ES2362749T3

ES2362749T3 - Composiciones inmunógenas para streptococcus agalactiae.

Info

Publication number: ES2362749T3
Application number: ES04784029T
Authority: ES
Inventors: John L. Telford; Guido Grandi; Immaculada Margarit Y Ros; Domenico Maione
Original assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 2003-09-15
Filing date: 2004-09-15
Publication date: 2011-07-12
Anticipated expiration: 2024-09-15
Also published as: ATE507841T1; JP2007527866A; DE602004032550D1; JP4771948B2

Abstract

Una composición que es isotónica con respecto a los seres humanos y/o está liofilizada, composición que comprende una combinación de dos o más antígenos GBS, en la que dicha combinación incluye: i) GBS 80 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 o un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma; y ii) al menos uno entre GBS 91 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 11, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 104 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 19, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 184 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 24, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 276 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 27, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 305 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 32, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 322 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 37, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 330 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 338 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 42, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 361 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 45, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 404 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 48, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 690 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 50, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma, GBS 691 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 53, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma.

Description

Campo de la invención

La invención se refiere a un antígeno inmunógeno derivado de Streptococcus agalactiae (“GBS”) y a su uso en combinaciones con otros antígenos GBS para proporcionar una cobertura más amplia entre las diferentes cepas del GBS. En concreto, la invención se refiere a una composición según lo expuesto en las reivindicaciones que comprende una combinación de dos o más antígenos GBS, en la que la combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo. La combinación incluye GBS 80 y, al menos, otro antígeno GBS. Por ejemplo, la combinación puede incluir GBS 80 y hasta trece antígenos GBS. En una realización preferida, la combinación puede incluir GBS 80 y hasta diez antígenos GBS. En una realización preferida más, la combinación puede incluir GBS 80 y hasta cinco antígenos GBS. En una realización, la combinación puede consistir en dos a trece antígenos GBS seleccionados de un grupo de antígenos que consiste en GBS 80, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Preferiblemente, la combinación incluye GBS 80 en combinación con uno o más de GBS 104 y GBS 322.

Antecedentes de la invención

El GBS ha surgido en los últimos 20 años como la principal causa de septicemia y meningitis neonatal, afectando a 0,5–3 de cada 1.000 nacidos vivos, y como una causa importante de morbilidad entre el grupo de mayor edad, afectando a 5–8 de cada 100.000 miembros de la población. Las estrategias actuales de tratamiento de esta enfermedad se basan en la administración de antibióticos durante el parto y en la monitorización neonatal, lo que ha reducido la mortalidad en los casos neonatales de más del 50% en los años setenta a menos del 10% en los años noventa. No obstante, todavía existe una morbilidad y una mortalidad considerables, y su tratamiento es caro. Del 15–35% de las mujeres embarazadas son portadoras asintomáticas y están en alto riesgo de transmitir la enfermedad a sus bebés. El riesgo de infección neonatal está asociado con bajos anticuerpos maternos específicos de determinados serotipos, siendo los altos títulos considerados como protectores. Además, cada vez se reconocen más casos de ancianos con la enfermedad invasiva por GBS que padecen una enfermedad subyacente, tal como la diabetes o el cáncer.

La “B” de “GBS” se refiere a la clasificación de Lancefield, que se basa en la antigenicidad de un hidrato de carbono que es soluble en ácido diluido y se denomina hidrato de carbono C. Lancefield identificó 13 tipos de hidratos de carbono C, denominados A a O, que podrían estar serológicamente diferenciados. Los organismos que infectan más comúnmente a seres humanos se encuentran en los grupos A, B, D y G. En el grupo B, las cepas se pueden dividir en al menos 9 serotipos (Ia, Ib, Ia/c, II, III, IV, V, VI, VII y VIII) en base a la estructura de su cápsula de polisacárido. En el pasado, los serotipos Ia, Ib, II y III se extendieron de igual manera en el vehículo vaginal normal y en la septicemia de aparición temprana en recién nacidos. Sin embargo, el GBS de tipo V ha surgido como una causa importante de infección por GBS en EE.UU., y las cepas de los tipos VI y VIII se han extendido entre las mujeres japonesas.

Se ha publicado la secuencia del genoma de una cepa del serotipo V 2603 V/R (Ref. 1) y se han identificado diversos polipéptidos para su uso como antígenos para vacunas (Ref. 2). Sin embargo, las vacunas que se encuentran actualmente en ensayo clínico se basan en antígenos de polisacárido. Sus desventajas son la especificidad del serotipo y su baja inmunogenicidad, y por tanto, existe la necesidad de vacunas eficaces contra la infección de S. agalactiae.

Un objeto de la invención consiste en proporcionar más y mejores composiciones para proporcionar inmunidad contra la enfermedad y/o la infección por GBS. Las composiciones se basan en una combinación de dos o más (p.ej., tres o más) antígenos GBS.

Resumen de la invención

Los solicitantes han descubierto que un antígeno GBS inmunógeno, el GBS 80, es particularmente adecuado a efectos de inmunización, especialmente, cuando se usa en combinación con otros antígenos GBS. La combinación puede incluir GBS 80 y, al menos, otro antígeno GBS o hasta trece de otros antígenos GBS según lo expuesto en las reivindicaciones. En una realización preferida, la combinación puede incluir GBS 80 y hasta 10 antígenos GBS. En una realización preferida más, la combinación incluye GBS 80 y hasta cinco antígenos GBS. En concreto, la invención se refiere a una composición que comprende una combinación de dos o más antígenos GBS, en la que la combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo. En una realización, la combinación puede consistir en dos a trece antígenos GBS seleccionados del grupo que consiste en GBS 80, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Preferiblemente, la combinación consiste en GBS 80, GBS 104 y GBS 322.

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En lugar del antígeno de longitud completa, la combinación puede comprender un fragmento inmunógeno del antígeno GBS seleccionado y/o una secuencia polipeptídica que tenga identidad secuencial con el antígeno seleccionado.

Preferiblemente, la combinación de antígenos GBS está constituida por tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez antígenos GBS. Todavía más preferiblemente, la combinación de antígenos GBS está constituida por tres, cuatro o cinco antígenos GBS.

Descripción detallada de la invención

La práctica de la presente invención empleará, a no ser que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de Química, Bioquímica, Biología Molecular, Inmunología y Farmacología pertenecientes al ámbito de la técnica. Tales técnicas se explican de manera completa en la bibliografía. Véase, p.ej., “Remington’s Pharmaceutical Sciences”, Mack Publishing Company, Easton, Pa., XIX Edición (1995); “Methods In Enzymology” (S. Colowick y N. Kaplan, eds., Academic Press, Inc.); y “Handbook of Experimental Immunology”, Vols. I–IV (D.M. Weir y C.C. Blackwell, eds., 1986, Blackwell Scientific Publications); Sambrook, et al., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual” (II Edición, 1989); “Handbook of Surface and Colloidal Chemistry” (Birdi, K.S. ed., CRC Press, 1997); “Short Protocols in Molecular Biology”, IV ed. (Ausubel et al. eds., 1999, John Wiley & Sons); “Molecular Biology Techniques: An Intensive Laboratory Course”, (Ream et al., eds., 1998, Academic Press); PCR (Introduction to Biotechniques Series), II ed. (Newton & Graham eds., 1997, Springer Verlag); Peters y Dalrymple, Fields Virology (II ed), Fields et al. (eds.), B.N. Raven Press, Nueva York, NY.

Todas las publicaciones, patentes y solicitudes de patente citadas en la presente memoria se encuentran incorporadas en el presente documento por referencia en su totalidad.

Antígenos GBS

Según lo tratado anteriormente, la invención proporciona una composición inmunógena según lo expuesto en las reivindicaciones que comprende una combinación de dos o más antígenos GBS, en la que dicha combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo.

Las combinaciones de antígenos GBS pueden incluir fragmentos polipeptídicos de los antígenos GBS identificados. La longitud del fragmento puede variar en función de la secuencia de aminoácidos del antígeno GBS específico, pero el fragmento es preferiblemente de al menos 7 aminoácidos consecutivos (p.ej., 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200 o más). Preferiblemente, el fragmento comprende uno o más epítopos de la secuencia. Otros fragmentos preferidos incluyen (1) los péptidos señal N–terminales de cada antígeno GBS identificado; (2) los antígenos GBS identificados sin sus péptidos señal N–terminales y (3) cada antígeno GBS identificado en el que se han eliminado hasta 10 residuos de aminoácido (p. ej. 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25

o más) del terminal N y/o el terminal C, p.ej., puede estar eliminado el residuo de aminoácido N–terminal. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de la proteína (p.ej., la omisión de un péptido señal, de un dominio citoplasmático, de un dominio transmembrana o de un dominio extracelular).

Las combinaciones de antígenos GBS pueden incluir secuencias polipeptídicas que tienen identidad secuencial con los antígenos GBS identificados. El grado de identidad secuencial puede variar en función de la secuencia de aminoácidos (a) en cuestión, pero es preferiblemente mayor del 80% (p.ej., 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 99,5% o más). Los polipéptidos que tienen identidad secuencial incluyen homólogos, ortólogos, variantes alélicas y mutantes funcionales de los antígenos GBS identificados. Comúnmente, una identidad del 50% o mayor entre dos proteínas se considera un indicio de equivalencia funcional. La identidad entre proteínas se determina preferiblemente mediante el algoritmo de búsqueda de homologías de Smith–Waterman según lo puesto en marcha en el programa MPSRCH (Oxford Molecular) usando una búsqueda de huecos afines con los parámetros de penalización por abertura de hueco = 12 y de penalización por extensión de hueco = 1.

Como es obvio, los polipéptidos se pueden preparar mediante diversos procedimientos (p.ej., expresión recombinante, purificación de GBS, síntesis química etc.) y en diversas formas (p.ej., nativa, fusiones, glucosilada, no glucosilada, etc.). Se preparan preferiblemente en una forma sustancialmente pura (i.e., sustancialmente libre de otras proteínas estreptocócicas o de células huésped) o en forma sustancialmente aislada.

GBS 80

Según lo tratado anteriormente, la invención se refiere al uso de GBS 80 en combinación sinérgica con otros antígenos GBS. GBS 80 se refiere a una proteína putativa de la familia de las proteínas de anclaje a la superficie de la pared celular. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 80 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 8779 y SEC ID N.º 8780. Estas secuencias también se exponen a continuación como las SEC ID N.º 1 y 2:

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SEC ID N.º 1

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SEC ID N.º 2

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Según lo descrito anteriormente, las combinaciones de la invención pueden incluir un fragmento de un antígeno GBS. En algunos casos, la eliminación de uno o más dominios, tales como la región de la secuencia líder o señal, una región transmembrana, una región citoplasmática o un motivo de anclaje a la pared celular pueden facilitar la clonación del gen que codifica el antígeno y/o la expresión recombinante de la proteína GBS. Además, en las composiciones de la invención, se pueden usar fragmentos que comprenden epítopos inmunógenos de los antígenos GBS citados.

El GBS 80 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 2 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal de GBS 80. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 80 como la SEC ID N.º 3:

SEC ID N.º 3

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El GBS 80 contiene una región transmembrana C–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada próxima al extremo de SEC ID N.º 2 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región transmembrana y/o una región citoplasmática. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 80 como la SEC ID N.º 4:

SEC ID N.º 4

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GBS 80 contiene un motivo de aminoácidos indicativo de un anclaje a la pared celular: SEC ID N.º 5 IPNTG (mostrado en letra cursiva en la SEC ID N.º 2 anterior). En algunos sistemas de células huésped recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secreción de una proteína GBS 80 recombinante desde la célula huésped. Por consiguiente, en un fragmento de GBS 80 preferido para su uso en la invención, se han eliminado las regiones transmembrana y/o citoplasmática y el motivo de anclaje a la pared celular de GBS 80. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 80 como la SEC ID N.º 6.

SEC ID N.º 6

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Alternativamente, en algunos sistemas de células huésped recombinantes, puede ser preferible usar el motivo de anclaje a la pared celular para anclar la proteína expresada recombinantemente a la pared celular. Se puede escindir el dominio extracelular de la proteína expresada durante la purificación o se puede dejar unida la proteína recombinante a sus células huésped o membranas celulares inactivas en la composición final.

En una realización, se han eliminado la región de la secuencia líder o señal, las regiones transmembrana y citoplasmática y el motivo de anclaje a la pared celular de la secuencia de GBS 80. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 80 como la SEC ID N.º 7.

SEC ID N.º 7

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Los solicitantes han identificado un fragmento particularmente inmunógeno de la proteína GBS 80. Este fragmento inmunógeno está ubicado hacia el terminal N de la proteína y está subrayado en la secuencia SEC ID N.º 2 de GBS 80 que se presenta a continuación. El fragmento subrayado se expone debajo como la SEC ID N.º 8.

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SEC ID N.º 2

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SEC ID N.º 9

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Se realizaron tanto un ensayo de inmunización materna activa como un ensayo de inmunización materna pasiva en esta colección de proteínas.

Como se usa en la presente memoria, ensayo de inmunización materna activa se refiere a un ensayo de protección in vivo en el que se inmunizan ratones hembra con la composición de antígeno de prueba. Entonces se reproducen los ratones hembra y las crías son sometidas a una prueba de provocación con una dosis letal de GBS. Se miden los títulos en suero de los ratones hembra durante el proceso de inmunización, así como el tiempo de supervivencia de las crías tras la prueba de provocación.

Específicamente, los ensayos de inmunización materna activa se refieren a grupos usados en la presente memoria de cuatro ratones hembra CD–1 (Charles River Laboratories, Calco, Italia). Se inmunizaron intraperitonealmente estos ratones con las proteínas seleccionadas en adyuvante de Freund los días 1, 21 y 35 antes de la reproducción. Los ratones de 6–8 semanas recibieron 20 μg de proteína/dosis cuando se inmunizaron con un solo antígeno y 30– 45 μg proteína/dosis (15 μg de cada antígeno) cuando se inmunizaron con una combinación de antígenos. Se monitorizó la respuesta inmune de la madres usando muestras de suero tomadas el día 0 y el día 49. Se reprodujeron los ratones hembra 2–7 días después de la última inmunización (a aproximadamente t = 36–37) y tuvieron, por lo común, un período de gestación de 21 días. En las 48 horas de haber nacido, las crías fueron sometidas a una prueba de provocación por vía I.P. con GBS en una dosis aproximadamente igual a una cantidad que sería suficiente para matar al 70–90% de las crías sin inmunizar (determinada mediante los datos empíricos obtenidos de los grupos control de PBS). La dosis de provocación de GBS se administra preferiblemente en 50 μl de medio THB. Preferiblemente, la prueba de provocación de las crías tiene lugar de los días 56 a 61 posteriores a la primera inmunización. Las cantidades inoculadas de la provocación se prepararon partiendo de cultivos congelados diluidos hasta la concentración apropiada con THB antes de su uso. Se controló la supervivencia de las crías durante los 5 días posteriores a la prueba de provocación.

Como se usa en la presente memoria, ensayo de inmunización materna pasiva se refiere a un ensayo de protección in vivo en el que ratonas preñadas son inmunizadas pasivamente mediante la inyección de sueros inmunes de conejo (o sueros control) aproximadamente 2 días antes de la administración. Entonces se somete a las crías a una prueba de provocación con una dosis letal de GBS.

Específicamente, el ensayo de inmunización materna pasiva se refiere a grupos usados en la presente memoria de ratonas CD1 preñadas que fueron inmunizadas pasivamente, mediante la inyección de 1 ml de sueros inmunes de conejo o sueros control por vía I.P., 2 días antes de la administración. Se someten los ratones recién nacidos (24–48 h después de su nacimiento) a una prueba de provocación por vía I.P. con un 70–90% de dosis letal de COH1 de serotipo III de GBS. La dosis de provocación, obtenida diluyendo un cultivo congelado en fase logarítmica media, se administró en 50 µl de medio THB.

Para ambos ensayos, se analizó el número de crías que sobrevivieron a la infección por GBS cada 12 h durante 4 días. La significación estadística se estimó mediante el test exacto de Fisher.

En las siguientes Tablas 1 y 2, se exponen los resultados de cada ensayo para la inmunización con SEC ID N.º 7, SEC ID N.º 8, PBS y célula entera de GBS.

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TABLA 1: Inmunización materna activa

Antígeno: Vivas/total % de supervivencia Test exacto de Fisher

PBS (control neg.) GBS (célula entera) GBS80 (intacto) GBS80 (fragmento) SEC ID N.º 7 GBS80 (fragmento) SEC ID N.º 8: 13/80 54/65 62/70 35/64 13/67 16% 83% 88% 55% 19% P<0,00000001 P<0,00000001 P=0,0000013 P=0,66

TABLA 2: Inmunización materna pasiva

Antígeno: Vivas/total % de supervivencia Test exacto de Fisher

PBS (control neg.) GBS (célula entera) GBS80 (intacto) GBS80 (fragmento) SEC ID N.º 7 GBS80 (fragmento) SEC ID N.º 8: 12/42 48/52 48/55 45/57 13/54 28% 92% 87% 79% 24% P<0,00000001 P<0,00000001 P=0,0000006 P=1

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Como se muestra en las Tablas 1 y 2, la inmunización con el fragmento de GBS 80 de SEC ID N.º 7 proporcionó una tasa de supervivencia sustancialmente mayor para las crías sometidas a la prueba de provocación en comparación con el fragmento de GBS 80 de SEC ID N.º 8. Estos resultados indican que el fragmento de GBS 80 de SEC ID N.º 7 puede comprender un epítopo inmunógeno importante de GBS 80.

Combinaciones que incluyen el GBS 80

La invención incluye combinaciones de dos o más antígenos GBS, en las que la combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo. Los solicitantes han descubierto que el GBS 80 es particularmente adecuado para la inmunización en combinación con otros antígenos GBS y que estas combinaciones de antígenos proporcionan una cobertura más amplia entre las diferentes cepas de GBS.

Preferiblemente, las combinaciones de la invención proporcionan una mayor inmunogenicidad frente a la inmunogenicidad de los antígenos administrados solos. La mejoría de inmunogenicidad se puede medir, por ejemplo, mediante el ensayo de inmunización materna activa. Según lo tratado anteriormente, este ensayo se puede usar para medir los títulos en suero de los ratones hembra durante el calendario de inmunizaciones, así como el tiempo de supervivencia de las crías tras la prueba de provocación. Preferiblemente, la inmunización con las composiciones inmunógenas de la invención produce un aumento de al menos 2 puntos porcentuales (preferiblemente de al menos 3, 4 ó 5 puntos porcentuales) del porcentaje de supervivencia de las crías sometidas a la prueba de provocación en comparación con el porcentaje de supervivencia obtenido tras la inmunización materna con un solo antígeno de la composición administrado solo. Preferiblemente, el aumento es de al menos 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 ó 30 puntos porcentuales. Preferiblemente, las combinaciones de GBS de la invención que comprenden GBS 80 demuestran un aumento del porcentaje de supervivencia en comparación con el porcentaje de supervivencia obtenido tras la inmunización con un solo antígeno distinto de GBS 80.

Según una realización de la invención, las combinaciones de antígenos o de proteínas de fusión que contienen una parte o varias partes de los antígenos incluirán GBS 80 o una parte del mismo en combinación con de uno a 10 antígenos, preferiblemente, de uno a 10 o menos antígenos. Tales otros antígenos incluyen, a modo de ejemplo y sin restricciones, GBS 67, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Hay aún otros antígenos más identificados en el documento estadounidense con n.º de serie 10/415.182, presentado el 28 de abril de 2003, incorporado en la presente memoria en su totalidad.

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Las combinaciones pueden incluir, por ejemplo, GBS 80, GBS 104, GBS 322 y GBS 276; GBS 80, GBS 338, GBS 330; GBS 80, GBS 330, GBS 104; GBS 80, GBS 104, GBS 404; GBS 80, GBS 338, GBS 104; GBS 80, GBS 338, GBS404; GBS 338, GBS 330, GBS 104; GBS 338, GBS 104, GBS 404; GBS 80, GBS 330, GBS 404; GBS 80, GBS 322, GBS 104; GBS 80, GBS 322, GBS 276; GBS 80, GBS 322, GBS 91; GBS 80, GBS 104, GBS 276; GBS 80, GBS 104, GBS 91; GBS 80, GBS 276, GBS 91; GBS 80, GBS 322, GBS 104; GBS 80, GBS 322, GBS 276; GBS 80, GBS 322, GBS 91; GBS 80, GBS 104, GBS 276; GBS 80, GBS 104, GBS 91; GBS 80, GBS 276, GBS 91; GBS 80, GBS 690, GBS 691; GBS 80, GBS 690, GBS 338; GBS 80, GBS 690, GBS 305; GBS 80, GBS 691, GBS 305; GBS 80, GBS 338, GBS 305; GBS 80, GBS 338, GBS 361; GBS 80, GBS 305, GBS 361; GBS 80, GBS 184, GBS 691; GBS 80, GBS 691, GBS 338; GBS 80, GBS 104, GBS 276, GBS 322; GBS 80, GBS 104, GBS 67 y GBS 322. A continuación, se exponen ejemplos de combinaciones de la invención que demuestran una mayor inmunogenicidad. Tras los ejemplos, se expone una descripción más detallada de los antígenos GBS a los que se hace referencia en estos experimentos.

Ejemplo 1: Ensayo de inmunización materna activa de GBS 80 solo frente a GBS en combinación

En este ejemplo, se usó el análisis de inmunización materna activa para medir el porcentaje de supervivencia de las crías sometidas a la prueba de provocación con el serotipo de tipo III de GBS (aislado COH1) en t = 56 días. Las ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa descrito anteriormente con GBS 80 solo, con combinaciones de antígenos GBS (con y sin GBS 80), placebo (PBS) o aislado de GBS de célula entera desactivado según lo indicado en la siguiente Tabla 3. En estos experimentos, la dosis de la prueba de provocación para el aislado de cepa de tipo III de GBS COH1 suficiente para matar al 70–90% de las crías sin inmunizar es aproximadamente igual a 10 x el 50% de la DL (en el que el 50% de la DL es la dosis letal media obtenida estadísticamente).

Tabla 3. Ensayo de inmunización materna activa de GBS 80 solo frente a GBS 80 en combinación

α–GBS: Prueba de provocación I, t = 56 días COH1 de tipo III, 10 x 50% de DL Vivas/tratadas % de supervivencia

α–PBS α–GBS III 80 80+338+330 80+330+104 80+104+404 80+338+104 80+338+404 338+330+104 338+104+404 80+330+404: 3/26 9/20 24/34 39/40 38/40 24/24 33/34 30/30 22/30 24/37 25/28 11 45 70 97 95 100 97 100 73 65 89

Como se muestra en la Tabla 3, las combinaciones de antígenos GBS que incluyeron GBS 80 demostraron una mayor inmunogenicidad frente al uso de los antígenos solos. Por ejemplo, la inmunización con GBS 80 solo produjo una tasa de supervivencia del 70% entre las crías sometidas a la prueba de provocación. La inmunización con combinaciones de GBS 80 con GBS 338, GBS 330, GBS 104 y GBS 404 produjo una tasa de supervivencia del 95 al 100% entre las crías sometidas a la prueba de provocación. Esto es un aumento de 25 a 30 puntos porcentuales.

Si se realiza una comparación, las combinaciones de estos antígenos que no incluyeron a GBS 80 no alcanzaron el % de supervivencia de GBS 80 solo. Por ejemplo, la inmunización con GBS 338, GBS 104 y GBS 404 produjo una tasa de supervivencia del 65%. La sustitución de uno cualquiera de estos antígenos con GBS 80 aumentó de manera espectacular el porcentaje de supervivencia hasta entre el 97 y el 100%. Esto es un aumento de 32 a 35 puntos porcentuales. (Véanse los porcentajes de supervivencia de GBS 80, 338, 101 (97%); GBS 80, 338, 404 (100%) y GBS 80, 104, 404 (100%)). De igual manera, la inmunización con GBS 338, 330 y 104 produjo una tasa de supervivencia del 73%. La sustitución de uno cualquiera de estos antígenos con GBS 80 aumentó el porcentaje de supervivencia hasta entre el 95–97%.

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Estas conclusiones indican que la protección producida por el aislado COH1 se aumenta con el uso de GBS 80 en 5 combinación con otros antígenos GBS.

Ejemplo 2: Ensayo de inmunización materna activa de GBS 80, GBS 322, GBS 276, GBS 104 solos frente a los mismos en combinación

En este ejemplo, se usó el ensayo de inmunización materna activa para medir el porcentaje de supervivencia de las crías sometidas a la prueba de provocación con un serotipo de tipo III de GBS (aislado COH1) en t = 56 días. Las

10 ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito con un solo GBS 80, con combinaciones de antígenos GBS con GBS 80 y con placebo (PBS) según lo indicado en la siguiente Tabla 4.

Tabla 4. Ensayo de inmunización materna activa de GBS 80, GBS 322, GBS 276 o GBS 104 solos frente a los mismos en combinación con GBS 80

α–GBS: Prueba de provocación I, t = 56 días COH1 de tipo III 10 x 50% de DL Vivas/tratadas % de supervivencia

80 + 322 + 104: 27/27 100

80 + 322 + 276: 35/38 92

80 + 322 + 91: 24/24 100

80 + 104 + 276: 29/30 97

80 + 104 + 91: 36/40 90

80 + 276 + 91: 33/40 82

GBS 80: 24/30 80

GBS 322: 7/40 17

GBS 276: 13/37 35

GBS 104: 28/38 74

α–PBS: 2/27 7

15 Como se muestra en la Tabla 4, las combinaciones de los antígenos con GBS 80 produjeron una mayor inmunogenicidad frente al uso de los antígenos solos. Por ejemplo, la inmunización con GBS 322 solo produjo una tasa de supervivencia del 17% entre las crías sometidas a la prueba de provocación. La inmunización con combinaciones de GBS 322 con GBS 80 y otro antígeno GBS produjo tasas de supervivencia del 92–100%. Como otro ejemplo, la inmunización con GBS 104 solo produjo una tasa de supervivencia del 74%. La inmunización con

20 combinaciones de GBS 104 con GBS 80 y otro antígeno GBS produjo tasas de supervivencia del 90–100%. Como otro ejemplo, la inmunización con GBS 276 solo produjo una tasa de supervivencia del 35%. La inmunización con combinaciones de GBS 276 con GBS 80 y otro antígeno GBS produjo tasas de supervivencia del 82–97%.

Una vez demostrada la inmunogenicidad de las combinaciones anteriormente descritas, se analizó además la duración de la respuesta inmune en el modelo de ratones. Se aparearon una segunda vez las ratonas madre usadas 25 en el ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito y las crías resultantes fueron sometidas a una prueba de provocación con un serotipo diferente de GBS (tipo V, aislado CJB 111) a una dosis espectacularmente mayor (300 x 50% de DL) en t = 91 días. Los parámetros de esta segunda prueba de provocación mucho más potente estaban fuera de los usados en el ensayo de inmunización materna activa estándar, y con ellos se pretendía explorar los límites de la memoria inmunológica generada a partir de la inmunización materna original en el modelo 30 de ratones. Se cree que el indicio de la memoria inmunológica de este modelo en estas condiciones es relevante.

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Como se muestra en la Tabla 5, incluso en estas condiciones extremas, en general, se obtuvieron tasas de supervivencia mayores, particularmente, para la combinación que comprendía GBS 80, GBS 322 y GBS 104. Fue sorprendente advertir que el porcentaje de supervivencia para la combinación de GBS 80, GBS 233 y GBS 104 fue del 100% tanto para la primera como para la segunda prueba de provocación.

Tabla 5. Crías de la segunda generación sometidas a una prueba de provocación con una dosis más alta de una cepa diferente

α–GBS: Prueba de provocación II, t = 91 días CJB111 de tipo V, 300 x 50% de DL Vivas/tratadas % de supervivencia

80 + 322 + 104: 20/20 100

80 + 322 + 276: 32/37 86

80 + 322 + 91: 27/30 90

80 + 104 + 276: 22/37 59

80 + 104 + 91: 36/39 92

80 + 276 + 91: 23/28 82

GBS 80: 13/30 43

GBS 322: 25/30 83

GBS 276: 18/40 45

GBS 104: 21/39 54

α–PBS: 9/36 25

Ejemplo 3: Ensayo de inmunización materna activa de combinaciones de GBS 80 con GBS 690, GBS 691, GBS 338, GBS 305, GBS 361 y GBS 184

En este ejemplo, se usaron más combinaciones de antígenos GBS en el ensayo de inmunización materna activa, de nuevo con una prueba de provocación con aislado COH1 de tipo III de GBS. Las ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito con las combinaciones de antígenos GBS expuestas en la siguiente Tabla 6.

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Tabla 6. Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS 80 con GBS 690, GBS 691, GBS 338, GBS 305, GBS 361 y GBS 184

80 + 690 + 691 80 + 690 + 338 80 + 690 + 305 80 + 691 + 305 80 + 338 + 305 80 + 338 + 361 80 + 305 + 361 80 + 184 + 691 α–PBS: 26/29 35/40 34/35 37/40 25/30 26/30 23/30 32/39 10/40 90 87 97 92 83 87 77 82 25

También se aparearon las ratonas madre de este modelo una segunda vez y se sometieron las crías resultantes a una prueba de provocación con el mismo aislado de GBS a una dosis espectacularmente superior (100 x 50% de DL) en t = 84 días. Como en el ejemplo anterior, los parámetros de esta segunda prueba de provocación mucho más

5 potente estaban fuera de los usados en el ensayo de inmunización materna activa estándar, y con ellos se pretendía explorar los límites de la memoria inmunológica generada a partir de la inmunización materna original en el modelo de ratones. Como se muestra en la Tabla 7, incluso en estas condiciones extremas, algunas de las tasas de supervivencia permanecieron en el 70% o fueron superiores. Sorprendentemente, los porcentajes de supervivencia para la combinación de GBS 80, GBS 184 y GBS 691 incluso aumentaron.

10 Tabla 7. Crías de la segunda generación sometidas a una prueba de provocación con una dosis mayor

Prueba de provocación II, t = 84 días COH1 de tipo III 100 x 50% de DL

α–GBS: Vivas/tratadas % de supervivencia

80 + 690 + 691 80 + 690 + 338 80 + 690 + 305 80 + 691 + 305 80 + 338 + 305 80 + 338 + 361 80 + 305 + 361 80 + 184 + 691: 19/39 21/30 23/40 22/30 18/30 25/40 21/30 35/40 49 70 57 73 60 62 70 87

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(continuación)

α–GBS: Vivas/tratadas % de supervivencia

α–PBS: 4/20 20

Ejemplo 4: Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS 80 con GBS 690, GBS 691, GBS 338, GBS 305 y GBS 361

En este ejemplo, se usaron más combinaciones de antígenos GBS en el ensayo de inmunización materna activa, esta vez con una prueba de provocación con aislado CJB111 de tipo V de GBS. En estos experimentos, la dosis de 5 la prueba de provocación para el aislado de tipo V de GBS CJB111 suficiente para matar al 70–90% de las crías sin inmunizar es aproximadamente igual a 60 x el 50% de la DL (en el que el 50% de la DL es la dosis letal media obtenida estadísticamente). Las ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito con las combinaciones de antígenos GBS expuestas en la siguiente Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 8, en este estudio de prueba de provocación en particular con este aislado de cepa de

10 tipo V específico, las tasas de supervivencia para la totalidad de las combinaciones alcanzaron al menos el 70%.

Tabla 8: Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS80 con GBS 690, GBS 691, GBS 338, GBS 305 y GBS 361

α–GBS: Prueba de provocación I, t = 56 días CJB111 de tipo V 60 x 50% de DL Vivas/tratadas % de supervivencia

80 + 690 + 691: 24/30 80

80 + 690 + 338: 11/17 70

80 + 691 + 338: 7/10 70

80 + 691 + 305: 21/30 70

80 + 338 + 305: 26/30 87

80 + 338 + 361: 26/30 87

80 + 305 + 361: 28/30 93

GBS 80: 21/30 70

α–PBS: 5/18 28

También se aparearon las ratonas madre de este modelo una segunda vez y se sometieron las crías resultantes a

15 una prueba de provocación con el mismo aislado de GBS a una dosis espectacularmente superior (600 x 50% de DL) en t = 84 días. Como en el ejemplo anterior, los parámetros de esta segunda prueba de provocación mucho más potente estaban fuera de los usados en el ensayo de inmunización materna activa estándar, y con ellos se pretendía explorar los límites de la memoria inmunológica generada a partir de la inmunización materna original en el modelo de ratones. Como se muestra en la Tabla 9, incluso en estas condiciones extremas, algunas de las tasas de

20 supervivencia permanecieron por encima del 70%. Sorprendentemente, los porcentajes de supervivencia para dos de los grupos de antígenos incluso aumentaron (GBS 80, GBS 690 y GBS 338) y (GBS 80, GBS 691 y GBS 338).

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Tabla 9: Crías de la segunda generación sometidas a una prueba de provocación con una dosis más alta

α–GBS: Prueba de provocación II, t = 84 días CJB111 de tipo V 600 x 50% de DL Vivas/tratadas % de supervivencia

80 + 690 + 691: 27/37 73

80 + 690 + 338: 15/20 75

80 + 691 + 338: 27/30 90

80 + 691 + 305: 23/40 57

80 + 338 + 305: 12/20 60

80 + 338 + 361: 24/30 80

80 + 30 5+ 361: 24/30 80

GBS 80: 24/30 80

α–PBS: ND ND

Ejemplo 5: Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS 80 con GBS 104, GBS 276 y GBS 322

En este ejemplo, se usaron más combinaciones de antígenos GBS en el ensayo de inmunización materna activa,

5 esta vez con una prueba de provocación con aislado de diferentes cepas de GBS. En estos experimentos, la dosis de la prueba de provocación para las diferentes cepas de GBS fue suficiente para matar al 60%–90 de las crías sin inmunizar y fue aproximadamente igual a 10 x el 50% de la DL (en el que el 50% de la DL es la dosis letal media obtenida estadísticamente). Las ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito con la combinación de antígeno GBS 80 con los antígenos GBS 104, GBS 276

10 y GBS 322 en las cepas de GBS expuestas en la siguiente Tabla 10. Se observó el % de supervivencia con la combinación de GBS con dos adyuvantes diferentes, alumbre y adyuvante de Freund. Como se muestra en las Tablas 10 y 11, en este estudio de prueba de provocación en concreto, las tasas de supervivencia para la combinación en la totalidad de las cepas de GBS alcanzaron hasta el 96%.

Tabla 10: Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS 80 con GBS 104, GBS 276 15 y GBS 322 – Adyuvante de alumbre

ALUMBRE

Mezcla = 322+80+104+276: PBS

Cepas de GBS: Tipo Vivas/tratadas % de supervivencia Vivas/tratadas % de supervivencia

JM9130013 CJB111 COH1 M781 2603 18RS21: VIII V III III V II 32/36 118/145 96/115 42/52 79/145 86/186 89 81 83 81 54 46 18/46 21/110 22/104 18/48 28/128 24/131 40 19 21 38 22 18

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(continuación)

ALUMBRE

Mezcla = 322+80+104+276: PBS

DK21 7357b– A909 090 SMO53: II Ib Ia Ia VII 31/140 25/88 4/40 2/31 17/54 22 28 10 6 31 28/118 25/106 9/60 4/53 4/39 24 23 15 7 10

Tabla 11: Ensayo de inmunización materna activa usando combinaciones de GBS 80 con GBS 104, GBS 276 y GBS 322 – Adyuvante de Freund

Freund

Mezcla = 322+80+104+276: PBS

JM9130013 CJB111 COH1 M781 2603 18RS21 DK21 H36B 7357b– A909: VIII V III III V II II Ib Ib Ia nd 47/49 47/50 33/50 28/30 31/78 37/68 8/38 29/50 18/49 Nd 96 94 66 93 40 54 21 58 37 Nd 12/46 12/50 6/50 8/48 10/46 15/60 5/60 5/50 6/49 Nd 26 24 12 17 22 25 8 10 12

5 Por consiguiente, la invención incluye por tanto composiciones que comprenden combinaciones de dos o más antígenos GBS, en las que la combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial con el mismo.

En una realización, la combinación puede estar constituida por dos a trece antígenos GBS, incluyendo GBS 80. Como ejemplo, la combinación puede contener GBS 80 y otros antígenos GBS seleccionados del grupo que consiste

10 en GBS 80, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Preferiblemente, la combinación incluye GBS 80 en combinación con uno o más de GBS 104 y GBS 322. Por ejemplo, la combinación puede incluir GBS 80, GBS 104, GBS 322 y GBS 67.

En lugar del antígeno de longitud completa, la combinación puede comprender un fragmento inmunógeno del antígeno GBS seleccionado y/o una secuencia polipeptídica que tenga identidad secuencial con el antígeno

15 seleccionado.

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A continuación se exponen detalladamente los ejemplos de los antígenos GBS para su uso en combinación con el GBS 80.

GBS 91

SEC ID N.º 10

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SEC ID N.º 11

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al comienzo de la SEC ID N.º 11 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de esta región de la secuencia líder o señal de GBS 91. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 91 como la SEC ID N.º 12.

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SEC ID N.º 12

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El GBS 91 contiene una región transmembrana C–terminal que puede estar ubicada en la región subrayada próxima al extremo de SEC ID N.º 11 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana y citoplasmática. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 91 como la SEC ID N.º 13.

SEC ID N.º 13

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SEC ID N.º 15

imagen3

En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana y citoplasmática de la secuencia de GBS 91. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 91 como la SEC ID N.º 16.

SEC ID N.º 16

imagen3

En otra realización, se han eliminado la región de la secuencia líder o señal, las regiones transmembrana y citoplasmática y el motivo de anclaje a la pared celular de la secuencia de GBS 91. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 91 como la SEC ID N.º 17.

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SEC ID N.º 17

imagen3

Se puede encontrar más información relativa a GBS 91 en el documento WO 01/25440 (polipéptido de unión C3), WO 01/32882 (ID–65), WO 02/31156 (BVH) y Reinscheid et al., “Microbiology” (2002) 148: 3245–3254 (gen bsp), cada uno de los cuales se encuentra incorporado en la presente memoria por referencia en su totalidad.

GBS 104

SEC ID N.º 18 SEC ID N.º 19

imagen21

imagen22

imagen3

El GBS 104 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 19 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal de GBS 104. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 104 como la SEC ID N.º 20.

SEC ID N.º 20

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El GBS 104 contiene una región transmembrana y/o citoplasmática C–terminal que se indica mediante la región subrayada próxima al extremo de SEC ID N.º 19 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 104 como la SEC ID N.º 21.

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SEC ID N.º 21

imagen3

En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 104 como la SEC ID N.º 22.

SEC ID N.º 22

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En otras realizaciones, se proporcionan más fragmentos de GBS 104, incluyendo un fragmento de 830 aminoácidos de GBS 104 de los aminoácidos 28–858, un fragmento de 359 aminoácidos de GBS 104 de los aminoácidos 28–387, un fragmento de 581 aminoácidos de GBS 104 de los aminoácidos 28–609 o un fragmento de 740 aminoácidos de GBS 104 de los aminoácidos 28–768.

GBS 184

SEC ID N.º 23 SEC ID N.º 24

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subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 24 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la secuencia líder o señal de GBS 184. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 184 como la SEC ID N.º 25.

SEC ID N.º 25

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GBS 276

SEC ID N.º 26 SEC ID N.º 27

imagen27

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imagen3

El GBS 276 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 27 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal de GBS 276. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 276 como la SEC ID N.º 28.

SEC ID N.º 28

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El GBS 276 contiene una región transmembrana y/o citoplasmática C–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada próxima al extremo de SEC ID N.º 27 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática de GBS 276. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 276 como la SEC ID N.º 29.

SEC ID N.º 29

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática de GBS 276. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 276 como la SEC ID N.º 30.

SEC ID N.º 30

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Se puede encontrar una descripción más detallada de GBS 276 en las siguientes referencias: Qi Chen et al., "Immunization with C5a Peptidase or Peptidase–Type III Polysaccharide conjugate Vaccines Enhances Clearance of Group B Streptococci from Lungs of Infected Mice", Infection and Immunity (2002) 70 (11):6409 – 6415; Beckmann et al., "Identification of Novel Adhesions from Group B Streptococci by Use of Phage Display Reveals that C5a Peptidase Mediates Fibronectin Binding" Infection and Immunity (2002) 70(6):2869 – 2876; Cheng et al., "The Group B Streptococcal C5a Peptidase Is Both a Specific Protease and an Invasin" Infection and Immunity (2002) 70(5) 2408

– 2413; y Cheng et al., "Antibody against Surface–Bound C5a Peptidase Is Opsonic and Initiates Macrophage Killing of Group B Streptococci" Infection and Immunity (2001) 69(4):2302 – 2308.

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GBS 305

SEC ID N.º 31

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imagen31

El GBS 305 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 32 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal de GBS 305. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 305 como la SEC ID N.º 33.

SEC ID N.º 33

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El GBS 305 contiene una región transmembrana o citoplasmática C–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada próxima al extremo de SEC ID N.º 32 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática de GBS 305. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 305 como la SEC ID N.º 34.

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SEC ID N.º 34

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de las regiones transmembrana o citoplasmática de GBS 305. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 305 como la SEC ID N.º 35.

SEC ID N.º 35

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GBS 322

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SEC ID N.º 37

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El GBS 322 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que se indica mediante la secuencia subrayada próxima al comienzo de SEC ID N.º 37. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de

imagen34

la región de la secuencia líder o señal de GBS 322. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 322 como la SEC ID N.º 38.

SEC ID N.º 38

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GBS 330

40:

SEC ID N.º 39

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SEC ID N.º 40

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GBS 338

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SEC ID N.º 41

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SEC ID N.º 42

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SEC ID N.º 43

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20 GBS 361

GBS 361 se refiere a una proteína cyll. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 361 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 8769 y SEC ID N.º 8770. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 44 y 45:

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SEC ID N.º 44

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SEC ID N.º 45

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SEC ID N.º 46

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GBS 404

La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 404 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 8799 y SEC ID N.º 8800. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 47 y 48:

SEC ID N.º 47

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SEC ID N.º 48

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GBS 690

La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 690 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 9965 y SEC ID N.º 9966. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 49 y 50:

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SEC ID N.º 49

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SEC ID N.º 50

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SEC ID N.º 51

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GBS 691

GBS 691 se refiere a un transportador ABC de compuestos de hierro o a una proteína de unión a sustratos. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 691 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 3691 y SEC ID N.º 3692. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 52 y 53:

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SEC ID N.º 52

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SEC ID N.º 53

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SEC ID N.º 54

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SEC ID N.º 55

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de la región transmembrana o citoplasmática de GBS 691. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 691 como la SEC ID N.º 56.

SEC ID N.º 56

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A continuación se exponen más ejemplos de los antígenos GBS que se pueden usar en combinación con el GBS 80.

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GBS 4

GBS 4 se refiere a otra proteína putativa de la familia de las proteínas de anclaje a la superficie de la pared celular. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 4 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 1 y SEC ID N.º 2. Estas secuencias también se exponen a continuación como las SEC ID N.º 57 y 58:

SEC ID N.º 57

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SEC ID N.º 58

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GBS 4 contiene una región de secuencia líder o señal N–terminal que está subrayada al comienzo de la SEC ID N.º 58 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos del dominio del péptido líder o señal N– terminal de GBS 4. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 4 como la SEC ID N.º 59.

SEC ID N.º 59

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Es posible eliminar otra parte N–terminal más de GBS 4 para facilitar la expresión recombinante. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 4 como la SEC ID N.º 60.

SEC ID N.º 60

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GBS 4 contiene una región transmembrana C–terminal que está subrayada en el extremo de SEC ID N.º 58 anterior. En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región transmembrana C–terminal. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 4 como la SEC ID N.º 61.

SEC ID N.º 61

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En una realización, se han eliminado tanto el dominio líder o señal N–terminal como el dominio transmembrana C– terminal de la secuencia de GBS 4. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 4 como la SEC ID N.º 62.

SEC ID N.º 62

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En otra realización más, se han eliminado el dominio líder o señal N–terminal, otra región N–terminal más y el dominio transmembrana C–terminal de la secuencia de GBS 4. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 4 como la SEC ID N.º 63.

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SEC ID N.º 63

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GBS 22

SEC ID N.º 64

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SEC ID N.º 65

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GBS 85

SEC ID N.º 66 SEC ID N.º 67

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GBS 147

SEC ID N.º 68 SEC ID N.º 69

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SEC ID N.º 70 SEC ID N.º 71

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de la región transmembrana o citoplasmática de la secuencia de GBS 147. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 147 como la SEC ID N.º 72.

SEC ID N.º 72

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GBS 173

SEC ID N.º 73 SEC ID N.º 74

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SEC ID N.º 75

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SEC ID N.º 76

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de la región transmembrana o citoplasmática. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 173 como la SEC ID N.º 77.

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SEC ID N.º 77

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GBS 313

La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 313 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 4089 y SEC ID N.º 4090. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 78 y 79:

SEC ID N.º 78

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SEC ID N.º 79

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GBS 328

GBS 328 pertenece a la familia de las 5’–nucleotidasas. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 328 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 V/R se exponen en la Ref. 2 como la SEC ID N.º 6015 y SEC ID N.º 6016. Estas secuencias se exponen a continuación como las SEC ID N.º 80 y 81:

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SEC ID N.º 80

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SEC ID N.º 81

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SEC ID N.º 82

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SEC ID N.º 83

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En una realización, se han eliminado uno o más aminoácidos de la región de la secuencia líder o señal, y uno o más aminoácidos de la región transmembrana o citoplasmática de GBS 328. A continuación, se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 328 como la SEC ID N.º 84.

SEC ID N.º 84

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GBS 656

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SEC ID N.º 85

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SEC ID N.º 86

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GBS 67

A continuación, se ofrecen ejemplos de los fragmentos preferidos de GBS 67. La secuencia de nucleótidos y la de aminoácidos de GBS 67 secuenciadas a partir de la cepa aislada del serotipo V 2603 se exponen a continuación como la SEC ID N.º 87 y SEC ID N.º 88.

SEC ID N.º 87 SEC ID N.º 88

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SEC ID N.º 89

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SEC ID N.º 90 IPMTG. (Mostrado en cursiva en la SEC ID N.º 88 anterior). En algunos sistemas de células huésped recombinantes, puede ser preferible eliminar este motivo para facilitar la secreción de una proteína GBS 67 recombinante desde la célula huésped. Por consiguiente, en un fragmento de GBS 67 preferido para su uso en la invención, se han eliminado la transmembrana y el motivo de anclaje a la pared celular de GBS 67. A continuación,

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se expone un ejemplo de tal fragmento de GBS 67 como la SEC ID N.º 91.

SEC ID N.º 91

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Las composiciones de la invención también pueden incluir combinaciones que incluyan uno o más antígenos GBS conocidos en combinación con GBS 80.

Existe un límite superior para el número de antígenos GBS que estarán en las composiciones de la invención. Preferiblemente, el número de antígenos GBS de una composición de la invención es menor de 20, menor de 19, menor de 18, menor de 17, menor de 16, menor de 15, menor de 14, menor de 13, menor de 12, menor de 11, menor de 10, menor de 9, menor de 8, menor de 7, menor de 6, menor de 5, menor de 4 o menor de 3. Todavía más preferiblemente, el número de antígenos GBS de una composición de la invención es menor de 6, menor de 5 o menor de 4. Incluso más preferiblemente, el número de antígenos GBS de una composición de la invención es de 3.

Los antígenos GBS usados en la invención están preferiblemente aislados, i.e., separados y diferenciados, del organismo entero con el que la molécula se encuentra en la naturaleza o, cuando el polinucleótido o polipéptido no se encuentra en la naturaleza, está suficientemente libre de otras macromoléculas biológicas, de manera que el polinucleótido o el polipéptido se puede usar para el objetivo deseado.

Proteínas de fusión

Los antígenos GBS usados en la invención pueden estar presentes en la composición como polipéptidos separados individuales, pero es preferible que al menos dos (i.e., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 ó 18) de los antígenos estén expresados como una sola cadena polipeptídica (un polipéptido “híbrido” o de “fusión”). Tales polipéptidos de fusión ofrecen dos ventajas fundamentales: primero, es posible ayudar a un polipéptido que pueda ser inestable o estar poco expresado por sí mismo mediante la adición de una pareja de fusión adecuada que resuelva el problema; segundo, se simplifica la fabricación comercial al necesitarse sólo una expresión y purificación para producir dos polipéptidos que sean ambos antigénicamente útiles.

El polipéptido de fusión puede comprender dos o más secuencias polipeptídicas del grupo que consiste en GBS 80, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Preferiblemente, las secuencias polipeptídicas se seleccionan del grupo que consiste en GBS 80, GBS 104 y GBS 322. Lo más preferible es que el péptido de fusión incluya una secuencia polipeptídica de GBS 80. Por consiguiente, la invención incluye un péptido de fusión que comprende una primera secuencia de aminoácidos y una segunda secuencia de aminoácidos, en el que dicha primera y segunda secuencia de aminoácidos se seleccionan entre un antígeno GBS o un fragmento del mismo del anterior grupo de antígenos. Preferiblemente, la primera y la segunda secuencia de aminoácidos del polipéptido de fusión comprenden diferentes epítopos.

Ejemplo 7: Ejemplos de fragmentos para las proteínas de fusión de GBS 80 con GBS 104 y GBS 322

Los ejemplos de los fragmentos de GBS para las proteínas de fusión se obtienen de GBS 322, GBS 104 y GBS 80. Un ejemplo de fragmento de GBS 322 de una proteína de fusión es un fragmento de 407 aminoácidos con el péptido señal eliminado. También se pueden incorporar a las proteínas de fusión fragmentos de GBS 104. Un ejemplo de fragmentos de GBS 104 incluye un fragmento de 830 aminoácidos, un fragmento de 359 aminoácidos cercano al terminal N, un fragmento de 581 aminoácidos cercano al terminal N y un fragmento de 740 aminoácidos cercano al terminal N. Los ejemplos de fragmentos de GBS 80 incluyen un fragmento de 446 aminoácidos y un fragmento de 235 aminoácidos. La siguiente Tabla 13 resume los ejemplos de fragmentos para las proteínas de fusión y sus ubicaciones en la correspondiente proteína GBS de longitud completa.

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Tabla 13: Ensayo de inmunización materna activa en el que se usan combinaciones de GBS 80 con GBS 104 y GBS 322

GBS: Tamaño (AA) SEC ID N.º De…a

322: 407 92 25–432

104: 830 96 28–858

104 N1: 359 97 28–387

104 N2: 581 98 28–609

104 N3: 740 99 28–768

80: 446 100 37–483

80N: 235 101 37–272

Se prefieren los híbridos (o fusiones) que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve o diez antígenos GBS. En concreto, se prefieren los híbridos que consisten en secuencias de aminoácidos de dos, tres, cuatro o cinco antígenos GBS.

Se pueden mezclar diferentes polipéptidos híbridos en una sola formulación. En tales combinaciones, puede estar presente un antígeno GBS en más de un polipéptido híbrido y/o como un polipéptido no híbrido. Sin embargo, es preferible que haya un antígeno presente bien como un híbrido o como un no híbrido, pero no como ambas cosas.

Los polipéptidos híbridos se pueden representar mediante la fórmula NH2–A–{–X–L–}n–B–COOH, en la que: X es una secuencia de aminoácidos de un antígeno GBS o un fragmento del mismo del grupo de antígenos expuesto anteriormente; L es una secuencia de aminoácidos ligadora opcional; A es una secuencia de aminoácidos N– terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C–terminal opcional; y n es 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15.

Si un resto –X– tiene una secuencia de péptido líder en su forma de tipo natural, es posible incluirla u omitirla en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, se eliminarán los péptidos líder, a excepción de aquél del resto –X– ubicado en el terminal N de la proteína híbrida, i.e., se conservará el péptido líder de X1, pero los péptidos líder de X2 …. Xn serán omitidos. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líder y usar el péptido líder de X1 como resto –A–.

Para cada n ejemplos de {–X–L–}, la secuencia de aminoácidos ligadora –L– puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n = 2, el híbrido puede ser NH2–X1–L1–X2–L2–COOH, NH2–X1–X2–COOH, NH2–X1–L1–X2–COOH, NH2–X1–X2–L2–COOH, etc. La o las secuencias de aminoácidos ligadoras –L– serán, por lo común, cortas (p.ej., de 20 o menos aminoácidos, i.e., 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, ligadores de poli–glicina (i.e., que comprende Glyn, en la que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) y las etiquetas de histidina (i.e., Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Hay otras secuencias de aminoácidos ligadoras adecuadas que serán evidentes para los expertos en la técnica. Un ligador útil es GSGGGG, estando el dipéptido Gly–Ser formado desde un sitio de restricción de BamHI, ayudando así a la clonación y la manipulación, y siendo el tetrapéptido (Gly)4 un ligador de poli–glicina típico.

–A– es una secuencia de aminoácidos N–terminal opcional. Esta será, por lo común, corta (p.ej., de 40 o menos aminoácidos, i.e. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (p.ej., etiquetas de histidina, i.e., Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Hay otras secuencias de aminoácidos N–terminales adecuadas que serán evidentes para los expertos en la técnica. Si X1 carece de su propia metionina N–terminal, –A es preferiblemente un oligopéptido (p.ej., con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ó 8 aminoácidos) lo que proporciona una metionina N–terminal.

–B– es una secuencia de aminoácidos C–terminal opcional. Esta será, por lo común, corta (p.ej., de 40 o menos aminoácidos, i.e. 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas o secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación o la purificación (p.ej., que comprenden etiquetas de histidina, i.e., Hisn en la que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) o secuencias que aumenten la estabilidad de las proteínas. Hay otras secuencias de aminoácidos C–terminales adecuadas que serán evidentes para los expertos en la técnica. Más preferiblemente, n es 2 ó 3.

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Ejemplo 8: Ensayo de inmunización materna activa en el que se usan proteínas de fusión de fragmentos de GBS 80, GBS 67 y GBS 322

En este ejemplo, se usaron proteínas de fusión de antígenos GBS en el ensayo de inmunización materna activa con

5 una prueba de provocación con un aislado de diferentes cepas de GBS. En estos experimentos, la dosis de la prueba de provocación para las diferentes cepas de GBS fue suficiente para matar al 70–90% de las crías sin inmunizar y fue igual a 10 x el 50% de la DL (en el que el 50% de la DL es la dosis letal media obtenida estadísticamente). Las ratonas madre fueron inmunizadas según el calendario del ensayo de inmunización materna activa anteriormente descrito con las proteínas de fusión de un antígeno GBS 80 con el antígeno GBS 322 de las

10 cepas de GBS expuestas en la siguiente Tabla 14. Se observó el % de supervivencia con las proteínas de fusión de GBS. Como se muestra en la Tablas 14, en este estudio de prueba de provocación en concreto, las tasas de supervivencia para las proteínas de fusión en la totalidad de las cepas de GBS alcanzaron hasta el 79%.

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Tabla 14: Ensayo de inmunización materna activa en el que se usan proteínas de fusión de GBS 80 con GBS 322

COH1 (III): CJB111 (V) 515 (Ia) DK21 (II) 2603 (V)

GBS: Muertas/ tratadas % de supervivencia Muertas/ tratadas % de supervivencia Muertas/ tratadas % de supervivencia Muertas/ tratadas % de supervivencia Muertas/ tratadas % de supervivencia

80N–322: 16/40 60 8/39 79 12/28 57 7/19 63 8/37 78

80: 4/24 83

PBS: 35/40 12 27/35 23 32/39 18 31/40 22 33/40 17

80–322: 12/27 55 12/38 68

80: 0/33 100 28/40 30

322: 1/16 94

PBS: 19/20 5 38/39 2 25/29 14 19/26 27

Ácidos nucleicos

La invención también proporciona un ácido nucleico que codifica los antígenos GBS y/o los polipéptidos de fusión híbridos de la invención. Además, la invención proporciona un ácido nucleico que puede hibridarse con estos ácidos nucleicos, preferiblemente, en condiciones “muy restrictivas” (p.ej., 65°C en 0,1 x SSC; solución de SDS al 0,5%).

Los polipéptidos de la invención se pueden preparar mediante diversos procedimientos (p.ej., expresión recombinante, purificación de un cultivo celular, síntesis química etc.). y en diversas formas (p.ej., nativa, fusiones, no glucosilada, lipidada etc.). Se preparan preferiblemente en una forma sustancialmente pura (i.e., sustancialmente libre de otras proteínas GAS o de células huésped).

El ácido nucleico según la invención se puede preparar de muchos modos (p.ej., mediante síntesis química, a partir de genotecas o bancos de ADNc, del propio organismo, etc.). y puede adoptar diversas formas (p.ej., monocatenario, bicatenario, vectores, sondas etc.). Se preparan preferiblemente en una forma sustancialmente pura (i.e., sustancialmente libre de otros ácidos nucleicos de GBS o de células huésped).

La expresión “ácido nucleico” incluye ADN y ARN, y también sus análogos, tales como aquéllos que contienen estructuras modificadas (p.ej., fosforotioatos, etc.) y también ácidos nucleicos peptídicos (ANP) etc. La invención incluye ácidos nucleicos que comprenden secuencias complementarias a las descritas anteriormente (p.ej., a efectos de antisentido o sondado).

La invención también proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención que comprende la etapa de cultivar una célula huésped transformada con un ácido nucleico de la invención en condiciones que provoquen la expresión del polipéptido.

La invención proporciona un procedimiento para producir un polipéptido de la invención que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del polipéptido mediante procedimientos químicos.

La invención proporciona un procedimiento para producir un ácido nucleico de la invención que comprende la etapa de amplificar un ácido nucleico usando un procedimiento de amplificación basado en cebadores (p.ej., PCR).

La invención proporciona un procedimiento para producir un ácido nucleico de la invención que comprende la etapa de sintetizar al menos parte del ácido nucleico mediante procedimientos químicos.

Purificación y expresión recombinante

Los antígenos GBS de la invención pueden estar aislados de Streptococcus agalactiae o pueden ser producidos recombinantemente, por ejemplo, en un huésped heterólogo. Preferiblemente, el antígenos GBS se preparan usando un huésped heterólogo. El huésped heterólogo puede ser procariota (p.ej., una bacteria) o eucariota. Es preferiblemente E. coli, pero otros huéspedes adecuados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, micobacterias (p.ej., M. tuberculosis), levaduras, etc.

La producción recombinante de polipéptidos se facilita mediante la adición de una proteína marcadora al antígeno GBS para expresarlo como una proteína de fusión que comprende la proteína marcadora y el antígeno GBS. Tales proteínas marcadoras pueden facilitar la purificación, la detección y la estabilidad de la proteína expresada. Las proteínas marcadoras adecuadas para su uso en la invención incluyen una etiqueta de poliarginina (etiqueta Arg), una etiqueta de polihistidina (etiqueta His), una etiqueta FLAG, una etiqueta Strep, una etiqueta c–myc, una etiqueta S, un péptido de unión a calmodulina, un dominio de unión a celulosa, un etiqueta SBP, un dominio de unión a quitina, etiqueta de glutationa S–transferasa (GST), proteína de unión a maltosa, factor contra la terminación de la transcripción (NusA), tiorredoxina de E. coli (TrxA) y proteína disulfuro isomerasa I (DsbA). Las proteínas marcadores preferidas incluyen la etiqueta His y GST. En la Ref. 3, se puede encontrar una descripción completa del uso de proteínas marcadoras.

Tras la purificación, las proteínas marcadoras se pueden eliminar opcionalmente de la proteína de fusión expresada, i.e., mediante tratamientos enzimáticos específicos conocidos en la técnica. Las proteasas usadas comúnmente incluyen enteroquinasa, el virus del mosaico del tabaco (TEV), la trombina y el factor Xa.

Polisacáridos GBS

Las composiciones de la invención se pueden mejorar más mediante la inclusión de polisacáridos GBS. Preferiblemente, tanto el antígeno como el sacárido GBS contribuyen a la respuesta inmunológica en el receptor. La combinación es particularmente ventajosa cuando el sacárido y el polipéptido proporcionan protección contra diferentes serotipos de GBS.

Los antígenos combinados pueden estar presentes como una combinación simple en la que los antígenos de sacárido y de polipéptido separados se administren conjuntamente, o pueden presentarse como una combinación conjugada, en la que los antígenos de sacárido y polipéptido están ligados covalentemente entre sí.

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Por tanto, la invención proporciona una composición inmunógena que comprende (i) uno o más antígenos de polipéptido GBS y (ii) uno o más antígenos de sacárido GBS. El polipéptido y el polisacárido pueden ser ventajosamente ligados de manera covalente entre sí para formar un conjugado.

Entre ellos, los antígenos de polipéptido y sacárido combinados cubren preferiblemente (o proporcionan protección contra) dos o más serotipos de GBS (p.ej., 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 o más serotipos). Los serotipos de los antígenos de polipéptido y sacárido pueden solaparse o no. Por ejemplo, el polipéptido podría proteger contra el serogrupo II o V, mientras que el sacárido protege contra cualquiera de los serogrupos Ia, Ib o III. Las combinaciones preferidas protegen contra los siguientes grupos de serotipos: (1) serotipos Ia y Ib, (2) serotipos Ia y II, (3) serotipos Ia y III, (4) serotipos Ia y IV, (5) serotipos Ia y V, (6) serotipos Ia y VI, (7) serotipos Ia y VII, (8) serotipos Ia y VIII, (9) serotipos Ib y II, (10) serotipos Ib y III, (11) serotipos Ib y IV, (12) serotipos Ib y V, (13) serotipos Ib y VI, (14) serotipos Ib y VII,

(15) serotipos Ib y VIII, 16) serotipos II y III, (17) serotipos II y IV, (18) serotipos II y V, (19) serotipos II y VI, (20) serotipos II y VII, (21) serotipos II y VII, (22) serotipos III y IV, (23) serotipos III y V, (24) serotipos III y VI, (25) serotipos III y VII, (26) serotipos III y VIII, (27) serotipos IV y V, (28) serotipos IV y VI, (29) serotipos IV y VII, (30) serotipos IV y VIII, (31) serotipos V y VI, (32) serotipos V y VII, (33) serotipos V y VIII, (34) serotipos VI y VII, (35) serotipos VI y VIII, y (36) serotipos VII y VIII.

Incluso más preferiblemente, las combinaciones protegen contra los siguientes grupos de serotipos: (1) serotipos Ia y II, (2) serotipos Ia y V, (3) serotipos Ib y II, (4) serotipos Ib y V, (5) serotipos III y II y (6) serotipos III y V. Lo más preferible es que las combinaciones protejan contra serotipos III y V.

La protección contra los serotipos II y V se proporciona preferiblemente mediante los antígenos de polipéptido. La protección contra los serotipos Ia, Ib y/o III se puede proporcionar mediante antígenos de polipéptido o de sacárido.

En una realización, la composición inmunógena comprende un antígeno de sacárido GBS y al menos dos antígenos de polipéptido GBS, o fragmentos de los mismos, en la que dicho antígeno de sacárido GBS comprende un sacárido seleccionado entre el serotipo de GBS Ia, Ib y III, y en la que dichos antígenos de polipéptido GBS comprenden una combinación de al menos dos polipéptidos o un fragmento de los mimos seleccionados entre el grupo de antígenos que consiste en GBS 80, GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 y GBS 691. Preferiblemente, la combinación incluye uno o más de entre GBS 80, GBS 104 y GBS 322. Incluso más preferiblemente, la combinación incluye GBS 80 o un fragmento del mismo.

En ciertas realizaciones, las composiciones de la invención no incluyen un polisacárido GBS. En ciertas realizaciones, la combinación no incluye uno o más de los antígenos GBS seleccionados del grupo que consiste en GBS 4, GBS 22, GBS 85, GBS 338 y GBS 361.

Composiciones inmunógenas y medicamentos

Las composiciones de la invención son composiciones preferiblemente inmunógenas, y más preferiblemente, composiciones de vacuna. El pH de la composición es preferiblemente de entre 6 y 8, preferiblemente, de aproximadamente 7. El pH se puede mantener mediante el uso de un tampón. La composición puede ser estéril y/o estar libre de pirógenos. La composición puede ser isotónica con respecto a seres humanos.

Las vacunas según la invención pueden ser bien profilácticas (i.e., para prevenir la infección) o terapéuticas (i.e., para tratar la infección), pero comúnmente serán profilácticas. Por consiguiente, la invención incluye un procedimiento para el tratamiento terapéutico o profiláctico de un infección producida por Streptococcus agalactiae en un animal susceptible a la infección por estreptococos que comprende administrar a dicho animal una cantidad terapéutica o profiláctica de las composiciones inmunógenas de la invención.

La invención también proporciona una composición de la invención para su uso como un medicamento. El medicamento es preferiblemente capaz de generar una respuesta inmune en un mamífero (i.e., es una composición inmunógena) y más preferiblemente, es una vacuna.

La invención también proporciona el uso de las composiciones de la invención en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmune en un mamífero. El medicamento es preferiblemente una vacuna.

La invención también proporciona un kit que comprende un primer componente que comprende una combinación de antígenos GBS.

La invención también proporciona un dispositivo de administración prellenado con las composiciones inmunógenas de la invención.

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La invención también proporciona un procedimiento para generar una respuesta inmune en un mamífero que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención. La respuesta inmune es preferiblemente protectora e implica preferiblemente anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.

Preferiblemente, el mamífero es un ser humano. Cuando la vacuna es para un uso profiláctico, el ser humano es preferiblemente una mujer (bien en edad fértil o adolescente). Alternativamente, el ser humano puede ser de edad (p.ej., por encima de los 50, 55, 60, 65, 70 o 75 años) y puede tener una enfermedad subyacente, tal como diabetes o cáncer. Cuando la vacuna es para un uso terapéutico, el ser humano es preferiblemente una mujer embarazada o un adulto de mayor edad.

Estos usos y procedimientos son preferiblemente para la prevención y/o el tratamiento de una enfermedad causada por Streptococcus agalactiae. Las composiciones también pueden ser eficaces contra otras bacterias estreptocócicas.

Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección por GBS tras la administración de la composición de la invención. Un modo de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunes contra los antígenos GBS de las composiciones de la invención tras la administración de la composición.

Las composiciones de la invención serán generalmente administradas directamente a un paciente. La administración directa se puede realizar mediante la inyección parenteral (p.ej., subcutánea, intraperitoneal, intradérmica, intravenosa, intramuscularmente o en el espacio intersticial de un tejido) o por vía rectal, oral (p.ej., comprimido, pulverizado), vaginal, tópica, transdérmica {p.ej., véase la Ref. 4} o transcutánea (p.ej., véanse las Ref. 5 y 6), intranasal {p.ej., véase la Ref. 7}, ocular, aural, pulmonar o por otra mucosa.

La invención se puede usar para generar inmunidad sistémica y/o mucosa.

El tratamiento de dosificación puede ser un calendario de una sola dosis o un calendario de múltiples dosis. Se pueden usar múltiples dosis en un calendario de inmunizaciones primarias y/o en un calendario de inmunizaciones de refuerzo. En un calendario de múltiples dosis, las diversas dosis se pueden administrar por la misma vía o por vías diferentes, p.ej., una primera administración parenteral y un refuerzo por vía mucosa, una primera administración por vía mucosa y un refuerzo parenteral, etc.

Las composiciones de la invención se pueden preparar en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones se pueden preparar como inyectables, bien como soluciones o suspensiones líquidas. También se pueden preparar formas sólidas adecuadas para una disolución o suspensión en vehículos líquidos antes de la inyección (p.ej., una composición liofilizada). La composición se puede preparar para una administración tópica, p.ej., como una pomada, crema o polvo. La composición se puede preparar para una administración oral, p.ej., como un comprimido o cápsula, como un pulverizado o como un jarabe (opcionalmente aromatizado). La composición se puede preparar para una administración pulmonar, p.ej., como un inhalador, usando un polvo fino o un pulverizado. La composición se puede preparar como un supositorio o un pesario. La composición se puede preparar para una administración nasal, aural u ocular, p.ej., en forma de gotas. La composición puede estar en forma de kit, diseñado de modo que se reconstituya una composición combinada justo antes de su administración a un paciente. Tales kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.

Las composiciones inmunógenas usadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno(s), así como cualquier otro componente, si se precisa. “Cantidad inmunológicamente eficaz” pretende significar que la administración de esa cantidad a un individuo, bien en una sola dosis o como parte de una serie de dosis, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía en función de la salud y el estado físico del individuo que vaya a ser tratado, la edad, el grupo taxonómico del individuo que vaya a ser tratado (p.ej., primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmune del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseado, la formulación de la vacuna, la valoración del doctor que le esté tratando sobre su situación médica y otros factores relevantes. Se espera que la cantidad pertenezca a un intervalo relativamente amplio que se puede determinar a través de pruebas rutinarias.

Otros componentes de la composición

La composición de la invención comprenderá comúnmente, además de los componentes mencionados anteriormente, uno o más “vehículos farmacéuticamente aceptables”, que incluyen cualquier vehículo que no induzca por sí mismo la producción de anticuerpos dañinos para el individuo que reciba la composición. Los vehículos adecuados son comúnmente macromoléculas grandes, lentamente metabolizadas tales como proteínas, polisacáridos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácidos y agregados de lípidos (tales como gotas de aceite o liposomas). Tales vehículos son ampliamente conocidos por aquéllos expertos habituales en la técnica. Las vacunas también pueden contener diluyentes tales como agua, solución salina, glicerol, etc. Además, pueden estar presentes sustancias auxiliares, tales como agentes humectantes o emulsionantes, sustancias tamponadores del pH, y similares. En la referencia 8, se encuentra una descripción minuciosa de los excipientes farmacéuticamente aceptables.

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Las vacunas de la invención se pueden administrar en combinación con otros agentes inmunorreguladores. En concreto, las composiciones habitualmente incluirán un adyuvante.

Otros adyuvantes preferidos incluyen, pero no se limitan a, uno o más de los adyuvantes que se exponen a continuación:

A. Composiciones que contienen minerales

Las composiciones que contienen minerales adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio. La invención incluye sales minerales, tales como hidróxidos (p.ej., oxihidróxidos), fosfatos (p.ej., hidroxifosfatos, ortofosfatos), sulfatos, etc., {p.ej., véanse los capítulos 8 y 9 de la Ref. 9} o mezclas de diferentes compuestos minerales, adoptando los compuestos cualquier forma adecuada (p.ej., gel, cristalina, amorfa, etc.) y prefiriéndose la adsorción. Las composiciones que contienen minerales también pueden estar formuladas en forma de una partícula de sal metálica. Véase la Ref. 10.

B. Emulsiones oleaginosas

Las composiciones de emulsiones oleaginosas adecuadas para su uso como adyuvantes en la invención incluyen emulsiones de escualeno–agua, tales como MF59 (escualeno al 5%, Tween 80 al 0,5% y Span 85 al 0,5%, formulada en partículas submicrométricas usando un microfluidizador). Véase el documento WO90/14837. Véase también, Frey et al., "Comparison of the safety, tolerability, and immunogenicity of a MF59–adjuvanted influenza vaccine and a non–adjuvanted influenza vaccine in non–elderly adults", Vaccine (2003) 21:4234 – 4237.

Los adyuvantes particularmente preferidos para su uso con las composiciones son emulsiones de aceite en agua submicrométricas. Las emulsiones de aceite en agua submicrométricas preferidas para su uso en la presente memoria son emulsiones de escualeno/agua que contienen opcionalmente diversas cantidades de MTP–PE, tales como una emulsión de aceite en agua submicrométrica que contiene escualeno al 4–5% p/v, Tween 80™ al 0,25– 1,0% p/v (monooleato de polioxieltilenosorbitán) y/o Span 85™ al 0,25–1,0% (trioleato de sorbitán) y, opcionalmente, N–acetilmuramil–L–alanil–D–isoglutaminil–L–alanina–2–(1’–2’–dipalmitoil–sn–glicero–3–hidroxifosfoforiloxi)–etilamina (MTPPE), por ejemplo, la emulsión de aceite en agua submicrométrica conocida como "MF59" (publicación internacional n.º WO 90/14837; patentes estadounidenses n.º 6.299.884 y 6.451.325, incorporadas en la presente memoria por referencia en su totalidad; y Ott et al., "MF59 –Design and Evaluation of a Safe and Potent Adjuvant for Human Vaccines" en Vaccine Design: The Subunit and Adjuvant Approach (Powell, M.F. y Newman, M.J. eds.) Plenum Press, Nueva York, 1995, pp. 277–296). MF59 contiene escualeno al 4–5% p/v (p.ej., 4,3%), Tween 80™ al 0,25–0,5% p/v y Span 85™ al 0,5% p/v, y contiene opcionalmente diversas cantidades de MTP–PE, formuladas en partículas submicrométricas usando un microfluidizador tal como el microfluidizador de Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA). Por ejemplo, MTP–PE puede estar presente en una cantidad de aproximadamente 0–500 μg/dosis, más preferiblemente, 0–250 μg/dosis y lo más preferible, 0–100 μg/dosis. Como se usa en la presente memoria, el término “MF59–0” se refiere a la anterior emulsión de aceite en agua submicrométrica que carece de MTP–PE, mientras que el término MF59–MTP denota una formulación que contiene MTP–PE. Por ejemplo, “MF59–100” contiene 100 μg de MTP–PE por dosis, etcétera. MF69, otra emulsión de aceite en agua submicrométrica para su uso en la presente memoria, contiene un 4,3% p/v de escualeno, Tween 80™ al 0,25% p/v y Span 85™ al 0,75% p/v y, opcionalmente, MTP–PE. Otra emulsión de aceite en agua submicrométrica más es MF75, también conocida como SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80™ al 0,4%, polímero en bloque de plurónico al 5% L121 y thr– MDP, también microfluidificado en una emulsión submicrométrica. MF75–MTP denota una formulación de MF75 que incluye MTP, tal como de 100–400 μg de MTP–PE por dosis.

En la publicación internacional n.º WO 90114837 y las patentes estadounidenses n.º 6.299.884 y 6.451.325, incorporadas en la presente memoria por referencia en su totalidad, se describen emulsiones de aceite en agua submicrométricas, procedimientos para elaborar las mismas y agentes inmunoestimulantes, tales como los péptidos de muramilo, para su uso en las composiciones.

También se pueden usar adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF) como adyuvantes en la invención.

C. Formulaciones de saponina

Como adyuvantes de la invención, también se pueden usar formulaciones de saponina. Las saponinas son un grupo heterólogo de glucósidos de esterol y glucósidos de triterpenoide que se encuentran en la corteza, las hojas, los tallos, las raíces e incluso en las flores de una amplia selección de especies vegetales. La saponina procedente de la corteza del árbol Quillaia saponaria Molina ha sido ampliamente estudiada como adyuvante. La saponina también se puede obtener comercialmente de Smilax ornata (zarzaparrilla), Gypsophilla paniculata (velo de novia) y Saponaria officianalis (jabonera). Las formulaciones con adyuvante de saponina incluyen formulaciones purificadas, tales como QS21, así como las formulaciones de lípidos, tales como las ISCOM.

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Se han purificado composiciones de saponina usando una cromatografía de capa fina de alta resolución (CCF–AR) y cromatografía en fase líquida de alta resolución en fase inversa (CLAR–FI). Se han identificado las fracciones purificadas específicas obtenidas mediante estas técnicas, e incluyen QS7, QS17, QS18, QS21, QH–A, QH–B y QH–C. Preferiblemente, la saponina es QS21. En la patente estadounidense n.º 5.057.540, se revela un procedimiento para la producción de QS21. Las formulaciones de saponina también pueden comprender un esterol, tal como colesterol (véase el documento WO 96/33739). Se pueden usar combinaciones de saponinas y colesteroles para formar partículas únicas denominadas complejos inmunoestimulantes (ISCOM). Los ISCOM también incluyen comúnmente un fosfolípido tal como fosfatidiletanolamina o fosfatidilcolina. Se puede usar cualquier saponina conocida e los ISCOM. Preferiblemente, el ISCOM incluye uno o más entre Quil A, QHA y QHC. Los ISCOM también se describen en los documentos EP 0 109 942, WO 96/11711 y WO 96/33739. Opcionalmente, los ISCOM pueden carecer de otro detergente. Véase la Ref. 11.

En la Ref. 12, se puede encontrar una revisión de la elaboración de adyuvantes basados en saponinas.

C. Virosomas y partículas de tipo viral (VLP)

Los virosomas y las partículas de tipo viral (VLP) también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Estas estructuras generalmente contienen una o más proteínas de un virus opcionalmente, combinadas o formuladas con un fosfolípido. En general, son no patógenas, no replicantes y, generalmente, no contienen ninguno de los genomas virales nativos. Las proteínas virales se pueden producir recombinantemente o ser aisladas de los virus enteros. Estas proteínas virales adecuadas para su uso en virosomas o VLP incluyen proteínas derivadas del virus de la gripe (tales como HA o NA), virus de la hepatitis B (tales como proteínas del núcleo o de la cápside), virus de la hepatitis E, virus del sarampión, Virus Sindbis, Rotavirus, virus de la fiebre aftosa, Retrovirus, Virus Norwalk, virus del papiloma humano, VIH, fagos de ARN, fago Qβ (tales como proteínas de la cubierta), fago GA, fago fr, fago AP205 y Ty (tal como la proteína p1 del retrotransposón de Ty). En los documentos WO 03/024480, WO 03/024481 y en las Ref. 13, 14, 15 y 16, también se describen VLP. Los virosomas se describen también, por ejemplo, en la Ref. 17.

D. Derivados bacterianos y microbianos

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen derivados bacterianos o microbianos, tales como:

(1) derivados no tóxicos de lipopolisacárido (LPS) enterobacterianoTales derivados incluyen el lípido A monofosforilado (MPL) y MPL 3–O–desacilado (3dMPL). 3dMPL es una mezcla del lípido A monofosforilado 3 Des– O–acilado con 4, 5 ó 6 cadenas aciladas. En el documento EP 0 689 454, se revela una forma “de partícula pequeña” preferida del lípido A monofosforilado 3 Des–O–acilado. Tales “partículas pequeñas” de 3dMPL son lo suficientemente pequeñas para ser filtradas en condiciones estériles a través de una membrana de 0,22 micrómetros (véase el documento EP 0 689 454). Otros derivados de LPS no tóxicos incluyen los mímicos del lípido A monosfoforilado, tales como derivados de aminoalquil–glucosaminida–fosfato, p.ej., RC–529. Véase la Ref. 18.

(2) Derivados de lípidos A

Los derivados de lípidos A incluyen derivados del lípido A de Escherichia coli, tales como OM–174. OM–174 se describe, por ejemplo, en la Ref. 19 y 20.

(3) Oligonucleótidos inmunoestimulantes

Los oligonucleótidos inmunoestimulantes adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen secuencias de nucleótidos que contienen un motivo CpG (una secuencia que contiene una citosina desmetilada seguida por una guanosina y ligada por un enlace de tipo fosfato). También se ha observado que el ARN bicatenario bacteriano o los oligonucleótidos que contienen secuencias palindrómicas o poly(Dg) son inmunoestimulantes.

Los CpG pueden incluir modificaciones/análogos de nucleótidos, tales como modificaciones del fosforotioato, y pueden ser bicatenarios o monocatenarios. Opcionalmente, se puede sustituir la guanosina por un análogo, tal como 2’–desoxi–7–desazaguanosina. Véase la Ref. 21, el documento WO 02/26757 y el WO 99/62923 para ejemplos de posibles sustituciones de análogos. También se describe el efecto adyuvante de los oligonucleótidos CpG en las Ref. 22, 23, WO 98/40100, la patente estadounidense n.º 6.207.646, la patente estadounidense n.º 6.239.116 y la patente estadounidense n.º 6.429.199.

La secuencia de CpG puede ser dirigida a TLR9, tal como el motivo GTCGTT o TTCGTT. Véase la Ref. 24. La secuencia de CpG puede ser específica para inducir una respuesta inmune de Th1, tal como un ODN CpG–A, o puede ser más específica de la inducción de una respuesta de lifocitos B, tal como ODN CpG–B. Los ODN CpG–A y ODN CpG–B se describen en las Ref. 25, 26 y WO 01/95935. Preferiblemente, el CpG es un ODN CpG–A.

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Preferiblemente, el oligonucleótido CpG está construido de manera que el extremo 5' sea accesible para el reconocimiento de receptores. Opcionalmente, se pueden unir dos secuencias de oligonucleótidos CpG por sus extremos 3’ para formar “inmunómeros”. Véanse, por ejemplo, las Ref. 27, 28, 29 y WO 03/035836.

(4) Toxinas de ribosilación del ADP y sus derivados desintoxicados

Las toxinas bacterianas de ribosilación del ADP y sus derivados desintoxicados se pueden usar como adyuvantes en la invención. Preferiblemente, la proteína deriva de E. coli (i.e., la enterotoxina lábil al calor de E. coli “LT”), cólera (“CT”) o pertussis (“PT”). El uso de toxinas de ribosilación del ADP desintoxicadas como adyuvantes mucosos se describe en el documento WO 95/17211 y como adyuvantes parenterales, en el documento WO 98/42375. Preferiblemente, el adyuvante es un mutante de LT desintoxicado, tal como LT–K63.

E. Inmunomoduladores humanos

Los inmunomoduladores humanos adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen citoquinas, tales como interleuquinas (p.ej., IL–1, IL–2, IL–4, IL–5, IL–6, IL–7, IL–12, etc.), interferones (p.ej., interferón y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral.

F. Bioadhesivos y mucoadhesivos

Los bioadhesivos y los mucoadhesivos también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Los bioadhesivos adecuados incluyen microesferas de ácido hialurónico esterificado (Ref. 30) o mucoadhesivos, tales como derivados entrecruzados de ácido poli(acrílico), alcohol polivinílico, pirrolidona polivinílica, polisacáridos y carboximetilcelulosa. El quitosán y los derivados del mismo también se pueden usar como adyuvantes en la invención. P.ej., Ref. 31.

G. Micropartículas

Las micropartículas también se pueden usar como adyuvantes en la invención. Se prefieren las micropartículas (i.e., una partícula de ~100 nm a ~150 μm de diámetro, más preferiblemente, de ~200 nm a ~30 μm de diámetro, y lo más preferible, de ~500 nm a ~10 μm de diámetro) formadas a partir de materiales que son biodegradables y no tóxicos (p.ej., un ácido poli(α–hidroxílico), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.), con poli(lactida–co–glucólido), opcionalmente, tratadas para que tengan una superficie cargada negativamente (p.ej., con SDS) o una superficie cargada positivamente (p.ej., con un detergente catiónico, tal como CTAB).

H. Liposomas

En la patente estadounidense n.º 6.090.406, la patente estadounidense n.º 5.916.588 y EP 0 626 169, se describen ejemplos de formulaciones de liposomas adecuadas para su uso como adyuvantes.

I. Formulaciones de polioxietilen–éter y polioxitilen–éster

Los adyuvantes adecuados para su uso en la invención incluyen polioxietilen–éteres y polioxitilen–ésteres. Ref. 32. Tales formulaciones incluyen además tensioactivos de polioxietilensorbitán–éster en combinación con un octoxinol (Ref. 33), así como tensioactivos de polioxietilenalquil–éteres o –ésteres en combinación con al menos un tensioactivo no iónico más, tal como octoxinol (Ref. 34).

Los polioxietilen–éteres preferidos se seleccionan entre el siguiente grupo: polyoxietilen–9–lauril–éter (laureth 9), polioxietilen–9–esteoril–éter, polioxietilen–8–esteoril–éter, polioxietilen–4–lauril–éter, polioxietilen–35–lauril–éter y polioxietilen–23–lauril–éter.

J. Polifosfaceno (PCPP)

Las formulaciones de PCPP se describen, por ejemplo, en las Ref. 35 y 36.

K. Péptidos de muramilo

Los ejemplos de péptidos de muramilo adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen N–acetil– muramil–L–treonil–D–isoglutamina (thr–MDP), N–acetil–normuramil–L–alanil–D–isoglutamina (nor–MDP) y N– acetilmuramil–L–alanil–D–isoglutaminil–L–alanina–2–(1’–2’–dipalmitoil–sn–glicero–3–hidroxifosforiloxi)–etilamina (MTP–PE).

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L. Compuestos de imidazoquinolona

Los ejemplos de compuestos de imidazoquinolona adecuados para su uso como adyuvantes en la invención incluyen Imiquamod y sus homólogos, descritos más detalladamente en las Ref. 37 y 38.

La invención también puede comprender combinaciones de aspectos de uno o más de los adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, en la invención, se pueden usar las siguientes composiciones adyuvantes:

(1): una saponina y una emulsión de aceite en agua (Ref. 39);

(2): una saponina (p.ej., QS21) + un derivado de LPS no tóxico (p.ej., 3dMPL) (véase WO 94/00153);

(3): una saponina (p.ej., QS21) + un derivado de LPS no tóxico (p.ej., 3dMPL) + un colesterol;

(4): una saponina (p.ej., QS21) + 3dMPL + IL–12 (opcionalmente + un esterol) (Ref. 40);

(5): combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua (Ref. 41);

(6): SAF, que contiene escualeno al 10%, Tween 80 al 0,4%, polímero en bloque de plurónico al 5% L121 y thr–MDP, bien microfluidificado en una emulsión submicrométrica o sometido a movimientos vorticiales para generar una emulsión de partículas de mayor tamaño.

(7): Sistema de adyuvantes Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2%, Tween 80 al 0,2% y uno

o más componentes de la pared celular bacteriana del grupo que consiste en lípido A monofosforilado (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS), preferiblemente, MPL + CWS (Detox™); y

(8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) + un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dPML).

Las sales de aluminio y MF59 son los adyuvantes preferidos para una inmunización parenteral. Las toxinas bacterianas mutantes son los adyuvantes mucosos preferidos.

La composición puede incluir un antibiótico.

Otros antígenos

Las composiciones de la invención pueden comprender además uno o más antígenos que no sean antígenos GBS adicionales, incluyendo más antígenos bacterianos, virales o parasitarios.

En otra realización, las combinaciones de antígenos GBS de la invención se combinan con uno o más antígenos no GBS adicionales adecuados para su uso en una vacuna diseñada para proteger a individuos ancianos inmunocomprometidos. Por ejemplo, las combinaciones de antígenos GBS se pueden combinar con un antígeno derivado del grupo que consiste en Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Staphylococcus epidermis, Pseudomonas aeruginosa, Legionella pneumophila, Listeria monocytogenes, Neisseria meningitides, virus de la gripe y virus de la parainfluenza (“PIV”).

Cuando se usa un antígeno de sacárido o de carbohidrato, está preferiblemente conjugado con una proteína transportadora para aumentar la inmunogenicidad {p.ej., Ref. 42 a 51}. Las proteínas transportadoras preferidas son toxinas bacterianas o toxoides, tales como difteria o toxoides de tétanos. Se prefiere particularmente el toxoide de la difteria CRM197 {52}. Otros polipéptidos transportadores incluyen proteína de la membrana externa de N. meningitidis {53}, péptidos sintéticos {54, 55}, proteínas de choque térmico {56, 57}, proteínas de pertussis {58, 59}, proteína D de H. influenzae {60}, citoquinas {61}, linfoquinas, hormonas, factores de crecimiento, toxina A o B de C. difficile {62}, proteínas de reabsorción de hierro {63}, etc. Cuando una mezcla comprende sacáridos capsulares de ambos serogrupos A y C, puede ser preferible que la proporción (p/p) del sacárido MenA:sacárido MenC sea mayor de 1 (p.ej., 2:1, 3:1, 4:1, 5:1, 10:1 o superior). Se pueden conjugar diferentes sacáridos con el mismo tipo o un tipo diferente de proteína transportadora. Se puede usar cualquier reacción de conjugación adecuada con cualquier ligador adecuado cuando sea necesario.

Los antígenos de proteínas tóxicas se pueden desintoxicar cuando sea necesario, p.ej., realizar una desintoxicación de la toxina pertussis mediante procedimientos químicos y/o genéticos.

Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, es preferible que también incluya antígeno de tétanos y antígenos de pertussis. De igual manera, cuando se incluye un antígeno de tétanos, es preferible que también incluya antígenos de difteria y pertussis. De igual manera, cuando se incluye un antígeno de pertussis, es preferible que también incluya antígenos de difteria y tétanos.

Los antígenos de la composición estarán comúnmente presentes a una concentración de al menos 1 μg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para provocar una respuesta inmune contra ese antígeno.

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Como alternativa al uso de antígenos proteicos en la composición de la invención, se puede usar un ácido nucleico que codifique el antígeno {p.ej., Ref. 64 a 72}. Por tanto, se pueden sustituir los componentes proteicos de las composiciones de la invención por ácido nucleico (preferiblemente, ADN, p.ej., en forma de un plásmido) que codifique a la proteína.

Definiciones

La expresión “que comprende” significa “que incluye”, así como “que consiste en”, p.ej., una composición “que comprende” X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo más, p.ej., X +Y.

El término “aproximadamente” en relación con un valor numérico x significa, por ejemplo x ± 10%.

Las referencias a un porcentaje de identidad secuencial entre dos secuencias de aminoácidos significa que cuando se alinean, ese porcentaje de aminoácidos es el mismo al comparar las dos secuencias. La alineación y el porcentaje de homología o de identidad secuencial se pueden determinar usando programas informáticos conocidos en la técnica como, por ejemplo, los descritos en el apartado 7.7.18 de la referencia 73. Una alineación preferida se determina mediante el algoritmo de búsqueda de homologías de Smith–Waterman usando una búsqueda de huecos afines con una penalización por abertura de hueco de 12 y una penalización por extensión de hueco de 2, matriz de BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homologías de Smith–Waterman se revela en la referencia 74.

REFERENCIAS (cuyos contenidos se encuentran incorporados en la presente memoria por referencia)

1.: Tettelin et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. EE.UU.,10.1073/pnas.182380799.

2.: Solicitud de patente internacional WO02/34771.

3.: Terpe et al., "Overview of tag protein fusions: from molecular and biochemical fundamentals to commercial systems", Appl Microbiol Biotechnol (2003) 60:523 – 533.

4.: WO99/27961.

5.: WO02/074244.

6.: WO02/064162.

7.: WO03/028760.

8.: Gennaro (2000), “Remington: The Science and Practice of Pharmacy”. XX ed., ISBN: 0683306472.

9.: “Vaccine design:the subunit and adjuvant approach” (1995) Powell & Newman. ISBN 0–306–44867–X.

10.: WO00/23105.

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Claims

REIVINDICACIONES

1. Una composición que es isotónica con respecto a los seres humanos y/o está liofilizada, composición que comprende una combinación de dos o más antígenos GBS, en la que dicha combinación incluye:

i) GBS 80 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 2 o un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma; y

ii) al menos uno entre

GBS 91 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 11, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 104 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 19, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 184 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 24, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 276 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 27, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 305 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 32, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 322 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 37, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 330 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 40, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 338 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 42, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 361 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 45, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 404 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 48, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 690 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 50, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma,

GBS 691 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEC ID N.º 53, un fragmento inmunógeno de la misma o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad secuencial del 80% o mayor con la misma.
2.

La composición de la reivindicación 1, en la que dicha combinación de antígenos GBS demuestra tener una mejor inmunogenicidad medida mediante el ensayo de inmunización materna activa, en la que dicho ensayo de inmunización materna activa mide los títulos en suero de ratones hembra durante un calendario de inmunizaciones y la tasa de supervivencia (%) de las crías tras la prueba de provocación.
3.

La composición de la reivindicación 2, en la que la tasa de supervivencia (%) de las crías sometidas a la prueba de provocación es de al menos 2 puntos porcentuales superior a la tasa de supervivencia (%) de las crías sometidas a la prueba de provocación que proceden de ratones hembra inmunizadas con un solo antígeno distinto del GBS 80.
4.

La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1–3, en la que dicha combinación consiste en dos a trece antígenos GBS seleccionados entre GBS 80, GBS 91, GBS104, GBS184, GBS276, GBS305, GBS322, GBS330, GBS338, GBS361, GBS404, GBS690 y GBS691, fragmentos inmunógenos de dichos antígenos GBS, o secuencias polipeptídicas que tienen una identidad secuencial del 80% o superior con dichos antígenos GBS.
5.

La composición de la reivindicación 4, en la que dicha combinación consiste en dos, tres, cuatro o cinco de dichos antígenos GBS.
6.

La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1–5, en la que el fragmento de GBS 80 comprende la secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en las SEC ID N.º 3, 4, 5, 6, 7, 8 y 9.
7.

La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1–6, en la que dicha combinación incluye GBS 80, GBS

104 y GBS 322, o fragmentos inmunógenos de dichos antígenos GBS, o secuencias polipeptídicas que tienen una identidad secuencial del 80% o mayor con dichos antígenos GBS.
8.

La composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1–7, en la que el antígeno GBS 80, un fragmento inmunógeno o una secuencia polipeptídica que tiene una identidad del 80% o mayor con GBS 80 se expresa como

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5 un polipéptido de fusión con al menos un antígeno GBS seleccionado entre GBS 91, GBS 104, GBS 184, GBS 276, GBS 305, GBS 322, GBS 330, GBS 338, GBS 361, GBS 404, GBS 690 o GBS 691, fragmentos inmunógenos de los mismos o secuencias polipeptídicas que tienen una identidad del 80% o mayor con dichos antígenos GBS.
9. La composición de la reivindicación 8 que comprende un polipéptido de fusión que consiste esencialmente en el

antígeno GBS 80 y el antígeno GBS 322, o fragmentos inmunógenos de los mismos, o secuencias polipeptídicas 10 que tienen una identidad del 80% o mayor con dichos antígenos GBS.
10.

Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1–9 para su uso en terapia.
11.

Una composición según una cualquiera de las reivindicaciones 1–9 para el tratamiento terapéutico o profiláctico de la infección por GBS.
12. El uso de una composición de una cualquiera de las reivindicaciones 1–9 en la fabricación de un medicamento 15 para el tratamiento o la prevención de una infección por GBS.