JP2017532949A - ドコサペンタエン酸を含む脂質 - Google Patents
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Abstract
Description
微細藻類、セン類及び真菌類などの生物のLC−PUFAの生合成は、通常、一連の酸素依存性不飽和化及び伸長反応として起こる(図1)。これらの生物内でEPAを産生する最も共通の経路としては、Δ6−不飽和化反応、Δ6−伸長反応及びΔ5−不飽和化反応(Δ6−不飽和化反応経路と呼ばれる)が挙げられ、一方で、余り共通でない経路は、Δ9−伸長反応、Δ8−不飽和化反応及びΔ5−不飽和化反応(Δ9−不飽和化反応経路と呼ばれる)を使用する。これらの連続した不飽和化及び伸長反応は、図1の上左部に模式的に示したω6脂肪酸基質LA(ω6)または図1の下右部に示したEPAに完結するω3基質ALA(ω3)のいずれかで開始し得る。もし、最初のΔ6−不飽和化反応が、ω6基質LA上で起こるならば、一連の3種の酵素のLC−PUFA産生物は、ω6脂肪酸ARAであろう。LC−PUFA合成生物は、アラキドン酸(ARA、20:4ω6)のEPAへの転換について図1中のΔ17−デサチュラーゼ工程として示したω3−デサチュラーゼを用いて、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換し得る。ω3−デサチュラーゼファミリーのいくつかのメンバーは、LAからARAまでの範囲の様々な基質上で作用できる。植物ω3−デサチュラーゼは、しばしば、LAからALAまでのΔ15−不飽和化反応を特異的に触媒するが、一方、真菌類及び酵母のω3−デサチュラーゼは、ARAからEPAまでのΔ17−不飽和化反応に対して特異的であり得る(Pereiraら,2004a;Zankら,2005)。広範囲のω6基質をそれらの対応するω3産生物に転換できる非特異的ω3−デサチュラーゼが存在し得ることを、いくつかの報告が示唆している(Zhangら,2008)。
ほとんどのLC−PUFA代謝工学は、好気性Δ6−不飽和化/伸長経路を用いて行われている。タバコ中にγ−リノレン酸(GLA、18:3ω6)の生合成は、シアノバクテリア・シネコシスティス(cyanobacterium Synechocystis)のΔ6−デサチュラーゼを用いて、1996年に初めて報告された(ReddyとThomas、1996)。より近年では、GLAは、ベニバナ(種子オイル中GLA73%、WO2006/127789)及びダイズ(GLA28%;Satoら、2004)などの作物で産生された。EPA及びDHAなどのLC−PUFAの産生は、関連する不飽和化及び伸長工程数が多いせいで、より複雑な工学操作を伴う。EPA陸上植物のEPA産生は、Qiらにより初めて報告され(2004)、イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)のΔ9−エロンガーゼ、ユーグレナ・グラシリス(Euglena gracilis)のΔ8−デサチュラーゼ及びモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)のΔ5−デサチュラーゼをコードする遺伝子を、EPA3%までの収率で、アラビドプシス属(Arabidopsis)に導入した。この研究後、Abbadiら(2004)が続き、ニセツリガネゴケ(Physcomitrella patens)のΔ6−デサチュラーゼ及びΔ6−エロンガーゼ及びフェオダクチラム・トリコルヌタム(Phaeodactylum tricornutum)のΔ5−デサチュラーゼをコードする遺伝子を用いて、亜麻仁でEPA0.8%までの産生を報告した。
ほとんどの生物体が、1〜2%を超えてDPAを有するオイルを産生することができず、そのため、天然源からラージスケールでDPAを産生するという選択肢は、たとえあったとしても限定的である。本発明者らは、天然源よりも非常に高レベルのDPAを有する脂質を産生するための方法及び植物を特定した。
i)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約2%から18%の間、約2%から16%の間、約2%から15%の間、または約3%から10%の間であること、
ii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)のレベルは、6%未満、3%未満、2%未満、1%未満、または約0.1%であること、
iii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、約1%から約20%の間、約30%から約60%の間、約45%〜約60%、約30%、または約15%から約30%の間であること、
iv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸(LA)のレベルは、約4%から約35%の間、約4%から約20%の間、約4%から約17%の間、または約5%から約10%の間であること、
v)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸(ALA)のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間、約4%から約16%の間、または約2%から約16%の間であること、
vi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸(GLA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から約7%の間、0.05%から4%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
vii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸(SDA)のレベルは、約10%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、約0.05%から約10%の間、または約0.05%から約2%の間であること、
viii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から約6%の間、0.05%から約5%の間、0.05%から約4%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
ix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間であること、
x)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸(EPA)のレベルは、4%から15%の間、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
xi)該脂質は、その脂肪酸含有物中にω6−ドコサペンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含むこと、
xii)該脂質は、その脂肪酸含有物中に0.1%未満のω6−ドコサペンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含むこと、
xiii)該脂質は、その脂肪酸含有物中に0.1%未満の1つ以上または全てのSDA、EPA及びETAを含むこと、
xiv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約4%から約25%の間、約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、または約6%から約12%の間であること、
xv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約4%から約40%の間、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、8%から約22%の間、約15%から約40%の間または約15%から約35%の間であること、
xvi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約20%から約75%の間、30%から75%の間、約50%から約75%の間、約60%、約65%、約70%、約75%、または約60%から約75%の間であること、
xvii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸レベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から約20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間であること、
xviii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸レベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、0.5%から約8%の間、または0.5%から4%の間であること、
xix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸レベルは、36%から約65%の間、36%から約70%の間、40%から約60%の間、約30%から約60%の間、約35%から約60%の間、40%から約65%の間、約30%から約65%の間、約35%から約65%の間、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%または約70%であること、
xx)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸レベルは、21%から約45%の間、21%から約35%の間、約23%から約35%の間、約25%から約35%の間、約27%から約35%の間、約23%から約25%の間、約27%、約30%、約35%、約40%または約45%であること、
xxi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0未満、約0.1未満、約0.10〜約0.4、または約0.2であること、
xxii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.02から約0.1の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.02、約0.05、約0.1、約0.2または約1.0であること、
xxiii)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間のΔ12−デサチュラーゼによるオレイン酸からLAへの転換効率に基づくこと、
xxiv)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間のΔ6−デサチュラーゼによるALAからSDAへの転換効率に基づくこと、
xxv)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間のΔ6−エロンガーゼによるSDAからETA酸への転換効率に基づくこと、
xxvi)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間のΔ5−デサチュラーゼによるETAからEPAへの転換効率に基づくこと、
xxvii)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約99%の間、約85%から約99%の間、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間のΔ5−エロンガーゼによるEPAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxviii)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、約20%、約25%、約30%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、約10%から約25%の間または約20%から約30%の間のオレイン酸からDPAへの転換効率に基づくこと、
xxix)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間のLAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxx)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約30%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約22%から約70%の間、約17%から約55%の間、約22%から約40%の間、または約24%から約40%の間のALAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxxi)該抽出脂質中の総脂肪酸は、1.5%未満のC20:1、1%未満のC20:1または約1%のC20:1を有すること、
xxxii)該脂質のトリアシルグリセロール(TAG)含有率は、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間であること、
xxxiii)該脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含み、DAGは好ましくはDPAを含むこと、
xxxiv)該脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満または約0.001%から約5%の間の遊離(非エステル化)脂肪酸及び/またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
xxxv)TAGの形態でエステル化されたDPAの少なくとも70%、少なくとも72%または少なくとも80%は、該TAGのsn−1位またはsn−3位であり、
xxxvi)該脂質中に最も豊富なDPAを含むTAG化学種は、DPA/18:3/18:3(TAG58:12)であり、該脂質はトリDPA TAG(TAG66:18)を含むこと、及び
xxxvii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが、約7%、約8%、約9%、約10%、約12%、約15%、約18%、約20%、約22%、約24%、約26%、約28%、約31%、約7%から約31%の間、約7%から約28%の間、約10%から約35%の間、約10%から約30%の間、約10%から約25%の間、約10%から約22%の間、約14%から約35%の間、約16%から約35%の間、約16%から約30%の間、約16%から約25%の間、または約16%から約22%の間であり、場合により、DHAレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の0.5%未満であること
の1つ以上を有する。
i) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、2%から15%の間であること、
ii) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)のレベルは、約0.1%であること、
iii) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、1%から30%の間であること、
iv) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸(LA)のレベルは、4%から20%の間であること、
v) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸(ALA)のレベルは、4%から40%の間であること、
vi) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸(GLA)のレベルは、0.05%から7%の間であること、
vii) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸(SDA)のレベルは、0.05%から10%の間であること、
viii) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、6%未満であること、
ix) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満であること、
x) 該抽出植物脂質は、その脂肪酸含有物中に0.1%未満のω6−ドコサペンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含むこと、
xi) 該抽出植物脂質の総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸のレベルは、10%未満であること、
xii) 該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、1.0から3.0の間、または0.1から1の間であること、
xiii) 該抽出植物脂質の脂肪酸含有物中の新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、1.0から3.0の間、または0.02から0.1の間、または0.1から1の間であること、
xiv) 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも10%のオレイン酸からDPAへの転換効率に基づくこと、
xv) 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも15%のLAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xvi) 該抽出植物脂質の脂肪酸組成は、少なくとも17%のALAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xvii) 該抽出植物脂質中の総脂肪酸は、1.5%未満のC20:1であること、及び
xviii) 該抽出植物脂質中のトリアシルグリセロール(TAG)含有率は、少なくとも70%であり、1つ以上の以下の特徴により特徴付けられ得ること、
xix) 該抽出植物脂質は、DPAを含むジアシルグリセロール(DAG)を含むこと、
xx) 該抽出植物脂質は、10%未満の遊離(非エステル化)脂肪酸及び/またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
xxi) TAGの形態でエステル化されたDPAの少なくとも70%は、該TAGのsn−1位またはsn−3位であること、
xxii)該抽出植物脂質中の最も豊富なDPA含有TAG化学種は、DPA/18:3/18:3(TAG58:12)であること、及び
xxiii)該抽出植物脂質は、トリDPA TAG(TAG66:18)を含むこと
の1つ以上を有する。
i)脂質を含む植物部分、好ましくは脂質を含むアブラナ属の種子もしくはカメリナサティバの種子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、及びドコサペンタエン酸(DPA)を含み、場合により、1つ以上のステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びエイコサテトラエン酸(ETA)を含んでもよく、該植物部分または微生物部分の該脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが約7%から35%の間である工程、及び
ii)該植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程であって、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが約7%から35%の間である工程、
を含む、抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法を提供する。ある実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが、約7%から20%の間または20.1%から35%の間である。ある実施形態では、DPAのレベルは、7%から20%の間、または20.1%から30%の間、好ましくは、20.1%から35%の間、より好ましくは、30%から35%の間である。ある実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが、8%から20%の間、または10%から20%の間、より好ましくは11%から20%の間、または12%から20%の間である。
i)脂質を含む植物部分、好ましくはアブラナ属の種子もしくはカメリナサティバの種子、または微生物細胞を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂質は、がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸及びドコサペンタエン酸(DPA)、並びにステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びエイコサテトラエン酸(ETA)のうち1つ以上を含む脂肪酸組成を有し、(i)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAレベルが7%から30%の間または7%から35%の間、好ましくは30%から35%の間であり、(ii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベルが2%から16%の間であり、(iii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)レベルが6%未満、好ましくは1%未満であり、(iv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベルが1%から30%の間であり、(v)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸(LA)レベルが4%から35%の間であり、(vi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸(ALA)が4%から40%の間であり、(vii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸(ETrA)レベルが4%未満であり、(viii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルが4%から25%の間であり、(ix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比が0.05から1の間であり、(x)該脂質のトリアシルグリセロール(TAG)含有率が少なくとも70%であり、及(xi)びTAGの形態でエステル化された少なくとも70%のDPAが該TAGのsn−1位またはsn−3位である、並びに
ii)該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが約7%から30%の間または7%から35%の間、好ましくは、30%から35%の間である、抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法を提供する。好ましくは、TAGの形態でエステル化されたDPAの少なくとも81%または少なくとも90%は、該TAGのsn−1位またはsn−3位である。
i)脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む細胞を含む植物部分または微生物細胞、より好ましくはアブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって、該脂質は、エステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸(DPA)を含み、トリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された少なくとも35%のDPAは、該TAGのsn−2位でエステル化されており、及び
ii)該細胞から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された少なくとも35%のDPAは、該TAGのsn−2位でエステル化されている、抽出脂質の産生方法を提供する。実施形態では、該方法により産生された抽出脂質は、(i)オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸の1つ以上または全てを含み、場合により、ステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びエイコサテトラエン酸(ETA)の1つ以上を含んでもよいこと、(ii)少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約48%、35%から約60%の間、または35%から約50%の間のトリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化されたDPAが該TAGのsn−2位でエステル化されていること、及び(iii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが約1%から35%の間、または約7%から35%の間または約20.1%から35%の間であることの1つ以上または全てにより、さらに特徴付けられる。本態様の実施形態では、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルは、約7%、約8%、約9%、約10%、約12%、約15%、約18%、約20%、約22%、約24%、約26%、約28%、約30%、約7%から約28%の間、約7%から約25%の間、約10%から約35%の間、約10%から約30%の間、約10%から約25%の間、約10%から約22%の間、約14%から約35%の間、約16%から約35%の間、約16%から約30%の間、約16%から約25%の間、または約16%から約22%の間である。好ましい実施形態では、該抽出脂質は、(i)及び(ii)、(i)及び(iii)または(ii)及び(iii)、より好ましくは、(i)、(ii)及び(iii)の全てにより特徴付けられる。好ましくは、該抽出脂質は、約2%から16%の間である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベル、及び、もし存在する場合、1%未満である該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)レベルにより、さらに特徴付けられる。
i)脂質を含む細胞、好ましくは、脂質を含む、細胞を含む植物部分または微生物細胞、より好ましくは、アブラナ属の種子またはカメリナサティバの種子を得る工程であって、該脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸(DPA)を含み、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、並びにステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びエイコサテトラエン酸(ETA)のうち1つ以上をさらに含み、(i)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸レベルが2%から16%の間であり、(ii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)レベルが1%未満であり、(iii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸レベルが1%から30%の間であり、(iv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸(LA)レベルが4%から35%の間であり、(v)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸(ALA)が4%から40%の間であり、(vi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸(ETrA)レベルが4%未満であり、(vii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルが4%から25%の間であり、(viii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比が0.05から1の間であり、(ix)該脂質のトリアシルグリセロール(TAG)含有率が少なくとも70%であり、及び(x)トリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された少なくとも35%のDPAが該TAGのsn−2位でエステル化されている、並びに
ii)該植物部分から脂質を抽出する工程
を含み、該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるトリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された少なくとも35%のDPAは、該TAGのsn−2位でエステル化されている、抽出脂質の産生方法を提供する。
i)ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。
i)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該植物部分または細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。
i)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、該細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。好ましくは、LPAATは、DPA−CoAなどのC22多価不飽和脂肪アシル−CoA基質を使用できる。
i)Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約95%の間、約70%から約90%の間、または約75%から約85%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ii)ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約91%の間、または約80%から約91%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換すること、
iii)Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ALAをSDAに転換すること、
iv)Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換すること、
v)Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約80%の間、または約75%から約80%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、SDAをETAに転換すること、
vi)Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約95%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約95%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ETAをEPAに転換すること、
vii)Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約90%の間、または約85%から約95%の間の効率で、1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、EPAをDPAに転換すること、
ix)1つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞内において、オレイン酸をDPAに転換する効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、約20%、約25%、約30%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間、または約20%から約30%の間であること、
x)1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、LAをDPAに転換する効率が、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、約25%、約30%、約35%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間であること、
xi)1つ以上の該植物部分の細胞内または組換え細胞内において、ALAをDPAに転換する効率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約30%、約30%、約35%、約40%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間であること、
xi)1つ以上の該植物部分の細胞または組換え細胞は、該外来性ポリヌクレオチドを含まない対応細胞より、少なくとも約25%、少なくとも約30%、約25%から約40%の間、または約27.5%から約37.5%の間で多いω3脂肪酸を含むこと、
xii)Δ6−デサチュラーゼは、リノール酸(LA)と比較してα−リノレン酸(ALA)を優先的に不飽和化すること、
xiii)Δ6−エロンガーゼは、Δ9−エロンガーゼ活性も有すること、
xiv)Δ12−デサチュラーゼは、Δ15−デサチュラーゼ活性も有すること、
xv)Δ6−デサチュラーゼは、Δ8−デサチュラーゼ活性も有すること、
xvi)Δ8−デサチュラーゼは、Δ6−デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ6−デサチュラーゼ活性を有しないこと、
xvii)Δ15−デサチュラーゼは、GLAに対するω3−デサチュラーゼ活性も有すること、
xviii)ω3−デサチュラーゼは、LAに対するΔ15−デサチュラーゼ活性も有すること、
xix)ω3−デサチュラーゼは、LA及び/またはGLAの両方を不飽和化すること、
xx)ω3−デサチュラーゼは、LAと比較してGLAを優先的に不飽和化すること、
xxi)1つ以上または全てのデサチュラーゼ、好ましくはΔ6−デサチュラーゼ及び/またはΔ5−デサチュラーゼは、対応するアシル‐PC基質より、アシル−CoA基質に対して高い活性を有すること、
xxii)Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、LAより、ALAに対して高いΔ6−デサチュラーゼ活性を有すること、
xxiii)Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn−2位と結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して高いΔ6−デサチュラーゼ活性を有すること、
xxiv)Δ6−デサチュラーゼは、LAと比較して、基質としてのALAに対して、少なくとも約2倍高いΔ6−デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくとも4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有すること、
xxv)Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのsn−2位と結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して高い活性を有すること、
xxvi)Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのsn−2位に結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して、少なくとも約5倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有すること、
xxvii)デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
xxviii)Δ6‐デサチュラーゼは、ETAに対する検出可能なΔ5‐デサチュラーゼ活性を有しないこと
の1つ以上または全てを有する。
i)Δ12−デサチュラーゼは、配列番号4で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号4と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと、
ii)ω3−デサチュラーゼは、配列番号6で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号6と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと、
iii)Δ6−デサチュラーゼは、配列番号9で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号9と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと、
iv)Δ6−エロンガーゼは、配列番号16で提供される配列を有するアミノ酸、配列番号17などのその生物活性なフラグメント、または配列番号16及び/または配列番号17と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと、
v)Δ5−デサチュラーゼは、配列番号20で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号20と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと、及び、
vi)Δ5−エロンガーゼは、配列番号25で提供される配列を有するアミノ酸、その生物活性なフラグメント、または配列番号25と少なくとも50%同一なアミノ酸配列を含むこと。
a)エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
b)酵素の以下のセット;
i)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
iii)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、または
iv)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上の種子特異的プロモーターと作動可能に結合されており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、及び場合により、γ−リノレン酸(GLA)、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、及びドコサペンタエン酸(DPA)を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸(EPA)及び/またはエイコサテトラエン酸(ETA)を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが7%から35%の間である、
油料種子植物、もしくは種子などのその部分、好ましくはその種子中に脂質を含むアブラナ属植物またはカメリナサティバ植物、または微生物細胞を提供する。本態様の好ましい実施形態では、DHAは、種子及び抽出脂質の脂質の総脂肪酸含有物の2%未満、または0.5%未満のレベルで存在し、より好ましくは、脂質の総脂肪酸含有物中に検出されない。
a)エステル化された形態の脂肪酸であって、該脂肪酸は、ドコサペンタエン酸(DPA)を含み、トリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された少なくとも35%のDPAは、該TAGのsn−2位でエステル化されている該脂肪酸、及び
b)酵素の以下のセットのうち1つをコードする外来性ポリヌクレオチド;
i)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
を含む細胞、好ましくは、油料種子植物などの植物中もしくはそれからの細胞または種子などのその部分、または好ましくはアブラナ属植物もしくはカメリナサティバ植物といった油料植物もしくはその部分、または微生物細胞を提供し、各ポリヌクレオチドが、該細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合している。好ましくは、LPAATは、DPA−CoAなどのC22多価不飽和脂肪アシル−CoA基質を使用でき、抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルは、約1%から35%の間、または、約7%から35%の間、または約20.1%から35%の間である。実施形態では、トリアシルグリセロール(TAG)の形態でエステル化された、少なくとも約40%、少なくとも約45%、少なくとも約48%、35%から約60%の間、または35%から約50%の間のDPAは、TAGのsn−2位でエステル化されている。
i)本発明の植物由来であること、
ii)本明細書で定義した脂質を含むこと、または
iii)本発明の方法で使用できること、のうちの1つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞などの組換え細胞も提供される。
a)複数の植物または微生物細胞などの組換え細胞からの種子などの1つ以上の植物部分または微生物細胞などの組換え細胞により産生された脂質中のDPAのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞などの組換え細胞が、酵素の以下のセット;
i)ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ix)ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
x)Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、または、
xi)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
の1つをコードする1つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または組換え細胞の細胞内の該ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、該アッセイすること、と
b)1つ以上のその部分の本発明の抽出植物脂質または組換え細胞脂質の産生に使用できる複数の植物または組換え細胞から植物または組換え細胞を同定すること、と
c)場合によっては、前記同定植物または組換え細胞、またはそれ由来の種子から後代植物または組換え細胞を産生すること
とを含む。
a)好ましくは、少なくとも1000または2000または3000のかかる植物の集合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも1ヘクタールまたは2ヘクタールまたは3ヘクタールの領域、あるいは標準条件下温室内で、本発明の植物、または本発明の植物部分を産生、もしくは本発明の種子を産生する植物を生育すること、
b)前記1つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
c)場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgまたは70kgまたは80kgのDPA/ヘクタールの総DPA収率でオイルを産生すること
を含む。
i) そのオイルは、本明細書で定義したものであること、または
ii) 該植物部分または種子または組換え細胞が本発明の方法で使用可能であること
の1つ以上を有する。
a)本発明の種子を含む植物の地上部を包む、引き抜く及び/または刈り取ること
b)植物の部分を脱穀及び/または選穀して、植物部分の残部から種子を分離すること、及び
c)工程b)で分離した種子を篩い分け及び/または選別し、篩い分け及び/または選別した種子を貯蔵箱に充填し、それにより、種子の箱を製造すること、を含む種子の箱の製造方法を提供する。
配列番号1−pJP3416−GA7ヌクレオチド配列。
配列番号2−pGA7−mod_Bヌクレオチド配列。
配列番号3−植物のラカンセア・クルイベリ(Lachancea Kluyveri)Δ12デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号4−ラカンセア・クルイベリ(Lachancea Kluyveri)Δ12デサチュラーゼ。
配列番号5−植物のピキア・パストリス(Pichia pastoris)ω3デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号6−ピキア・パストリス(Pichia pastoris)ω3デサチュラーゼ。
配列番号7−ミクロモナス・プシーラ(Micromonas pusilla)Δ6−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号8−植物のミクロモナス・プシーラ(Micromonas pusilla)Δ6−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号9−ミクロモナス・プシーラ(Micromonas pusilla)Δ6−デサチュラーゼ。
配列番号10−オストレオコッカス・ルシマリヌス(Ostreococcus lucimarinus)Δ6−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号11−植物のオストレオコッカス・ルシマリヌス(Ostreococcus lucimarinus)Δ6−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号12−オストレオコッカス・ルシマリヌス(Ostreococcus lucimarinus)Δ6−デサチュラーゼ。
配列番号13−オストレオコッカス・タウリ(Ostreococcus tauri)Δ6−デサチュラーゼ。
配列番号14−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ6−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号15−植物のピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ6−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム(3’末端で短縮化され、機能的エロンガーゼをコードする)。
配列番号16−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ6−デサチュラーゼ。
配列番号17−短縮化ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ6−デサチュラーゼ。
配列番号18−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ5−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号19−植物のパブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ5−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号20−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ5−デサチュラーゼ。
配列番号21−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ5−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号22−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ5−デサチュラーゼ。
配列番号23−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ5−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号24−植物のピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ5−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号25−ピラミモナス・コルダタ(Pyramimonas cordata)Δ5−エロンガーゼ。
配列番号26−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ4−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号27−植物のパブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ4−デサチュラーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号28−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ4−デサチュラーゼ。
配列番号29−イソクリシス・ガルバナ(Isochrysis galbana)Δ9−エロンガーゼ。
配列番号30−植物のエミリアニア・ハクスレイ(Emiliania huxleyi)Δ9−エロンガーゼの発現のコドン最適化オープンリーディングフレーム。
配列番号31−エミリアニア・ハクスレイ(Emiliania huxleyi)CCMP1516Δ9−エロンガーゼ。
配列番号32−パブロバ・サリナ(Pavlova pinguis)Δ9−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号33−パブロバ・サリナ(Pavlova pinguis)Δ9−エロンガーゼ。
配列番号34−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ9−エロンガーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号35−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ9−エロンガーゼ。
配列番号36−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ8−デサチュラーゼをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号37−パブロバ・サリナ(Pavlova salina)Δ8−デサチュラーゼ。
配列番号38−V2ウイルスサプレッサー。
配列番号39−V2ウイルスサプレッサーをコードするオープンリーディングフレーム。
配列番号40−シロイヌナズナ(Arabidopsis thaliana)LPAAT2。
配列番号41−リムナンテス・アルバ(Limnanthes alba)LPAAT。
配列番号42−サッカロミセス・セレビシア(Saccharomyces cerevisiae)LPAAT。
配列番号43−ミクロモナス・プシーラ(Micromonas pusilla)LPAAT。
配列番号44−モルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)LPAAT。
配列番号45−セイヨウアブラナ(Braccisa napus)LPAAT。
配列番号46−セイヨウアブラナ(Brassica napus)LPAAT。
配列番号47−フィトフトラ・インフェスタンス(Phytophthora infestans)ω3−デサチュラーゼ。
配列番号48−タラシオシラ・シュードナナ(Thalassiosira pseudonana) ω3−デサチュラーゼ。
配列番号49−ピシリウム・イレグラーレ(Pythium irregulare)ω3−デサチュラーゼ。
配列番号50〜58−オリゴヌクレオチドプライマー/プローブ。
特に、別段の規定がない限り、本明細書で使用する全ての技術及び科学用語は、当業者(例えば、細胞培養、分子遺伝学、脂肪酸合成、トランスジェニック植物、組換え細胞、タンパク質化学、及び生化学)により共通に理解されるのと同じ意味を有すると解すべきである。
本明細書で使用するとき、「抽出植物脂質」及び「単離植物脂質」という語は、例えば、植物または種子などのその部分から、例えば、圧搾により抽出された脂質組成物を表す。該抽出脂質は、例えば、植物種子の圧搾により得られた比較的粗製の組成物、または植物材料由来の水、核酸、タンパク質及び炭水化物の1つ以上または各々の、もし全部でなければ、ほとんどを取り除いたより純粋な組成物であり得る。精製方法の例を以下に記載する。実施形態では、抽出または単離植物脂質は、組成物の少なくとも約60重量%、少なくとも約70重量%、少なくとも約80重量%、少なくとも約90重量%、または少なくとも約95重量%(w/w)の脂質を含む。脂質は、室温において、固体であっても液体であってもよく、液体の時、オイルであると見なされる。実施形態では、本発明の抽出脂質を、別原料(例えば、魚油のDPA)により産生されたDPAなどの別の脂質と配合していない。実施形態では、抽出後、DPAに対するオレイン酸、DPAに対するパルミチン酸、DPAに対するリノレン酸、及び総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の1つ以上または全ての比を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、有意に変化しなかった(例えば、10%または5%以下の変化)。別の実施形態では、抽出植物脂質を、無処置の種子または細胞中の比と比較したとき、DPAに対するオレイン酸、DPAに対するパルミチン酸、DPAに対するリノレン酸、及び総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の1つ以上または全ての比を変化させ得る水素化または分取などの方法にさらさなかった。本発明の抽出植物脂質がオイル中に含まれるとき、該オイルは、ステロール類などの非脂肪酸分子をさらに含んでもよい。
本明細書で使用するとき、「デサチュラーゼ」という語は、例えば、アシル−CoAエステルなどの通常エステル化された形態の脂肪酸基質のアシル基に炭素−炭素二重結合を導入可能な酵素を表す。アシル基を、ホスファチジルコリン(PC)などのリン脂質に、またはアシルキャリアータンパク質(ACP)に、または好ましい実施形態では、CoAにエステル化してもよい。デサチュラーゼは、それによって、3つの群に通常分類され得る。1つの実施形態では、デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼである。
脂肪酸伸長が4工程:縮合反応、還元反応、脱水反応及び第二還元反応から成ることは生化学的証拠が示唆している。本発明に関連して、「エロンガーゼ」は、適切な生理条件下、伸長複合体の他のメンバーの存在で、縮合工程を触媒するポリペプチドを表す。伸長タンパク質複合体の縮合成分(「エロンガーゼ」)のみの細胞内非相同発現または相同的発現は、それぞれのアシル鎖の伸長に必要であることが分かっている。このように、導入されたエロンガーゼは、トランスジェニック宿主から還元及び脱水活性を首尾良く補充でき、アシル伸長を上手く実行する。脂肪酸基質の鎖長及び不飽和度に対する伸長反応の特異性は、縮合成分に属すると考えられる。この成分は、伸長反応に律速であるとも考えられる。
微生物細胞などの組換え細胞、またはトランスジェニック植物もしくはその部分に導入された導入遺伝子は、LPAATもコードし得る。本明細書で使用するとき、リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼまたはアシル−CoA−リゾホスファチジン酸アシルトランスフェラーゼとも呼ばれる「1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ」(LPAAT)という語は、sn−1−アシル−グリセロール−3−リン酸(sn−1G−3−P)を、sn−2位でアシル化してホスファチジン酸(PA)を生成するタンパク質を表す。従って、「1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ活性」という語は、sn−2位において、sn−1 G−3−Pをアシル化してPA(EC2.3.1.51)を産生することを表す。好ましいLPAATは、基質として多価不飽和C22アシル−CoAを使用して多価不飽和C22アシル基をLPAのsn−2位に転移してPAを生成することができるものである。実施形態では、多価不飽和C22アシル−CoAは、DPA−CoAである。そのようなLPAATを実施例6に例示しており、そこに記載のように試験できる。実施形態では、本発明の有用なLPAATは、配列番号40〜46のいずれか1つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか1つ以上の配列番号40〜46と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。別の実施形態では、LPAATは、配列番号44のいずれか1つの配列を有するアミノ酸を有しない。好ましい実施形態では、C22多価不飽和脂肪アシル−CoA基質、好ましくは、DPA−CoAを使用できる、本発明に有用なLPAATは、配列番号41、42及び44のいずれか1つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか1つ以上の配列番号41、42及び44と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。好ましい実施形態では、C22多価不飽和脂肪アシル−CoA基質、好ましくは、DPA−CoAを使用できる、本発明に有用なLPAATは、配列番号41または42のいずれか1つの配列を有するアミノ酸、その生物活性フラグメント、またはいずれか1つ以上の配列番号41または42と少なくとも40%同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、LPAATは、好ましくは、そのアミノ酸配列が配列番号44で記載されるモルティエレラ・アルピナ(Mortierella alpina)LPAAT、または基質としてDPA−CoAを使用して、DPAをLPAに転移し、sn−2位においてDPAを有するPAを生成できる別のLPAATである。
「ポリペプチド」及び「タンパク質」という語は、概して、互換的に使用される。
本発明は、例えば、遺伝子、単離ポリヌクレオチド、T−DNA分子などのキメラ遺伝子構築物、またはキメラDNAであり得るポリヌクレオチドの使用も提供する。ポリヌクレオチドは、ゲノム起源もしくは合成起源、二本鎖もしくは一本鎖のDNAまたはRNAであってよく、本明細書で定義された特定の活性を行うために炭水化物、脂質、タンパク質または他の物質と結合していてもよい。「ポリヌクレオチド」という語は、本明細書中、「核酸分子」という語と互換的に使用される。
組換え発現を、本発明の組換え細胞、または植物もしくは植物部分の産生するため使用できる。組換えベクターは、非相同ポリヌクレオチド配列、すなわち、好ましくは、該ポリヌクレオチド分子が誘導された種以外の種由来の、本明細書で定義されたポリヌクレオチド分子と隣接して、天然に見られないポリヌクレオチド配列を含む。ベクターは、RNAあるいはDNAのいずれかであり得、通常、プラスミドである。プラスミドベクターは、通常、原核細胞内の発現カセット、例えば、pUC誘導ベクター、pSK誘導ベクター、pGEM誘導ベクター、pSP誘導ベクター、pBS誘導ベクター、または好ましくは、1つ以上のT−DNA領域を含むバイナリーベクターの容易な選択、増幅、及び形質転換を提供する付加的核酸配列を含む。付加的核酸配列は、ベクターの自律的複製を提供する複製開始点、好ましくは、抗菌剤または除草剤耐性をコードする選択可能なマーカー遺伝子、核酸配列または核酸構築物内でコードされた遺伝子を挿入する多重部位を提供する固有の多重クローニング部位、及び原核細胞及び真核細胞(特に植物)の形質転換を促進する配列を含む。組換えベクターは、好ましくは、本明細書で定義されたキメラ遺伝子構築物と組み合わせて、本明細書で定義された1つより多いポリヌクレオチド、例えば、3つ、4つ、5つまたは6つの本明細書で定義されたポリヌクレオチドを含んでもよく、各ポリヌクレオチドは、対象となる細胞内で作働可能な発現制御配列と作動可能に結合している。好ましくは、該発現制御配列は、非相同プロモーターを含む、または全てである、すなわち、それらが制御するコード領域に関して非相同である。本明細書で定義された1つより多いポリヌクレオチド、例えば、3つ、4つ、5つまたは6つのポリヌクレオチド、好ましくは、各々が異なるポリペプチドをコードする7つまたは8つのポリヌクレオチドを、好ましくは、1つのT−DNA分子内の1つの組換えベクター中で好適に共有結合し、それから、細胞内に1つの分子として導入して本発明に記載の組換え細胞を生成し、好ましくは、組換え細胞のゲノム内に、例えば、トランスジェニック植物内に組み込んでもよい。ゲノム内への組込みは、核のゲノムまたはトランスジェニック植物のプラスチドゲノム内への組込みであってよい。それにより、そのように結合したポリヌクレオチドは、組換え細胞または植物の子孫の単一遺伝子座として一緒に遺伝するだろう。組換えベクターまたは植物は、2つ以上のそのような組換えベクターを含んでもよく、各々は、例えば、各々の組換えベクターが3つ、4つ、5つまたは6つのポリヌクレオチドを含む、複数のポリヌクレオチドを含む。
本明細書で使用するとき、発現ベクターは、宿主細胞を形質転換すること及び1つ以上の特異的ポリヌクレオチド分子の発現に影響することが可能であるDNAベクターである。本発明の発現ベクターは、植物細胞内または微生物細胞などの組換え細胞内で遺伝子発現を誘導できる。本発明に有用な発現ベクターは、転写制御配列、翻訳制御配列、複製開始点、及び組換え細胞と互換性があり、本発明のポリヌクレオチド分子の発現を制御する他の調節配列などの調節配列を含む。特に、本発明に有用なポリヌクレオチドまたはベクターは、転写制御配列を含む。転写制御配列は、転写の開始、伸長、及び停止を制御する配列である。特に、重要な転写制御配列は、プロモーター及びエンハンサー配列などの転写開始を制御するものである。適切な転写制御配列は、本発明の少なくとも1つの組換え細胞内で機能できるいずれかの転写制御配列を含む。使用される調節配列の選択は、対象となる植物及び/または器官または組織などの対象生物体に依存する。かかる調節配列を、植物または植物ウイルスなどの真核生物から得てもよく、化学的に合成してもよい。様々なそのような転写制御配列は、当業者に公知である。特に、好ましい転写制御配列は、恒常的にあるいは植物もしくその部分の使用に依存して特異的な段階及び/または組織のいずれかに、植物内の転写を誘導する活性のあるプロモーターである。
本明細書で名詞として使用するとき、「植物」という語は、植物全体を表すが、形容詞として使用するとき、例えば、植物器官(例えば、葉、幹、根、花)、1つの細胞(例えば、花粉)、種子、植物細胞など、植物中に存在、植物から得られる、植物由来、または植物に関連する物質を表す。「植物部分」という語は、該植物部分が本発明に記載の脂質を合成する限り、例えば、葉もしくは幹、根、花器もしくは花の構造物、花粉、種子、胚などの種子部分、胚乳、胚盤もしくは種皮、例えば、維管束組織などの植物組織、その細胞と子孫などの植物性構造物を含む植物DNAを含む全ての植物部分を表す。
a)Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、及びΔ6−エロンガーゼ、
b)Δ5−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、及びΔ9−エロンガーゼ、
c)Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ15−デサチュラーゼ、
d)Δ5−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ15−デサチュラーゼ、
e)Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ17−デサチュラーゼ、
f)Δ5−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−エロンガーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ17−デサチュラーゼ、
g)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
h)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
i)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
j)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
k)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
l)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
m)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
n)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
o)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
p)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
q)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、または
r)1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ、及びΔ5−エロンガーゼ、
をコードする外来性ポリヌクレオチドのセットを少なくとも含む。
トランスジェニック植物を、A.Slaterら、Plant Biotechnology−The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)、及びP.Christou and H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley and Sons(2004)に全般的に記載されたものなど、当技術分野で公知の技術を用いて産生できる。
サイレンシングサプレッサー
実施形態では、植物細胞、植物または植物部分は、サイレンシングサプレッサータンパク質をコードする外来性ポリヌクレオチドを含む。
本質的に、植物種子内で発現されるのが望ましいいずれかのRNAを、サイレンシングサプレッサーと同時発現できる。コードされたポリペプチドは、オイル、デンプン、炭水化物、栄養素、その他の代謝と関連し得る、またはタンパク質、ペプチド類、脂肪酸類、脂質類、ワックス類、オイル類、デンプン類、糖類、炭水化物、香料、匂い、毒素類、カロテノイド類、ホルモン類、高分子類、フラボノイド類、貯蔵タンパク質、フェノール酸類、アルカロイド類、リグニン類、タンニン類、セルロース類、糖タンパク質、糖脂質、他、好ましくは、TAGの生合成または会合体の合成に関与し得る。
組換え細胞または種子などの植物部分内で産生されたLC−PUFAまたは複数のLC−PUFAの組合せのレベルは重要である。特定のLC−PUFAまたは関連するLC−PUFA群、例えば、ω3LC−PUFAもしくはω6LC−PUFA、もしくはVLC−PUFA、もしくは当技術分野で公知の方法により決定され得るその他である総脂肪酸の組成(%)として、レベルを表してよい。例えば、組換え細胞を含む物質の乾燥重量におけるLC−PUFAのパーセント、例えば、LC−PUFAである種子の重量のパーセントなど、LC−PUFA含有率として、レベルを表してもよい。油料種子内で産生されたLC−PUFAが、オイル産生物のために生育されない野菜または穀類におけるより、LC−PUFA含有率の点でかなり高く、さらにどちらも類似のLC−PUFA組成を有し、どちらもヒトまたは動物の食用LC−PUFAの供給源として使用してもよいことは認識されるだろう。
1. OAからDPA=100x(DHA%+DPA%)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
2. LAからDPA=100x(DHA%+DPA)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
3. ALAからDPA=100x(DHA%+DPA%)/(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
4. EPAからDPA=100x(DHA%+DPA)/(EPA、DPA及びDHAの%総和)。
5. DPAからDHA(Δ4−デサチュラーゼ効率)=100X(DHA%)/(DPA及びDHAの%総和)。
6. Δ12−デサチュラーゼ効率=100x(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
7.ω3−デサチュラーゼ効率=100x(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)/(LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
8. OAからALA=100x(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)/(OA、LA、GLA、DGLA、ARA、EDA、ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
9. Δ6−デサチュラーゼ効率(ω3基質ALA)=100x(SDA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)/(ALA、SDA、ETrA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%)
10. Δ6−エロンガーゼ効率(ω3基質SDA)=100x(ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)/(SDA、ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
11. Δ5−デサチュラーゼ効率(ω3基質ETA)=100x(EPA、DPA及びDHAの%総和)/(ETA、EPA、DPA及びDHAの%総和)。
12. Δ5−エロンガーゼ効率(ω3基質EPA)=100x(DPA及びDHAの%総和)/(EPA、DPA及びDHAの%総和)。
当技術分野においてルーチンに実施される技術を、本発明の細胞、植物、種子、その他により産生されたオイルを抽出、処理、及び分析するために使用できる。通常、植物種子を調理し、圧力をかけ、抽出して粗オイルを製造し、それから該オイルを脱ガムし、精製し、脱色し、脱臭する。概して、種子を粉砕する技術は、当技術分野において公知である。例えば、油料種子を、水との噴霧により適度な柔らかさにして、例えば、含水率を8.5%まで上げることができ、0.23〜0.27mmのギャップ設定した平滑ローラーを用いてフレーク状にする。種子のタイプに応じて、粉砕前に水を添加しなくてもよい。加熱は酵素を不活性化させ、さらなる細胞破壊を促進し、油滴を凝集させ、タンパク質粒子を凝集させる。これらの全ては、抽出処理を促進する。
脱ガムはオイル精製の初期工程であり、その主な目的は、総抽出脂質の約1〜2%存在し得る、該オイルからリン脂質のほとんどを除去することである。70〜80℃において、リン酸を通常含む、約2%の水を粗オイルに添加すると、微量金属及び顔料と会合したリン脂質のほとんどが分離する。除去された不溶性物質は、主に、リン脂質及びトリアシルグリセロールの混合物であり、レクチンとしても公知である。濃縮リン酸を粗種子オイルに添加することにより、脱ガムを実行し、水和可能でないホスファチド類を水和可能な形態に転換して、存在する少量の金属をキレート化できる。ガムを遠心分離により種子オイルから分離する。
アルカリ精製は、時折、中和とも呼ばれる、粗オイルの処理の精製方法の1つである。通常、脱ガム後、脱色前に行う。脱ガム後、十分量のアルカリ溶液の添加により、種子オイルを処理して、脂肪酸及びリン酸の全てを滴定し、こうして生成した石鹸を除去し得る。適切なアルカリ物質としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、水酸化リチウム、水酸化カルシウム、炭酸カルシウム及び水酸化アンモニウムが挙げられる。この方法は、通常、室温において実行され、遊離脂肪酸部分を除去する。石鹸を遠心分離または石鹸を溶媒に抽出することにより除去し、中和オイルを水で洗浄する。必要であれば、オイル中の過剰アルカリを、塩酸または硫酸などの適切な酸で中和してもよい。
脱色は、漂白土(0.2〜2.0%)の存在下、酸素の非存在下、窒素または蒸気でまたは真空中での操作により、90〜120℃において、10〜30分間、オイルを加熱する精製方法である。オイル処理のこの工程は、望まれない顔料(カロテノイド、クロロフィル、ゴシポール、他)を除去するように設計されており、この方法は、酸化生成物、微量金属、イオウ化合物及び微量の石鹸も除去する。
脱臭は、高温(200〜260℃)及び低圧(0.1〜1mmHg)におけるオイル及び脂肪の処理である。通常、約0.1ml/分/100mlの種子オイルの速度で種子オイル中に蒸気を導入することにより、これを実施する。約30分のスパージ後、種子オイルを真空下冷却させる。種子オイルを、通常、ガラス容器に移動して、冷蔵貯蔵する前にアルゴンを流す。この処理により、種子オイルの色を改善し、揮発性物質または残っている遊離脂肪酸、モノアシルグリセロール及び酸化生成物を含む臭気化合物の大部分を除去する。
脱ろうは、オイル及び脂肪を、周囲以下の温度における結晶化により固体(ステアリン)及び液体(オレイン)フラクションに分離するため、オイルの商業生産で時々使用される方法である。最初に、綿実油に応用され、固形分のない製品を製造した。オイルの飽和脂肪酸含有量を減少させるために、通常使用される。
本明細書で使用するとき、「エステル交換反応」は、TAG内及びTAG間で脂肪酸を交換または脂肪酸を別のアルコールに転移してエステルを生成する方法を意味する。これは、遊離脂肪酸としてTAGから脂肪酸を遊離することを最初に含み得る、または直接、脂肪酸エステル、好ましくは、脂肪酸メチルエステルまたはエチルエステルを生成し得る。メタノールまたはエタノールなどのアルコールとTAGとのエステル交換反応では、アルコールのアルキル基は、TAGのアシル基(DPAを含む)とのエステル結合を生成する。分取方法と合わせたとき、エステル交換反応を、脂質の脂肪酸組成の修飾のため使用できる(Marangoniら、1995)。エステル交換反応は、化学的(例えば、強酸または塩基触媒)または酵素的手段のいずれかを使用でき、後者は、TAGの脂肪酸に対して位置特異的(sn−1/3またはsn−2特異的)であり得る、または他よりいくつかの脂肪酸に対して選択性を有するリパーゼを使用する(Speranzaら、2012)。オイル中のLC−PUFA濃度を上昇させる脂肪酸分取を、例えば、凍結結晶化、尿素を用いた複合体形成、分子蒸留、超臨界流体抽出法、カウンターカレントクロマトグラフィー及び銀イオン錯体化などの、当技術分野で公知の方法のいずれかにより実施できる。尿素との複合体形成は、オイル中の飽和及び一価不飽和脂肪酸レベルを低下するのにその簡便さ及び効率のため、好ましい方法である(Gamezら、2003)。初めに、オイルのTAGを、酸または塩基触媒反応条件下のいずれかで加水分解により、しばしば、脂肪酸エステルの形態で、その構成脂肪酸に分割し、それにより、生成したアルキルアステルと生成されたまたはリパーゼによるグリセロールとの分離が可能であるように過剰のアルコールを含む、少なくとも3モルのアルコール(例えば、エチルエステルにはエタノールまたはメチルエステルにはメタノール)と、TAGの1モルを反応する。それから、処理により脂肪酸組成が通常変更されない、これらの遊離脂肪酸または脂肪酸エステルを複合体生成のため、尿素のエタノール溶液と混合してもよい。飽和及び一価不飽和脂肪酸は、容易に尿素と複合体を形成し、冷却により晶出し、その後、濾過により除去してもよい。非尿素複合フラクションは、それにより、LC−PUFAが豊富となる。
本発明は、飼料として使用できる組成物を含む。本発明の目的のため、「飼料」は、体に取り込まれたとき、(a)栄養を与えるまたは組織を蓄積するまたはエネルギーを供給する役割をし;及び/または(b)充分な栄養状態または代謝機能を維持、回復または支持するヒトまたは動物の食用の食物または製剤を含む。本発明の飼料としては、例えば、乳児用調整粉乳、及び本発明のシードミールなどの乳児及び/または幼児のための栄養組成物が挙げられる。
本発明は、組成物、特に、1つ以上の脂肪酸及び/または好ましくは、脂肪酸のエチルエステルの形態の、本発明の方法を用いて産生され得られたオイルを含む医薬組成物も包含する。
一過性発現系の植物細胞内の遺伝子の発現
外来性遺伝子構築物を、Voinnetら(2003)及びWoodら(2009)により記載されたように、本質的に一過性発現系の植物細胞内で発現した。
30m SGE−BPX70カラム(70%シアノプロピルポリシルフェニレン−シロキサン、内径0.25mm、膜厚0.25mm)、FID、スプリット/スプリットレスインジェクター及びAgilent Technologies7693シリーズオートサンプラー及びインジェクターを備えたAgilent Technologies7890A GC(米国カリフォルニア州パロアルト)を用いてガスクロマトグラフィにより、FAMEを分析した。キャリアガスとしてヘリウムを使用した。150℃のオーブン温度において、スプリットモード(比50:1)で試料を注入した。注入後、オーブン温度を1分間150℃で保持し、その後、3℃/分で210℃まで上昇させ、再度、50℃/分で240℃まで上昇させ、最終的に240℃で1.4分保持した。外部標準GLC−411(Nucheck)及びC17:0−ME内部標準の既知量の応答に基づいて、Agilent Technologies ChemStationソフトウェア(Rev B.04.03(16)、米国カリフォルニア州パロアルト)を用いて、ピークを定量化した。
開花後12日目(daf)、凍結乾燥した発育種子及び内部定量標準としてトリ−C17:0−TAGの既知量を添加後の成熟種子から総脂質を抽出した。乾燥物質5mg当たりブタノール:メタノール(1:1v/v)中の10mMブチル化ヒドロキシトルエン1mL中に抽出脂質を溶解し、Agilent1200シリーズLC及び6410bエレクトロスプレーイオン化トリプル四重極LC−MSを用いて分析した。流速0.2mL/分でバイナリーグラジエントを用いて、Ascentis Express RP−アミドカラム(50mm x 2.1mm、2.7μm、Supelco)を用いて、液体をクロマトグラフィー法で分離した。移動相は:A.10mMギ酸アンモニウム水溶液:メタノール:テトラヒドロフラン(50:20:30v/v/v);B.10mMギ酸アンモニウム水溶液:メタノール:テトラヒドロフラン(5:20:75v/v/v)。多重反応モニタリング(MRM)リストは、コリジョンエネルギー30V及びフラグメンタ60Vを用いて、次の主要脂肪酸:16:0、18:0、18:1、18:2、18:3、18:4、20:1、20:2、20:3、20:4、20:5、22:4、22:5、22:6に基づいた。22:6のニュートラルロスからアンモニアと化合したプリカーサ−イオンとプロダクトイオンに基づいて、個々のMRM TAGを同定した。10μMトリステアリン外部標準を用いて、TAGを定量化した。
Agilent6410Bエレクトロスプレーイオン化QQQ−MS(Agilent、米国カリフォルニア州パロアルト)と連結したAgilent1200シリーズLCを用いて、抽出した総脂質を分析した。流速0.2mL/分でバイナリーグラジエントを用いたAscentis Express RP−アミド 50mm x 2.1mm、2.7μm HPLCカラム(Sigma−Aldrich、オーストラリア、キャッスルヒル)を用いて、各総脂質抽出物5μLを注入して、クロマトグラフィー法で分離した。移動相は:A.10mMギ酸アンモニウム水溶液:メタノール:テトラヒドロフラン(50:20:30v/v/v);B.10mMギ酸アンモニウム水溶液:メタノール:テトラヒドロフラン(5:20:75v/v/v)。コリジョンエネルギー30V及びフラグメンテーションエネルギー60Vを用いて、多重反応モニタリング(MRM)により、選択した中性脂質(TAG及びDAG)及びリン脂質(PC、PE、PI、PS、PA、PGを含むPL)を分析した。次の主要脂肪酸:16:0(パルミチン酸)、18:0(ステアリン酸)、18:1ω9(オレイン酸、OA)、18:2ω6(リノール酸、LA)、18:3ω3(α−リノレン酸、ALA)、18:4ω3(ステアリドン酸、SDA)、20:1、20:2、20:3、20:4ω3、20:5ω3、22:4ω3、22:5ω3、22:6ω3に、中性脂質を標的とし、一方、それぞれ、0−3、0−4、0−5、4−6の二重結合を有するC16、C18、C20及びC22化学種を含めてリン脂質をスキャンした。
種子オイル含有率を決定する場合、種子を、24時間デシケーター内で乾燥し、種子約4mgを、テフロン加工スクリューキャップを含む2mlガラスバイアル中に移動した。トルエン0.1ml中に溶解したトリヘプタデカノイン0.05mgを内部標準としてバイアルに添加した。
内部標準としてC24:0モノオールのアリコットを添加して一緒にオイル約10mgの試料を、80%MeOH中5%KOH4mLを用いてけん化し、テフロン加工スクリューキャップしたガラスチューブ内で80℃2時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリQ水2mLを添加し、ステロールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン:ジクロロメタン(4:1v/v)2mL中に抽出した。混合物を遠心分離し、ステロール抽出物を除去し、ミリQ水2mLで洗浄した。それから、該ステロール抽出物を振盪及び遠心分離後に除去した。該抽出物を窒素ガス気流中で蒸発し、BSTFA200mLを用いて、ステロールをシリル化し、80℃で2時間加熱した。
順方向プライマー10pmol(ピコモル)及び逆方向プライマー30pmol、最終濃度2.5mMまでのMgSO4、緩衝剤を含むRNA合計400ng(ナノグラム)及び製造者説明書に従ったヌクレオチド成分を用いた、体積25μLのSuperscript III One−Step RT−PCRシステム(Invitrogen)を用いて、逆転写PCR(RT−PCR)増幅を通常に行った。典型的な温度状況は、45℃、30分間の1サイクルで逆転写を起こし、;それから、94℃、2分の1サイクル、次いで、94℃、30秒の40サイクル、52℃、30秒間、70℃、1分間;それから、72℃、2分間の1サイクル後、反応混合物を5℃まで冷却した。
トランスジェニック植物内の導入遺伝子のコピー数を決定するため、次のように、デジタルPCR法を使用した。この方法を、植物が、本明細書に記載の遺伝子構築物のトランスジェニックであるかどうかを決定するためにも使用できるはずである。約1平方センチメートルの葉組織を、各個々の植物から収穫し、コレクションマイクロチューブ(Qiagen)に入れた。それから、試料を24〜48時間凍結乾燥した。DNA抽出物の試料を解氷のため、ステンレススチールボールベアリングを各乾燥試料に添加し、Qiagen Tissuelyserでチューブを振盪した。抽出緩衝液375μL(0.1M トリス−HCl pH8、0.05M EDTA pH8及び1.25%SDS)を各チューブに添加し、混合物を65℃で1時間インキュベートし、それから、冷却後、6M酢酸アンモニウム(4℃)187μLを徹底的に混合しながら各チューブに添加した。それから、試料を3000rpmで30分間遠心分離した。各チューブの上澄みを、室温で5分間DNA沈降のためイソプロパノール220μLを各々含む新しいマイクロチューブ中に取り出した。DNAを、3000rpmで30分間チューブを遠心分離することにより集め、DNAペレットを、70%エタノール320μLで洗浄し、乾燥後、水225μL中にDNAを再懸濁した。不溶解性物質を3000rpmで20分間遠心分離することによりペレット化し、各上澄み150μLを長期貯蔵用96ウェルプレートに移動した。
フルオレセイン二酢酸エステル(FDA)を、アセトン中に2mg/mlで溶解して原液を得た。持続的白濁の外観により示される飽和に達するまで、ショ糖溶液(0.5M)2mlにFDA原液を滴下することにより使用直前に、FDA希釈液を調製した。
WO2013/185184に記載のレベルを超えるアブラナのDHA産生レベルを改善するため、バイナリーベクターpJP3416−GA7−modA、pJP3416−GA7−modB、pJP3416−GA7−modC、pJP3416−GA7−modD、pJP3416−GA7−modE及びpJP3416−GA7−modFを、WO2013/185184に記載の通り構築し、トランスジェニック植物で試験した。これらのバイナリーベクターは、pJP3416−GA7構築物の変異体であり、特に、Δ6−デサチュラーゼ及びΔ6−エロンガーゼ機能の改良により、植物種子内のDHA合成をさらに増加するように設計した。SDAは、Δ5−エロンガーゼと比較して、比較的低いΔ6−エロンガーゼ効率のによってGA7構築物で形質転換されたいくつかの種子内に蓄積されるので、他の修飾の中で、2つのエロンガーゼ遺伝子位置をT−DNA中にスイッチすることが観察された。
この実験の焦点が油料種子作物種内のDHA及びDPAの産生の実証であった一方、上記の結果は、構築物設計展望からも興味があった。最初、modF構築物中のΔ6−及びΔ5−エロンガーゼコード領域位置のスイッチは、より低いΔ5−エロンゲーションのために蓄積されたより多いEPAを含む意図されたプロファイル変化をもたらした。Δ6−エロンゲーションの同時増加が観察されたが、これは、より低いSDAレベルをもたらさなかった。これは、より高活性なアマコンリニン2プロモーターによる短縮化ナピンプロモーター(FP1)の置換だけでなく、余分にミクロモナス・プシーラΔ6−デサチュラーゼ発現カセットの付加により引き起こされた、modF形質転換種子内のΔ6−不飽和化の増加に起因した。modG構築物で観察されたΔ6−不飽和化のいくらか低い増加は、GA7中の高発現Δ5−エロンガーゼカセットの利用に起因した。Δ6−デサチュラーゼ及びΔ5−エロンガーゼコード領域の位置のスイッチは、より大きなΔ6−不飽和化をもたらした。Cnl2プロモーターによるFP1プロモーターの置換によって、この場合では、Δ5−エロンガーゼ活性は減少しなかった。
形質転換シロイヌナズナ種子のTAG上のDHAの位置分布を、NMRにより測定した。総脂質を、ヘキサン10mLを含むガラスチューブに粉砕種子を移動する前に、ヘキサン下に、種子を先ず粉砕することにより約200mgの種子から抽出した。チューブを水浴で約55℃に温めて、それから、ボルテックスして遠心分離した。ヘキサン溶液を取り出し、さらに4x10mLでこの手順を繰り返した。抽出物を合わせて、ロータリーエバポレーターで濃縮し、抽出脂質中のTAGを、20mLのヘキサン中7%ジエチルエーテルを用いて、短いシリカカラムを通過させることにより極性脂質から分離して精製した。精製TAG上のアシル基位置分布を前述のように定量的に測定した(Petrieら、2010a及びb)。
オーストラリアの商業的給源から購入した12種の植物オイルからのフィトステロールは、実施例1に記載のO−トリメチルシリルエーテル(OTMSi−エーテル)誘導体としてGC及びGC−MSにより特徴付けられた。ステロールを、保持データ、質量スペクトル解析及び文献と実験標準質量スペクトルデータとの比較により同定した。ステロールを5β(H)−コラン−24−オール内部標準の使用により定量化した。同定されたステロールのフィトステロール基本構造及び化学構造を、図3及び表10に示す。
本発明は、TAGのsn−2位におけるDHA及び/またはDPA蓄積を、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)をGA7構築物またはその変異体により与えられるなど、DHAまたはDPA生合成経路と一緒に同時発現することにより増加できた。好ましいLPAATは、内在性LPAATと比較して、LPAのsn−2位における多価不飽和C22鎖の挿入増加をもたらし、PAを生成する、基質として多価不飽和C22脂肪アシル−CoA、好ましくはDHA−CoA及び/またはDPA−CoAに対して作用できるもの、特に基質としてDHA−CoA及びDPA−CoAの両方を用いることができるものである。細胞質内LPAAT酵素は、特に、該種が合成及びTAG中の異常な脂肪酸を蓄積する場合、しばしば、多様な基質選択性を示す。リムナンテス・ダグラシー(Limnanthes douglasii)からのLPAAT2を、C22基質を利用できない同じ種からのLPAAT1との対照で、PA合成の基質として、エルコイルCoA(C22:1−CoA)を使用することが分かった(Brownら、2002)。
総脂質含有率
GA7構築物のT−DNAに対してホモ接合である及び総脂肪酸含有物中にDHAを含むカメリナサティバ種子を、以下の総脂質含有率及び組成について分析した。2つの連続した溶媒抽出工程を、初め、ヘキサンを用いて、次に、クロロホルム/メタノールを用いて、種子に対して行った。抽出または分析中、酸化防止剤は添加しなかった。脂質/溶媒混合物の長時間加熱及び還流により種子脂質を抽出ために通常に使用されるソックスレー抽出法は、DHAなどのω3PUFAの分解または酸化の可能性があるので、使用しない。
ヘキサン及びCM抽出物の脂質分類を、石英ロッド上のChromarod S−IIIシリカと組み合わせて、展開溶媒系としてヘキサン/ジエチルエーテル/氷酢酸(70:10:0.1、v/v/v)を用いて、水素炎イオン化検出器を備えた薄層クロマトグラフィー(TLC−FID;Iatroscan Mark V.Iatron Laboratories、日本、東京)により分析した。適切な補正曲線を、Nu−Chek Prep.Inc.(米国ミネソタ州エリジアン)から得た代表的基準を用いて作成した。SIC−480IIソフトウェア(SISCバージョン:7.0−E)を用いて、データを処理した。リン脂質化学種をシリカカラムクロマトグラフィーから得られた精製リン脂質フラクションの適用及びFID検出前のクロロホルム/メタノール/氷酢酸/水(85:17:5:2、v/v/v)中、ロッドの展開により分離した。
概して、DHA及び/またはDPAを産生する種子では、本発明者らは、種子中の全脂質の直接的メチル基転移反応により決定したとき、種子中の総脂質の脂肪酸組成が、TAGフラクショと類似していることを観察した。このことは、種子中に存在する総脂質の90%より多くが、TAGの形態で起こることに起因した。
抽出脂質中のステロール含有率及び組成を決定するため、TAGリッチヘキサン抽出物及び極性脂質リッチCM抽出物からの約10mgの総脂質試料を、80%MeOH中5%KOH4mLを用いてけん化し、テフロン加工スクリューキャップしたガラス試験チューブ内で80℃2時間加熱した。反応混合物を冷却後、ミリQ水2mLを添加し、ステロール及びアルコールを、振盪及びボルテックスすることにより、ヘキサン:ジクロロメタン(4:1v/v)2mL中に抽出した。混合物を遠心分離し、有機相の各抽出物を、振盪及び遠心分離によりミリQ水2mLで洗浄した。上層のステロール含有有機層を抜き出した後、溶媒を、窒素気流を用いて蒸発させ、ステロール及びアルコールを、ビス(トリメチルシリル)−トリフルオロアセトアミド(BSTFA、Sigma−Aldrich)200μLを用いて、密封GCバイアル内で80℃2時間加熱によりシリル化した。この方法により、遊離ヒドロキシル基をトリメチルシリルエーテルに転換した。ステロール−及びアルコール−OTMSi誘導体を、窒素気流下、加熱ブロック(40℃)で乾燥し、上記GC/GC−MS分析直前に、ジクロロメタン(DCM)に再溶解した。
種子中の脂肪アルコールを誘導体化し、ステロールと同様に分析した。イソ分岐脂肪アルコールを伴ったC16〜C22の一連の脂肪アルコールを、ヘキサン及びCM抽出物両方で同定した。トランスジェニック及びコントロール種子について、観察された個々の成分の比率のいくらかの差異を含む類似のプロファイルが観察された。クロロフィル由来のフィトールは主要脂肪族アルコールであり、それぞれ、トランスジェニック及びコントロール種子中のヘキサンフラクションの総脂肪アルコールの47%及び37%を占める。奇数鎖アルコールは、ヘキサン抽出物中(16%〜23%)より、CM抽出物中で高いレベルで存在する(総脂肪アルコール含有物の37%〜38%)。イソ−17:0(16%〜38%)は、17:0(0.3%〜5.7%)に対して優勢であった。存在する別の奇数鎖アルコールは、19:0であった(4.5%〜6.5%)。検出された他のアルコールは、イソ−16:0、16:0、イソ−18:0、18:1、18:0を含み、少量レベルのイソ−20:0、20:1、20:0、イソ−22:0、22:1及び22:0も存在した。
結果は、室温においてヘキサンで複数回抽出と電動式乳鉢及び乳棒を用いた粉砕は、トランスジェニック種子からTAG含有オイルの大部分を回収するのに効果的であることを示した。中程度レベルのDHAを含むトランスジェニック種子からのオイルに加えて、トランスジェニック種子は、コントロール種子と比較して、大部分の脂質分類(トリアシルグリセロール、糖脂質及びリン脂質)中に著しく高いレベルのALAも含んでいた。このことは、Δ15−デサチュラーゼ活性が、種子発育中に、トランスジェニック種子内で著しく増強されることを示した。興味深いことに、様々な抽出物及びフラクション中の脂肪酸組成及びDHAの比率においていくらかのわずかな差があり、DHAレベルは、TAGリッチヘキサン抽出物及びCM抽出からのTAG中でより高く(6%〜6.8%)、極性脂質フラクション中でより低かった(糖脂質中3%及びリン脂質中1.6%)。16:0のレベルは、TAGリッチヘキサン抽出物及びCM抽出からのTAG(6%〜7%)と比較して、CM抽出物中の糖脂質及びリン脂質の極性脂質フラクション中でより高かった(19%〜21%)。
トランスジェニックセイヨウアブラナ植物を、以下のように、DHAの産生のため、GA7−modB構築物(実施例3)を用いて産生した。長日反応性変種のカラシナ種子を、Keresztら(2007)に記載のように塩素ガスを用いて滅菌した。滅菌種子を、pH5.8に調節した、0.8%寒天で固形化した1/2強化MS培地(Murashige及びSkoog、1962)で発芽させ、6〜7日間、16/8時間(明/暗)光周期で、蛍光灯下(50μE/m2s)、24℃において生育した。2〜4mm柄の子葉柄を、これらの苗から無菌的に単離し、移植片として使用した。アグロバクテリウム・ツメファシエンス(Agrobacterium tumefaciens)株AGL1を、バイナリーベクターGA7で形質転換した。アグロバクテリウム培養を開始し、Belideら(2013)に記載のように感染処理した。全形質転換のため、約50の新たに単離した子葉柄を、6分間、アグロバクテリウム・ツメファシエンス10mlで感染させた。感染葉柄を、滅菌フィルターペーパー上で吸い取り、過剰なアグロバクテリウム・ツメファシエンスを除去して、共培養培地(1,5mg/LのBA、0.01mg/LのNAA及び100μMアセトシリンゴンを含み、L−システイン(50mg/L)、アスコルビン酸(15mg/L)及びMES(250mg/L)を添加したMS)に移動した。全プレートをマイクロポアテープで密封し、共培養48時間24℃において、暗所でインキュベートした。それから、移植片を、事前選択培地(1.5mg/LのBA、0.01mg/LのNAA、3mg/LのAgNO3、250mg/Lのセフォタキシム及び50mg/Lのチメンチンを含むMS−寒天)に移動し、16/8時間光周期で、24℃において4〜5日間培養した後、移植片を、事前選択培地(1.5mg/LのBA、0.01mg/LのNAA、3mg/LのAgNO3、250mg/Lのセフォタキシム、50mg/Lのチメンチン及び5mg/LのPPTを含むMS−寒天)に移動し、16/8時間光周期で、24℃において4週間培養した。緑色のカルスを有する移植片を、シュート形成培地(2.0mg/LのBA、3mg/LのAgNO3、250mg/Lのセフォタキシム、50mg/Lのチメンチン及び5mg/LのPPTを含むMS−寒天)に移動し、さらに2週間培養した。小さな再分化シュート芽を、ホルモンフリーMS培地(3mg/LのAgNO3、250mg/Lのセフォタキシム、50mg/Lのチメンチン及び5mg/LのPPTを含むMS−寒天)に移動し、さらに2〜3週間培養した。
サザンブロットハイブリダイゼーション解析を、GA7−modB構築物からのT−DNAで形質転換された選択T2セイヨウアブラナ植物に対して実行した。植物組織試料から抽出されたDNAを、サザンブロットハイブリダイゼーション解析のためいくつかの制限酵素で消化した。T−DNA部分に対応する放射活性プローブを、該ブロットにハイブリダイズし、ストリンジェントな条件下洗浄し、ブロットを膜に暴露してハイブリダイズするバンドを検出した。試料のいくつかは、植物の1つのT−DNAインサーションに対応する各制限酵素の単一ハイブリダイズバンドを示したが、他は、2本のバンドを示し、また、他は、4つ〜6つのインサーションに対応する複数のT−DNAバンドを示した。サザンブロット解析により観察されたハイブリダイズバンド数は、デジタルPCR法により決定されるとき、約3または4のコピー数まで、トランスジェニック植物のT−DNAコピー数とよく相関した。約5より大きいコピー数においては、デジタルPCR法はあまり信頼性ができなかった。
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Claims (26)
- エステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸は、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸及びドコサペンタエン酸(DPA)を含み、場合により、ステアリドン酸(SDA)、エイコサペンタエン酸(EPA)、及びエイコサテトラエン酸(ETA)のうち1つ以上を含んでもよく、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが、7%から35%の間である、抽出植物脂質または微生物脂質。
- 以下の特徴:
i)前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるパルミチン酸のレベルは、約2%から15%の間、または約3%から10%の間であること、
ii)前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるミリスチン酸(C14:0)のレベルは、約0.1%であること、
iii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるオレイン酸のレベルは、約1%から約30%の間、約3%から約30%の間、約6%から約30%の間、約1%から約20%の間、約30%から約60%の間、約45%〜約60%、約30%、または約15%から約30%の間であること、
iv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるリノール酸(LA)のレベルは、約4%から約35%の間、約4%から約20%の間、約4%から約17%の間、または約5%から約10%の間であること、
v)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるα−リノレン酸(ALA)のレベルは、約4%から約40%の間、約7%から約40%の間、約10%から約35%の間、約20%から約35%の間、約4%から約16%の間、または約2%から約16%の間であること、
vi)前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるγ−リノレン酸(GLA)のレベルは、4%未満、約3%未満、約2%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から7%の間、0.05%から4%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
vii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるステアリドン酸(SDA)のレベルは、約10%未満、約8%未満、約7%未満、約6%未満、約4%未満、約3%未満、約0.05%から約7%の間、約0.05%から約6%の間、約0.05%から約4%の間、約0.05%から約3%の間、約0.05%から約10%の間、または約0.05%から約2%の間であること、
viii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサテトラエン酸(ETA)のレベルは、約6%未満、約5%未満、約4%未満、約1%未満、約0.5%未満、0.05%から約6%の間、0.05%から約5%の間、0.05%から約4%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
ix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサトリエン酸(ETrA)のレベルは、4%未満、約2%未満、約1%未満、0.05%から4%の間、0.05%から3%の間、または0.05%から約2%の間、または0.05%から約1%の間であること、
x)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるエイコサペンタエン酸(EPA)のレベルは、4%から15%の間、4%未満、約3%未満、約2%未満、0.05%から10%の間、0.05%から5%の間、0.05%から約3%の間、または0.05%から約2%の間であること、
xi)もし、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDHAのレベルが、2%未満、または0.05%から約2%の間であること、
xii)該脂質は、その脂肪酸含有物中にω6−ドコサペンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含むこと、
xiii)該脂質は、その脂肪酸含有物中に0.1%未満のω6−ドコサペンタエン酸(22:5Δ4,7,10,13,16)を含むこと、
xiv)該脂質は、その脂肪酸含有物中に0.1%未満の1つ以上または全てのSDA、EPA及びETAを含むこと、
xv)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総飽和脂肪酸レベルは、約4%から約25%の間、約4%から約20%の間、約6%から約20%の間、または約6%から約12%の間であること、
xvi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総一価不飽和脂肪酸レベルは、約4%から約40%の間、約4%から約35%の間、約8%から約25%の間、8%から約22%の間、約15%から約40%の間または約15%から約35%の間であること、
xvii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総多価不飽和脂肪酸レベルは、約20%から約75%の間、30%から75%の間、約50%から約75%の間、約60%、約65%、約70%、約75%、または約60%から約75%の間であること、
xviii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸レベルは、約35%から約50%の間、約20%から約35%の間、約6%から約20%の間、20%未満、約16%未満、約10%未満、約1%から約16%の間、約2%から約10%の間、または約4%から約10%の間であること、
xix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸レベルは、約10%未満、約8%未満、約6%未満、4%未満、約1%から約20%の間、約1%から約10%の間、0.5%から約8%の間、または0.5%から4%の間であること、
xx)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω3脂肪酸レベルは、36%から約65%の間、36%から約70%の間、40%から約60%の間、約30%から約60%の間、約35%から約60%の間、40%から約65%の間、約30%から約65%の間、約35%から約65%の間、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約65%または約70%であること、
xxi)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω3脂肪酸レベルは、21%から約45%の間、21%から約35%の間、約23%から約35%の間、約25%から約35%の間、約27%から約35%の間、約23%から約25%の間、約27%、約30%、約35%、約40%または約45%であること、
xxii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における総ω6脂肪酸:総ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約1.0未満、約0.1未満、約0.10〜約0.4、または約0.2であること、
xxiii)該抽出脂質の総脂肪酸含有量における新ω6脂肪酸:新ω3脂肪酸の比は、約1.0から約3.0の間、約0.02から約0.1の間、約0.1から約1の間、約0.1から約0.5の間、約0.50未満、約0.40未満、約0.30未満、約0.20未満、約0.15未満、約0.02、約0.05、約0.1、約0.2または約1.0であること、
xxiv)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約98%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約90%の間のΔ12−デサチュラーゼによるオレイン酸からLAへの転換効率に基づくこと、
xxv)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間のΔ6−デサチュラーゼによるALAからSDAへの転換効率に基づくこと、
xxvi)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約88%の間、または約75%から約85%の間のΔ6−エロンガーゼによるSDAからETA酸への転換効率に基づくこと、
xxvii)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約99%の間、約70%から約99%の間、または約75%から約98%の間のΔ5−デサチュラーゼによるETAからEPAへの転換効率に基づくこと、
xxviii)該脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約99%の間、約85%から約99%の間、約50%から約95%の間、または約85%から約95%の間のΔ5−エロンガーゼによるEPAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxix)前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、約20%、約25%、約30%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、約10%から約25%の間または約20%から約30%の間のオレイン酸からDPAへの転換効率に基づくこと、
xxx)前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、約25%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間のLAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxxi)前記脂質の脂肪酸組成は、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約30%、約30%、約35%、約40%、約45%、約50%、約55%、約60%、約22%から約70%の間、約17%から約55%の間、約22%から約40%の間、または約24%から約40%の間のALAからDPAへの転換効率に基づくこと、
xxxii)該抽出脂質中の総脂肪酸は、1.5%未満のC20:1、1%未満のC20:1または約1%のC20:1を有すること、
xxxiii)該脂質のトリアシルグリセロール(TAG)含有率は、少なくとも約70%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、少なくとも約95%、約70%から約99%の間、または約90%から約99%の間であること、
xxxiv)該脂質は、ジアシルグリセロール(DAG)を含み、DAGは好ましくはDPAを含むこと、
xxxv)該脂質は、約10%未満、約5%未満、約1%未満または約0.001%から約5%の間の遊離(非エステル化)脂肪酸及び/またはリン脂質を含む、または本質的にそれを含まないこと、
xxxvi)TAGの形態でエステル化されたDPAの少なくとも70%、少なくとも72%または少なくとも80%は、前記TAGのsn−1位またはsn−3位であること、
xxxvii)前記脂質において最も豊富なDPA含有TAG種は、DPA/18:3/18:3(TAG56:12)であること、
xxxviii)前記脂質は、トリDPA TAG(TAG66:18)を含むこと、及び
xxxix)該抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが、約7%、約8%、約9%、約10%、約12%、約15%、約18%、約20%、約22%、約24%、約26%、約28%、約31%、約7%から約31%の間、約7%から約28%の間、約10%から約35%の間、約10%から約30%の間、約10%から約25%の間、約10%から約22%の間、約14%から約35%の間、約16%から約35%の間、約16%から約30%の間、約16%から約25%の間、または約16%から約22%の間であり、場合により、DHAレベルは、該抽出脂質の総脂肪酸含有量の0.5%未満であること
の1つ以上を有する、請求項1に記載の脂質。 - 前記脂質がオイル、好ましくは、油料種子から採れるオイルであり、より好ましくは、前記脂質が、セイヨウアブラナ(Brassica napus)オイルまたはカラシナ(Brassica juncea)オイルなどのアブラナ属(Brassica sp.)オイル、ワタ(Gossypium hirsutum)オイル、アマ(Linum usitatissimum)オイル、ヘリアンタス属(Helianthus sp.)オイル、ベニバナ(Carthamus tinctorius)オイル、ダイズ(Glycine max)オイル、トウモロコシ(Zea mays)オイル、ギニアアブラヤシ(Elaesis guineenis)オイル、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)オイル、アオバナルーピン(Lupinus angustifolius)オイル、カメリナサティバ(Camelina sativa)オイル、クランベアビシニカ(Crambe abyssinica)オイル、ジャイアントミスカンサス(Miscanthus x giganteus)オイル、またはススキ(Miscanthus sinensis)オイルを含むまたはである、請求項1または2のいずれか1項に記載の脂質。
- i)脂質を含む植物部分または微生物細胞を得る工程であって、前記脂質がエステル化された形態の脂肪酸を含み、前記脂肪酸がオレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、ドコサペンタエン酸(DPA)を含み、場合により、1つ以上のエイコサペンタエン酸(EPA)及びエイコサテトラエン酸(ETA)を含んでもよく、前記植物部分中の抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが7%から35%の間である前記工程、及び
ii)前記植物部分または微生物細胞から脂質を抽出する工程
を含み、前記抽出脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが7%から35%の間である抽出植物脂質または微生物脂質の産生方法。 - 前記抽出脂質が請求項2または請求項3で定義された特徴の1つ以上を有する、請求項4記載の方法
- 前記植物部分が種子、好ましくは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)またはカラシナ(Brassica juncea)などのアブラナ属(Brassica sp.)、ワタ(Gossypium hirsutum)、アマ(Linum usitatissimum)、ヘリアンタス属(Helianthus sp.)、ベニバナ(Carthamus tinctorius)、ダイズ(Glycine max)、トウモロコシ(Zea mays)、ギニアアブラヤシ(Elaesis guineenis)、ベンサミアナタバコ(Nicotiana benthamiana)、アオバナルーピン(Lupinus angustifolius)、カメリナサティバ(Camelina sativa)、またはクランベアビシニカ(Crambe abyssinica)、好ましくは、セイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)またはカメリナサティバ(C. sativa)の種子などの油料種子である、請求項4または5に記載の方法。
- 前記植物部分または微生物細胞が、酵素の以下のセット:
i)ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ix)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、または
x)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチドを含み、各ポリヌクレオチドは、前記植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合している、請求項4〜6のいずれか1項に記載の方法。 - 前記植物部分または微生物細胞が、以下の特徴:
i)前記Δ12‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約80%、約60%から約95%の間、約70%から約90%の間、または約75%から約85%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、オレイン酸をリノール酸に転換すること、
ii)前記ω3‐デサチュラーゼが、少なくとも約65%、少なくとも約75%、少なくとも約85%、約65%から約95%の間、約75%から約91%の間、または約80%から約91%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、ω6脂肪酸をω3脂肪酸に転換すること、
iii)前記Δ6‐デサチュラーゼが、少なくとも約20%、少なくとも約30%、少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約30%から約70%の間、約35%から約60%の間、または約50%から約70%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、ALAをSDAに転換すること、
iv)前記Δ6‐デサチュラーゼが、約5%未満、約2.5%未満、約1%未満、約0.1%から約5%の間、約0.5%から約2.5%の間、または約0.5%から約1%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、リノール酸をγ‐リノレン酸に転換すること、
v)前記Δ6‐エロンガーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、約60%から約95%の間、約70%から約80%の間、または約75%から約80%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、SDAをETAに転換すること、
vi)前記Δ5‐デサチュラーゼが、少なくとも約60%、少なくとも約70%、少なくとも約75%、少なくとも約80%、少なくとも約90%、約60%から約95%の間、約70%から約95%の間、または約75%から約95%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、ETAをEPAに転換すること、
vii)前記Δ5‐エロンガーゼが、少なくとも約80%、少なくとも約85%、少なくとも約90%、約50%から約90%の間、または約85%から約95%の間の効率で、前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、EPAをDPAに転換すること、
viii)前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、オレイン酸をDPAに転換する効率が、少なくとも約10%、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約25%、約20%、約25%、約30%、約10%から約50%の間、約10%から約30%の間、または約10%から約25%の間、または約20%から約30%の間であること、
ix)前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、LAをDPAに転換する効率が、少なくとも約15%、少なくとも約20%、少なくとも約22%、少なくとも約25%、少なくとも約30%、約25%、約30%、約35%、約15%から約50%の間、約20%から約40%の間、または約20%から約30%の間であること、
x)前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞内で、ALAをDPAに転換する効率が、少なくとも約17%、少なくとも約22%、少なくとも約24%、少なくとも約30%、約30%、約35%、約40%、約17%から約55%の間、約22%から約35%の間、または約24%から約35%の間であること、
xi)前記植物部分または微生物細胞の1つ以上の細胞は、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応細胞より、少なくとも約25%、少なくとも約30%、約25%から約40%の間、または約27.5%から約37.5%の間で多いω3脂肪酸を含むこと、
xii)前記Δ6−デサチュラーゼは、リノール酸(LA)と比較してα−リノレン酸(ALA)を優先的に不飽和化すること、
xiii)前記Δ6−エロンガーゼは、Δ9−エロンガーゼ活性も有すること、
xiv)前記Δ12−デサチュラーゼは、Δ15−デサチュラーゼ活性も有すること、
xv)前記Δ6−デサチュラーゼは、Δ8−デサチュラーゼ活性も有すること、
xvi)前記Δ8−デサチュラーゼは、Δ6−デサチュラーゼ活性も有する、またはΔ6−デサチュラーゼ活性を有しないこと、
xvii)前記Δ15−デサチュラーゼは、GLAに対するω3−デサチュラーゼ活性も有すること、
xviii)前記ω3−デサチュラーゼは、LAに対するΔ15−デサチュラーゼ活性も有すること、
xix)前記ω3−デサチュラーゼは、LA及び/またはGLAの両方を不飽和化すること、
xx)前記ω3−デサチュラーゼは、LAと比較してGLAを優先的に不飽和化すること、
xxi)1つ以上または全ての前記デサチュラーゼは、対応するアシル‐PC基質より、アシル−CoA基質に対して高い活性を有すること、
xxii)前記Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質として、LAより、ALAに対して高いΔ6−デサチュラーゼ活性を有すること、
xxiii)前記Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのSn−2位と結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して高いΔ6−デサチュラーゼ活性を有すること、
xxiv)前記Δ6−デサチュラーゼは、LAと比較して、基質としてのALAに対して、少なくとも約2倍高いΔ6−デサチュラーゼ活性、少なくとも3倍高い活性、少なくとも4倍高い活性、または少なくとも5倍高い活性を有すること、
xxv)前記Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのsn−2位と結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して高い活性を有すること、
xxvi)前記Δ6−デサチュラーゼは、脂肪酸基質としてのPCのsn−2位に結合したALAに対するより、脂肪酸基質としてのALA−CoAに対して、少なくとも約5倍高いΔ6‐デサチュラーゼ活性または少なくとも10倍高い活性を有すること、
xxvii)前記デサチュラーゼは、フロントエンドデサチュラーゼであること、及び
xxviii)前記Δ6‐デサチュラーゼは、ETAに対する検出可能なΔ5‐デサチュラーゼ活性を有しないこと
の1つ以上または全てを有する、請求項7記載の方法。 - 前記植物部分または微生物細胞が、ジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(DGAT)、モノアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(MGAT)、グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(GPAT)、1−アシル−グリセロール−3−リン酸アシルトランスフェラーゼ(LPAAT)、好ましくは、DPA−CoAなどのC22多価不飽和脂肪アシル−CoA基質を使用できるLPAAT、アシル−CoA:リゾホスファチジルコリンアシルトランスフェラーゼ(LPCAT)、ホスホリパーゼA2(PLA2)、ホスホリパーゼC(PLC)、ホスホリパーゼD(PLD)、CDP−コリンジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ(CPT)、ホスファチジルコリンジアシルグリセロールアシルトランスフェラーゼ(PDAT)、ホスファチジルコリン:ジアシルグリセロールコリンホスホトランスフェラーゼ(PDCT)、アシル−CoAシンターゼ(ACS)、またはその2つ以上の組合せをコードする外来性ポリヌクレオチドをさらに含む、請求項7または請求項8記載の方法。
- 前記外来性ポリヌクレオチドが、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたDNA分子、好ましくは、T−DNA分子内に共有結合しており、好ましくは、前記植物部分または微生物細胞の細胞のゲノムに組み込まれたかかるDNA分子数が、1以下、2もしくは3以下であり、または2もしくは3である、請求項7〜9のいずれか1項に記載の方法。
- 前記外来性ポリヌクレオチドを含む前記植物部分または微生物細胞の総オイル含有率が、前記外来性ポリヌクレオチドを含まない対応する植物部分または微生物細胞の総オイル含有率の少なくとも約40%、少なくとも約50%、少なくとも約60%、少なくとも約70%、約50%から約80%の間、または約80%から約100%の間である、請求項4〜10のいずれか1項に記載の方法。
- 前記脂質を処理して、総脂肪酸含有率のパーセンテージとして、DPAのレベルを増加させることをさらに含み、前記処理が、1つ以上の分別蒸留、蒸留またはDPAのメチルエステルまたはエチルエステルの生成などのエステル交換反応を含む、請求項4〜11のいずれか1項に記載の方法。
- その種子中に脂質を含む油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞であって、
a)エステル化された形態の脂肪酸を含む脂質、及び
b)酵素の以下のセット;
i)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
iii)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、または
iv)ω3−デサチュラーゼ及び/またはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
の1つをコードする外来性ポリヌクレオチド
を含み、
各ポリヌクレオチドが、前記植物の発育種子中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上の種子特異的プロモーター、または前記微生物細胞中の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合されており、前記脂肪酸が、オレイン酸、パルミチン酸、リノール酸(LA)を含むω6脂肪酸、α−リノレン酸(ALA)を含むω3脂肪酸、ステアリドン酸(SDA)、及びドコサペンタエン酸(DPA)を含み、場合によっては、エイコサペンタエン酸(EPA)及び/またはエイコサテトラエン酸(ETA)を含んでもよく、及び前記種子または微生物細胞の脂質の総脂肪酸含有量におけるDPAのレベルが7%から35%の間である、
前記油料種子植物、もしくはその部分、または微生物細胞。 - DPAを含む種子を産生可能であるセイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)またはカメリナサティバ(Camelina sativa)植物であって、前記植物の成熟した収穫された種子が、種子1グラム当たり少なくとも約28mg、好ましくは、種子1グラム当たり少なくとも約32mg、種子1グラム当たり少なくとも約36mg、種子1グラム当たり少なくとも約40mg、より好ましくは、種子1グラム当たり少なくとも約44mgまたは少なくとも48mg、種子1グラム当たり少なくとも約80mg、または種子1グラム当たり約30mgから約80mgの間のDPA含有量を有する、前記植物。
- 前記外来性ポリヌクレオチドを含む請求項13記載の植物細胞。
- 以下の特徴:
i)請求項13または14記載の植物由来であること、
ii)請求項1〜3のいずれか1項に記載の脂質を含むこと、
iii)請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法で使用できること
の1つ以上を有する植物部分、好ましくは種子、または微生物細胞。 - DPA及び約4重量%から約15重量%の間、好ましくは、約6重量%から約8重量%の間または約4重量%から約8重量%の間の水分を含む成熟して収穫されたセイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)またはカメリナサティバ(Camelina sativa)種子であって、前記種子のDPA含有量が種子1グラム当たり少なくとも約28mg、好ましくは、種子1グラム当たり少なくとも約32mg、種子1グラム当たり少なくとも約36mg、種子1グラム当たり少なくとも約40mg、より好ましくは、種子1グラム当たり少なくとも約44mgまたは種子1グラム当たり少なくとも約48mg、種子1グラム当たり約80mg、または種子1グラム当たり約30mgから約80mgの間である、前記種子。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載の抽出植物脂質または抽出微生物脂質の製造に使用できる植物または微生物細胞の産生方法であって、前記方法が、
a)複数の植物または微生物細胞からの1つ以上の植物部分または微生物細胞により産生された脂質中のDPAのレベルをアッセイすることであって、各植物または微生物細胞が、酵素の以下のセット;
i)ω3−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ii)Δ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
iv)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
v)ω3−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vi)Δ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
vii)Δ12−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
viii)Δ12−デサチュラーゼ、ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、
ix)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ6−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ6−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ、または
x)ω3−デサチュラーゼまたはΔ15−デサチュラーゼ、Δ8−デサチュラーゼ、Δ5−デサチュラーゼ、Δ9−エロンガーゼ及びΔ5−エロンガーゼ
の1つをコードする1つ以上の外来性ポリヌクレオチドを含み、
各ポリヌクレオチドが、植物部分または微生物細胞の細胞内の前記ポリヌクレオチドの発現を誘導可能である1つ以上のプロモーターと作動可能に結合する、前記アッセイすること、と
b)1つ以上のその部分の請求項1〜3のいずれか1項に記載の抽出植物脂質または微生物脂質の産生に使用できる複数の植物または微生物細胞から植物または微生物細胞を同定すること、と
c)場合によっては、前記同定植物または微生物細胞、またはそれ由来の種子から後代植物または微生物細胞を産生すること
とを含む前記方法。 - 種子の産生方法であって、前記方法が、
a)好ましくは、少なくとも1000または2000または3000のかかる植物の集合部分としての耕地または標準栽植密度で植えられた少なくとも1ヘクタールまたは2ヘクタールまたは3ヘクタールの領域で、請求項13または14記載の植物、または請求項16記載の植物部分を産生、もしくは請求項17記載の種子を産生する植物を生育すること、
b)前記1つまたは複数の植物から種子を収穫すること、及び
c)場合によっては、前記種子から脂質を抽出して、好ましくは、少なくとも60kgまたは70kgまたは80kgのDPA/ヘクタールの総DPA収率でオイルを産生すること
を含む、前記方法。 - 次の特徴:
i)請求項2または請求項3に定義されるオイルを含むこと、及び
ii)前記植物部分または種子または微生物細胞が請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法で使用可能であること
の1つ以上を有する、請求項13〜17のいずれか1項に記載の植物、植物細胞、植物部分もしくは種子、または微生物細胞。 - 請求項4〜12のいずれか1項に記載の方法を用いて、請求項15記載の細胞、請求項13記載の油料種子植物、請求項13記載の微生物細胞、請求項14記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)もしくはカメリナサティバ(Camelina sativa)植物、請求項16記載の植物部分、または請求項17記載の種子により産生、またはから得られる脂質、またはオイル。
- 請求項17記載の種子から得られる、または請求項13または14記載の植物から得られるシードミール。
- 1つ以上の請求項21記載の脂質もしくはオイル、請求項15記載の細胞、請求項20記載の植物細胞または微生物細胞、請求項17記載の種子、または請求項22記載のシードミールを含む組成物。
- 1つ以上の請求項21記載の脂質もしくはオイル、請求項15記載の細胞、請求項13記載の油料種子植物、請求項20記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項14記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)もしくはカメリナサティバ(Camelina sativa)植物、請求項20記載の植物部分、請求項17記載の種子、請求項22記載のシードミール、または請求項23記載の組成物を含む家畜飼料、化粧品または化学薬品。
- 家畜飼料の製造方法であって、前記方法が、少なくとも1つの他の食物成分と、1つ以上の請求項1〜3のいずれか1項に記載の脂質もしくはオイル、請求項15記載の細胞、請求項13記載の油料種子植物、請求項20記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項14記載のセイヨウアブラナ(Brassica napus)、カラシナ(B. juncea)もしくはカメリナサティバ(Camelina sativa)植物、請求項20記載の植物部分、請求項17記載の種子、請求項22記載のシードミール、または請求項23記載の組成物を混合することを含む前記方法。
- PUFAから利益を受けることになる症状の治療または予防用医薬品製造のための、請求項1〜3のいずれか1項に記載の1つ以上の脂質またはオイル、請求項15記載の細胞、請求項20記載の植物細胞もしくは微生物細胞、請求項20記載の植物部分、請求項17記載の種子、請求項22記載のシードミール、または請求項23記載の組成物の使用。
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