蹄疫抗原。
抗原性序列 SEQ ID NO.
hTERT核酸 48
hTERT氨基酸序列 49
PSA抗原1核酸 50
PSA抗原1氨基酸序列 51
PSA抗原2核酸 52
PSA抗原2氨基酸 53
PSMA抗原1核酸序列 54
PSMA抗原1氨基酸序列 55
PSMA抗原2DNA序列 56
PSMA抗原2氨基酸序列 57
STEAP抗原1DNA序列 58
STEAP抗原1氨基酸序列 59
STEAP抗原2DNA序列 60
STEAP抗原2氨基酸序列 61
PSCA抗原DNA序列 62
PSCA抗原氨基酸序列 63
A亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 64
A亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 65
亚洲1亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 66
亚洲1亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 67
C亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 68
C亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 69
O亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 70
O亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 71
SAT1亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 72
SAT1亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 73
SAT2亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 74
SAT2亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 75
SAT3亚型共有VP1-VP4和共有C3DNA序列 76
SAT3亚型共有VP1-VP4和共有C3氨基酸序列 77
共有C3DNA序列 78
共有C3氨基酸序列 79
A亚型共有VP1-VP4DNA序列 80
A亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 81
亚洲1亚型共有VP1-VP4DNA序列 82
亚洲1亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 83
C亚型共有VP1-VP4DNA序列 84
C亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 85
O亚型共有VP1-VP4DNA序列 86
O亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 87
SAT1亚型共有VP1-VP4DNA序列 88
SAT1亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 89
SAT2亚型共有VP1-VP4DNA序列 90
SAT2亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 91
SAT3亚型共有VP1-VP4DNA序列 92
SAT3亚型共有VP1-VP4氨基酸序列 93
亚洲亚型VP1DNA序列 94
亚洲亚型VP1氨基酸序列 95
O亚型VP1DNA序列 96
O亚型VP1氨基酸序列 97
A亚型VP1DNA序列 98
A亚型VP1氨基酸序列 99
C亚型VP1DNA序列 100
C亚型VP1氨基酸序列 101
A亚型VP1+C亚型VP1DNA序列 102
A亚型VP1+C亚型VP1氨基酸序列 103
A亚型VP1+O亚型VP1DNA序列 104
A亚型VP1+O亚型VP1氨基酸序列 105
(e)II类MHC结合亲和力
抗原可对II类MHC(MHC-II)具有高亲和力。抗原的MHC-II亲和力可为IC50小于或等于50nM。亲和力也可为IC50小于或等于100、95、90、85、80、75、70、65、60、55、50、45、40、35、30、25、20、15、10、9、8、7、6、4、3、2、1、0.9、0.8、0.7、0.6、0.5、0.4、0.3、0.2或0.1nM。
可使用计算机算法预测抗原对MCH-II的亲和力。算法可为MHCPred，如由Guan P，Doytchinova IA，Zygouri C，Flower DR，MHCPred：bringing a quanntative dimension to the online prediction ofMHC binding，Appl Bioinformatics.20032：63-66；Guan P，DoytchinovaIA，Zygouri C，Flower DR，MHCPred：A server for quantitativeprediction of peptide-MHC binding，Nucleic Acids Res.200331：3621-3624；和Hattotuwagama CK，Guan P，Doytchinova IA，ZygouriC，Flower DR，Quantitative online prediction of peptide binding to themajor histocompatibility complex，J Mol Graph Model.200422：195-207所述，所述参考文献的内容以引用的方式并入本文。算法也可为NN-比对或SMM-比对，如由Nielsen M和Lund O，NN-align，A neuralnetwork-based alignment algorithm for MHC class II peptide bindingprediction，BMC Bioinformatics.2009；10：296；和Nielsen M，Lundegaard C，Lund O，Prediction of MHC class II binding affinity usingSMM-align，a novel stabilization matrix alignment method，BMCBioinformatics.2007；8：238所述，所述参考文献的内容以引用的方式并入本文。
c.载体
本文进一步提供一种可包括DNA的载体。载体可能够表达抗原。载体可为表达构建体，其通常是用于将特定基因引入靶细胞中的质粒。一旦表达载体处于细胞内部，由基因编码的蛋白质即通过细胞转录和翻译机构核糖体复合体来产生。质粒常被工程化来含有充当增强子和启动子区域且导致表达载体上携带的基因高效转录的调控序列。本发明的载体表达大量稳定信使RNA且因此蛋白质。
载体可具有表达信号，如强启动子、强终止密码子、启动子与克隆基因之间的距离的调整、以及转录终止序列和PTIS(便携式翻译起始序列)的插入。
(1)表达载体
载体可为环状质粒或线性核酸。环状质粒和线性核酸能够指导特定核苷酸序列在适当主题细胞中的表达。载体可具有可操作地连接于抗原编码核苷酸序列的启动子，所述抗原编码核苷酸序列可可操作地连接于终止信号。载体也可含有为适当翻译核苷酸序列所需的序列。包含目标核苷酸序列的载体可为嵌合的，这指的是它的至少一种组分相对于它的至少一种其它组分是异源的。表达盒中的核苷酸序列的表达可受控于组成型启动子或仅在宿主细胞暴露于某一特定外部刺激时起始转录的诱导型启动子。在多细胞生物体的情况下，启动子也可为特定组织或器官或发育阶段特异性的。
(2)环状或线性载体
载体可为环状质粒，其可通过整合至细胞基因组中来转化靶细胞或存在于染色体外(例如具有复制起点的自主复制质粒)。
载体可为pVAX、pcDNA3.0或provax或能够表达DNA且使得细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。载体可与抗原以5：1与1：5之间或1：1与2：1之间的质量比组合。
本文也提供一种能够通过电穿孔高效递送至受试者中且表达一种或多种所需抗原的线性核酸疫苗或线性表达盒(“LEC”)。LEC可为无任何磷酸骨架的任何线性DNA。DNA可编码一种或多种抗原。LEC可含有启动子、内含子、终止密码子、聚腺苷酸化信号。抗原的表达可受启动子控制。LEC可不含有任何抗生素抗性基因和/或磷酸骨架。LEC可不合有与所需抗原基因表达无关的其它核酸序列。
LEC可源于能够线性化的任何质粒。质粒可能够表达抗原。质粒可为pNP(波多黎哥/34)或pM2(新喀里多尼亚/99)。参见图8。质粒可为pVAX、pcDNA3.0或provax或能够表达DNA且使得细胞能够将序列翻译成由免疫系统识别的抗原的任何其它表达载体。
LEC可为pcrM2。LEC可为pcrNP。pcrNP和pcrMR可分别源于pNP(波多黎哥/34)和pM2(新喀里多尼亚/99)。LEC可与抗原以5：1与1：5之间或1：1至2：1之间的质量比组合。
(3)启动子、内含子、终止密码子和聚腺苷酸化信号
载体可具有启动子。启动子可为能够驱动基因表达和调控分离的核酸的表达的任何启动子。所述启动子是为通过DNA依赖性RNA聚合酶进行转录所需的顺式作用序列元件，所述RNA聚合酶转录本文所述的抗原序列。对用于指导异源核酸的表达的启动子的选择取决于特定应用。启动子可如同其在其天然环境中距转录起始位点的距离一般，在载体中位于距转录起始位点大致相同的距离。然而，可接纳这个距离的变化形式而不损失启动子功能。
启动子可可操作地连接于编码抗原的核酸序列以及为转录物的聚腺苷酸化所需的信号、核糖体结合位点和翻译终止位点。启动子可为CMV启动子、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子、多角体蛋白启动子或对于在真核细胞中的表达显示有效的另一启动子。
载体可包括增强子和具有功能性拼接供体和接受位点的内含子。载体可在结构基因下游含有转录终止区域以提供高效终止。终止区域可获自与启动子序列相同的基因或可获自不同基因。
d.疫苗的赋形剂和其它组分
疫苗可进一步包含其它组分，如转染促进剂、药学上可接受的赋形剂、佐剂。药学上可接受的赋形剂可为作为媒介物、佐剂、载体或稀释剂的功能分子。药学上可接受的赋形剂可为转染促进剂，其可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏(Freunds)不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁肽、醌类似物、囊泡(如角鲨烯(squalene)和角鲨烯(squalene))、透明质酸、脂质、脂质体、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知转染促进剂。
转染促进剂可为聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染促进剂可为聚-L-谷氨酸。聚-L-谷氨酸可以小于6mg/ml的浓度存在于疫苗中。转染促进剂也可包括表面活性剂，如免疫刺激复合物(ISCOMS)、弗氏不完全佐剂、LPS类似物(包括单磷酰基脂质A)、胞壁肽、醌类似物和囊泡(如角鲨烯和角鲨烯)，且透明质酸也可用于连同基因构建体一起施用。在一些实施方案中，DNA质粒疫苗也可包括转染促进剂，如脂质、脂质体(包括卵磷脂脂质体或本领域中已知的其它脂质体，如DNA-脂质体混合物(参见例如W09324640))、钙离子、病毒蛋白质、聚阴离子、聚阳离子或纳米粒子或其它已知转染促进剂。转染促进剂是聚阴离子、聚阳离子(包括聚-L-谷氨酸(LGS))或脂质。转染剂在疫苗中的浓度小于4mg/ml、小于2mg/ml、小于1mg/ml、小于0.750mg/ml、小于0.500mg/ml、小于0.250mg/ml、小于0.100mg/ml、小于0.050mg/ml或小于0.010mg/ml。
药学上可接受的赋形剂可为佐剂。佐剂可为在替代性质粒中表达或作为蛋白质与在疫苗中的以上质粒组合而被递送的其它基因。佐剂可选自由以下组成的组：α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、皮肤T细胞吸引趋化因子(CTACK)、上皮胸腺表达的趋化因子(TECK)、粘膜相关上皮趋化因子(MEC)、IL-12、IL-15、MHC、CD80、CD86(包括缺失信号序列且任选包括来自IgE的信号肽的IL-15)。佐剂可为IL-12、IL-15、IL-28、CTACK、TECK、血小板源性生长因子(PDGF)、TNFα、TNFβ、GM-CSF、表皮生长因子(EGF)、IL-1、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-10、IL-12、IL-18或其组合。
可为适用佐剂的其它基因包括编码以下的那些基因：MCP-1、MIP-1a、MIP-1p、IL-8、RANTES、L-选择素(L-selectin)、P-选择素、E-选择素、CD34、GlyCAM-1、MadCAM-1、LFA-1、VLA-1、Mac-1、p150.95、PECAM、ICAM-1、ICAM-2、ICAM-3、CD2、LFA-3、M-CSF、G-CSF、IL-4、IL-18的突变形式、CD40、CD40L、血管生长因子、成纤维细胞生长因子、IL-7、神经生长因子、血管内皮生长因子、Fas、TNF受体、Flt、Apo-1、p55、WSL-1、DR3、TRAMP、Apo-3、AIR、LARD、NGRF、DR4、DR5、KILLER、TRAIL-R2、TRICK2、DR6、半胱天冬酶(Caspase)ICE、Fos、c-jun、Sp-1、Ap-1、Ap-2、p38、p65Re1、MyD88、IRAK、TRAF6、IkB、不活化NIK、SAP K、SAP-1、JNK、干扰素反应基因、NFkB、Bax、TRAIL、TRAILrec、TRAILrecDRC5、TRAIL-R3、TRAIL-R4、RANK、RANK配体、Ox40、Ox40配体、NKG2D、MICA、MICB、NKG2A、NKG2B、NKG2C、NKG2E、NKG2F、TAP1、TAP2及其功能片段。
疫苗可进一步包含如1994年4月1日提交的美国序列号021，579中所述的基因疫苗促进剂，所述专利以引用的方式完全并入。
可根据待用施用模式配制疫苗。可注射疫苗药物组合物可为无菌、无热原和无颗粒的。可使用等张制剂或溶液。用于实现等张性的添加剂可包括氯化钠、右旋糖、甘露糖醇、山梨糖醇和乳糖。疫苗可包含血管收缩剂。等张溶液可包括磷酸盐缓冲盐水。疫苗可进一步包含稳定剂，包括明胶和白蛋白。稳定剂可使制剂在室温或环境温度下稳定延长的时期，所述稳定剂包括LGS或聚阳离子或聚阴离子。疫苗接种方法
本文提供一种对受试者接种疫苗的方法。所述方法使用电穿孔作为递送疫苗的机制。电穿孔可通过微创性装置来进行。
e.微创性电穿孔装置
微创性电穿孔装置(“MID”)可为用于将上述疫苗和相关流体注射至身体组织中的设备。装置可包括中空针、DNA盒和流体递送部件，其中所述装置适合于在使用中启动流体递送部件以在针插入所述身体组织中的过程中同时(优选自动)将DNA注射至身体组织中。这具有以下优势：能够在插入针时逐渐注射DNA和相关流体导致流体遍及身体组织更均匀的分布。由于所注射的DNA在较大面积分布，因而在注射过程中经受的疼痛可减轻。
MID可在不使用针的情况下将疫苗注射至组织中。MID可以使疫苗穿透组织表面且进入下层组织和/或肌肉中的力以小液流或射流形式注射疫苗。在小液流或射流背后的力可通过使压缩气体(如二氧化碳)在一秒钟的若干分之几内穿过微孔进行膨胀来提供。微创性电穿孔装置及其使用方法的实例描述于公布的美国专利申请号20080234655；美国专利号6,520,950；美国专利号7，171,264；美国专利号6,208,893；美国专利号6,009,347；美国专利号6，120,493；美国专利号7,245,963；美国专利号7,328,064；和美国专利号6,763,264中，所述专利各自的内容以引用的方式并入本文。
MID可包括产生无痛穿透组织的高速液体射流的注射器。所述无针注射器可商购获得。可在本文中利用的无针注射器的实例包括美国专利号3,805,783；4,447,223；5,505,697；和4,342,310中所述的那些，所述专利中每个的内容以引用的方式并入本文。
可通常通过使组织表面与注射器接触以便以足以导致疫苗穿透至组织中的力启动药剂射流的递送来使用无针注射器将呈适于直接或间接电转运的形式的所需疫苗引入(例如，注射)待处理组织中。举例而言，如果待处理组织是粘膜、皮肤或肌肉，那么以足以导致药剂穿透角质层且进入真皮层中或分别进入下层组织和肌肉中的力来向粘膜或皮肤表面投射药剂。
无针注射器充分适合于向所有类型的组织，特别是向皮肤和粘膜递送疫苗。在一些实施方案中，无针注射器可用于向表面且向受试者的皮肤或粘膜中推进含有疫苗的液体。可使用本发明方法处理的各种类型的组织的代表性实例包括胰腺、喉、鼻咽、下咽、口咽、唇、喉咙、肺、心脏、肾、肌肉、乳房、结肠、前列腺、胸腺、睾丸、皮肤、粘膜组织、卵巢、血管或其任何组合。
MID可具有对组织电穿孔的针电极。通过在多电极阵列中的多对电极之间产生脉冲，优选呈矩形或正方形样式的设置提供比在一对电极之间产生脉冲的结果改进的结果。例如于题为“Needle Electrodesfor Mediated Delivery of Drugs and Genes”的美国专利号5,702,359中公开针阵列，其中可在治疗性处理过程中对多对针产生脉冲。在仿佛完全阐述一般以引用的方式并入本文的那个申请中，针以环状阵列安置，但具有使得能够在相对针电极对之间产生脉中的连接器和转换设备。可使用一对用于向细胞递送重组表达载体的针电极。所述装置和系统描述于美国专利号6,763,264中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。或者，可使用单个针装置，其允许用类似于正常注射针的单个针注射DNA和电穿孔且施加电压低于由目前使用的装置递送的脉冲电压的脉冲，由此减轻由患者经受的电感觉。
MID可包括一个或多个电极阵列。阵列可包括直径相同或不同的两个或更多个针。针可均匀或不均匀间隔分开。各针可在0.005英寸与0.03英寸之间、在0.01英寸与0.025英寸之间；或在0.015英寸与0.020英寸之间。针的直径可为0.0175英寸。各针可间隔分开0.5mm、1.0mm、1.5mm、2.0mm、2.5mm、3.0mm、3.5mm、4.0mm或4.0mm以上。
MID可由脉中产生器和两个或更多个在单一步骤中递送疫苗和电穿孔脉冲的针疫苗注射器组成。脉冲产生器可允许通过闪存卡操作的个人计算机灵活编程脉冲和注射参数，以及全面记录和储存电穿孔和患者数据。脉冲产生器可在短时期期间递送多种电压脉中。举例而言，脉冲产生器可在持续时间内递送3个100ms的15伏脉中。所述MID的实例是Inovio Biomedical Corporation的Elgen1000系统，其描述于美国专利号7,328,064中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
MID可为CELLECTRA(Inovio Pharmaceuticals，Blue Bell PA)装置和系统，其为促进将大分子(如DNA)引入身体或植物中的所选组织的细胞中的模块化电极系统。模块化电极系统可包括多个针电极；皮下注射针；提供自可编程恒定电流脉冲控制器至多个针电极的导电连接的电连接器；和电源。操作者可抓住固定在支撑结构上的多个针电极并将它们坚固地插入身体或植物中的所选组织中。接着通过皮下注射针将大分子递送至所选组织中。启动可编程恒定电流脉冲控制器，且将恒定电流电脉冲施加至多个针电极。施加的恒定电流电脉冲促进将大分子引入多个电极之间的细胞中。通过借助于恒定电流脉冲来限制组织中的功率耗散，归因于细胞过热的细胞死亡得以最小化。Cellectra装置和系统描述于美国专利号7,245,963中，所述专利的内容以引用的方式并入本文。
(1)Elgen1000系统
MID可为Elgen1000系统(Inovio Pharmaceuticals)。Elgen1000系统可包括提供中空针；和流体递送部件的装置，其中设备适合于在使用中启动流体递送部件以便在针插入所述身体组织中的过程中同时(优选自动)将流体，优选本文所述的疫苗注射至身体组织中。优势在于能够在插入针时逐渐注射流体导致流体遍及身体组织更均匀的分布。也据信由于所注射的流体体积在较大面积分布，因而在注射过程中经受的疼痛会减轻。
此外，自动注射流体有助于自动监测和记录注射的流体的实际剂量。必要时，可出于文件编制目的由控制单元储存这个数据。
应了解注射速率可为线性或非线性的且注射可在针已穿过待治疗受试者的皮肤插入之后以及当它们进一步插入身体组织中时进行。
可通过本发明的设备将流体注射至其中的适合组织包括肿瘤组织、皮肤或肝组织，但将优选为肌肉组织。
优选地，设备进一步包括用于指导将针插入身体组织中的针插入部件。流体注射速率由针插入速率控制。这具有以下优势：针插入与注射流体两者均可控制以使得插入速率可与如所需的注射速率匹配。此也使得设备更易于为使用者所操作。必要时，可提供用于自动将针插入身体组织中的部件。
使用者可选择何时开始注射流体。然而，理想的是，在针尖已到达肌肉组织时开始注射，且设备优选包括用于感测针已插入至足以开始注射流体的深度时的部件。这意味当针已到达所需深度(其将通常是肌肉组织开始的深度)时，可提示自动开始注射流体。肌肉组织开始的深度可例如被看作是预设置针插入深度，如将被视为针足以穿过皮肤层的值4mm。
感测部件可包括超声探针。感测部件可包括用于感测阻抗或电阻变化的部件。在这个情况下，部件可能不同样记录针在身体组织中的深度，而是将适合于感测当针自不同类型的身体组织向肌肉中移动时的阻抗或电阻变化。这些替代方案的任一者提供相对准确且操作简单的感测可开始注射的部件。必要时，可进一步记录针的插入深度且可用于控制流体的注射以使当记录针插入深度时确定待注射的流体体积。
设备可进一步包括：用于支撑针的底座；和用于在其中容纳所述底座的外壳，其中所述底座可相对于所述外壳移动以使当所述底座相对于所述外壳呈第一向后位置时针缩回在所述外壳内，且当所述底座在所述外壳内呈第二向前位置时针伸出所述外壳。这对于使用者有利，因为外壳可在患者皮肤上对齐，且可接着通过相对于底座移动外壳来将针插入患者的皮肤中。
如上所述，合乎需要的是实现受控制的流体注射速率，以使当针插入皮肤中时，流体在针的长度均匀分布。因此，优选地，流体递送部件包括适合于以控制速率注射流体的活塞驱动部件。活塞驱动部件可例如由伺服电机启动。然而，优选地，通过相对于外壳在轴向上移动的底座来启动活塞驱动部件。应了解可提供用于流体递送的替代性部件。因此，举例而言，可代替注射器和活塞系统提供可被挤压以在控制或非控制速率下递送流体的密闭容器。
上述设备可用于任何类型的注射。然而，设想所述设备特别适用于电穿孔领域中且因此它优选进一步包括用于对针施加电压的部件。这使针不仅用于注射而且也在电穿孔过程中用作电极。这特别有利，因为这意味向与注射流体相同的区域施加电场。电穿孔在传统上存在的问题在于很难使电极与先前注射的流体准确对准，且因此使用者已倾向于在较大区域注射体积大于所需的流体且在较大区域施加电场以试图保证注射物质与电场之间重叠。使用本发明，注射的流体体积与施加的电场大小两者均可降低，同时实现电场与流体之间的良好切合。
3.试剂盒
本文提供一种试剂盒，其可用于对受试者接种疫苗。试剂盒可包括疫苗和MID。所述试剂盒可任选地进一步包括抗原性肽。所述试剂盒可进一步包括用于使用所述试剂盒以及进行分析、监测或治疗的说明书。
试剂盒也可包括一个或多个容器，如小瓶或瓶，其中各容器含有单独试剂。试剂盒可进一步包括书面说明书，其可描述如何进行或解释本文所述的分析、监测、治疗或方法。
本发明具有由以下非限制性实施例说明的多个方面。
实施例
实施例1
材料和方法
以下是对用于以下鉴定的实施例2-6中的材料和方法的描述。
关于动物、细胞系和试剂，成年雌性C57BL/6小鼠(8-10周龄)来自北京维通利华实验动物技术有限公司(Beijing Vital LaboratoryAnimal Technology Company,Ltd.)(北京，中国)且在SPF条件下饲养。HBV sAg转基因小鼠Alb1-HBV和IFN-γ-/-小鼠(B6.129S7-Ifngtml Ts/J)购自Jackson实验室(Jax，USA)。所有动物实验都由中国农业大学的实验动物委员会(Committee of ExperimentAnimals of China Agricultural University)核准。RAW264.7、JAWSII和DC2.4购自ATCC(VA，USA)。LipofactamineTM2000购自Invitrogen(CA，USA)。HBV sAg购自华北制药集团有限责任公司(NCPC Ltd.)(河北，中国)。S208-215肽由科肽有限公司(ScipeptideLtd.)(上海，中国)合成。在实验室中克隆pcD-S2且保藏[46]。用于DC成熟(抗CD40-PE、抗CD80-PE、抗CD83-PE、抗CD86-PE、抗MHC I-PE、抗MHC II-PE)、细胞子组鉴定(抗CD11c-FITC、抗CD11b-FITC、抗B220-PE、抗CD3-FITC)和多色流式细胞术(抗CD3-APC-Cy7、抗CD8-FITC、抗IFN-γ-PerCP-Cy5.5、抗穿孔素-PE和抗粒酶B-PE-Cy7)的所有抗体都购自eBioscience(CA，USA)。用于IL-6、TNF、IL-1β和IFN-γ的Flexset试剂盒购自BD Biosciences(USA)。
关于细胞培养和抑制剂处理，在DMEM/10％FCS中培养RAW264.7和DC2.4，且在含GMCSF(1000U/ml，Peprotech，USA)的DMEM/10％FCS中培养JAWSII。将阿米洛利(Sigma-Aldrich，USA)制备成10mM溶液且在处理之前于DMEM培养基中稀释至1mM、100uM、10uM。在移除培养基之后，在37℃下用阿米洛利、MβCD(5mM，Sigma)或菲律宾菌素(Fillipin)(10μg/ml，sigma)处理细胞1小时。在37℃下添加含LPS(10ng/ml，sigma)或10μg/ml DNA的DMEM，持续0.5小时，在洗涤之后，添加培养基且培养细胞。
在10ml PBS洗涤下自腹膜腔制备腹膜巨噬细胞，通常具有约50-70％F4/80纯度。自板粘着细胞制备脾树突细胞且用Miltenyi DC纯化试剂盒(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany)纯化。处理细胞且培养3天以实现先天性反应。
关于质粒制备和荧光缀合，自DH5α培养物制备pEGFP(Clontech，USA)和pcD-S2质粒，通过EndoFree质粒大量试剂盒(Qiagen，Germany)纯化且根据LAL测试，内毒素低于10EU/mg。如手册指示，用Mirus Label IT试剂盒(Mirus，USA)使Cy5缀合于质粒。
关于DNA免疫，在+/-阿米洛利的情况下下，将含20μgCy5-pEGFP的PBS注射至C57/B64、鼠右后足垫中。4小时后，收集两种腹股沟淋巴结。在+/-阿米洛利的情况下，每两周持续4次将含20ug pcD-S2的PBS注射至后足垫中。
关于体外和体内CTL，如所报道[47]进行体外CTL。简而言之，用试剂盒(Miltenyi Biotec，Gladbach，Germany)将来自免疫的小鼠脾细胞的CD8T细胞纯化为效应细胞。用10-6M HBsAg CTL肽S208-215[48]脉冲刺激来自首次接受试验的C57BL/6小鼠的脾细胞且用30μMCFSE标记作为靶细胞。未进行肽脉冲刺激的相同首次接受试验的脾细胞用10μM CFSE标记作为对照。以比率10：l、1：1和1：10混合效应细胞和靶细胞。在培养3天之后，通过FACSCalibur(BD Biosciences，USA)分析靶细胞溶解。特异性溶解计算为(1-靶细胞/对照细胞)×100％。
如先前所述[46]，用来自首次接受试验的C57BL/6小鼠的具有S208-215且用30μM CFSE标记的作为靶细胞的脾细胞进行体内CTL测定。无肽的相同脾细胞用10μM CFSE标记作为对照。靶细胞和对照细胞以1：1比率混合且以每只小鼠2×107个总细胞静脉内注射至免疫的小鼠中。12小时后，收集且分析注射的小鼠的脾细胞。
对于Alb1-HBV小鼠，收集肝且制备单细胞混悬液。在作为靶细胞的CFSE标记细胞与对照细胞1：1混合之后，将Alb1-HBV肝细胞与纯化CD8效应T细胞一起共培养，或静脉内转移至免疫的小鼠中。
关于多色流式细胞术，用抗CD3、抗CD8、抗IFN-γ、抗穿孔素和抗粒酶B设置多色组。在用sAg体外再刺激24小时或用S208-215体外再刺激12小时，随后用莫能菌素(monensin)阻断6小时之后，固定、穿透且染色脾细胞。用BD Aria收集数据且用Flowjo(Tree Star，Ashland，USA)分析。
关于共培养，将在有或无100μM阿米洛利的情况下，用pcD-S2(10μg/ml)处理的APC、腹膜巨噬细胞或脾树突细胞培养2天。在第3天，以APC：T比率1：5、1：2、1：1将纯化的CD8T细胞(R&Dsystems，USA)添加至培养物中。在第8天，收集细胞且用S208-215(10μg/ml)再刺激。添加PMA+离子霉素(Ionomycin)作为再刺激的阳性对照。
使用单侧学生t检验(图3、4E、4G、5D-F、6A-D、6G)、针对2组以上的单因素ANOVA(图1、2B、4C、5C、6A-D、6E、补充图1)或双因素ANOVA(图4D、4F)分析数据。对于*，在p<0.05下，且对于**，在p<0.01下，差异被视为统计显著。
实例2
阿米洛利加速DNA进入抗原呈递细胞
初始在胞吞抑制测定过程中观察到阿米洛利增强DNA进入JAWSII DC细胞系中(数据未显示)。这个现象关于巨噬细胞细胞系(RAW264.7)和树突细胞系(JAWSII和DC2.4)得以再现。这些细胞系用1mM阿米洛利预处理1小时，而后，Cy5标记的pEGFP质粒在2小时内被显著摄取且相较于未处理细胞，在培养3天之后，表达显著较高水平的GFP。这个高表达水平与脂质体处理的细胞的表达水平类似。参见图1。
为探究阿米洛利是否将克服体内低转染效率，在有或无阿米洛利的情况下将Cy5标记的pEFGP质粒注射至C57B/6小鼠的后足垫中。在4小时之后，收集引流淋巴结且通过FACS分析来分析Cy5+细胞。参见图2A。也收集来自未注射侧的腹股沟淋巴结作为阴性对照。数据显示淋巴结(LN)中的Cy5-质粒+细胞的百分比在10μM下增加且在100μM下达到峰值，但在1mM下降低。参见图2B。大多数Cy5+细胞呈CD11c+和CD11b+，表明是树突细胞和巨噬细胞。其它约10％是B220+，其为一种B细胞标记物。因为具有CD3+细胞的背景信号，所以存在少许T细胞。参见图2C。
作为脂筏依赖性胞吞的抑制剂的MβCD或作为胞膜窖依赖性胞吞的抑制剂的菲律宾菌素可影响阿米洛利介导的DNA进入和基因表达。在RAW264.7中，阿米洛利介导的DNA进入可由MβCD加菲律宾菌素完全消除。参见图3A和3B。类似抑制也在JAWSII细胞系与DC2.4细胞系两者中观察到。参见图3C-3F。这些结果表明阿米洛利介导的DNA进入是通过体内脂筏或胞膜窖依赖性胞吞来进行。
实施例3
阿米洛利增强先天性免疫性
与Cy5缀合的编码HBV表面抗原HBsAg的乙型肝炎病毒DNA疫苗(pcD-S2)用于测试阿米洛利促进的DNA进入抗原呈递细胞中是否可正面影响先天性免疫反应。在阿米洛利处理下，pcD-S2质粒在体外刺激CD40、CD80和CD86在RAW264.7上较高水平的表达，表明阿米洛利处理可增加这个巨噬细胞的成熟水平。参见图4A和4B。与巨噬细胞成熟一致，相较于未进行阿米洛利处理的相同细胞，阿米洛利处理诱导TNF和IFN-γ的较高水平表达。参见图4C。在DC2.4和JAWSII两种树突细胞系中均达到这个类似成熟状态，但促炎性细胞因子的表达水平有一些差异。参见图4D-4G。
处理自脾的腹膜巨噬细胞或树突细胞新鲜分离的抗原呈递细胞且剖析细胞因子。两组均显示相较于用单独pcD-S2处理的细胞，在用pcD-S2加阿米洛利处理的细胞中，成熟标记物更高表达且有更多促炎性细胞因子分泌。参见图4H-K)。
实施例4
阿米洛利作为CTL佐剂用于pcD-S2DNA疫苗
在有或无阿米洛利的情况下用表达HBV表面抗原(HBsAg)的pcD-S2通过C57B/6小鼠的足垫使它们免疫。参见图5A。结果显示相较于单独pcD-S2，在阿米洛利组中，针对HBsAg的抗体的水平以剂量依赖性方式增加。参见图5B。相较于单独pcD-S2，在pcD-S2加阿米洛利组中，针对HBsAg的延迟型过敏(“DTH”)反应也增加。参见图5C。两个实验均显示1mM阿米洛利是体内处理的最有效剂量。
DTH反映细胞介导的免疫性(CMI)的有效性，其中CD8+细胞溶解性T淋巴细胞(CTL)是一个重要因素。为探究阿米洛利是否也可影响CTL，将来自免疫的小鼠的CD8+T细胞纯化为效应细胞。初始C57脾细胞用HBsAg肽S208-215处理且随后用CFSE标记作为靶细胞，以不同比率混合。在培养3天之后，阿米洛利加pcD-S2组中60％靶细胞溶解，此显著多于来自单独pcD-S2组的约30％。参见图5D。此外，通过静脉内途径将肽处理的CFSE标记靶细胞转移至免疫的同源小鼠中以检测体内CTL。相较于未处理对应物，观察到在pcD-S2连同阿米洛利一起的情况下，细胞毒性更强。参见图5E。使用来自作为肝特异性HBsAg转基因小鼠的Alb1-HBV小鼠的肝细胞，这种抗原特异性杀伤得以进一步证明。这些肝细胞以靶细胞形式在体外和在体内使用。参见图5F和5G。相较于对照，在阿米洛利加pcD-S2组中实现较高水平的CTL。
实施例5
阿米洛利增加三阳性CD8T细胞
IFN-γ、穿孔素和粒酶B是CTL中有助于病毒清除的主要组分。包括IFN-γ、穿孔素和粒酶B的多功能组用于区分细胞溶解性CD8+T效应物。相较于单独pcD-S2免疫，阿米洛利加pcD-S2的免疫不增加对这些CD8+T效应物的特异性抗原的反应性的频率。参见图6A。然而，此增加反应的CD8+群体内三阳性CD8+T效应物的比例。参见图6B和6C。此外，也可在HBsAg刺激的CD8反应中观察到三阳性细胞，表明阿米洛利通常加强针对HBV的CD8T细胞的细胞毒性。参见图6D。这些结果指示可通过阿米洛利增强的三阳性CD8T细胞比例来获得对靶细胞的更强且更高效杀伤。
为进一步证明三阳性CD8T效应物的增加是由于阿米洛利处理的APSc的随后作用，收集腹膜巨噬细胞和脾树突细胞且在有或无阿米洛利的情况下用pcD-S2处理，接着与来自HBsAg免疫的小鼠的纯化CD8T细胞一起共培养5天。在共培养过程中，HBsAg源性肽S208-215(ILSPFLPL；H-2Kb限制性)用于再刺激。分析反应性T细胞的比例。阿米洛利显著增加共培养系统中的巨噬细胞和DC中的S208-215特异性三阳性CD8T效应物的百分比。参见图6E和6F。
实施例6
阿米洛利在CTL受损背景下增加穿孔素和粒酶B比例
为检查多功能CD8T细胞与CTL功能之间的关联，在有或无阿米洛利的情况下用pcD-S2免疫IFN-γ敲除小鼠(IFN-γ-/-)。结果显示在野生型或IFN-γ-/-敲除小鼠中，阿米洛利加pcD-S2提供的CTL水平高于单独pcD-S2提供的CTL水平。参见图7。相较于野生型小鼠，观察到IFN-γ-/-敲除小鼠中针对S208-215涂布的脾细胞的体外或体内CTL反应较低，或针对Alb1肝细胞的体外或体内CTL反应较低。参见图7A-D。与CTL反应较低一致，当用S208-215刺激时，展现敲除小鼠中的反应性CD8T细胞数目低于野生型小鼠的反应性CD8T细胞数目。参见图7E。尽管CTL水平降低，但证实阿米洛利加pcD-S2处理组中针对S208-215或HBsAg的穿孔素+粒酶B+CD8T细胞的频率高于单独pcD-S2组的频率。参见图7F和7G。

Claims (18)

1.一种能够引发针对所需癌症或感染性疾病的免疫反应的疫苗制剂，所述制剂包含疫苗促进剂和编码抗原性肽的DNA，其中所述疫苗促进剂是Na/K泵抑制剂。
2.如权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促进剂是包括5-(N-乙基-N-异丙基_阿米洛利(EIPA)、苯扎明或阿米洛利。
3.如权利要求1所述的疫苗，其中所述疫苗促进剂是阿米洛利。
4.如权利要求1至3中任一项所述的疫苗，所述疫苗进一步包含所述抗原性肽。
5.如权利要求4所述的疫苗，其中所述DNA是环状质粒。
6.如权利要求4所述的疫苗，其中所述DNA是线性表达盒。
7.如权利要求6所述的疫苗，其中所述线性表达盒不具有磷酸骨架。
8.如权利要求5至6中任一项所述的疫苗，其中所述疫苗能够被电穿孔至有需要的受试者中。
9.如权利要求5至6中任一项所述的疫苗，其中所述抗原选自由以下组成的组：M2、LACK、HBV、神经氨酸苷酶、血凝素、其变体及其共有序列。
10.如权利要求5至6中任一项所述的疫苗，其中所述DNA进一步包含选自由以下组成的组的启动子：CMV、SV40早期启动子、SV40晚期启动子、金属硫蛋白启动子、鼠乳腺肿瘤病毒启动子、劳斯肉瘤病毒启动子和多角体蛋白启动子。
11.如权利要求6所述的疫苗，其中所述线性表达盒选自由pcrNP和pcrM2组成的组。
12.一种疫苗接种试剂盒，所述试剂盒包括如权利要求5至6中任一项所述的疫苗。
13.如权利要求12所述的试剂盒，所述试剂盒进一步包括电穿孔装置。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其中所述电穿孔装置是微创性电穿孔装置。
15.一种疫苗接种方法，所述方法包括向有需要的受试者施用如权利要求5至6中任一项所述的疫苗。
16.如权利要求15所述的方法，其中所述疫苗是通过电穿孔来施用。
17.如权利要求16所述的方法，其中所述电穿孔途径选自由皮内途径和肌肉内途径组成的组。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述疫苗是用微创性电穿孔装置来电穿孔。
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