ES2837825T3 - Antígenos y combinaciones de antígenos - Google Patents

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Abstract

Una composición inmunogénica que comprende un antígeno de H. influenzae no tipable NT067 para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por H. influenzae en un mamífero, en el que dicho antígeno NT067 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 95 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 5.

Description

DESCRIPCIÓN
Antígenos y combinaciones de antígenos
Campo técnico
La presente invención se encuentra en el campo de la inmunología y vacunología de Haemophilus influenzae, en particular H. influenzae no tipable (NTHI, forma siglada de non-typeable H. influenzae). La invención proporciona composiciones inmunogénicas que comprenden polipéptidos de antígenos y combinaciones de polipéptidos de antígenos para generar anticuerpos y respuestas inmunitarias, y contra cepas de H. influenzae. La invención también proporciona composiciones que contienen tales antígenos, y el uso de las mismas como vacunas o medicamentos contra H. influenzae. La invención también proporciona composiciones inmunogénicas que contienen tales antígenos utilizados solos o en combinación, o utilizados junto con otras vacunas. La invención también proporciona procedimientos para generar respuestas inmunitarias contra H. influenzae, y procedimientos para el tratamiento y prevención de infecciones por H. influenzae.
Antecedentes de la técnica
Haemophilus influenzae es un cocobacilo gramnegativo pequeño, no móvil. Es un patógeno respiratorio que provoca un amplio espectro de infecciones en el ser humano, que incluyen: colonización asintomática de las vías respiratorias altas (es decir, estado de portador); infecciones que se extienden desde las superficies de la mucosa colonizada para provocar otitis media (inflamación del oído medio), bronquitis, conjuntivitis, sinusitis, infecciones de las vías urinarias y neumonía; e infecciones invasivas, tales como bacteriemia, artritis séptica, epiglotitis, neumonía, empiema, pericarditis, celulitis, osteomielitis y meningitis. H. influenzae fue la primera bacteria para la que se publicó la secuencia genómica completa [1].
Las cepas de H. influenzae son encapsuladas (tipables) o no encapsuladas (no tipables), y hay seis tipos serológicos principales de cepas encapsuladas (a a f). El 95 % de las enfermedades invasivas causadas por H. influenzae están provocadas por cepas de H. influenzae tipo b ('Hib'). La manifestación más grave de la enfermedad por Hib es la meningitis, pero la introducción en los años ochenta de las vacunas a base de sacáridos capsulares de Hib ha reducido en gran manera la incidencia de esta enfermedad.
Aunque las infecciones por Hib pueden controlarse ahora por vacunación, otras cepas de H. influenzae patógenas mantienen un riesgo. Por ejemplo, H. influenzae no tipable (NTHI) es responsable de la otitis media (OM), particularmente OM crónica y aguda. Mientras que la OM se asocia raramente con mortalidad, se asocia con una morbilidad significativa. La sordera parcial es la complicación más común de la OM, siendo los retrasos en el desarrollo del comportamiento, educativo y del lenguaje consecuencias adicionales de la OM con derrame de inicio temprano. La OM aguda es la infección bacteriana más común en niños en los Estados Unidos. H. influenzae biogrupo aegyptius no tipable provoca conjuntivitis epidérmica y fiebre purpúrica brasileña (FPB) [2], teniendo la FPB una mortalidad de hasta el 70 %.
A la fecha, los antibióticos son la herramienta principal contra el espectro de las entidades clínicas conocidas en conjunto como OM, pero el uso generalizado de los antibióticos para la OM ha sido objeto de controversia debido a la aparición de microorganismos resistentes a múltiples antibióticos. El progreso hacia una vacuna es lento debido a un entendimiento incompleto de la patogenia de la OM y de la respuesta inmunitaria frente a ésta.
La secuencia genómica de la cepa de serotipo d KW20 [1,3] ha sido útil para entender la biológica básica de H. influenzae, pero no ha sido tan útil para contrarrestar las cepas de H. influenzae patógenas, ya que, en general, las cepas de serotipo d no son patógenas. Los polipéptidos de H. influenzae no tipable patógenos se han identificado e investigado como candidatos de vacunas. La referencia 4 desvela polipéptidos inmunogénicos de una cepa de H. influenzae no tipable, patógena.
Sin embargo, sigue habiendo una necesidad de proporcionar una vacuna que proteja contra un amplio espectro de cepas de H. influenzae. H. influenzae es un microorganismo versátil con una capacidad mejorada para adaptarse a nuevos nichos y provocar un amplio espectro de enfermedades. Los factores de aptitud, virulencia y colonización pueden cambiar, para permitir que el microorganismo se adapte a diferentes tejidos y hospedadores. Por lo tanto, los posibles antígenos están sometidos a una alta presión de selección y, como resultado, pueden tener variabilidad de secuencia entre las diferentes cepas.
Por tanto, sigue habiendo una necesidad de identificar antígenos adicionales y mejorados para su uso en las vacunas de Haemophilus influenzae no tipable, y en particular para vacunas que sean útiles contra múltiples patologías provocadas por NTHI.
La base de datos de los genomas disponibles en ncbi.nlm.nih.gov bajo genomas enumera genomas de Haemophilus influenzae patógenos y no patógenos, con tan poco como 2.500 proteínas a tanto como 4.000 proteínas. Sin embargo, tales enumerados no identifican cuáles están conservados a través de una fracción significativa de NHTI patógenas, cuáles son las regiones conservadas en las proteínas que están así conservadas o qué proteínas entre los miles de posibles proteínas pueden usarse en una vacuna para producir una respuesta inmunitaria suficiente para proteger contra NHTI patógena, lo que requiere cribar un gran número de proteínas para identificar los mejores candidatos.
El documento WO2010/092176 desvela varios antígenos de H. influenzae con efectos protectores. Es un objeto de la invención proporcionar más y mejores antígenos y/o combinaciones que sean eficaces para generar las respuestas inmunitarias contra las diferentes cepas de H. influenzae, para su uso en el desarrollo de vacunas para prevenir y/o tratar infecciones provocadas por patógenos de H. influenzae, en particular H. influenzae no tipable. En particular, es un objeto proporcionar polipéptidos y combinaciones de polipéptidos para su uso en composiciones inmunogénicas mejoradas y vacunas para prevenir y/o tratar tales infecciones, y en particular la otitis media aguda y la enfermedad pulmonar obstructiva crónica (EPOC). Los polipéptidos también pueden ser útiles para fines de diagnóstico y como dianas de antibióticos.
Divulgación de la invención
La presente invención describe polipéptidos de Haemophilus influenzae no tipable (NTHI) que son útiles para inmunización, para su uso ya sea solos o en combinación. Estos polipéptidos pueden combinarse también con otros polipéptidos de NTHI. Los antígenos son útiles en vacunas de NTHl, pero también pueden usarse como componentes en las vacunas para la inmunización contra múltiples patógenos.
Usando dos enfoques paralelos, en concreto, vacunología inversa y análisis proteómico de vesículas de membrana externa (las OMV, forma siglada de outer membrane vesicles), ha sido posible identificar antígenos que estén conservados entre 86 diferentes cepas de NTHI. La vacunología inversa utiliza el análisis in silico para identificar las proteínas conservadas en los genomas de diferentes cepas de NTHI y posiblemente expuestas en superficie. El segundo enfoque de centra en cambio en la identificación de antígenos analizando la espectrometría de masas de las proteínas contenidas en las vesículas de membrana externa producidas por NTHI.
El genoma de una cepa de NTHI incluye aproximadamente 1800 genes. Los inventores han identificado 274 antígenos conservados de 15 genomas completos más 39 cepas seleccionadas en función de la distribución geográfica y 32 cepas procedentes de una colección finlandesa de otitis media, todas actualmente disponibles públicamente. De estas 274, los inventores han seleccionado 53 polipéptidos de interés particular. Estos antígenos se seleccionaron de la cepa NP86-028, con la excepción de CGSHiGG_00130, que se ha seleccionado de PittG, CGSHiGG_02400, seleccionado de PittG, gi-145633184 seleccionado de la cepa 3655 y gi-145628236 seleccionado de la cepa 22.1-21.
Entre el grupo de 53 antígenos, se ha generado la siguiente selección adicional considerando criterios de inmunogenicidad y conservación:
• Un grupo de 26 antígenos denominado en el presente documento "el primer grupo de antígenos"
• Un grupo de 6 antígenos denominado en el presente documento "el segundo grupo de antígenos"
• Un grupo de 21 antígenos denominado en el presente documento "el tercer grupo de antígenos"
El grupo de antígenos más preferido se denomina en el presente documento "el primer grupo de antígenos". Por tanto, la divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende al menos un antígeno, que comprende preferentemente uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) antígenos seleccionados del grupo que consiste en: (1) NTHI0915 (NT018), (2) NTHI1416 (NT024), (3) NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038), (5) NTHI1292 (NT067), (6) NTHI0877 (NT001), (7) NTHI0266 (NT016), (8) CGSHiGG_00130 (NT052), (9) NTHI1627 (NT002), (10) NTHI1109 (NT026), (11) NTHI0821 (NT009), (12) NTHI0409 (NT025), (13) NTHI1954 (NT028), (14) NTHI0371 (NT029), (15) NTHI0509 (NT031), (16) NTHI0449 (NT015), (17) NTHI1473 (NT023), (18) gi-145633184 (NT100), (19) NTHI1110 (NT040), (20) gi-46129075 (NT048), (21) gi-145628236 (NT053), (22) NTHI1230 (NT066), (23) NTHI0522 (NT097), (24) NT004, (25) NT014, (26) NT022. Estos antígenos muestran una actividad bactericida positiva, como se muestra en la Tabla III y la Tabla IV.
Dentro del primer grupo de antígenos, los antígenos preferidos se seleccionan de un subgrupo de cualquiera de (1) antígeno NTHI0915 (NT018), (2) antígeno NTHI1416 (NT024), (3) antígeno NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038), (5) antígeno NTHI1292 (NT067), (6) antígeno NTHI0877 (NT001), (8) antígeno NT052, (24) antígeno NT004, (25) antígeno NT014, (26) antígeno NT022, (7) antígeno NTHI0266 NT016. Todos estos antígenos muestran un buen nivel de purificación, como se muestra en la Tabla II, y la eficacia de inmunogenicidad se informa en las Tablas III y IV.
Los antígenos particularmente preferidos fueron NT067, NT014, NT016, NT022.
Por tanto, la invención proporciona una composición inmunogénica que comprende un antígeno de H. influenzae no tipable NT067 para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por H. influenzae en un mamífero, en el que dicho antígeno NT067 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 95 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 5.
Además, se desvela una composición inmunogénica que comprende uno o más (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) antígenos seleccionados del grupo que consiste en el "primer grupo de antígenos".
Los inventores también han identificado los siguientes 6 polipéptidos: (24) P48 (NTHI0254 también definido como NT007), (25) HtrA (NTHI1905, también definido como NT006), (26) PE (NTHI0267 también definido como NT035), (27) P26 (NTHI0501 también definido como NT010), (28) PHiD (NTHI0811 también definido como NT080), (29) P6 (NTHI0501, también definido como NT081). Este grupo de 6 antígenos se denomina en el presente documento "el segundo grupo de antígenos".
Los inventores también han identificado los siguientes 22 polipéptidos: (30) NTHI0532 (NT013), (31) NTHI0363 (NT106), (32) NTHI0370 (NT107), (33) NTHI0205 (NT108), (34) NTHI0374 (NT109), (35) NTHI0579 (NT110), (36) NTHI0837 (NT111), (37) NTHI0849 (NT112), (38) NTHI0921 (NT113), (39) NTHI0995 (NT114), (40) NTHI1091 (NT115), (41) NTHI1169 (NT116), (42) NTHI1208 (NT117), (43) NTHI1318 (NT118), (44) NTHI1796 (NT123), (45) NTHI1930 (NT124), (46) NTHI1565 (NT119), (47) NTHI1569 (NT120), (48) NTHI1571 (NT121), (49) NTHI1667 (NT122), (50) NTHI0588 (NT061), (51) NTHI0915 (NT017). Este grupo de 22 antígenos se denomina en el presente documento "el tercer grupo de antígenos".
En el presente documento se desvela una composición que incluye al menos un antígeno (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del primero grupo de antígenos y/o al menos un antígeno (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del segundo grupo de antígenos y/o al menos un antígeno (es decir, 1,2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del tercer grupo de antígenos. Los antígenos del primer grupo de antígenos pueden seleccionarse del subgrupo más preferido de antígenos.
Además, se desvela una composición inmunogénica que comprende un antígeno seleccionado de cualquiera del primer grupo de antígenos o el segundo grupo de antígenos o el tercer grupo de antígenos.
Por tanto, en el presente documento se desvela una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos, comprendiendo dicha combinación dos o más (es decir, 2, 3, 4, 5, 6 o más) antígenos seleccionados del grupo que consiste en el "primer grupo de antígenos" y/o el "segundo grupo de antígenos" y/o el "tercer grupo de antígenos".
Cuando una composición incluye un antígeno del "segundo grupo de antígenos", se prefiere que la composición también deba incluir (i) al menos un antígeno adicional del "segundo grupo de antígenos" o (ii) al menos un antígeno del "primer grupo de antígenos" o el "tercer grupo de antígenos". Por tanto, la invención no abarcaría una composición que incluye, como su único componente antigénico, un solo antígeno del "segundo grupo de antígenos". Cuando una composición incluye dos o más antígenos del "segundo grupo de antígenos", se prefiere que la composición deba incluir al menos un antígeno que no es (a) un antígeno P48 (b) un antígeno HtrA (c) un antígeno PE o (d) un antígeno P26. Por tanto, la invención no abarca combinaciones solamente de P48, HtrA, PE y/o P26. De manera similar, la invención no abarca antígenos híbridos que incluyen "X" radicales solamente de P48, HtrA, PE y/o P26.
Dentro de los 11 antígenos preferidos del primer grupo de antígenos hay 55 parejas posibles de diferentes antígenos. Todas estas parejas se desvelan en el presente documento. Por tanto, en el presente documento se desvela una composición inmunogénica que comprende una pareja de antígenos, en la que dicha pareja es una de dichas 55 parejas.
En un ejemplo, una composición incluye al menos un antígeno (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del primer grupo de antígenos y/o al menos un antígeno (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del segundo grupo de antígenos, y/o al menos un antígeno (es decir, 1, 2, 3, 4, 5, 6 o más) seleccionado del tercer grupo de antígenos.
En todos los casos, los antígenos del primer grupo de antígenos pueden seleccionarse convenientemente del subgrupo más preferido de cualquiera de (1) NTHI0915 (NT018), (2) NTHI1416 (NT024), (3) NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038), (5) NTHI1292 (NT067), (6) NTHI0877 (NT001), (8) NT052, (24) NT004, (25) NT014, (26) NT022, (7) NT016.
Además, en el presente documento se desvela una composición inmunogénica que comprende una combinación de antígenos, comprendiendo dicha composición dos o más (es decir, 2, 3, 4 o 5) antígenos seleccionados del grupo que consiste en: (1) NTHI0915 (NT018), (2) NTHI1416 (NT024), (3) NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038), (5) NTHI1292 (NT067), (6) NTHI0877 (NT001), (8) NT052, (24) NT004, (25) NT014, (26) NT022, (7) NT016. La composición también puede incluir un adyuvante, por ejemplo, un adyuvante que comprende una emulsión de aceite en agua o una sal de aluminio.
La referencia 5 analiza antígenos de H. influenzae no tipable, entre otros, como candidatos para el posible uso en vacunas. Las referencias 6 a 10 se refieren, individualmente, a los polipéptidos de H. influenzae no tipable P48, HtrA, PE y P26, respectivamente y, entre otros, con su potencial inmunogénico. La referencia 5 también menciona HtrA, PE y p26 individualmente entre un número mayor de candidatos de vacunas y, por ejemplo, la referencia 10 se refiere al polipéptido PE. Sin embargo, estos antígenos pertenecen al "segundo grupo de antígenos" y no se describieron para su uso en combinación. Sorprendentemente, se ha descubierto ahora que una combinación de uno o más de estos antígenos (segundo grupo de antígenos) con al menos uno del antígeno enumerado en el "primer grupo de antígenos" es particularmente apropiada para generar una respuesta inmunitaria protectora contra H. influenzae no tipable.
Las combinaciones ventajosas son aquellas en las que dos o más antígenos actúan de forma sinérgica. Por tanto, la protección contra el patógeno NTHI alcanzada por su administración combinada supera la esperada por la simple adición de su eficacia protectora individual.
PRIMER GRUPO DE ANTÍGENOS
Antígeno NT018
El antígeno "NT018" se anota como una proteína que contiene la repetición TPR y también como subunidad de hemo liasa de maduración de citocromo c CcmH2. Se ha anotado como NTHI0915 en la cepa 86-028NP. Esta secuencia está altamente conservada entre todas las cepas analizadas y se predice que es una metal-peptidasa unida a membrana. NT018 está expuesta en superficie como se muestra en la Tabla III. NT018 se ha clonado y expresado a partir de otra cepa de no tipable, Fi176, que es una cepa aislada de la colección de otitis media de Finlandia.
Los antígenos NT018 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 1 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 1, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 018 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 1, tales como la SEQ ID NO: 49, que se ha clonado y expresado, y probado en inmunogenicidad (Tablas III, IV). Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 26, 27, 28 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 1, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 1. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT018 puede expresarse con sus 28 aminoácidos N-terminales de NT018 nativos (MNFTLIFILTTLVVALICfYp LLRQFKA; SEQ ID NO: 69) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT024
El antígeno "NT024" se anota como "proteína hipotética" y se ha anotado como NTH11416 en el genoma 86-028NP. Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT024 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 2 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 2, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 024 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 2, tales como la SEQ ID NO: 50 clonada a partir de la cepa Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 2, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 2. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT024 puede expresarse con los 20 aminoácidos N-terminales nativos de NT024 (MKLKLFFHIVLLCFSLPVWA; SEQ ID NO: 70) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT032
El antígeno "NT032" se anota como "proteína hipotética" y se ha anotado como NTHI2017 en el genoma 86-028NP. El dominio más conservado entre las cepas probadas se describe como "proteína de pliegue de OB (forma siglada de oligosaccharíde-binding, unión a oligosacáridos) bacteriana (BOF, forma siglada de Bacterial OB fold)". Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT032 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 3 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 3, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 032 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 3, tales como la SEQ ID NO: 51 clonada a partir de la cepa Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 3, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 3. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT032 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de NT032 (MKKFALATIFALATTSAFA; SEQ ID NO: 71) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT067
El antígeno "NT067" se anota como proteína transportadora ABC y se ha propuesto su función hipotética como la proteína OppA de unión de oligopéptidos periplásmica. En la cepa 86-028NP se ha anotado como NTH11292. Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT067 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 5 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 5; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 5, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 067 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 5, tales como la SEQ ID NO: 52 clonada a partir de la cepa Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 5, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 5. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT067 de la invención puede expresarse con los 20 aminoácidos N-terminales nativos de NT067 (MQHKLLFSAIALALSYSVQA; SEQ ID NO: 72) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT038
Este antígeno se conoce como la proteína Hia (adhesina de Haemophilus influenzae) [11] y se ha identificado en la cepa CGSHiGG_02400 como de 282 aa de longitud, sin embargo, es una forma truncada de Hia (616 aa) como se describe originalmente en la cepa 86-028NP o en otras cepas de NTHi. Este antígeno se ha clonado a partir de la cepa R2846.
Los antígenos NT038 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 4 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 4; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 4, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 038 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 4, tal como la SEQ ID NO: 53, que carece de los primeros 23 aminoácidos N-terminales nativos y 102 aminoácidos en el C-terminal. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 4. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C (incluso hasta 102 aa) y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 4, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 4. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT038 puede expresarse con los 23 aminoácidos N-terminales nativos de NT038 (MPFQYVTEDGKTVVKv Gn GYYEA; SEQ ID NO: 73) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT001
Este antígeno se ha anotado como NTHI0877 en el genoma 86-028NP y se conoce como lipoproteína de unión a D-metionina MetQ. MetD es un transportador ABC que codifica un sistema de captación de metionina DL. Este antígeno se ha desvelado anteriormente como BASB202 (28 Kda) [12, 13] y se ha propuesto su uso como una vacuna contra NTHI. Este antígeno comparte el 99,63 % de alineamiento ID con un antígeno homólogo, como se describe en la Ref. (4) y se ha encontrado bien conservado entre todas las cepas consideradas en la presente divulgación. En la presente divulgación, se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT001 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 6 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 6; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 6, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 001 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 4, tal como la SEQ ID NO: 54. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 6. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 21, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 6, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 6. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT001 puede expresarse con los 21 aminoácidos N-terminales nativos de NT001 (MKLKQLFAITAIASALVlTg C; SEQ ID NO: 74) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT016
Este antígeno se ha anotado como NTHI0266 en la cepa 86-028NP y se describe como una lipoproteína hipotética. Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT016 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 7 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 7; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 7, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 016 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 7, tal como la SEQ ID NO: 55. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 7. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 19, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 7, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 7. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT016 puede expresarse con los 16 aminoácidos N-terminales nativos de NT016 (MRKIKSLALLAVAALVIg C; SEQ ID NO: 75) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT052
Este antígeno se ha anotado como CGSHiGG_00130 de la cepa PittGG. Es parte de las familias de proteínas que contienen el dominio Sell. Se ha clonado a partir de la cepa R2846 y la secuencia clonada se informa como la SEQ ID NO: 8. A pesar de que la secuencia clonada de R2846 está compartiendo solamente el 64,16 % de identidad a lo largo de la secuencia anotada como CGSHiGG_00130, se ha demostrado que hay dominios SelI conservados que se repiten a lo largo de la secuencia, los cuales son útiles para proporcionar una antigenicidad eficaz. El consenso para estas repeticiones es la SEQ ID NO: EAVKWYRKAAEQ.
Los antígenos NT052 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 8 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 8, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 052 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 8, tal como la SEQ ID NO: 56. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 8, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 8. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT052 puede expresarse con los 11 aminoácidos N-terminales nativos de NT052 (MLLFILSIAWA; SEQ ID NO: 76) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT002
Este antígeno se ha anotado como NTHI1627 en la cepa 86-026NP y como una lipoproteína. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT002 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 9 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 9; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 9, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 002 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 9, tal como la SEQ ID NO: 57. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 9, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 9. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT002 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT002 (MKVYKSFLIATASLFLFA; SEQ ID NO: 77) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT002 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT026
Este antígeno se ha anotado como proteína hipotética NTHI1109 en la cepa 86-026NP. Se ha predicho que es una proteína de membrana citoplasmática. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT026 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 10 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 10, en la que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 026 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 10, tal como la SEQ ID NO: 58, clonada a partir de la cepa Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 10, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 10. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT026 puede expresarse con los 24 aminoácidos N-terminales nativos de NT026 (MQKGMTLVELLIGLAIISIVLNFA; SEQ ID NO: 78) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT009
Este antígeno se ha anotado como NTHI0821 en la cepa 86-026NP y es parte de la proteína de la familia OMP85. Se ubica en la membrana externa de las bacterias. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT009 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 11 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 11; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 11, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T009 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 11, tales como la SEQ ID NO: 59 clonada a partir de Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 11. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 22, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 11, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 11. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT009 puede expresarse con los 22 aminoácidos N-terminales nativos de NT009 (MNKTLLKLTALFLALNCFPAFA; SEQ ID NO: 79) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT025
Este antígeno se ha anotado como NTHI0409 en la cepa 86-026NP y pertenece a la familia de proteínas de la subunidad de pilina de tipo IV. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT025 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 12 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 12, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT025 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 12, tales como la SEQ ID NO: 60 clonada de Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 23, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 12, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 12. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT025 puede expresarse con los 23 aminoácidos N-terminales nativos de NT025 (MKLTTQQTLKKGFTLIELMIVIA; SEQ ID NO: 80) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT028
Este antígeno se ha anotado como NTHI1954 en la cepa 86-026NP y como la lipoproteína NlpC. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT028 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 13 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 13, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T028 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 13, tales como la SEQ ID NO: 61 clonada de Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 13, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 13. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT028 puede expresarse con los 21 aminoácidos N-terminales nativos de NT028 (MLKRILVIIGLAVLATACSNA; SEQ ID NO: 81) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT028 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT029
Este antígeno se ha anotado como NTHI0371 en la cepa 86-026NP y como proteína A de unión a hemo/hemopexina, que pertenece a la familia de proteínas de membrana externa. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa R2846.
Los antígenos NT029 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 14 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 14; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 14, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T029 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 14, tales como la SEQ ID NO 62 clonada a partir de la cepa R2846. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 14. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 14, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 14. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT029 puede expresarse con los 21 aminoácidos N-terminales nativos de NT029 (MYKLNVISLIILTTYTGATYA; SEQ ID NO: 82) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT031
Este antígeno se ha anotado como lipoproteína de membrana externa inducible por inanición NTHI0509 en la cepa 86-026NP. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa R2846.
Los antígenos NT031 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 15 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 15; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 15, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT031 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 15, tales como la SEQ ID NO: 63 clonada y expresada a partir de la cepa R2846. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 15. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 18, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 15, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 15. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT031 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT031 (MKGKITLFFTALCFGLTG; SEQ ID NO: 83) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT031 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT015
Este antígeno se ha anotado como proteína asociada a opacidad OapB NTHI0449 en la cepa 86-026NP. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT015 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 16 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 16; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 16, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T015 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 16, tales como la SEQ ID NO: 64 clonada y expresada a partir de Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 16. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 16, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 16. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT015 puede expresarse con los 17 aminoácidos N-terminales nativos de NT015 (MLKKTSLIFTALLLAGC; SEQ ID NO: 84) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT023
Este antígeno se ha anotado como lipoproteína de membrana externa PCP, NTHI1473 en la cepa 86-026NP. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT023 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 17 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 17; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 17, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T023 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 17, tales como la SEQ ID NO: 65 clonada y expresada a partir de la cepa Fi176. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 17. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 17, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 17. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT023 puede expresarse con los 20 aminoácidos N-terminales nativos de NT023 (MKKTNMALALLVAFSVTGCA; SEQ ID NO: 85) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT023 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT100
Este antígeno se ha anotado como "supuesto receptor de sideróforo férrico de tipo hidroxamato" y en NCBI como gi-145633184 de la cepa 3655. Se ha clonado a partir de la cepa R246.
Los antígenos NT100 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 18 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 18; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 18, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 100 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 18, tal como la SEQ ID NO: 66. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 18, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 18. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT100 puede expresarse con los 30 aminoácidos N-terminales nativos de NT100 (MDLGPIYNTRDINDGKVINIDNPNy Tn PVA; SEQ ID NO: 86) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT040
Este antígeno se ha anotado como proteína hipotética NTHI1110 en la cepa 86-026NP. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa R2846 Los antígenos NT040 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 19 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 19; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 19, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T040 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 19. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 19. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 19, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 19. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT040 puede expresarse con los 26 aminoácidos N-terminales nativos de NT040 (MMKTLLKGQTLLALMIs Lt LSSLLLL; SEQ ID NO: 87) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT048
Este antígeno se ha anotado como NTHI1169 en la cepa 86-028NP. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa R2846.
Los antígenos NT048 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 20 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 20; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 20, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT048 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 20. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 20. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 20, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 20. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT048 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT048 (MKSVPLITGGLSFLLSAC; SEQ ID NO: 88) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT053
El antígeno se ha anotado como gi-145628236 en la cepa R2846 y se ha clonado a partir de dicha cepa.
Los antígenos NT053 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 21 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 21, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT053 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 21. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 21, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 21. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT053 puede expresarse con la Met N-terminal nativa de NT053 o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT066
El antígeno se ha anotado como NTHI1230 en la cepa NP86-028 y se ha localizado en el periplasma de la bacteria. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT066 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 22 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 22; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 22, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 066 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 22, tal como la SEQ ID NO: 67. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 22. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 27, 30, 33 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 22, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 22. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT066 puede expresarse con los 33 aminoácidos N-terminales nativos de NT066 (MKIYLRFVWILIIILNFLLNLFITTNGVIIVNA; SEQ ID NO: 90) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT097
El antígeno se ha anotado como NTHI0522 en la cepa NP86-028 y se ha descrito como proteína transportadora de tipo Fadl de ácidos grasos de cadena larga predicha como presente en el medio de la membrana externa. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa R2846.
Los antígenos NT097 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 23 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 23; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 23, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas Nt 097 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 23. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 22, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 23, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 23. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT097 puede expresarse con los 22 aminoácidos N-terminales nativos de NT097 (MKKFNQSILATAMLLAa Gg ANA; SEQ ID NO: 91) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT004
El antígeno se ha anotado como la proteína hipotética CGSHiGG_08215 de la cepa PittGG en el medio de la membrana externa. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi 176.
Los antígenos NT004 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 122 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 122; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 122, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT004 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 122. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 122. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 22, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 122, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 122. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT004 puede expresarse con los 20 aminoácidos N-terminales nativos de NT004 (MKKKNQILVSLSIVALLGGC; SEQ ID NO: 125) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT014
El antígeno se ha anotado como proteína hipotética HI1658 de la cepa Rd KW20. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los antígenos NT014 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 123 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 123; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 123, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT014 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 123. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 123. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 22, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 123, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 123. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT014 puede expresarse con los 22 aminoácidos N-terminales nativos de NT014 (MTLSPLKKLAILLGATIFLQGC; SEQ ID NO: 126) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT022
El antígeno se ha anotado como NTHI0830 de la cepa NP86-028 y se ha identificado que es una posible lipoproteína B antigénica de la membrana externa. Se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176. Además, se ha descubierto que contiene un dominio catalítico LytM y que está expuesta en superficie y se secreta.
Los antígenos NT022 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 124 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 124; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 124, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT022 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 124. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 124. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 22, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 124, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 124. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT022 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT022 (MKKSFLLLPLSLVVLSAC; SEQ ID NO: 127) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
SEGUNDO GRUPO DE ANTÍGENOS
Antígeno P48
El polipéptido P48 se ha anotado en la bibliografía como una subunidad A de NADH-quinona reductasa de translocación de Na(+). Con fines de referencia, una secuencia de aminoácidos de longitud completa de P48 se proporciona como la SEQ ID NO: 24 en el presente documento.
Los polipéptidos P48 preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 24, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 24, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos P48 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 24. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 24, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 24. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Idealmente, un antígeno P48 no tiene los 25 aminoácidos N-terminales nativos de P48 (MITIKKGLDLPIAGKPAQVIHSGNA; SEQ ID NO: 92) y por tanto debería expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
El antígeno T P48 puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los antígenos HtrA, PE, P26, Antígeno PHiD y/o P6 como se describe en el presente documento, en particular, por ejemplo con HtrA.
Antígeno HtrA
El polipéptido HtrA se ha anotado en la bibliografía como un precursor similar a serina proteasa do/HhoA periplásmico, y se ha descrito como una proteína de choque térmico o chaperona. Con fines de referencia, una secuencia de aminoácidos de longitud completa de HtrA se proporciona como la SEQ ID NO: 25 en el presente documento.
Los polipéptidos HtrA preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) con la SEQ ID NO: 25, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 25, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos HtrA incluyen variantes de la SEQ ID NO: 25. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 25. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 25, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 25. Otros fragmentos omiten uno o más dominios polipeptídicos.
Idealmente, un antígeno HtrA no tiene los 26 aminoácidos N-terminales nativos de HtrA (MKKTRFVLNSIALGLSVLSTSFVAQA; SEQ ID NO: 93) y por tanto debería expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
El antígeno HtrA puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1,2, o 3) de los antígenos P48, PE, P26, P6 y/o PHiD, en particular, por ejemplo, con P48.
Antígeno PE
El polipéptido PE se ha anotado como proteína de unión de lipoproteína - vitronectina, o como que se une a IgD y actúa como una adhesión a células alveolares de tipo 2. Con fines de referencia, una secuencia de aminoácidos de longitud completa de PE se proporciona como la SEQ ID NO: 26 en el presente documento.
Los polipéptidos PE preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) con la SEQ ID NO: 26, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 26, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos PE incluyen variantes de la SEQ ID NO: 26. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 26. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 26, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 26. Otros fragmentos omiten uno o más dominios polipeptídicos.
Idealmente, un antígeno PE no tiene los 16 aminoácidos N-terminales nativos de PE (MKKIILTLSLGLLTAC; SEQ ID NO: 94) y por tanto debería expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
El antígeno PE puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de los antígenos P48, HtrA, P26, P6 y/o PHiD como se describe en el presente documento.
Antígeno P26
El polipéptido P26 también se conoce como proteína de membrana externa 26. Se ha anotado como un miembro de la familia Skp de proteínas, cuya supuesta función es la translocación de proteínas de membrana externa [5]. Con fines de referencia, una secuencia de aminoácidos de longitud completa de P26 se proporciona como la SEQ ID NO: 27 en el presente documento.
Los polipéptidos P26 preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) con la SEQ ID NO: 27, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 27, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos P26 incluyen variantes de la SEQ ID NO:27. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 27. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 27, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 27. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
El antígeno P26 puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1,2 o 3) de los antígenos P48, HtrA, PE, PHiD y/o P6 como se describe en el presente documento, en particular con cualquiera o todos de P48, HtrA y o PE como se describe en el presente documento.
Antígeno PHiD
El antígeno PHiD también se conoce como "proteína D" y se ha usado principalmente como una proteína trasportadora en las estrategias de vacuna para NTHi de glucoconjugados [95]. Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi176.
Los polipéptidos PHiD preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) con la SEQ ID NO: 28, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 28, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos PHiD incluyen variantes de la SEQ ID NO: 28. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 28. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 28, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 28. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno PhiD puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de PhiD (MKLKTLALSLLAAGVLAG; SEQ ID NO: 95) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada. El antígeno PHiD puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de cualquiera de los antígenos P48, HtrA, PE, P26 y/o P6 como se describe en el presente documento.
Un antígeno PHiD puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno P6
El antígeno P6 también se conoce como OMP 6 (proteína 6 de membrana externa) [14]. Este antígeno se ha clonado y expresado a partir de la cepa Fi 176.
Los polipéptidos P6 preferidos comprenden una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99.5 % o más) con la SEQ ID NO: 29, por ejemplo, el 90 % o más de identidad, o el 95 % o más de identidad o el 99 % o más de identidad; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 29, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150 o más; por ejemplo, 20 o más; o, por ejemplo, 50 o más; o, por ejemplo, 80 o más). Estos polipéptidos P6 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 29. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 29. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 29, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 29. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno P6 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de P6 (MNKFVKSLLVAGSVAALAA; SEQ ID NO: 96) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
El antígeno P6 puede combinarse ventajosamente con uno o más (por ejemplo, 1, 2 o 3) de cualquiera de los antígenos P48, HtrA, PE, P26 y/o PHiD como se describe en el presente documento.
Un antígeno P6 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
TERCER GRUPO DE ANTÍGENOS
Antígeno NT013
El antígeno "NT013" se anota como una proteína que contiene la repetición TPR y también como subunidad de hemo liasa de maduración de citocromo c CcmH2. Se ha publicado como NTHI0532 en la cepa 86-028NP. NT013 se ha anotado como perteneciendo a la familia de proteínas metaloproteasas y tiene un dominio catalítico LytM.
Los antígenos NT013 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 30 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 30; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 30, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT013 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 30. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 30. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 30, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 30. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT013 puede expresarse con los 42 aminoácidos N-terminales nativos de NT013 (MPVQHVKLARDRRKKRTYIKVGVFFVAILLILTGILLTIKDK; SEQ ID NO: 97) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT106
El antígeno "NT106" se anota como lipoproteína y se ha publicado como NTHI0363 en el genoma 86-028NP.
Los antígenos NT106 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 31 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 31; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 31, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT106 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 31. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 31. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 31, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 31. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT106 puede expresarse con los 17 aminoácidos N-terminales nativos de NT106 (MKKIILNLVTAIILAGC; SEQ ID NO: 98) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT106 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT107
El antígeno "NT107" se anota como "proteína B de unión a hemo/hemopexina" y se ha publicado como NTHI0370 en el genoma 86-028NP.
Los antígenos NT107 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 32 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 32; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 32, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT107 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 32. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 32. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 32, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 32. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT107 puede expresarse con los 28 aminoácidos N-terminales nativos de NT107 (MKMRPRYSVIASAVSLGFVLSKSVMALG; SEQ ID NO: 99) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT108
El antígeno "NT108" se anota como lipoproteína transglucosilasa A de mureína. En la cepa 86-028NP se ha anotado como NTHI0205.
Los antígenos NT108 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 33 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 33; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 33, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT108 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 33. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 33. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 33, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 33. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT108 puede expresarse con los 24 aminoácidos N-terminales nativos de NT108 (MSVCKPFWFKTFSISIIt A l LVSC; SEQ ID NO: 100) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT108 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT109
Este antígeno se anota como proteína sensora de nitrato/nitrito NarQ y se ha identificado como NTHI0374 en la cepa 86-028NP, y se ha descubierto que está conservada en las cepas analizadas.
Los antígenos NT109 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 34 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 34; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 34, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT109 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 34. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 34. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 34, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 34. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT109 puede expresarse con los 33 aminoácidos N-terminales nativos de NT109 (MYTKGSVSTRIAKYLFIILIVAGVISSLSLAIM; SEQ ID NO: 101) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT110
Este antígeno se ha anotado como NTHI0579 en el genoma 86-028NP y se conoce como una supuesta TlyC de hemolisis. Se ha descubierto asociado a la membrana externa.
Los antígenos NT110 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 35.
Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 35. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 35, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 35. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT110 puede expresarse con los 30 aminoácidos N-terminales nativos de NT110 (MIMELFHTILAIVALILSsAv VSSAEiSlA; SEQ ID NO: 102) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT111
Este antígeno se ha anotado como NTHI0837 en la cepa 86-028NP y se describe como una supuesta lipoproteína.
Los antígenos NT111 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 36 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 36; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 36, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT111 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 36. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 36. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 36, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 36. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT111 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de NT111 (MKKTLVAALISSVILLTg C; SEQ ID NO: 103) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT110 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT112
Este antígeno se ha anotado como NTHI0849 de la cepa NP86-028. Se anota como lipoproteína VacJ.
Los antígenos NT112 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 37 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 37; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 37, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT112 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 37. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 37. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 37, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 37. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT112 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de NT112 (MKTKVILTALLSAIALTg C; SEQ ID NO: 104) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT112 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT113
Este antígeno se ha anotado como NTHI0921 en la cepa 86-026NP y como una lipoproteína.
Los antígenos NT113 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 38 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 38; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 38, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas n T113 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 38.
Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 38. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 38, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 38. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT113 puede expresarse con los 16 aminoácidos N-terminales nativos de NT113 (MKKYLLLALLPFLYAC; SEQ ID NO: 105) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT113 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT114
Este antígeno se ha anotado como una proteína transglucosilasa de mureína lítica soluble y como NTHI0995 en la cepa 86-026NP.
Los antígenos NT114 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 39 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 39; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 39, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT114 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 39. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 39. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 39, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 39. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT114 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de NT114 (MKKVALISLCIFTAL-SAFA; SEQ ID NO: 106) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT115
Este antígeno se ha anotado como NTHI1091 en la cepa 86-026NP y como una supuesta lipoproteína LptE. Se ubica en el medio extracelular.
Los antígenos NT115 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 40 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 40; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 40, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT115 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 40. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 40. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 40, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 40. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT115 puede expresarse con los 35 aminoácidos N-terminales nativos de NT115 (MKYLHFTRPTIKVIFMINSIKTLLLIATLAILSAC; SEQ ID NO: 107) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Un antígeno NT115 puede ser una lipoproteína, por ejemplo, lipidada en una cisteína del extremo N.
Antígeno NT116
Este antígeno se ha descrito como NTHI1169 en la cepa 86-026NP y pertenece a la familia de proteínas de unión a transferrina.
Los antígenos NT116 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 41 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99%, 99,5% o más) con la SEQ ID NO: 41; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 41, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT116 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 41. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 41. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 41, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 41. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT116 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT116 (MKSVPLITGGLSFLLSAC; SEQ ID NO: 108) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT117
Este antígeno se ha anotado como NTHI1208 en la cepa 86-026NP y como posible transglutaminasa. Se ha ubicado en la membrana externa.
Los antígenos NT117 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 42 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 42; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 42, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT117 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 42 Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 42 Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 42, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 42. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT117 puede expresarse con los 19 aminoácidos N-terminales nativos de NT117 (MKKLIAVAVFSACGSLa Ha ; SEQ ID NO: 109) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT118
Este antígeno se ha anotado como NTHI1318 en la cepa 86-026NP y como proteína hipotética.
Los antígenos NT118 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 43 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 43; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 43, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT118 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 43. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 43, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 43. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT118 puede expresarse con los 18 aminoácidos N-terminales nativos de NT118 (MNIRWNVILGVIALCALA; SEQ ID NO: 110) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT119
Este antígeno se ha anotado como la proteína hipotética NTHI1565 en la cepa 86-028NP.
Los antígenos NT119 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 114 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 114; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 114, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT119 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 114. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 114. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 114, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 114. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT119 puede expresarse con los 26 aminoácidos N-terminales nativos de NT119 (MRFTKTLFTTALLGASIFSFQSTAWA; SEQ ID NO: 118) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT120
Este antígeno se ha anotado como la proteína hipotética NTHI1569 en la cepa 86-028NP.
Los antígenos NT120 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 115 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 115; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 115, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT120 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 115. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 115. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 115, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 115. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT120 puede expresarse con los 26 aminoácidos N-terminales nativos de NT120 (MKLTKTLLTTALFGASVFSFQSTAWA; SEQ ID NO: 119) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT121
Este antígeno se ha anotado como la proteína hipotética NTHI1571 en la cepa 86-028NP.
Los antígenos NT121 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 116 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 116; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 116, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT121 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 116. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 116. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 116, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 116. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT121 puede expresarse con los 26 aminoácidos N-terminales nativos de NT121 (MKLTKTLLTTALLGASVFSFQSTAWA; SEQ ID NO: 120) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT122
Este antígeno se ha anotado como la proteína hipotética NTHI1667 en la cepa 86-028NP.
Los antígenos NT122 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 117 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 117; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 117, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT122 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 117. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 117. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 117, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 117. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT122 puede expresarse con los 23 aminoácidos N-terminales nativos de NT122 (MEKIMKKLTLALVLGSALAVTGC; SEQ ID NO: 121) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT123
Este antígeno se ha anotado como zinc proteasa NTHI1796 en la cepa 86-026NP.
Los antígenos NT123 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 44 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 44; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ ID NO: 44, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT123 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 44. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 44. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 44, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 44. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT123 puede expresarse con los 17 aminoácidos N-terminales nativos de NT123 (MKKTTALFLLIFSLIAC; SEQ ID NO: 111) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT124
Este antígeno se ha anotado como proteína hipotética NTHI1930 en la cepa 86-026NP.
Los antígenos NT124 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 45 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 45; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la s Eq ID NO: 45, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT124 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 45. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 45, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 45. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT124 puede expresarse con los 22 aminoácidos N-terminales nativos de NT124 (MKKSKIAAGVVISLAAv W c AGA; SEQ ID NO: 89) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT061
Este antígeno se ha anotado como proteína de supervivencia proteína similar a SurA NTHI0588 en la cepa 86-026NP.
Los antígenos de antígenos NT061 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 128 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 128; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO: 128, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT061 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 128. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 128. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 128, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 128. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT061 puede expresarse con los 27 aminoácidos N-terminales nativos de NT061 (MKMKKFILKSFLLATLGCVAFTSMAQA; SEQ ID NO: 129) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Antígeno NT017
Este antígeno se ha anotado como proteína de supervivencia proteína similar a SurA NTHI0915 en la cepa 86-026NP.
Los antígenos de antígenos NT017 útiles pueden suscitar un anticuerpo (por ejemplo, cuando se administran a un ser humano) que reconoce la SEQ ID NO: 130 y/o pueden comprender una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con la SEQ ID NO: 130; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos 'n' aminoácidos consecutivos de la SEQ iD NO: 130, en el que 'n' es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más). Estas proteínas NT017 incluyen variantes de la SEQ ID NO: 130. Los fragmentos preferidos de (b) comprenden un epítopo de la SEQ ID NO: 130. Otros fragmentos preferidos carecen de uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo C y/o uno o más aminoácidos (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25 o más) del extremo N de la SEQ ID NO: 130, al tiempo que conservan al menos un epítopo de la SEQ ID NO: 130. Otros fragmentos omiten uno o más dominios de proteína.
Un antígeno NT017 puede expresarse con los 20 aminoácidos N-terminales nativos de NT017 (MLRFGVNQKTSLLLTAl Ls C; SEQ ID NO: 131) o puede expresarse con una secuencia N-terminal alternativa, por ejemplo, con una simple metionina del extremo N, o Met-Ala-, o un péptido líder que dirige o trafica la proteína expresada de una manera deseada.
Polipéptidos híbridos
Los polipéptidos utilizados pueden expresarse individual o independientemente en cadenas polipeptídicas separadas. De manera alternativa, dos o más de los polipéptidos utilizados también pueden expresarse como una sola cadena polipeptídica (un polipéptido "híbrido"). Los polipéptidos híbridos pueden representarse por la fórmula NH2-A-{-X-L-}n-B-COOH, en la que: A es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional; B es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional; n es un entero de 2 o más (por ejemplo, 2, 3, 4, 5, 6, etc.); en la que al menos uno de Xn es una secuencia de aminoácidos de un antígeno desvelado en el presente documento (como se describe anteriormente); y L es una secuencia de aminoácidos de engarce opcional. Por ejemplo, cada Xn puede comprender las secuencias de aminoácidos de un antígeno seleccionado del grupo que consiste en: (1) NTHI0915 (NT018), (2) NTHI1416 (NT024), (3) NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038, pero este no está entre los preferidos), (5) NTHI1292 (NT067), (6) NTHI0877 (NT001), (7) NTHI0266 (NT016), (8) CGSHiGG_00130 (NT052), (9) NTHI1627 (NT002), (10) NTHI1109 (NT026), (11) NTHI0821 (NT009), (12) NTHI0409 (NT025), (13) NTHI1954 (NT028), (14) NTHI0371 (NT029), (15) NTHI0509 (NT031), (16) NTHI0449 (NT015), (17) NTHI1473 (NT023), (18) gi-145633184 (NT100), (19) NTHI1110 (NT040), (20) gi-46129075 (NT048), (21) gi-145628236 (NT053), (22) NTHI1230 (NT066), (23) NTHI0522 (NT097), (24) P48 (NTHI0254 también definido como NT007), (25) HtrA (NTHI1905 también definido como NT006), (26) PE (NTHI0267 también definido como NT035), (27) P26 (NTHI0501 también definido como NT010), (28) PHiD (NTHI0811 también definido como NT080), (29) P6 (NTHI0501, también definido como NT081), (30) NT013, (31) NT106, (32) NT107, (33) NT108, (34) NT109, (35) NT110, (36) NT111, (37) NT112, (38) NT113, (39) NT114, (40) NT115, (41) NT116, (42) NT117, (43) NT118, (44) NT119, (45) NT120, (46) NT121, (47), NT122, (48) NT123, (49) NT124; (50) NT004; (51) NT014; (52) NT022 (también anotado como NTHI0830); (53) NT016 (también anotado como NTHI0266).
La Xn puede comprender las dos secuencias de aminoácidos de dos o más antígenos seleccionados del grupo que consiste en cualquiera de los antígenos enumerados en el "Primer grupo de antígenos" y cualquiera de los antígenos enumerados en el "Segundo grupo de antígenos". Cada Xn puede ser una secuencia de aminoácidos de un antígeno de una combinación de antígenos descrita en el presente documento (como se describe anteriormente). En determinadas realizaciones, n es 2. Cuando n es 2, también puede usarse cualquier combinación de dos de los antígenos como se describe anteriormente como se describe en el presente documento. Cuando n es 3, por ejemplo, puede usarse cualquier combinación de tres antígenos, como se describe anteriormente. En general, dos o más de las Xn pueden ser los mismos antígenos o, cuando n es 2, 3 o 4, cada Xn puede ser un antígeno diferente. Cuando dos o más de las Xn son secuencias del mismo antígeno), estas dos o más Xn pueden tener la misma secuencia polipeptídica o una secuencia polipeptídica diferente, por ejemplo, pueden ser variantes o fragmentos diferentes del antígeno dado, como se describe anteriormente.
Cuando estos antígenos se definen en términos de (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia dada; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de una secuencia dada, en la que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más), el nivel de identidad en (a) y el valor de "n" en (b) puede ser el mismo para cada X.
La secuencia peptídica líder en la forma de tipo silvestre de cada radical -X- puede incluirse u omitirse en la proteína híbrida. En algunas realizaciones, los péptidos líderes serán eliminados, excepto para el del radical -X- localizado en el extremo N de la proteína híbrida, es decir, el péptido líder de X1 se conservará, pero los péptidos líderes de X2... Xn se omitirán. Esto es equivalente a eliminar todos los péptidos líderes y usar el péptido líder de X1 como el radical -A-.
Para cada n casos de {-X-L-}, la secuencia de aminoácidos de engarce -L- puede estar presente o ausente. Por ejemplo, cuando n=2, el híbrido puede ser NH2-X1-L1-X2-L2-COOH, NH2-X1-X2-COOH, NH2-X1-L1-X2-COOH, NH2-X1-X2-L2-COOH, etc. La secuencia (o secuencias) de aminoácidos de engarce -L- serán normalmente cortas (por ejemplo, de 20 o menos aminoácidos, es decir, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos comprenden secuencias peptídicas cortas que facilitan la clonación, engarces de poli-glicina (es decir, que comprenden Glyn en que n = 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más), y etiquetas de histidina (es decir, Hisn en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más). Otras secuencias de aminoácidos de engarce apropiadas serán evidentes para los expertos en la materia. Un engarce útil es GSGGGG (SEQ ID NO:46) o GSg Sg Gg G (SEQ ID NO:47), estando formado el dipéptido Gly-Ser a partir de un sitio de restricción BamHI, ayudando de esta manera a la clonación y manipulación, y siendo el tripéptido (Gly)4 un engarce de poliglicina típico. Otros engarces apropiados, particularmente para el uso como el Ln final, son un dipéptido Leu-Glu.
- A- es una secuencia de aminoácidos N-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, de 40 o menos aminoácidos, es decir, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias líder para dirigir el tráfico de proteínas, o secuencias peptídicas cortas, las cuales facilitan la clonación y purificación (por ejemplo, etiquetas de histidina, es decir, Hisn, en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más) tal como la SEQ ID NO: 48. Otras secuencias de aminoácidos N-terminales apropiadas serán evidentes para los expertos en la materia. Si X1 carece de su propia metionina del extremo N, -A- es preferentemente un oligopéptido (por ejemplo, con 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 u 8 aminoácidos) que proporciona una metionina en el extremo N, por ejemplo, Met-Ala-Ser, o un único resto de Met.
- B- es una secuencia de aminoácidos C-terminal opcional. Esta será normalmente corta (por ejemplo, de 40 o menos aminoácidos, es decir, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15, 14, 13, 12, 11, 10, 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2, 1). Los ejemplos incluyen secuencias para dirigir el tráfico de proteínas, secuencias peptídicas cortas, las cuales facilitan la clonación o purificación (por ejemplo, que comprenden etiquetas de histidina, es decir, Hisn, en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, tal como la SEQ ID NO: 68), o secuencias que mejoran la estabilidad de proteínas. Otras secuencias de aminoácidos C-terminales apropiadas serán evidentes para los expertos en la materia.
Cepas y variantes
Los antígenos se definen anteriormente por referencia a las convenciones de nomenclatura de la bibliografía, por ejemplo, la numeración "NTHI" (del genoma de la cepa 86-028NP) o la numeración CGSHiGG (del genoma de la cepa PittGG). Dichas convenciones se explican en mayor detalle en la referencia 15 (particularmente en la Tabla 1). La Tabla V en el presente documento relaciona la nomenclatura existente con la nomenclatura "NT" utilizada en el presente documento. Por tanto, una secuencia de aminoácidos y de nucleótidos ilustrativa para cualquiera de los antígenos desvelados en el presente documento, puede encontrarse fácilmente en las bases de datos de secuencias públicas para las cepas indicadas (junto con la información adicional, tal como las anotaciones funcionales), pero la divulgación no se limita a las secuencias de las cepas 86-028NP, 3655 o PittGG. Las secuencias genómicas de varias otras cepas de NTHI están disponibles (nuevamente, véase la Tabla 1 de la referencia 15). Las técnicas de búsqueda y alineamiento convencionales pueden usarse para identificar en cualquiera de estas (u otras) secuencias genómicas adicionales el homólogo de cualquier secuencia particular dada en el presente documento. Además, las secuencias disponibles pueden usarse para designar los cebadores para la amplificación de las secuencias homólogas de otras cepas. Por tanto, la divulgación no se limita a estas cepas específicas, sino que abarca tales variantes y homólogos de otras cepas de NTHI, así como variantes no naturales. En general, las variantes apropiadas de una SEQ ID NO particular incluyen sus variantes alélicas, sus formas polimórficas, sus homólogos, sus ortólogos, su parálogos, sus mutantes, etc. Por ejemplo, las SEQ ID NO: 49, 52, 54, 55, 57-59, 64, 65 y 67 incluyen las mutaciones, como se describe a continuación.
Por tanto, por ejemplo, los polipéptidos utilizados pueden, en comparación con la SEQ ID NO en el presente documento, incluir uno o más (e, incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) sustituciones de aminoácidos, tal como sustituciones conservativas (es decir, sustituciones de un aminoácido por otro, el cual tiene una cadena lateral relacionada). Los aminoácidos codificados genéticamente en general se dividen en cuatro familias: (1) ácidos, es decir, aspartato, glutamato; (2) básicos, es decir, lisina, arginina, histidina; (3) no polares, es decir, alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptófano; y (4) polares no cargados, es decir, glicina, asparagina, glutamina, cisteína, serina, treonina, tirosina. En ocasiones la fenilalanina, el triptófano y la tirosina se clasifican conjuntamente como aminoácidos aromáticos. En general, la sustitución de aminoácidos individuales dentro de estas familias no tiene un efecto importante sobre la actividad biológica. Los polipéptidos también pueden incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) eliminaciones de aminoácidos individuales, con respecto a la secuencia SEQ ID n O. Los polipéptidos también pueden incluir uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, etc.) inserciones (por ejemplo, cada una de 1, 2, 3, 4 o 5 aminoácidos) con respecto a las secuencias SEQ ID NO.
De manera similar, un polipéptido puede comprender una secuencia de aminoácidos que:
(a) es idéntica (es decir, el 100 % idéntica) a una secuencia desvelada en el listado de secuencias;
(b) comparte identidad de secuencia (por ejemplo, del 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más) con una secuencia desvelada en el listado de secuencias;
(c) tiene 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10 (o más) alteraciones de aminoácidos individuales (eliminaciones, inserciones, sustituciones), que pueden estar en sitios separados o pueden ser contiguas, comparado con las secuencias de (a) o (b); y/o
(d) cuando se alinean con una secuencia particular del listado de secuencias utilizando un algoritmo de alineamiento por parejas, cada ventana móvil de x aminoácidos del extremo N al extremo C (de modo que para una alineamiento que se extiende hasta p aminoácidos, en que p>x, hay p-x+1 de tales ventanas) tiene al menos x y aminoácidos alineados idénticos, en que: x se selecciona de 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200; y se selecciona de 0,50, 0,60, 0,70, 0,75, 0,80, 0,85, 0,90, 0,91, 0,92, 0,93, 0,94, 0,95, 0,96, 0,97, 0,98, 0,99; y si x y no es un entero, entonces se redondea hasta el entero más cercano. El algoritmo de alineamiento por parejas preferido es el algoritmo de alineamiento global de Needleman-Wunsch [16], que utiliza los parámetros por defecto (por ejemplo, con una penalización de apertura de hueco = 10,0, y con una penalización de extensión de hueco = 0,5, utilizando la matriz de puntación EBLOSUM62). Este algoritmo se implementa convenientemente en la herramienta needle en el paquete EMBOSS [17].
Cuando se utilizan polipéptidos híbridos, los antígenos individuales dentro del híbrido (es decir, los radicales -X-individuales) pueden ser de una o más cepas. Cuando n=2, por ejemplo, X2 puede ser de la misma cepa que X1 o de una cepa diferente. Cuando n=3, las cepas pueden ser (i) X-i=X2=X3 (ii) X-i=X2^X3 (iii) X # X 2=X3 (iv) X # X 2^X3 o (v) X-f X3*X 2 , etc.
Dentro del grupo (c), las eliminaciones o sustituciones pueden ser en el extremo N y/o el extremo C, o pueden estar entre los dos extremos. Por tanto, un truncamiento es un ejemplo de una eliminación. Los truncamientos pueden implicar la eliminación de hasta 40 (o más) aminoácidos en el extremo N y/o el extremo C. El truncamiento del extremo N puede eliminar los péptidos líderes, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo. El truncamiento del extremo C puede eliminar las secuencias de anclaje, por ejemplo, para facilitar la expresión recombinante en un hospedador heterólogo.
En general, cuando un antígeno comprende una secuencia que no es idéntica a una secuencia de NTHI del listado de secuencias (por ejemplo, cuando comprende un listado de secuencias con <100 % de identidad de secuencia con la misma, o cuando comprende un fragmento de la misma) se prefiere en cada caso individual que el antígeno pueda suscitar un anticuerpo que reconozca la secuencia de NTHI respectiva del listado de secuencias.
Bacterias mutantes
La presente divulgación también proporciona una bacteria NTHi en que uno o más de los antígenos de la invención se ha genosuprimido [18]. Las técnicas para producir bacterias genosuprimidas son bien conocidas, y se ha informado la genosupresión de genes de las cepas de NTHi, es decir, en la Ref. 19. Una mutación de genosupresión puede situarse en la región codificante del gen o puede encontrarse dentro de sus regiones de control transcripcional (por ejemplo, dentro de su promotor). Una mutación de genosupresión reducirá el nivel de ARNm que codifica el antígeno a <1 % del producido por la bacteria de tipo silvestre, preferentemente <0,5 %, más preferentemente <0,1 %, y muy preferentemente al 0 %.
La divulgación también proporciona una bacteria NTHI en que uno o más de los antígenos de la invención tiene una mutación que inhibe su actividad. El gen que codifica el antígeno tendrá una mutación que cambia la secuencia de aminoácidos codificada o anula su expresión. La mutación puede implicar la eliminación, sustitución, y/o inserción, cualquiera de las cuales puede implicar uno o más aminoácidos.
Un ejemplo proporciona eliminaciones de uno o más genes que codifican los antígenos desvelados en el presente documento.
Es sabido en E. coli que dos componentes de la maquinaria de división con los dominios LytM (EnvC y NlpD) son reguladores directos de las hidrolasas (amidasas) de pared celular responsables de la separación celular (AmiA, AmiB y AmiC) [20]. También es sabido que las metaloproteasas LytM en E. coli se absolutamente necesarias para la separación de células hijas.
Además, en el presente documento se desvelan genes de NTHI que codifican los polipéptidos que tienen el dominio catalítico LytM. En general, las metaloproteasas se identifican por contener los dominios aminoacídicos HxH y HxxxD en sus dominios catalíticos. Preferentemente, éstos uno o más genes están codificando uno cualquiera de NT013, NT022 o NT017.
Además, se desvela que la mutación o eliminación de uno o más genes que codifican los polipéptidos que tienen en común el dominio catalítico LytM da como resultado un cambio drástico en la división celular bacteriana y el fenotipo bacteriano.
Los inventores también han demostrado que dicha mutación o eliminación da como resultado la liberación de las vesículas conocidas como las OMV o vesículas de membrana externa, mientras que las mismas cepas de NTHi de tipo silvestre no liberan normalmente las OMV.
En una realización particularmente preferida, se describe que eliminando NT013 y/o NT022 no solamente se afecta la división celular bacteriana, sino que también hay una producción y liberación sorprendente de vesículas de membrana externa (las OMV) en las cepas NTHI, que normalmente no liberan OMV.
Las realizaciones preferidas proporcionan cepas de NTHI en las que las eliminaciones de uno o más genes que codifican cualquiera de NT013 o NT022 o NT017. Por ejemplo, los genes eliminados pueden sustituirse por un casete de resistencia a antibiótico, tal como el casete de resistencia a eritromicina. Se ha descubierto que todos los polipéptidos mencionados anteriormente tienen en común un dominio catalítico LytM y son todos metaloproteasas.
También se ha descubierto que el dominio LytM en NT013 y NT022 está conservado. El sitio activo catalítico de NT013 se representa mediante los siguientes motivos de aminoácidos -HKGD- y -HLH- en la porción C-terminal, del sitio activo catalítico de NT022 se representa por los siguientes motivos de aminoácidos -NKGID- y -KLH- en C-terminal.
La divulgación también proporciona una bacteria, tal como una bacteria NTHi, que hiperexpresa un antígeno desvelado en el presente documento.
La divulgación también proporciona una bacteria, tal como una bacteria de NTHi, que expresa constitutivamente un antígeno desvelado en el presente documento. La divulgación también proporciona una E. coli que comprende al menos un gen que codifica un antígeno desvelado en el presente documento, en el que el gen está bajo el control de un promotor inducible.
Vacuna a base de OMV
Las bacterias gramnegativas están separadas del medio externo por dos capas sucesivas de estructuras membranosas. Estas estructuras, denominadas la membrana citoplásmica y la membrana externa (OM, forma siglada de outer membrane), difieren tanto estructural como funcionalmente. La membrana externa desempeña un papel importante en la interacción de las bacterias patógenas con sus respectivos hospedadores. En consecuencia, las moléculas bacterianas expuestas en la superficie representan dianas importantes para la respuesta inmunitaria del hospedador, haciendo de los componentes de la membrana externa candidatos atractivos para proporcionar vacunas, reactivos de diagnóstico y terapéuticos.
Las bacterias mutantes desveladas en el presente documento son particularmente útiles para preparar vesículas de membrana externa bacteriana, las cuales incluyen antígenos de NTHi (por ejemplo, antígenos desvelados en el presente documento), y que pueden usarse como inmunógenos.
La divulgación también proporciona una bacteria, tal como una bacteria NTHi, que hiperexpresa al menos un antígeno desvelado en el presente documento, preferentemente sobreproduciendo las OMV.
La regulación al alza puede usarse para aumentar los niveles de proteínas de NTHi útiles en las OMV.
También se desvela un procedimiento para la producción de una bacteria NTHi que sobreproduce las OMV desveladas en el presente documento, procedimiento que comprende modificar genéticamente una cepa bacteriana gramnegativa mediante uno o más de los siguientes procedimientos: (a) diseñar técnicamente la cepa para regular a la baja la expresión de uno o más de genes Tol; y (b) mutar uno o más gene que codifican una proteína que comprende un sitio asociado con peptidoglucano para atenuar la actividad de unión de peptidoglucano de la proteína (o proteínas); (c) por mutación o eliminación de uno o más genes que codifican los polipéptidos que tienen en común el dominio catalítico LytM. En una realización particularmente preferida, la NTHi no puede expresar los genes NT013, NT022 activos y/o cualquiera de los genes Tol [19], [18].
La divulgación también proporciona un procedimiento para la preparación de una vesícula de NTHi, que comprende una etapa de tratamiento de una bacteria NTHi desvelada en el presente documento, de modo que su membrana externa forma vesículas.
La divulgación también proporciona un procedimiento para la preparación de una vesícula de NTHi, que comprende una etapa de cultivar una bacteria NTHi desvelada en el presente documento en condiciones en que su membrana externa desprende espontáneamente las vesículas.
La divulgación también proporciona una bacteria NTHi que sobreproduce las OMV y que también hiperexpresa los antígenos desvelados en el presente documento.
Polipéptidos utilizados con la divulgación
Los polipéptidos utilizados con la divulgación pueden tomar diversas formas (por ejemplo, nativas, fusiones, glucosiladas, no glucosiladas, lipidadas, no lipidadas, fosforiladas, no fosforiladas, miristoiladas, no miristoiladas, monoméricas, multiméricas, particuladas, desnaturalizadas, etc.).
Los polipéptidos pueden prepararse por diversos medios (por ejemplo, expresión recombinante, purificación de cultivo celular, síntesis química, etc.). Se prefieren las proteínas expresadas de forma recombinante, particularmente para polipéptidos híbridos.
Los polipéptidos se proporcionan preferentemente en forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente exentos de otros polipéptidos (por ejemplo, exentos de polipéptidos de origen natural), particularmente de otros polipéptidos de H. influenzae o de la célula hospedadora y, en general, al menos aproximadamente el 50 % puros (en peso), y habitualmente al menos aproximadamente el 90 % puros, es decir, menos de aproximadamente el 50 %, y más preferentemente menos de aproximadamente el 10 % (por ejemplo, el 5 %) de una composición se compone de otros polipéptidos expresados. Por tanto, los antígenos en las composiciones se separan del organismo completo con el que se expresa la molécula.
El término "polipéptido" se refiere a polímeros de aminoácidos de cualquier longitud. El polímero puede ser lineal o ramificado, puede comprender aminoácidos modificados, y puede estar interrumpido por no aminoácidos. Los términos también abarcan un polímero de aminoácidos que se ha modificado naturalmente o por intervención; por ejemplo, formación de enlaces de disulfuro, glucosilación, lipidación, acetilación, fosforilación, o cualquier otra manipulación o modificación, tal como conjugación con un componente de marcaje. Además, se incluyen, por ejemplo, polipéptidos que contienen uno o más análogos de un aminoácido (que incluyen, por ejemplo, aminoácidos no naturales, etc.), así como otras modificaciones conocidas en la técnica. Los polipéptidos se pueden existir como cadenas individuales o como cadenas asociadas.
Los polipéptidos pueden comprender una secuencia -P-Q- o -Q-P-, en la que: -P- es una secuencia de aminoácidos como se definió anteriormente, y -Q- no es una secuencia como se definió anteriormente, es decir, pueden proporcionarse como proteínas de fusión. Cuando el codón del extremo N de -P- no es ATG, sino que este codón no está presente en el extremo N de un polipéptido, se traducirá como el aminoácido convencional para tal codón en lugar de Met. Cuando este codón está en el extremo N de un polipéptido, sin embargo, se traducirá como Met. Los ejemplos de los radicales -Q- incluyen, pero sin limitación, etiquetas de histidina (es decir, Hisn en que n = 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 o más, por ejemplo, la SEQ ID NO: 68), una proteína de unión de maltosa o glutatión-S-transferasa (GST).
Los polipéptidos pueden comprender la secuencia -P-Q- o -Q-P cuando se expresan inicialmente como una proteína naciente, pero en algunas realizaciones el radical -Q- puede estar ausente de la proteína en su punto de uso, por ejemplo, un péptido líder podría escindirse postraduccionalmente.
Una secuencia del extremo N útil para la expresión es la SEQ ID NO: 48.
Aunque la expresión de los polipéptidos se puede tener lugar en una H. influenzae, para la expresión se utilizará habitualmente un hospedador heterólogo (expresión recombinante). El hospedador heterólogo puede ser procariota (por ejemplo, una bacteria) o eucariota. Puede ser E. coli, pero otros hospedadores apropiados incluyen Bacillus subtilis, Vibrio cholerae, Salmonella typhi, Salmonella typhimurium, Neisseria lactamica, Neisseria cinerea, Mycobacteria (por ejemplo, M. tuberculosis), levaduras, etc. En comparación con los genes de H. influenzae de tipo silvestre que codifican los polipéptidos de la invención, es útil cambiar los codones para optimizar la eficacia de expresión en tales hospedadores sin afectar los aminoácidos codificados.
Los polipéptidos pueden sintetizarse mediante un procedimiento que comprende una etapa de síntesis de al menos parte del polipéptido por medios químicos.
Ácidos nucleicos
La divulgación también proporciona ácidos nucleicos (por ejemplo, combinaciones de ácidos nucleicos, vectores o combinaciones de vectores) que codifican los polipéptidos utilizados con la invención, combinaciones de polipéptidos o polipéptidos híbridos. Además, se proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia nucleotídica que codifica uno o más (por ejemplo, 2, 3 o 4) polipéptidos o polipéptidos híbridos de las combinaciones de antígenos desvelados en el presente documento. Un ácido nucleico puede ser, por ejemplo, un vector (por ejemplo, un vector de clonación o expresión).
Las secuencias nucleotídicas que codifican los polipéptidos de uno o más (al menos uno) antígenos y combinaciones de antígenos desvelados en el presente documento, se conocen (véase, por ejemplo, las referencias 6-9) o pueden diseñarse de acuerdo con el código genético. Por tanto, en el contexto de la presente divulgación, tal secuencia nucleotídica puede codificar uno o más de: (1) NTHI0915 (NT018), (2) NTHI1416 (NT024), (3) NTHI2017 (NT032), (4) CGSHiGG_02400 (NT038), (5) NTHI1292 (NT067), (6) NTHI0877 (NT001), (7) NTHI0266 (NT016), (8) CGSHiGG_00130 (NT052), (9) NTHI1627 (NT002), (10) NTHI1109 (NT026), (11) NTHI0821 (NT009), (12) NTHI0409 (NT025), (13) NTHI1954 (NT028), (14) NTHI0371 (NT029), (15) NTHI0509 (NT031), (16) NTHI0449 (NT015), (17) NTHI1473 (NT023), (18) gi-145633184 (NT100), (19) NTHI1110 (NT040), (20) gi-46129075 (NT048), (21) gi-145628236 (NT053), (22) NTHI1230 (NT066), (23) NTHI0522 (NT097) o un antígeno P48 (tal como la SEQ ID NO: 24); un antígeno HtrA (tal como la SEQ ID NO: 25); un antígeno PE (tal como la SEQ ID NO: 26); antígeno P26 (tal como la SEQ ID NO: 27); un antígeno PHiD (tal como la SEQ ID NO: 28); un antígeno P6 (tal como la SEQ ID NO: 29), (24) NT004, (25) NT014, (26) NT022 o uno o más antígenos del "tercer grupo de antígenos" o pueden codificar una secuencia de aminoácido: (a) que tiene el 50 % o más de identidad (por ejemplo, el 60 %, 65 %, 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 99 %, 99,5 % o más, por ejemplo, el 90 % de identidad o más, o el 95 % de identidad o más, o el 99 % de identidad o más, con cualquiera de los polipéptidos mencionados anteriormente; y/o (b) que comprende un fragmento de al menos "n" aminoácidos consecutivos de cualquiera de dichos polipéptidos: 1, en el que "n" es 7 o más (por ejemplo, 8, 10, 12, 14, 16, 18, 20, 25, 30, 35, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 150, 200, 250 o más; por ejemplo, 20 o más; o por ejemplo, 50 o más; o por ejemplo, 80 o más).
La invención también proporciona un ácido nucleico que puede hibridar a estos ácidos nucleicos. Las reacciones de hibridación pueden realizarse en condiciones de diferente "rigurosidad". Las condiciones que aumentan la rigurosidad de una reacción de hibridación son ampliamente conocidas y están publicada en la técnica (por ejemplo, página 752 de la referencia 121). Los ejemplos de las condiciones de interés incluyen (en orden de aumento de rigurosidad): temperaturas de incubación de 25 °C, 37 °C, 50 °C, 55 °C y 68 °C; concentraciones de tampón de SSC 10 x, SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x (en que SSC es NaCl 0,15 M y tampón de citrato 15 mM) y sus equivalentes utilizando otros sistemas de tampón; concentraciones de formamida del 0 %, 25 %, 50 % y 75 %; tiempos de incubación de 5 minutos a 24 horas; 1, 2, o más etapas de lavado; tiempos de incubación de 1, 2 o 15 minutos; y soluciones de lavado SSC 6 x, SSC 1 x, SSC 0,1 x, o agua desionizada. Las técnicas de hibridación y su optimización son bien conocidas en la técnica (por ejemplo, véanse las referencias, 21, 22 y 123).
Un ácido nucleico puede hibridar con una diana en condiciones de baja rigurosidad; en otras realizaciones hibrida en condiciones de rigurosidad intermedia; en realizaciones preferidas, hibrida en condiciones de alta rigurosidad. Un grupo ejemplar de condiciones de hibridación de baja rigurosidad es 50 °C y SSC 10 x. Un grupo ejemplar de condiciones de hibridación de rigurosidad intermedia es de 55 °C y SSC 1 x. Un grupo ejemplar de condiciones de hibridación de alta rigurosidad es 68 °C y SSC 0,1 x.
La divulgación incluye un ácido nucleico que comprende las secuencias complementarias a estas secuencias (por ejemplo, para antisentido o sonda, o para el uso como cebadores).
El ácido nucleico puede tomar varias formas (por ejemplo, monocatenario, bicatenario, vectores, cebadores, sondas, marcados, etc.). Los ácidos nucleicos pueden ser circulares o ramificados, pero en general serán lineales. A menos que se especifique o se precise otra cosa, cualquier realización que use un ácido nucleico, puede usar la forma bicatenaria y cada una de las dos formas monocatenarias complementarias que conforman la forma de bicatenaria. En general, los cebadores y sondas son de monocatenarios, como lo son los ácidos nucleicos antisentido.
Los ácidos nucleicos que codifican los antígenos descritos en el presente documento se proporcionan preferentemente en la forma purificada o sustancialmente purificada, es decir, sustancialmente exentos de otros ácidos nucleicos (por ejemplo, exentos de ácidos nucleicos de origen natural), en particular de otros ácidos nucleicos de H. influenzae o de la célula hospedadora, estando en general al menos aproximadamente el 50 % (en peso) puros, y habitualmente al menos aproximadamente el 90 % puros. Los ácidos nucleicos son preferentemente ácidos nucleicos de H. influenzae.
Los ácidos nucleicos que codifican los antígenos descritos en el presente documento pueden prepararse de muchas maneras, por ejemplo, por síntesis química (por ejemplo, síntesis de ADN de fosforamidita) totalmente o en parte, digiriendo ácidos nucleicos más largos utilizando nucleasas (por ejemplo, enzimas de restricción), uniendo ácidos nucleicos más cortos o nucleótidos (por ejemplo, utilizando ligasas o polimerasas), de bibliotecas genómicas o de ADNc, etc.
Los ácidos nucleicos pueden unirse a un soporte sólido (por ejemplo, una perla, placa, filtro, película, portaobjetos, soporte de micromatriz, resina, etc.). Los ácidos nucleicos pueden marcarse, por ejemplo, con un marcador radioactivo o fluorescente, o un marcador de biotina. Esto es particularmente útil cuando el ácido nucleico va a usarse en técnicas de detección, por ejemplo, cuando el ácido nucleico es un cebador, o como una sonda.
La expresión "ácido nucleico" incluye de manera general una forma polimérica de nucleótidos de cualquier longitud, los cuales contienen desoxirribonucleótidos, ribonucleótidos y/o sus análogos. Incluye ADN, ARN, híbridos de ADN/ARN. También incluye análogos de ADN o ARN, tales como los que contienen estructuras principales modificadas (por ejemplo, ácidos peptidonucleicos (los APN) o fosforotioatos) o bases modificadas. Por tanto, la divulgación incluye ARNm, ARNt, ARNr, ribozimas, ADN, ADNc, ácidos nucleicos recombinantes, ácidos nucleicos ramificados, plásmidos, vectores, sondas, cebadores, etc. Cuando el ácido nucleico toma la forma de ARN, puede o no tener una caperuza 5'.
Los ácidos nucleicos que codifican los antígenos descritos en el presente documento pueden ser parte de un vector, es decir, parte de una construcción de ácido nucleico diseñada para la transducción/transfección de uno o más tipos celulares. Los vectores pueden ser, por ejemplo, "vectores de clonación", los cuales se diseñan para aislamiento, propagación y replicación de los nucleótidos insertados, "vectores de expresión" que se diseñan para la expresión de una secuencia nucleotídica en una célula hospedadora, "vectores víricos" que se diseñan para dar como resultado la producción de un virus recombinante o partícula similivírica, o "vectores lanzadera", los cuales comprenden los atributos de más de un tipo de vector. Los vectores preferidos son plásmidos. Una "célula hospedadora" incluye una célula individual o cultivo celular que puede ser o ha sido una receptora de un ácido nucleico exógeno. Las células hospedadoras incluyen la progenie de una célula hospedadora individual, y la progenie puede no ser necesariamente completamente idéntica (en morfología o en el complemento de ADN total) a la célula parental original debido a la mutación y/o cambio natural, accidental o deliberado. Las células hospedadoras incluyen las células transfectadas o infectadas in vivo o in vitro con el ácido nucleico desvelado en el presente documento.
El término "complemento" o "complementario", cuando se utiliza con relación a los ácidos nucleicos, se refiere al apareamiento de bases de Watson-Crick. Por tanto, el complemento de C es G, el complemento de G es C, el complemento de A es T (o U) y el complemento de T (o U) es A. También es posible usar bases tales como I (la purina inosina), por ejemplo, para complementar las pirimidinas (C o T).
Los ácidos nucleicos que codifican los antígenos descritos en el presente documento pueden usarse, por ejemplo: para producir polipéptidos; como sondas de hibridación para la detección de un ácido nucleico en muestras biológicas; para generar copias adicionales de los ácidos nucleicos; para generar ribozimas u oligonucleótidos antisentido; como cebadores o sondas de ADN de monocatenario; o como oligonucleótidos que forman cadenas triples.
La divulgación proporciona un procedimiento de producción de un ácido nucleico que codifica los antígenos descritos en el presente documento, en el que el ácido nucleico se sintetiza en parte o totalmente utilizando todos medios químicos.
La divulgación proporciona vectores que comprenden secuencias nucleotídicas que codifican antígenos descritos en el presente documento (por ejemplo, vectores de clonación o de expresión) y células hospedadoras transformadas con tales vectores.
Para determinadas realizaciones de la divulgación, los ácidos nucleicos son preferentemente de al menos 7 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 90, 100, 110, 120, 130, 140, 150, 160, 170, 180, 190, 200, 225, 250, 275, 300 nucleótidos o más largos).
Para determinadas realizaciones de la divulgación, los ácidos nucleicos son como máximo preferentemente de 500 nucleótidos de longitud (por ejemplo, 450, 400, 350, 300, 250, 200, 150, 140, 130, 120, 110, 100, 90, 80, 75, 70, 65, 60, 55, 50, 45, 40, 39, 38, 37, 36, 35, 34, 33, 32, 31, 30, 29, 28, 27, 26, 25, 24, 23, 22, 21, 20, 19, 18, 17, 16, 15 nucleótidos o más cortos).
Composiciones inmunogénicas y medicamentos
Las composiciones inmunogénicas de la invención pueden ser útiles como vacunas. Las vacunas pueden ser profilácticas (es decir, para prevenir la infección) o terapéuticas (es decir, para tratar la infección), pero normalmente serán profilácticas.
Por tanto, las composiciones pueden ser farmacéuticamente aceptables. Habitualmente, incluirán componentes además de los antígenos, por ejemplo, incluyen normalmente uno o más vehículos y/o excipientes farmacéuticos. Una descripción completa de tales componentes está disponible en la referencia 118.
En general, las composiciones se administrarán a un mamífero en forma acuosa. Sin embargo, antes de la administración la composición puede haber estado en una forma no acuosa. Por ejemplo, aunque algunas vacunas se fabrican en forma acuosa, después se rellenan y distribuyen y administran también en forma acuosa, otras vacunas se liofilizan durante la fabricación y se reconstituyen en una forma acuosa en el momento del uso. Por tanto, una composición de la invención puede secarse, tal como una formulación liofilizada.
La composición puede incluir conservantes, tales como tiomersal o 2-fenoxietanol. Sin embargo, se prefiere que la vacuna deba estar sustancialmente exenta (es decir, menos de 5 |jg/ml) de material mercurial, por ejemplo, exenta de tiomersal. Se prefieren más las vacunas que no contienen mercurio. Se prefieren particularmente las vacunas exentas de conservantes.
Para mejorar la estabilidad térmica, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura. A continuación, se proporcionan detalles adicionales de tales agentes.
Para controlar la tonicidad, se prefiere incluir una sal fisiológica, tal como una sal de sodio. Se prefiere el cloruro de sodio (NaCl), el cual puede estar presente entre 1 y 20 mg/ml, por ejemplo, aproximadamente NaCl 10±2 mg/ml. Otras sales que pueden estar presentes incluyen cloruro de potasio, dihidrogenofosfato de potasio, fosfato de disodio deshidratado, cloruro de magnesio, cloruro de calcio, etc.
En general, las composiciones tendrán una osmolalidad de entre 200 mOsm/kg y 400 mOsm/kg, preferentemente de entre 240-360 mOsm/kg, y más preferentemente estarán dentro del intervalo de 290-310 mOsm/kg.
Las composiciones pueden incluir uno o más tampones. Los tampones típicos incluyen: un tampón de fosfato; un tampón Tris; un tampón de borato; un tampón de succinato; un tampón de histidina (particularmente con un adyuvante de hidróxido de aluminio); o un tampón de citrato. Los tampones estarán incluidos normalmente en el intervalo 5­ 20 mM.
En general, el pH de una composición estará entre 5,0 y 8,1, y más normalmente entre 6,0 y 8,0, por ejemplo, 6,5 y 7,5, o entre 7,0 y 7,8.
La composición es preferentemente estéril. La composición es preferentemente no pirógena, por ejemplo, que contiene <1 UE (unidad de endotoxina, una medida convencional) por dosis, y preferentemente <0,1 EU por dosis. La composición está preferentemente exenta de gluten.
La composición puede incluir un material para una sola inmunización, o puede incluir un material para inmunizaciones múltiples (es decir, un kit "multidosis"). La inclusión de un conservante se prefiere en las disposiciones en multidosis. Como alternativa (o además) a la inclusión de un conservante en las composiciones multidosis, las composiciones pueden estar contenidas en un recipiente que tenga un adaptador aséptico para la retirada de material.
Las vacunas humanas se administran normalmente en un volumen de dosificación de aproximadamente 0,5 ml, aunque a los niños se les puede administrar la mitad de la dosis (es decir, aproximadamente 0,25 ml).
Las composiciones inmunogénicas de la invención también pueden comprender uno o más agentes inmunorreguladores. Preferentemente, uno o más de los agentes inmunorreguladores incluyen uno o más adyuvantes. Los adyuvantes pueden incluir un adyuvante de TH1 y/o un adyuvante de TH2, analizado adicionalmente a continuación.
Los adyuvantes que pueden usarse en las composiciones de la invención incluyen, pero sin limitación:
• sales minerales, tales como sales de aluminio y sales de calcio, que incluyen hidróxidos (por ejemplo, oxihidróxidos), fosfatos (por ejemplo, hidroxifosfatos, ortofosfatos) y sulfatos, etc. [por ejemplo, véanse los capítulos 8 y 9 de la ref. 23];
• emulsiones de aceite en agua, tales como emulsiones de escualeno-agua, que incluyen MF59 (5 % de escualeno, 0,5 % de Tween 80 y 0,5 % de Span 85, formulada en partículas submicrométricas utilizando un microfluidificador) (Capítulo 10 de la ref. 23; véanse también las ref. 24-26 y el capítulo 12 de la ref. 27], adyuvante completo de Freund (ACF) y adyuvante incompleto de Freund (AIF);
• formulaciones de saponina [capítulo 22 de la ref. 23], tal como QS21 [28] y los ISCOM (forma abreviada de immunostimulating complexes, complejos inmunoestimulantes) [capítulo 23 de la ref. 23];
• virosomas y partículas similivíricas (las VLP, forma siglada de virus-like particles) [29-35];
• derivados bacterianos o microbianos, tales como derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), derivados del lípido A [36, 37], oligonucleótidos inmunoestimulantes [38-43], tales como IC-31™ [44] (desoxinucleótido que comprende la secuencia de 26 meros 5'-(IC)13-3' (SEQ ID NO: 112) y péptido de polímero policatiónico que comprende la secuencia de aminoácidos de 11 meros KLKLLLLLKLK (SEQ iD NO: 113) y toxinas de ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de las mismos [45-54];
• inmunomoduladores humanos, que incluyen citocinas, tales como interleucinas (por ejemplo, IL-1, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-12 [55, 56], interferones (por ejemplo, interferón-Y), factor estimulante de colonias de macrófagos y factor de necrosis tumoral;
• bioadhesivos y mucoadhesivos, tales como quitosano y derivados del mismo, microesferas de ácido hialurónico esterificado [57] o mucoadhesivos, tales como derivados reticulados de poli(ácido acrílico), alcohol polivinílico, polivinilpirrolidona, polisacáridos y carboximetilcelulosa [58];
• micropartículas (es decir, una partícula de ~100 nm a ~150 pm de diámetro, más preferentemente de ~200 nm a ~30 pm de diámetro, y muy preferentemente ~500 nm a ~10 pm de diámetro) formada de materiales que son biodegradables y no tóxicos (por ejemplo, un poli(a-hidroxiácido), un ácido polihidroxibutírico, un poliortoéster, un polianhídrido, una policaprolactona, etc.);
• liposomas [Capítulos 13 y 14 de la ref. 23, ref. 59-61];
• éteres de polioxietileno y ésteres de polioxietileno [62];
• formulaciones de PCPP [63 y 64];
• péptidos de muramilo, que incluyen N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil-normuramil-1-alanil-d-isoglutamina (nor-MDP) y N-acetilmuramil-1-alanil-d-isoglutaminil-1-alanin-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina MTP-PE); y
• compuestos de imidazoquinolona, que incluyen Imiquamod y sus homólogos (por ejemplo, "Resiquimod 3M") [65 y 66].
Las composiciones y vacunas inmunogénicas de la invención también pueden comprender combinaciones de aspectos de uno o más adyuvantes identificados anteriormente. Por ejemplo, las siguientes composiciones de adyuvantes pueden usarse en la invención: (1) una saponinay una emulsión de aceite en agua [67]; (2) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) [68]; (3) una saponina (por ejemplo, QS21) un derivado de LPS no tóxico (por ejemplo, 3dMPL) un colesterol; (4) una saponina (por ejemplo, QS21) 3dMPL IL-12 (opcionalmente un esterol) [69]; (5) combinaciones de 3dMPL con, por ejemplo, QS21 y/o emulsiones de aceite en agua [70]; (6) SAF, que contiene escualeno al 10 %, Tween 80™ al 0,4 %, polímero de bloques de pluronic L121 al 5 % y thr-MDP, ya sea microfluidificado en una emulsión submicrométrica o agitado vorticialmente para generar una emulsión de tamaño de partículas más grande. (7) Sistema adyuvante Ribi™ (RAS), (Ribi Immunochem) que contiene escualeno al 2 %, Tween 80 al 0,2 % y uno o más componentes de pared celular bacteriana del grupo que consiste en monofosforilípido A (MPL), dimicolato de trehalosa (TDM) y esqueleto de pared celular (CWS, forma siglada de cell wall skeleton), preferentemente MPL CWS (Detox™) y (8) una o más sales minerales (tales como una sal de aluminio) un derivado no tóxico de LPS (tal como 3dMPL).
Otras sustancias que actúan como agentes inmunoestimulantes se divulgan en el capítulo 7 de la referencia 23.
El uso de un adyuvante de hidróxido de aluminio y/o fosfato de aluminio se prefiere particularmente y, en general, los antígenos se adsorben a estas sales. El fosfato de calcio es otro adyuvante preferido. Otras combinaciones de adyuvantes preferidas incluyen las combinaciones de adyuvantes de Th1 y Th2, tales como CpG y alumbre, o resiquimod y alumbre. Puede usarse una combinación de fosfato de aluminio y 3dMPL (ésta se ha informado como eficaz en la inmunización neumocócica [71]). Se prefiere el uso de un adyuvante de MF59, en particular en el caso de la inmunización i.m. (intramuscular) o i.p. (Intraperitoneal).
Las composiciones de la invención pueden suscitar tanto una respuesta inmunitaria mediada por células como una respuesta inmunitaria humoral. Esta respuesta inmunitaria inducirá preferentemente anticuerpos duraderos (por ejemplo, neutralizantes) y una inmunidad mediada por células que puede responder rápidamente tras la exposición a NTHI.
En general se piensa que son necesarios dos tipos de linfocitos T, CD4 y CD8, para iniciar y/o potenciar la inmunidad mediada por células y la inmunidad humoral. Los linfocitos T CD8 pueden expresar un correceptor CD8 y se denominan comúnmente linfocitos T citotóxicos (los CTL). Los linfocitos T CD8 son capaces de reconocer o interactuar con antígenos presentados en las moléculas de MHC de Clase I.
Los linfocitos T CD4 pueden expresar un correceptor CD4 y se denominan comúnmente linfocitos T auxiliares. Los linfocitos T CD4 son capaces de reconocer los péptidos antigénicos unidos a las moléculas de MHC de clase II. Con la interacción con una molécula de MHC de clase II, los linfocitos CD4 pueden secretar factores, tales como citocinas. Estas citocinas secretadas pueden activar linfocitos B, linfocitos T citotóxicos, macrófagos y otras células que participan en una respuesta inmunitaria. Los linfocitos T auxiliares o linfocitos CD4+ además pueden dividirse en dos subgrupos funcionalmente distintos: el fenotipo TH1 y los fenotipos TH2 que difieren en su función de citocinas y efectora.
Los linfocitos TH1 activados potencian la inmunidad celular (incluyendo un aumento en la producción de CTL específicos de antígeno) y, por lo tanto, son de valor particular para responder a las infecciones intracelulares. Los linfocitos TH1 activados pueden secretar uno o más de IL-2, IFN-y y TNF-p. Una respuesta inmunitaria TH1 puede dar como resultado reacciones inflamatorias locales mediante la activación de macrófagos, linfocitos NK (citolíticos naturales) y linfocitos T citotóxicos CD8 (las CTL). Una respuesta inmunitaria TH1 también puede actuar expandiendo la respuesta inmunitaria estimulando el crecimiento de los linfocitos B y T con IL-12. Los linfocitos B estimulados por TH1 pueden secretar IgG2a.
Los linfocitos TH2 activados potencian la producción de anticuerpos y, por lo tanto, son valiosas para responder a infecciones extracelulares. Los linfocitos TH2 activados pueden secretar una o más de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10. Una respuesta inmunitaria TH2 puede dar como resultado la producción de IgG1, IgE, IgA y linfocitos B de memoria para la futura protección.
Una respuesta inmunitaria potenciada puede incluir uno o más de una respuesta inmunitaria TH1 potenciada y una respuesta inmunitaria TH2.
Una respuesta inmunitaria TH1 puede incluir uno o más de un aumento de los CTL, un aumento de una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH1 (tal como IL-2, IFN-y y TNF-p), un aumento de macrófagos activados, un aumento de la actividad NK o un aumento de la producción de IgG2a. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH1 potenciada incluirá un aumento en la producción de IgG2a.
Una respuesta inmunitaria TH1 puede suscitarse utilizando un adyuvante de TH1. En general, un adyuvante de TH1 suscita un aumento de los niveles de producción de IgG2a con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH1 apropiados para su uso en las composiciones de la invención pueden incluir, por ejemplo, formulaciones de saponina, virosomas y partículas similivíricas, derivados no tóxicos de lipopolisacárido enterobacteriano (LPS), oligonucleótidos inmunoestimulantes. Los oligonucleótidos inmunoestimulantes, tales como los oligonucleótidos que contienen un motivo CpG, son los adyuvantes de TH1 preferidos para su uso en las composiciones de la invención.
Una respuesta inmunitaria TH2 puede incluir uno o más de un aumento de una o más de las citocinas asociadas con una respuesta inmunitaria TH2 (tal como IL-4, IL-5, IL-6 e IL-10), o un aumento de la producción de IgG1, IgE, IgA y de linfocitos B de memoria. Preferentemente, la respuesta inmunitaria TH2 potenciada incluirá un aumento de la producción de IgG1.
Una respuesta inmunitaria TH2 puede suscitarse utilizando un adyuvante de TH2. En general, un adyuvante de TH2 suscitará un aumento de los niveles de producción de IgG1 con respecto a la inmunización del antígeno sin adyuvante. Los adyuvantes de TH2 apropiados para su uso en las composiciones de la invención incluyen, por ejemplo, composiciones que contienen minerales, emulsiones de aceite, y toxinas ribosilantes de ADP y derivados destoxificados de las mismas. Las composiciones que contienen minerales, tal como sales de aluminio, son los adyuvantes de TH2 preferidos para su uso en las composiciones de la invención.
Preferentemente, las composiciones de la invención incluyen una composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y un adyuvante de TH2. Preferentemente, tal composición suscita una respuesta TH1 potenciada y TH2potenciada, es decir, un aumento de la producción de IgG1 e IgG2a con respecto a la inmunización sin un adyuvante. Aún más preferentemente, la composición que comprende una combinación de un adyuvante de TH1 y de TH2 suscita un aumento de la respuesta inmunitaria THl y/o un aumento de TH2 con respecto a la inmunización con un único adyuvante (es decir, con respecto a la inmunización con un adyuvante de TH1 solo o inmunización con un adyuvante de TH2 solo).
La respuesta inmunitaria puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria TH1 y una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona uno o ambas de una respuesta TH1 potenciada y una respuesta TH2 potenciada.
La respuesta inmunitaria potenciada puede ser una o ambas de una respuesta inmunitaria sistémica y mucosa. Preferentemente, la respuesta inmunitaria proporciona una o ambas de una respuesta sistémica potenciada y una respuesta mucosa potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosa es una respuesta inmunitaria TH2. Preferentemente, la respuesta inmunitaria mucosa incluye un aumento de la producción de IgA.
Las infecciones por H. influenzae pueden afectar diversas áreas del cuerpo y, de esta manera, las composiciones de la invención pueden prepararse en diversas formas. Por ejemplo, las composiciones pueden prepararse como inyectables, ya sea como soluciones o suspensiones líquidas. Las formas sólidas apropiadas para solución en, o suspensión en, vehículos líquidos antes de la inyección, también pueden prepararse (por ejemplo, una composición liofilizada o una composición secada por pulverización). La composición puede prepararse para la administración tópica, por ejemplo, como un pomada, crema o polvo. La composición puede prepararse para la administración oral, por ejemplo, como un comprimido o cápsula, como una pulverización, o como un jarabe (opcionalmente saborizado). La composición puede prepararse para la administración pulmonar, por ejemplo, como un inhalador, utilizando un polvo fino o un pulverizador. La composición puede prepararse como un supositorio u óvulo vaginal. La composición puede prepararse para la administración nasal, ótica u ocular, por ejemplo, como gotas. La composición puede estar en forma de un kit, diseñado de manera que se reconstituya una composición combinada justo antes de la administración a un paciente. Dichos kits pueden comprender uno o más antígenos en forma líquida y uno o más antígenos liofilizados.
Cuando una composición va a prepararse extemporáneamente antes del uso (por ejemplo, cuando un componente se presenta en forma liofilizada) y se presenta como un kit, el kit puede comprender dos viales, o puede comprender una jeringuilla lista para su uso y un vial, utilizándose los contenidos de la jeringuilla para reactivar los contenidos del vial antes de la inyección.
Las composiciones inmunogénicas utilizadas como vacunas comprenden una cantidad inmunológicamente eficaz de antígeno (o antígenos), así como cualquier otro componente, conforme sea necesario. Por "cantidad inmunológicamente eficaz", se entiende que la administración de esa cantidad a un individuo ya sea en una sola dosis o como parte de una serie, es eficaz para el tratamiento o la prevención. Esta cantidad varía dependiendo de la salud y estado físico del individuo a tratar, la edad, el grupo taxonómico del individuo a tratar (por ejemplo, primate no humano, primate, etc.), la capacidad del sistema inmunitario del individuo para sintetizar anticuerpos, el grado de protección deseada, la formulación de la vacuna, la valoración del médico responsable de la situación médica, y otros factores pertinentes. Se espera que la cantidad esté en un intervalo relativamente amplio que puede determinarse a través de experimentos rutinarios. Cuando se incluye más de un antígeno en una composición, entonces pueden estar presentes dos antígenos a la misma dosis o a diferentes dosis.
Como se mencionó anteriormente, una composición puede incluir un agente protector de la temperatura, y este componente puede ser particularmente útil en las composiciones que contienen adyuvantes (particularmente las que contienen un adyuvante mineral, tal como una sal de aluminio). Como se describe en la referencia 72, puede añadirse un agente protector de la temperatura líquido a una composición de vacuna acuosa para disminuir su punto de congelación, por ejemplo, para reducir el punto de congelación a menos de 0 °C. Por tanto, la composición puede almacenarse por debajo de 0 °C, pero por encima de su punto de congelación, para inhibir la degradación térmica. El agente protector de la temperatura también permite la congelación de la composición, al tiempo que se protegen los adyuvantes de sales minerales frente a la aglomeración o sedimentación después de la congelación y descongelación, y también puede proteger a la composición a temperaturas elevadas, por ejemplo, por encima de 40 °C. Una vacuna acuosa de partida y el agente protector de la temperatura líquido pueden mezclarse de manera que el agente protector de la temperatura líquido forma el 1-80 % en volumen de la mezcla final. Los agentes protectores de la temperatura líquidos deberían ser seguros para la administración humana, fácilmente miscibles/solubles en agua y no deberían dañar otros componentes (por ejemplo, el antígeno y el adyuvante) en la composición. Los ejemplos incluyen glicerina, propilenglicol y/o polietilenglicol (PEG). Los PEG apropiados pueden tener un peso molecular promedio que oscila de 200-20.000 Da. En una realización preferida, el polietilenglicol puede tener un peso molecular promedio de aproximadamente 300 Da ("PEG-300").
Las composiciones de la invención pueden formarse mezclando (i) una composición acuosa que comprende dos o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4) antígenos de las combinaciones de antígenos de la invención con (ii) un agente protector de la temperatura. La mezcla después puede almacenarse, por ejemplo, debajo de 0 °C, de 0-20 °C, de 20-35 °C, de 35-55 °C, o más alto. Puede almacenarse en forma líquida o congelada. La mezcla puede liofilizarse. La composición puede formarse, alternativamente, mezclando (i) una composición seca que comprende dos o más (por ejemplo, 1,2, 3, 4) antígeno de las combinaciones de antígenos de la invención, con (ii) una composición líquida que comprende el agente protector de la temperatura. Por tanto, el componente (ii) puede usarse para reconstituir el componente (i).
Procedim ientos de tratamiento y administración de la vacuna
Las composiciones de la invención pueden utilizarse en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de una composición de la invención, o una o más etapas para administración de al menos uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 o 10) antígenos de la invención. La respuesta inmunitaria es protectora y preferentemente implica anticuerpos y/o inmunidad mediada por células. El procedimiento puede generar una respuesta de refuerzo.
La divulgación también proporciona al menos uno o más antígenos de la invención, para el uso combinado como un medicamento, por ejemplo, para el uso en la elevación de una respuesta inmunitaria en un mamífero.
La divulgación también proporciona el uso de al menos uno o más antígenos de la invención en la fabricación de un medicamento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero.
En los procedimientos y usos desvelados en el presente documento, al menos uno o más (por ejemplo, 1, 2, 3, 4) antígenos de la invención pueden administrarse simultánea, separada o secuencialmente.
Al generar una respuesta inmunitaria en el mamífero mediante estos usos y procedimientos, el mamífero puede estar protegido contra la infección por H. influenzae. La invención es eficaz contra H. influenzae de diversos serotipos diferentes, pero puede ser particularmente útil para proteger contra la enfermedad resultante de la infección por H. influenzae no tipable (NTHI). Una infección puede estar asociada con una enfermedad o afección seleccionada de, por ejemplo, otitis media (que incluye otitis media aguda), bronquitis, conjuntivitis, sinusitis, una infección de las vías urinarias, neumonía, bacteriemia, artritis séptica, epiglotitis, neumonía, empiema, pericarditis, celulitis, osteomielitis, infección respiratoria de vías bajas o meningitis. La invención es particularmente útil para el tratamiento o la prevención de la inflamación del oído medio o para el tratamiento o la prevención de las enfermedades de EPOC, al suscitar una respuesta inmunitaria que previene que las bacterias se muevan desde la garganta hasta el oído medio por medio de la trompa de Eustaquio, en donde después se coloniza el oído medio.
La divulgación también proporciona un kit que comprende un primer componente y un segundo componente, en el que ni el primer componente ni el segundo componente es una composición como se desvela en el presento documento, pero en el que el primer componente y el segundo componente pueden combinarse para proporcionar una composición como desvelada en el presente documento. El kit puede incluir además un tercer componente que comprende uno o más de los siguientes: instrucciones, jeringuilla u otro dispositivo de suministro, adyuvante o solución de formulación farmacéuticamente aceptable.
La divulgación también proporciona un dispositivo de suministro precargado con una composición inmunogénica de la invención.
El mamífero es preferentemente un ser humano, por ejemplo, un paciente humano. Cuando la vacuna es para el uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un niño (por ejemplo, un niño que empieza a caminar o un lactante) o un adolescente; cuando la vacuna es para el uso profiláctico, el ser humano es preferentemente un adolescente o un adulto. Una vacuna destinada para los niños también puede administrarse a adultos, por ejemplo, para evaluar la seguridad, dosificación, inmunogenicidad, etc. Un mamífero (por ejemplo, un ser humano, por ejemplo, un paciente) puede estar él mismo en riesgo de enfermarse o puede ser una mujer embarazada, por ejemplo, una mujer ("inmunización materna").
Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento terapéutico implica controlar la infección por H. influenzae después de la administración de las composiciones de la invención. Una manera de comprobar la eficacia del tratamiento profiláctico implica controlar las respuestas inmunitarias, sistémicamente (tal como controlando el nivel de la producción de IgG1 e IgG2a) y/o mucosalmente (tal como controlar el nivel de la producción de IgA), contra los antígenos en las composiciones de la invención después de la administración de la composición. La inmunogenicidad de las composiciones de la invención puede determinarse administrándolas a los pacientes de prueba (por ejemplo, niños de 12-16 meses o modelos animales, tal como el modelo de chinchilla
) y luego determinando parámetros convencionales que incluyen títulos de ELISA (MGT) de IgG. En general, estas respuestas inmunitarias se determinarán alrededor de 4 semanas después de la administración de la composición, y se compararán con los valores determinados antes de la administración de la composición. Cuando se administra más de una dosis de la composición, puede hacerse más de una determinación posadministración. Normalmente, las respuestas de anticuerpos en suero específicas de antígeno se determinan posinmunización pero preexposición, mientras que las respuestas mucosas de anticuerpos específicas de antígeno se determinan posinmunización y posexposición.
Otra manera de evaluar la inmunogenicidad de las composiciones de la presente invención es expresar las proteínas de forma recombinante para cribar sueros o secreciones mucosas de pacientes por inmunotransferencia y/o micromatrices. Una reacción positiva entre la proteína y la muestra del paciente indica que el paciente ha montado una respuesta inmunitaria frente a la proteína en cuestión. Este procedimiento también puede usarse para identificar antígenos inmunodominantes y/o epítopos dentro de los antígenos.
La eficacia de las composiciones de vacuna también puede determinarse in vivo mediante estudios de inmunización en modelos animales de infección por H. influenzae, por ejemplo, cobayas, chinchillas o ratones, con las composiciones de vacuna. Uno de tales modelos se describe en la referencia 74.
Otro modelo animal útil a utilizar para determinar in vivo la eficacia de las composiciones de vacuna de la invención se describe en la referencia 75.
Las composiciones de la invención en general se administrarán directamente a un paciente. El suministro directo puede realizarse por inyección parenteral (por ejemplo, por vía subcutánea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular o en el espacio intersticial de un tejido), o mucosa, tal como por administración rectal, oral, (por ejemplo, comprimido, pulverización), vaginal, tópica, transdérmica o transcutánea, intranasal, ocular, ótica, pulmonar u otra administración mucosa.
La composición de la invención puede usarse para suscitar una inmunidad sistémica y/o mucosa, preferentemente para suscitar una inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada.
Preferentemente, la inmunidad sistémica y/o mucosa potenciada se refleja en una respuesta inmunitaria TH1 y/o TH2 potenciada. Preferentemente, la respuesta inmunitaria potenciada incluye un aumento de la producción de IgGl y/o IgG2a, y/o de IgA.
La dosificación puede ser por una pauta de dosificación única o una pauta de dosificación múltiple. Las dosis múltiples pueden usarse en una pauta de inmunización primaria y/o en una pauta de inmunización de refuerzo. En un esquema de dosis múltiples, las diversas dosis pueden proporcionarse por las mismas vías o por distintas, por ejemplo, una sensibilización parenteral y un refuerzo mucoso, una sensibilización mucosa y refuerzo parenteral, etc. Las dosis múltiples se administrarán normalmente con una diferencia de al menos 1 semana (por ejemplo, aproximadamente 2 semanas, aproximadamente 3 semanas, aproximadamente 4 semanas, aproximadamente 6 semanas, aproximadamente 8 semanas, aproximadamente 10 semanas, aproximadamente 12 semanas, aproximadamente 16 semanas, etc.).
Las vacunas preparadas utilizando las composiciones de la invención pueden usarse para tratar a niños y adultos. Por tanto, un paciente humano puede ser menor de 1 año, 1-5 años, 5-15 años, 15-55 años o al menos de 55 años. Los pacientes preferidos para recibir las vacunas son los ancianos (por ejemplo, >50 años, >60 años y, preferentemente, >65 años), los jóvenes (por ejemplo, <5 años), pacientes hospitalizados, trabajadores sanitarios, servicios armados y personal militar, mujeres embarazadas, enfermos crónicos o pacientes inmunodeficientes. Sin embargo, las vacunas no son apropiadas exclusivamente para estos grupos y pueden usarse de forma más general en una población.
Las vacunas producidas utilizando las composiciones de la invención pueden administrarse a pacientes sustancialmente al mismo tiempo que (por ejemplo, durante la misma consulta o visita médica aun profesional sanitario o centro de vacunación) otras vacunas, por ejemplo, sustancialmente al mismo tiempo que una vacuna del sarampión, una vacuna de paperas, una vacuna de rubéola, una vacuna triple vírica, una vacuna de varicela, una vacuna tetravalente (para sarampión, paperas, rubéola y varicela), una vacuna de difteria, una vacuna del tétanos, una vacuna de tosferina, una vacuna de DTT, una vacuna conjugada de H. influenzae de tipo b, una vacuna de poliovirus inactivada, una vacuna de virus de la hepatitis B, una vacuna conjugada de meningocócica (tal como una vacuna tetravalente A-C-W135-Y), una vacuna de virus respiratorio sincicial, etc.
Inmunización mucosa
La divulgación proporciona los antígenos, combinaciones de antígenos y composiciones desvelados en el presente documento para inmunización mucosa. Por ejemplo, la divulgación proporciona una composición inmunogénica que comprende (i) una combinación de antígenos polipeptídicos de la invención, y (ii) una toxina ribosilante de ADP bacteriana y/o un derivado destoxificado de la mismas. La divulgación también proporciona un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria en un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de tal composición inmunogénica al mamífero. La composición se administra preferentemente a través de la mucosa (a una superficie mucosa), por ejemplo, puede administrarse intranasal.
La toxina del componente (ii) puede, por ejemplo, proceder de la enterotoxina termolábil ("LT") de E. coli. El derivado puede tener una mutación de destoxificación en su subunidad A, por ejemplo, puede ser LT-K63 o LT-R72. En particular, puede ser LT-K63. En otras realizaciones, no es LT-K63.
Se prefiere la administración intranasal de los antígenos o composiciones desvelados en el presente documento y un adyuvante de LT-K63. Esto puede disminuir la carga bacteriana de H. influenzae en la nasofaringe, pulmones y sangre y aumentar la tasa de supervivencia de los mamíferos infectados.
Componentes antigénicos adicionales de las composiciones de la invención
La invención también proporciona composiciones que además comprenden al menos un antígeno adicional de H. influenzae no tipable.
La invención también proporciona composiciones que además comprenden al menos un antígeno que no es un antígeno de H. influenzae no tipable.
En particular, la invención también proporciona una composición que comprende uno o más polipéptidos de las composiciones de la invención y uno o más de los siguientes antígenos adicionales:
- un antígeno del serogrupo A, B, C, W135 y/o Y de N. meningitidis.
- un antígeno de sacárido o polipeptídico de Streptococcus pneumoniae [por ejemplo, 76, 77, 78].
- un antígeno del virus de la hepatitis A, tal como virus inactivado [por ejemplo, 79, 80].
- un antígeno del virus de la hepatitis B, tal como los antígenos de superficie y/o central [por ejemplo, 80, 81]. - un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico [por ejemplo, capítulo 3 de la ref. 82] o el mutante CRM197 [por ejemplo, 83].
- un antígeno de tétanos, tal como un toxoide tetánico [por ejemplo, capítulo 4 de la ref. 82].
- un antígeno de Bordetella pertussis, tal como holotoxina de tosferina (PT) y hemaglutinina filamentosa (FHA, forma siglada de filamentous haemagglutinin) de B. pertussis, también opcionalmente en combinación con pertactina y/o aglutinógenos 2 y 3 [por ejemplo, las referencias 84 y 85].
- un antígeno de tosferina celular completo
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B [por ejemplo, 86].
- antígeno (o antígenos) de polio [por ejemplo, 87, 88] tal como VIP.
- antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola [por ejemplo, los capítulos 9, 10 y 11 de la ref. 82].
- antígeno (o antígenos) de gripe [por ejemplo, el capítulo 19 de la referencia 82], tal como las proteínas de superficie hemaglutinina y/o neuraminidasa.
- un antígeno de Moraxella catarrhalis [por ejemplo, 89].
- un antígeno proteico de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B) [por ejemplo, 90, 91].
- un antígeno de sacárido de Streptococcus agalactiae (estreptococo del grupo B).
- un antígeno de Streptococcus pyogenes (estreptococo del grupo A) [por ejemplo, 91, 92, 93].
- un antígeno de Staphylococcus aureus [por ejemplo, 94].
- un antígeno del virus respiratorio sincicial, por ejemplo, una proteína F recombinante [por ejemplo, 142]
- una composición de vacuna que comprende vacuna conjugada (adsorbida) de difteria (D), tétanos (T), tosferina (componente acelular) (Pa), hepatitis B (ADNr) (VHB), poliomielitis (inactivado) (VPI) y Haemophilus influenzae de tipo b (Hib), por ejemplo, Infanrix-hexa.
La composición puede comprender uno o más de estos antígenos adicionales. Las combinaciones con una vacuna de VRS y/o con una vacuna que contiene DTPa son de interés particular.
Los antígenos de proteínas tóxicas pueden destoxificarse cuando sea necesario (por ejemplo, destoxificación de la toxina de tosferina por medios químicos y/o genéticos [85]).
Cuando se incluye un antígeno de difteria en la composición, también se prefiere incluir el antígeno de tétanos y los antígenos de tosferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tétanos también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tosferina. De manera similar, cuando se incluye un antígeno de tosferina, también se prefiere incluir los antígenos de difteria y tétanos. Por tanto, se prefieren las combinaciones de DTP.
Los antígenos de sacáridos están preferentemente en forma de conjugados. Las proteínas transportadoras para los conjugados incluyen la toxina diftérica, toxina tetánica, la proteína de membrana externa de N. meningitidis [95], péptidos sintéticos [96, 97], proteína de choque térmico [98, 99], proteínas de tosferina [100,101], proteína D de H. influenzae [102], citocinas [103], linfocinas [103], proteínas estreptocócicas, hormonas [103], factores de crecimiento [103], toxina A o B de C. difficile [104], proteínas de captación de hierro [105], etc. Una proteína transportadora preferida es el mutante CRM197 de la toxina diftérica [106].
Los antígenos de la composición estarán presentes normalmente a una concentración de al menos 1 pg/ml cada uno. En general, la concentración de cualquier antígeno dado será suficiente para suscitar una respuesta inmunitaria contra tal antígeno.
Los antígenos están adsorbidos preferentemente en una sal de aluminio.
Anticuerpos
Los anticuerpos contra los antígenos desvelados en el presente documento pueden usarse para la inmunización pasiva [107]. En el presente documento se desvelan anticuerpos específicos para antígenos desvelados en el presente documento para su uso en terapia. Estos antígenos pueden usarse solos o en combinación. En el presente documento se desvelan composiciones inmunogénicas y farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos.
Los anticuerpos pueden usarse en medicina y en terapia, por ejemplo, para la inmunización pasiva contra NTHI, o para clarificar una infección por NTHI. En el presente documento se desvela el uso de tales anticuerpos en la fabricación de un medicamento. En el presente documento se desvela un procedimiento para el tratamiento de un mamífero, que comprende la etapa de administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo de la invención. Como se describe anteriormente para las composiciones inmunogénicas, estos procedimientos y usos permiten proteger a un mamífero contra infecciones por NTHl. En particular, los anticuerpos desvelados en el presente documento pueden usarse en procedimientos para el tratamiento o la prevención de infecciones por NTHI, que comprenden la etapa de administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo como se describe en el presente documento, o una composición que comprende tal anticuerpo.
El término "anticuerpo" incluye moléculas de inmunoglobulina intactas (como palivizumab), así como fragmentos de las mismas, las cuales son capaces de unirse a un antígeno de NTHI. Éstas incluyen moléculas de anticuerpo híbridas (quiméricas) [108, 109]; fragmentos F(ab')2 y F(ab), y moléculas Fv; heterodímeros no covalentes [110, 111]; moléculas de Fv monocatenario (sFv) [112]; construcciones de fragmentos de anticuerpo diméricas y triméricas; minicuerpos [113, 114]; moléculas de anticuerpos humanizados [115-117] y cualesquiera fragmentos funcionales obtenidos de tales moléculas, así como los anticuerpos obtenidos por medio de los procedimientos no convencionales, tal como presentación en fagos. Preferentemente, los anticuerpos son anticuerpos monoclonales. Los procedimientos para obtener anticuerpos monoclonales son bien conocidos en la técnica. Se prefieren los anticuerpos humanizados o completamente humanos. Los anticuerpos y las combinaciones de anticuerpos de los desvelados en el presente documento pueden purificarse o aislarse.
General
La práctica de la presente invención empleará, a menos que se indique lo contrario, procedimientos convencionales de química, bioquímica, biología molecular, inmunología y farmacología, dentro de la habilidad de la técnica. Dichas técnicas se explican completamente en la bibliografía. Véanse, por ejemplo, las referencias 118-125, etc.
Cuando la divulgación se refiere a un "epítopo", este epítopo puede ser un epítopo de linfocitos B y/o un epítopo de linfocitos T. Dichos epítopos pueden identificarse empíricamente (por ejemplo, utilizando PEPSCAN [126, 127] o procedimientos similares), o pueden predecirse (por ejemplo, utilizando el índice antigénico de Jameson-Wolf [128], estrategias basadas en matrices [129], , MAPITOPE [130], TEPITOPE [131,132], redes neurales [133], OptiMer y EpiMer [134, 135], ADEPT [136], Tsites [137], hidrofilicidad [138], índice antigénico [139] o los procedimientos desvelados en las referencias 140-144, etc.). Los epítopos son las partes de un antígeno que reconocen, y que se unen a, los sitios de unión a antígeno de los anticuerpos o receptores de linfocitos T, y también pueden denominarse "determinantes antigénicos".
Cuando se omite un "dominio" de antígeno, esto puede implicar la omisión de un péptido de señal, de un dominio citoplásmico, de un dominio de transmembrana, de un dominio extracelular, etc.
La expresión "que comprende" abarca "que incluye", así como "que consiste", por ejemplo, una composición "que comprende" X puede consistir exclusivamente en X o puede incluir algo adicional, por ejemplo, X Y.
El término "aproximadamente" con relación a un valor numérico x es opcional y significa, por ejemplo, x±10 %. Las referencias a un porcentaje de identidad de secuencia entre dos secuencias de aminoácidos significan que, cuando se alinean, este porcentaje de aminoácidos son los mismos al comparar las dos secuencias. Este alineamiento y la homología porcentual o la identidad de secuencia pueden determinarse utilizando programas informáticos conocidos en la técnica, por ejemplo, los descritos en la sección 7.7.18 de la ref. 22. Un alineamiento preferido se determina por el algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman utilizando una búsqueda de huecos afines con una penalización de abertura de hueco de 12 y una penalización de extensión de hueco de 2, matriz BLOSUM de 62. El algoritmo de búsqueda de homología de Smith-Waterman se desvela en la referencia 145.
Breve descripción de los dibujos
La Figura 1 muestran una miniinducción que confirma una fuerte expresión de los antígenos en células BL21 (DE3)T1r. (a): (LMWM: marcadores patrón de peso molecular)
La Figura 2 muestra diversos resultados para NT001, NT007, NT018, NT024, NT032 y NT067. Se obtuvieron resultados de expresión similares con los otros antígenos preferidos, tales como NT052, NT004, NT014, NT016 o NT022. Cada panel muestra los datos de transferencia de western y de FACS. Las transferencias de western se realizaron utilizando sueros de ratón, y los carriles muestran la reactividad con extractos bacterianos totales ("TE"), con vesículas preparadas de membranas externas de NTHI ("OMV") o con la proteína de recombinación purificada ("PP"). Los análisis de FACS después de la incubación de las bacterias inactivadas con sueros de ratones inmunizados con diversas composiciones de antígenos utilizando solamente alumbre como control negativo; controles negativos de suero preinmunes se muestran como áreas negras, y la señal de expresión superficial obtenida con un suero de muestra se muestra como una línea simple.
La Figura 3 muestra el diseño en una placa de 96 pocillos de un ensayo bactericida en suero para verificar la capacidad para destruir NTHI de los antisueros contra antígenos desvelados en el presente documento.
Ejemplos
Visión de conjunto
Se clonó y expresó el listado de todos los antígenos que se identificaron como conservados en un análisis comparativo realizado por los inventores de al menos 86 cepas diferentes de NTHI. Las proteínas se purificaron y usaron para inmunizar ratones. Los antisueros de los ratones inmunizados se utilizaron para verificar la localización superficial y la capacidad protectora de las proteínas utilizadas en la inmunización (Tabla III y/o Tabla IV). Los resultados muestran que la inmunización NT052, NT024, NT032, NT001, NT067, NT004, NT014, NT022, NT016 es altamente protectora contra NTHI y mostraron mayores, o al menos comparables, títulos de SBA (forma siglada de serum bactericidal assay, prueba bactericida en suero) de actividad de destrucción bacteriana incluso comparando con el "segundo grupo de antígenos".
Cepas y variantes
Los inventores descubrieron que los genes que codifican NT022, NT016, NT014, NT018, NT024, NT032, NT067 y NT001 estaban presentes y conservados en las 86 secuencias genómicas analizadas.
Las secuencias de NT018 codificadas eran el 95-100 % idénticas a través del panel compuesto por los 15 genomas completos y las 32 cepas de la colección de otitis finlandesa. Las secuencias de NT024 codificadas eran el 90-100 % idénticas en el panel compuesto por los 15 genomas completos y las 32 cepas de la colección de otitis finlandesa. Las secuencias de NT032 codificadas eran el 95-100 % idénticas en el panel compuesto por los 15 genomas completos y las 32 cepas de la colección de otitis finlandesa; las secuencias de NT067 codificadas eran el 95-100 % idénticas en el panel compuesto por los 15 genomas completos y las 32 cepas de la colección de otitis finlandesa. Las secuencias de NT001 codificadas eran el 95-100 % idénticas en el panel compuesto por los 15 genomas completos y las 32 cepas de la colección de otitis finlandesa.
La conservación en las secuencias de aminoácidos codificadas se muestra en la Tabla I.
Tabla I: conservación de los antígenos (% de identidad) entre genomas de y cepas de Haemophilus
Figure imgf000037_0001
A fines de expresión, los antígenos que pertenecen al "primer grupo de antígenos" y/o el "segundo grupo de antígenos" se clonaron de la cepa Fi176, la cual es una cepa aislada de una colección finlandesa de cepas obtenidas de pacientes con otitis media o de la cepa R2846 [146]. La mayoría de los antígenos seleccionados y probados adicionalmente en un modelo animal también se encuentra que están bien conservados entre las cepas, por ejemplo, NT016, NT067, NT022, NT014.
En algunos casos las mutaciones se han introducido en las secuencias de tipo silvestre. Estas mutaciones están subrayadas en el listado de secuencias para NT018, NT067, NT001, NT016, NT002, NT026, NT009, NT015, NT023 y NT066 (véanse las SEQ ID NO: 49, 52, 54, 55, 57-59, 64, 65 y 67).
Clonación y expresión de proteínas recombinantes NTHI
La clonación y expresión de antígenos puede realizarse por procedimientos convencionales [121].
Los ORF para los antígenos de la cepa de NTHI Fi176 o R2846 se amplificaron por PCR utilizando los oligonucleótidos específicos y ADN cromosómico de NTHI como molde. Los productos de PCR resultantes se clonaron en pET15b (Novagen) utilizando el procedimiento PIPE [147], que consiste en la amplificación de PCR del vector de clonación (V-PCR) y en la amplificación de PCR del inserto (I-PCR). Luego se mezclan 1 pl de V-PCR y 1 pl de I-PCR y se transforman en las células HK100 químicamente competentes [148]. Se configuraron reacciones de I-PCR, que contenían 1 pM de cada una de los cebadores directo e inverso, tampón de reacción de ADN polimerasa Pfu clonada 1x, 2,5 unidades de ADN polimerasa Pfu Turbo (Stratagene), 200 pM de cada dNTP (Invitrogen) y 50 ng de molde de ADN genómico. Las reacciones se realizaron como sigue: desnaturalización inicial durante 2 minutos a 95 °C, luego 25 ciclos de 95 °C durante 30 s, 55 °C durante 45 s y 68 °C durante 3 min, seguido por un enfriamiento final a 4 °C. Las reacciones de V-PCR fueron idénticas a las reacciones de I-PCR, pero las etapas a 68 °C fueron de una duración de 14 min y se utilizaron 2 ng del plásmido pET15b como el molde de ADN. Las transformaciones correctas se seleccionaron por cribado por PCR y secuenciación de ADN plasmídico de las uniones de inserto-vector. Después se preparó el plásmido correcto a partir de los clones de HK100 seleccionados y se utilizaron para transformar células BL21(DE3)T 1r (Sigma) para permitir la expresión de proteínas.
Para expresar las proteínas clonadas, los clones de BL21(DE3)T1r que contenían las construcciones de pET15b se crecieron en medio LB conteniendo 100 pg/ml de ampicilina a 37 °C hasta una DO600 = 0,5. La expresión de proteína se indujo a continuación añadiendo IPTG 1 mM y cultivando a la misma temperatura durante 3 horas adicionales. Se realizó extracciones de proteína y SDS-Page convencional para comprobar la expresión de proteína. La Figura 1 muestra una miniinducción que confirma la buena expresión de los antígenos.
Purificación de proteínas
Las proteínas se purificaron mediante el siguiente procedimiento general: se suspende biomasa húmeda de BL21(DE3)T1 en tampón de lisis y se clarifica por centrifugación. Para la purificación de la proteína soluble (), después de la lisis se aplican los sobrenadantes en placas de 96 pocillos His Multitrap HP 50 pl NiSepharose High Performance. Para la proteína insoluble (HtrA, PE y P48), se solubilizan los sedimentos que contienen la fracción insoluble después de la lisis con Guanidina-HCl 6 M y se recentrifugan, y los sobrenadantes se aplican a las placas de 96 pocillos de His Multitrap HP 50 ml NiSepharose High Performance.
Se recoge el flujo de paso y se lavan todos los pocillos con el tampón que contiene imidazol 20 mM. A continuación, las proteínas de fusión con His se eluyen con imidazol 250 mM. El procedimiento se realiza utilizando un sistema de vacío. Los antígenos purificados se utilizan en los esquemas de inmunización descritos en el presente documento.
Se siguió el siguiente protocolo:
1) Resuspender el sedimento de BL21(DE3)T1 (1 g) en 1,5 ml de tampón B-PER™ (PIERCE), añadir 15 pl de lisozima, 7,5 pl de ADNasa y 3 pl de MgCh 1 M
2) Incubar durante 30 min para la lisis
3) Centrifugar a 20 000 rpm a 4 °C durante 30 minutos; para la purificación de cualquier proteína insoluble, solubilizar los sedimentos que contienen la fracción insoluble después de la lisis con Guanidina-HCl 6 M y recentrifugar
4) Recuperar el sobrenadante y filtrar (poro de 0.8 pm).
5) Utilizar placas de 96 pocillos His Multitrap HP 50 pl NiSepharose High Performance, conectadas a un sistema de vacío
Tampón A: NaPPi 50 mM, NaCI 300mM, pH 8
Tampón B: NaPPi 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 250 mM, pH 8
Tampón C: NaPPi 50 mM, NaCl 300 mM, Imidazol 20 mM, pH 8
1a etapa: eliminar el etanol de la placa.
2a etapa: lavar la placa con 400 j l de H2O milliQ.
3 a etapa: equilibrar la placa con 400 j l de tampón A
4 a etapa: cargar 600 j l del material de partida para cada proteína en una de las 12 columnas. Si el volumen es mayor, repetir hasta que todo el material esté cargado por completo.
Recuperar el flujo de paso.
5 a etapa: Etapa de lavado: 4 lavados con 400 j l de tampón C. Desechar el flujo de paso.
6a etapa: Elución: 2 x 300 j l de tampón B (2 etapas de elución).
Activar el vacío 15 minutos después de añadir el tampón.
Se analizan por SDS-PAGE 1 j l del extracto total, 1 j l del material de partida, 1 j l de flujo de paso y 10 j l de volumen de elución (para cada proteína).
Para la proteína insoluble, el tampón B se reemplaza por tris 10 mM, Na2 HPO4 50 mM, urea 8 M, imidazol 250 mM, glicerol al 40 %.
Prueba LAL
La prueba LAL (forma siglada de Limulus amebocyte lysate, lisado de amebocitos de Limulus) es una prueba que mide la concentración de endotoxinas en una muestra de vacuna utilizando la tecnología endosafe®-PTS™ Charles River. Tecnología de prueba
La PTS utiliza la metodología cromogénica de cinética LAL para medir la intensidad de color directamente relacionada con la concentración de endotoxina en una muestra. Cada cartucho contiene cantidades precisas del reactivo de LAL autorizado, sustrato cromogénico y endotoxina patrón de control (CSE, forma siglada de control standard endotoxin). Los cartuchos se fabrican de acuerdo con procedimientos estrictos de control de calidad para asegurar la precisión de la prueba y la estabilidad del producto.
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Inmunización de ratones y producción de antisueros
Se inmunizaron ratones CD1 de cinco semanas de edad (8 para cada antígeno) mediante 3 inyecciones intraperitoneales (cada dos semanas) de 10 microgramos de antígenos de proteína purificados con adyuvante de Freund (200 microlitros por ratón) o con alumbre (adyuvante de hidróxido de aluminio; 2 mg/ml). Los sueros se recogieron dos semanas después de la tercera inyección y se almacenaron a -20 °C. Los controles se inyectaron solamente con adyuvante de Freund o solamente con alumbre.
Análisis de FACS
Se realizó un ensayo de marcaje superficial por FACS para examinar la exposición en superficie de los antígenos seleccionados y los niveles de expresión en diferentes cepas. Se incubaron las NTHI con los sueros obtenidos de los ratones inmunizados con las proteínas recombinantes o controles negativos, y se analizaron por FACS. Los resultados se muestran en la Figura 2. En la Figura 2, los controles negativos de suero preinmune se muestran como áreas negras, y la señal obtenida con el suero de muestra se representa como una línea simple. Los resultados del análisis de FACS de los antígenos P48, HtrA, PE y P26 demuestran que cada uno de estos antígenos se expone en la superficie de la bacteria y, de esta manera, es accesible a la unión con anticuerpos.
En este análisis se utilizaron los siguientes materiales y procedimientos:
Materiales
1. placas de 96 pocillos de fondo en U.
2. Tampón de bloqueo y lavado: PBS que contiene BSA al 1 % (p/v).
3. IgG anti-ratón de cabra-Isotiocianato de Fluoresceína FITC.
4. PBS que contiene para-formaldehído al 0,5 % (v/v): diluir una solución madre de para-formaldehído al 4 % (v/v) en PBS al 0,5 % (v/v) de manera reciente antes del ensayo y esterilizar por filtrado (filtro de 0,22 pm).
5. PBS que contiene BSA al 1 % (p/v). Para preparar esta solución, disolver BSA al 1 % (p/v) en PBS, preparar al menos 100 ml para cada cepa. Esterilizar por filtrado la solución (filtro de 0,22 pm) y preparar de manera reciente para el uso.
6. Tubos FACScan (Becton Dickson).
7. Citómetro de flujo FACScalibur (Becton Dickinson).
Procedimientos
1. Cultivar NTHI hasta que se alcance un valor de DOÁ600de nm de 0,5, después transferir 1 ml de cultivo a un tubo Eppendorf estéril de 1,5 ml y centrifugar a 13000 g en una microcentrífuga durante 3 minutos para sedimentar las bacterias. Descartar el sobrenadante y suspender el sedimento suspendido en 1 ml de PBS que contiene BSA al 1 % (p/v). Por último, diluir la suspensión bacteriana 1/50 en PBS que contiene BSA al 1 % (p/v).
2. Añadir muestras de 50 pl de los sueros diluidos en tampón de bloqueo (a 1/100, 1/200 y 1/400) en una placa de 96 pocillos. Incluir controles positivos, tal como antisueros anti-OMV.
3. Añadir 50 pl de células bacterianas a cada pocillo y almacenar la placa a 4 °C durante 2 h.
4. Centrifugar las células durante 5 minutos a 3500 g, descartar el sobrenadante y lavar las células añadiendo 200 pl/pocillo de tampón de lavado.
5. Añadir 50 pl de una dilución 1/100 de Ig anti-ratón de cabra conjugada a FITC a cada pocillo y almacenar la placa a 4 °C durante 1 h.
6. Centrifugar las células a 3500g durante 5 min y lavar el sedimento con 200pl/pocillo de PBS.
7. Repetir la etapa de centrifugación, descartar el sobrenadante y añadir 200 pl/pocillo de PBS que contiene paraformaldehído al 0,5 % (v/v), para fijar las células.
8. Transferir las muestras fijadas a tubos FACScan individuales y analizar por citometría de flujo, siguiendo las instrucciones del fabricante del equipo.
Ensayo bactericida en suero (SBA)
Los antisueros obtenidos de los ratones inmunizados con las proteínas recombinantes se probaron en un ensayo bactericida en suero, para verificar la presencia de anticuerpos funcionales capaces de inducir la destrucción de NTHi. Los sueros preinmunes y los sueros de ratones inyectados solamente con el adyuvante se utilizaron como controles negativos. El cultivo de NTHI (cepa 176) (BHI+NAD y Hemina) se incubó a 37 °C con agitación, hasta que la DO595 nm fue de 0,25-0,27. Las células bacterianas se diluyeron en tampón D-PBS a la dilución de trabajo de 1:50000. Los sueros se inactivaron a 56 ° durante 30 minutos y después se diluyeron en serie en D-PBS en una placa de 96 pocillos de fondo en U (véase la Figura 3). Las columnas 11 y 12 de la placa mostrada en la Figura 3 contienen controles negativos para evaluar el crecimiento de las bacterias y para detectar cualquier destrucción no mediada por complemento. Sa añadió a cada pocillo bacterias y una fuente de complemento (Conejo, 7504, Cedarlane), excepto en los pocillos de control de complemento que recibieron complemento inactivado con calor.
Como se muestra en la Figura 3, los pocillos de las columnas 1-10 contienen 25 pl de sueros diluidos, 12,5 pl de complemento activo y 12,5 pl de bacterias. Los pocillos de la columna 11 contienen 25 pl de tampón, 12,5 pl de complemento activo y 12,5 pl de bacterias. Los pocillos de la columna 12 contienen 25 pl de tampón, 5 pl de sueros, 12,5 pl de complemento inactivado con calor y 12,5 pl de bacterias.
Se colocaron en placas de agar chocolate (Biomerieux) 10 pl de los controles de ensayo de tiempo cero (T0) (columna 11-12) por el procedimiento de aplicación puntual y basculación. Las placas se incubaron a 37 °C, durante una noche. Las placas de microtitulación de ensayo se incubaron durante 1 hora a 37 °C. Después de este periodo (T60) se colocaron en placas 7 pl de cada pocillo como una aplicación puntual en una placa de agar chocolate (cada pocillo se colocó en placas por duplicado). El número de colonias (unidades formadoras de colonias, UFC) se recontó utilizando un contador de colonias o de forma manual. Se consideró que se observaba un efecto bactericida cuando el número de colonias fue menor del 50 % del T=0.
Una visión de conjunto de los resultados se proporciona a continuación en la Tabla III y la Tabla IV.
Tabla III: Resultados de inmunogenicidad
Figure imgf000041_0001
continuación
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Estos resultados muestran que los antígenos seleccionados son altamente eficaces en la destrucción de NTHI patógenas. En particular NT018, NT001, NT024, NT032, NT067, NT016 muestran efectos protectores particularmente fuertes.
Tabla IV: Experimentos de inmunización utilizando composiciones que comprenden antígenos de NTHI y alumbre
Figure imgf000042_0002
continuación
Figure imgf000043_0001
Estos resultados confirman además que los antígenos seleccionados son altamente eficaces en la destrucción de NHTI patógenas también cuando se utilizan en composiciones inmunogénicas con alumbre como adyuvante.
En particular, NT016, NT052, NT018, NT001, NT024, NT032, NT067, NT014, NT022 confirman todos efectos protectores particularmente fuertes al medirlo en el ensayo bactericida en suero (SBA).
Los antígenos particularmente preferidos fueron NT067, NT014, NT016, NT022. Estos antígenos también se han probado en un modelo animal in vivo de acuerdo con el protocolo descrito en la Ref. 75.
Análisis de eficacia de vacuna in vivo
Los antígenos individuales que se enumeran en la Tabla IV se pueden probar para determinar su capacidad para proteger contra una infección de otitis media (OM) utilizando un modelo in vivo, tal como mutantes de ratón Junbo y Jeff [75].
La eficacia de la vacuna en el experimento de protección in vivo se realiza utilizando 3 administraciones (en el día 0, 21, 35) de 10 microgramos/ratón de antígenos de proteína recombinante purificado formulados con o sin adyuvante, seguido de inoculación intranasal con cepas patógenas de NTHI seleccionadas.
Los sueros preinmunes, sueros posinmunización y sueros terminales 7 días posinoculación con NTHI, se cogieron y almacenaron a -80 °C. Los controles se inmunizaron con el adyuvante o con un antígeno no relacionado como control. Se recogen muestras de lavados de la bulla del oído medio y nasofaríngeos (NF) y se colocan en placas para determinar los números de NTHi; después se calculan la infección de la bulla y las tasas de estado portador nasofaríngeo, y los títulos de NTHi en la bulla.
Tabla V: Referencia cruzada de nomenclatura con las cepas representativas
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(continuación)
Figure imgf000044_0001
(continuación)
Figure imgf000045_0001
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Claims (9)

REIVINDICACIONES
1. Una composición inmunogénica que comprende un antígeno de H. influenzae no tipable NT067 para su uso en un procedimiento para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por H. influenzae en un mamífero, en el que dicho antígeno NT067 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene el 95 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 5.
2. La composición para su uso de la reivindicación 1, en la que dicho antígeno NT067 comprende la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 52.
3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, que comprende además uno o más antígenos de H. influenzae no tipable, seleccionados del grupo que consiste en: antígeno de H. influenzae no tipable NT052, en el que dicho antígeno NT052 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 8; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 8; antígeno de H. influenzae no tipable NT018, en el que dicho antígeno NT018 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 1; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 1; antígeno de H. influenzae no tipable NT024, en el que dicho antígeno NT024 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 2; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 2; antígeno de H. influenzae no tipable NT032, en el que dicho antígeno NT032 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 3; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 3; antígeno NT038 de H. influenzae no tipable, en el que dicho antígeno NT038 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 4; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 4; antígeno de H. influenzae no tipable NT001, en el que dicho antígeno NT001 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 6; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 6; antígeno de H. influenzae no tipable NT016, en el que dicho antígeno NT016 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 7; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 7; antígeno de H. influenzae no tipable NT002, en el que dicho antígeno NT002 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 9; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 9; antígeno de H. influenzae no tipable NT026, en el que dicho antígeno NT026 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 10; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 10; antígeno de H. influenzae no tipable NT009, en el que dicho antígeno NT009 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 11; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 11; antígeno NT025 de H. influenzae no tipable, en el que dicho antígeno NT025 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 12; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 12; antígeno de H. influenzae no tipable NT028, en el que dicho antígeno NT028 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 13; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 13; antígeno de H. influenzae no tipable NT029, en el que dicho antígeno NT029 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 14; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 14; antígeno de H. influenzae no tipable NT031, en el que dicho antígeno NT031 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 15; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 15; antígeno de H. influenzae no tipable NT015, en el que dicho antígeno NT015 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80% o más de identidad con la SEQ ID NO: 16; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 16; antígeno de H. influenzae no tipable NT023, en el que dicho antígeno NT023 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 17; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 17; antígeno NT100 de H. influenzae no tipable, en el que dicho antígeno NT100 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 18; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 18; antígeno de H. influenzae no tipable NT040, en el que dicho antígeno NT040 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 19; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 19; antígeno de H. influenzae no tipable NT048, en el que dicho antígeno NT048 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 20; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 20; antígeno de H. influenzae no tipable NT053, en el que dicho antígeno NT053 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80% o más de identidad con la SEQ ID NO: 21; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 21; antígeno de H. influenzae no tipable NT066, en el que dicho antígeno NT066 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 22; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 22; antígeno de H. influenzae no tipable NT097, en el que dicho antígeno NT097 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 23; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 23;antígeno NT 004 de H. influenzae no tipable, en el que dicho antígeno NT004 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 122; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 122; antígeno de H. influenzae no tipable NT014, en el que dicho antígeno NT014 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80% o más de identidad con la SEQ ID NO: 123; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 123; antígeno de H. influenzae no tipable NT022, en el que dicho antígeno NT022 es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 124; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 124.
4. Una composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: NT007 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 24; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 24; NT006 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 25; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 25; NT035 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 26; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 26; NT010 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 27; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 27; NT080 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 28; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 28; NT081 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID n O: 29; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 29.
5. Una composición inmunogénica para su uso de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende además al menos un polipéptido seleccionado del grupo que consiste en: NT013 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 30; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 30;NT106 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 31; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 31;NT107 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 32; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 32;NT108 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 33; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 33;NT109 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 34; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 34;NT110 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID n O: 35; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 35;NT111 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 36; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 36;NT112 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 37; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 37;NT113 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 38; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 38;NT114 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID n O: 39; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 39;NT115 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 40; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 40;NT116 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 41; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 41;NT117 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 42; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 42;NT118 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 43; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de 43;NT123 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80% o más de identidad con la SEQ ID NO: 44; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 44;NT124 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 45; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 45;NT119 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80% o más de identidad con la SEQ ID NO: 114; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 114;NT120 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 115; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 115;NT121 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 116; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 116;NT122 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ Id NO: 117; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 117; y/o NT061 que es un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos: (a) que tiene el 80 % o más de identidad con la SEQ ID NO: 128; y/o (b) que es un fragmento de al menos 10 aminoácidos consecutivos, y comprende un epítopo, de la SEQ ID NO: 128.
6. Una composición inmunogénica para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende una combinación de dos o más antígenos.
7. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, que comprende además al menos un antígeno de vacuna que no es un antígeno de H. influenzae no tipable seleccionado de cualquiera de:
- un antígeno del serogrupo A, B, C, W135 y/o Y de N. meningitidis
- un antígeno de sacárido o polipeptídico de Streptococcus pneumoniae
- un antígeno del virus de la hepatitis A
- un antígeno del virus de la hepatitis B
- un antígeno de difteria, tal como un toxoide diftérico
- un antígeno de tétanos
- un antígeno de Bordetella pertussis
- un antígeno de tosferina celular completo
- un antígeno de sacárido de Haemophilus influenzae B
- antígeno (o antígenos) de polio
- antígenos de sarampión, paperas y/o rubéola
- antígeno (o antígenos) de gripe
- un antígeno de Moraxella catarrhalis
- un antígeno del virus respiratorio sincicial
- una composición de vacuna que comprende vacuna conjugada (adsorbida) de difteria (D), tétanos (T), tosferina (acelular, componente) (Pa), hepatitis B (ADNr) (VHB), poliomielitis (inactivado) (VPI) y Haemophilus influenzae de tipo b (Hib), por ejemplo, Infanrix-hexa.
8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho procedimiento para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por H. influenzae en un mamífero es un procedimiento de protección frente a la otitis media.
9. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en la que dicho procedimiento para generar una respuesta inmunitaria protectora contra la infección por H. influenzae en un mamífero es un procedimiento para el tratamiento o la prevención de las enfermedades de EPOC.
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