CN116209778A - 抗茎腐病的玉蜀黍植物 - Google Patents
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Abstract
本公开文本属于植物育种和病害抗性领域。提供了一种用于开发对禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola)、其次对镰孢菌属物种(Fusarium spp.)的抗性增强的玉米植物的方法，禾生炭疽菌和镰孢菌属物种都引起茎腐病。还提供了一种鉴定具有以下多核苷酸序列的玉米植物的方法，所述多核苷酸序列被鉴定为充当对这些病原体的抗性的诊断标记。进一步描述了将所需遗传物质从一株或多株亲本植物准确无误地渗入到后代中，以在来自供体基因组的连锁累赘最小的情况下提高所述后代对这些病害的抗性。
Description
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年5月11日提交的美国临时申请号63/022,868的优先权权益，将其通过引用以其整体特此并入。
电子提交的文本文件的说明
将随同以电子方式提交的文本文件的内容通过引用以其整体并入本文：序列表的计算机可读格式拷贝(文件名：AGR-002_SeqList_20210507_6_ST25.txt，创建日期：2021年5月7日，文件大小≈0.99MB)。
技术领域
本公开文本涉及可用于鉴定和选择具有病原体抗性的植物的组合物和方法。此外，本公开文本涉及已经用本公开文本的组合物进行遗传转化或渗入的植物。
背景技术
玉米茎腐病是一种由包括禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicolaCes.Wils.)、轮枝镰孢菌(Fusarium verticilliodes)和相关物种在内的几种病原体引起的复合病害。这些病原体分别引起炭疽茎腐病(anthracnose stalk rot，ASR)和镰孢菌(Fusarium)茎腐病。据估计，在2016年仅这些茎腐病就使美国玉米作物产量减少了4.634亿蒲式耳(1180万MT)。参见Mueller等人,“Corn yield loss estimates due to diseasesin the United States and Ontario,Canada from 2012to 2015”,Papers in PlantPathology,2016,University of Nebraska-Lincoln。茎腐病也会导致茎秆大量倒伏。参见Callaway等人,“Effect of anthracnose stalk rot on grain yield and relatedtraits of maize adapted to the northeastern United States.”Canadian Journalof Plant Science,1992,72(4),1031-1036。其他人已经列举了对抗ASR的抗性来源。参见Badu-Apraku等人,“A major gene for resistance to stalk rot in maize.”,1987,Phytopathology 77:957-959；Toman和White,“Inheritance of resistance to stalkrot of corn.”Phytopathology,1993,83:981-986；Jung等人,“Generation-meansanalysis and quantitative trait locus mapping of anthracnose stalk rot genesin maize.”TAG,1994,89:413-418。
已知的抗性基因不足以开发和生产具有持久抗性的品种。正如通常在世界上的许多地区所实践的，在同一片田地里年复一年地种植玉米大大增加了病害的严重程度和病原体破坏宿主抗性的趋势。需要新的抗性来源和抗性基因的组合来战胜病原体的抗性破坏变体。本申请公开的主题满足了对植物病害、特别是对炭疽茎腐病的抗性的新的且具替代性的来源的需求。
附图说明
图1显示了QTL结果的曼哈顿图，其显示出4号和6号染色体上的两个ASR QTL超过了经验LOD(优势对数)显著性阈值(P<0.01)。
图2显示了4号染色体上的QTL内扩增子的比较。基因型1：Mp305，描述于通过引用以其整体并入本文的美国专利8,062,847中；基因型2：DW1035，选择Mp305 4号染色体片段的BC5；基因型3：NC262A，本公开文本的来源；基因型4：NC342，本公开文本的完整sib来源；基因型5：GEMN-0117，ASR耐受性对照；基因型6：GEMS-0016，ASR耐受性对照；基因型7：MN13，易感性对照；基因型8：MM69，易感性对照；基因型9：KW7638，易感性对照；基因型10：CB1，易感性对照。
图3显示了示例性茎秆分割机。所述茎秆分割机具有符合人体工程学的50cm的手柄、在机构主体上方的刀片以及在刀片下方的当分割的茎秆穿过主体出来时使其居中的弹簧张紧的滚轴。
图4显示了示例性茎秆分割机如何提供对被切割的茎秆具有可见性的居中切口，从而揭示内部茎腐病的程度。
图5是分割机主体的近视图，并且其铝制主体具有供定中心滚轴扩展的狭槽。
图6是显示茎秆穿过其中露出的中心孔的俯视图。当通过手柄向下施加压力到地面时，茎秆被横置刀片分割开。
序列
本申请中描述的序列总结在下表中。
发明内容
在一个方面，提供了一种鉴定对炭疽茎腐病表现出增强的抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测
a.在6号染色体上的抗性基因座处至少两个标记的存在，所述抗性基因座包含C16759-001-K1处的“G”和以下单核苷酸多态性之一：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
b.在6号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，所述抗性基因座包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个；和/或
c.在4号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，其中所述抗性基因座包含具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个单核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，
其中(a)的所述至少两个标记或(b)的所述至少一个标记与6号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联，并且(c)的所述至少一个标记与4号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联。优选地，Rcg1抗性等位基因在每个位置处都与源自登录号Mp305的Rcg1等位基因(参见美国专利号8,062,847)不同。
在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。在一些实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-104102206与PZE-104132759之间的染色体区间上。在其他实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。在一些实施方案中，6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的核苷酸序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的核苷酸序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
在一些实施方案中，在使用SEQ ID NO:120和121的引物、或SEQ ID NO:122和123的引物、或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子。
在一些实施方案中，在使用SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ IDNO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ IDNO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114的扩增子。
在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。在一些实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A或NC342。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测如上文在b.下所定义的在6号染色体上的所述抗性基因座处至少一个等位基因的存在或不存在。在一个具体实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测C16759-001-K1处的“G”。
在一些实施方案中，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中既检测(A)如上文在b.下所定义的在6号染色体上的所述抗性基因座处至少一个等位基因的存在或不存在，又检测(B)如上文在c.下所定义的在4号染色体上的所述抗性基因座处至少一个标记的存在或不存在。在一个具体实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测C16759-001-K1处的“G”。在一个具体实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测以下的单核苷酸多态性：SEQ ID NO:50中的位置413处的“C”、SEQ IDNO:50中的位置958处的“C”、SEQ ID NO:50中的位置971处的“C”、SEQ ID NO:50中的位置1099处的“T”、SEQ ID NO:50中的位置1154处的“A”、SEQ ID NO:50中的位置1250处的“T”、SEQ ID NO:50中的位置1607处的“G”、SEQ ID NO:50中的位置2001处的“G”、SEQ ID NO:50中的位置2598处的“A”或SEQ IDNO:50中的位置3342处的“A”。在一个具体实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测SEQ ID NO:50中的位置413处的“C”的单核苷酸多态性。
在各种实施方案中，至少一个核苷酸多态性的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增包含所述核苷酸多态性中的一个或多个的核酸序列。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置413处的“C”，并且所述引物包含序列GTACCATGTGACCA(SEQ ID NO:406)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置1099处的“T”，并且所述引物包含序列GTAGTGTTTTGAC(SEQ ID NO:407)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置1250处的“T”，并且所述引物包含序列TGATCTCAAAGAT(SEQ ID NO:408)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ IDNO:50中的位置1607处的“G”，并且所述引物包含序列GTTATGTGCACAA(SEQ ID NO:409)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置2001处的“G”，并且所述引物包含序列AGATGAAGGCTGT(SEQ ID NO:410)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置2598处的“A”，并且所述引物包含序列AAGTGACATGCAG(SEQID NO:411)。在一个具体实施方案中，所述单核苷酸多态性是SEQ ID NO:50中的位置3342处的“A”，并且所述引物包含序列CATCTGATGAAAGC(SEQ ID NO:412)。在一些实施方案中，所述核苷酸多态性选自表13的变体核苷酸。
在各种实施方案中，包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增所述等位基因的核酸序列。在一个具体实施方案中，所述引物包含序列AATTATGCTGATGA(SEQ ID NO:413)。
在另一个方面，提供了一种用于选择具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括根据任何以上方法鉴定所述玉蜀黍植物，以及如果检测到6号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记和/或4号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记的存在或不存在，则将所述玉蜀黍植物选择为具有炭疽茎腐病抗性。在一些实施方案中，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与所述一个或多个核苷酸多态性紧密连锁且关联。在一个具体实施方案中，所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与所述单核苷酸多态性连锁。在各种实施方案中，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁且关联。在一个具体实施方案中，所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁。在一些实施方案中，所述另外的标记等位基因与包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个的等位基因连锁。
在任何以上方法的各种实施方案中，所述方法进一步包括将所鉴定的玉蜀黍植物与另一株玉蜀黍植物回交，优选包括将6号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A的基因型中和/或将4号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A或NC342的基因型中。
在另一个方面，提供了一种将与炭疽茎腐病抗性相关的等位基因渗入到玉蜀黍植物中的方法，所述方法包括：
a.用检测6号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定筛选群体，所述抗性基因座包含
(i)以下单核苷酸多态性：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16759-001-K1处的“G”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
(ii)表13中所列举的变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
b.从所述群体中选择至少一株玉蜀黍植物，所述至少一株玉蜀黍植物包含6号染色体上的所述抗性基因座或包含C16759-001-K1处的“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
c.将所述至少一株玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
d.评价后代植物中C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的存在；以及
e.选择具有C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的后代植物。
在一些实施方案中，所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的“G”的5cM内。在一些实施方案中，所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的“G”的1cM内。在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。在一些实施方案中，6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
在一些实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％序列同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
在另一个方面，提供了一种将与炭疽茎腐病抗性相关的基因座渗入到玉蜀黍植物中的方法，所述方法包括：
a.筛选具有至少一个标记的群体，以确定来自所述群体的一株或多株玉蜀黍植物是否包含与炭疽茎腐病抗性相关的所述基因座，其中所述筛选包括用于检测4号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定，其中所述抗性基因座包含具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个单核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”；以及
b.从所述群体中选择包含与炭疽茎腐病抗性相关的所述基因座的至少一株玉蜀黍植物；以及
c.将所述至少一株玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
d.评价后代植物的与炭疽茎腐病抗性相关的所述至少一个标记；以及
e.选择具有与炭疽茎腐病抗性相关的所述等位基因的后代植物。
在各种实施方案中，所述至少一个标记位于以下中的任一个的5cM内：参考SEQ IDNO:50的位置413处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”、参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”或参考SEQ IDNO:50的位置3342处的“A”。
在各种实施方案中，所述至少一个标记位于以下中的任一个的1cM内：参考SEQ IDNO:50的位置413处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”、参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”或参考SEQ IDNO:50的位置3342处的“A”。
在一些实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-104102206与PZE-104132759之间的染色体区间上。在一些实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114的扩增子。
在一些实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A或NC342。
在另一个方面，提供了一种用于选择对炭疽茎腐病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
a.获得在其基因组内包含单体型的第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下中的一个或多个：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，和
xi.C16759-001-K1处的“G”；以及
b.将所述第一玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
c.评价后代植物的a.中的所述单体型或与b.中的所述单体型连锁且关联的至少一个标记等位基因；以及
d.选择具有a.中的所述单体型的后代植物。
在一些实施方案中，在(a)中获得在其基因组内包含单体型的所述第一玉蜀黍植物，所述单体型包含C16759-001-K1处的“G”和以下中的一个或多个：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在另一个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
在另一个方面，提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个单核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，
其中所述核酸分子编码能够在植物中赋予或提高对由真菌病原体引起的植物病害的抗性的多肽，所述多肽在所述植物中表达。
在一些实施方案中，在使用SEQ ID NO:120和121的引物、SEQ ID NO:122和123的引物或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子(扩增子7)。在一些实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114的扩增子。
在另一个方面，提供了一种表达盒，所述表达盒包含任何以上核酸分子，其中所述核酸分子与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接。
在另一个方面，提供了一种用于在玉蜀黍植物中赋予或提高对炭疽茎腐病的抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将任何以上核酸分子或表达盒引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；
(b)任选地从所述至少一个细胞再生或生长植物，以及
(c)使所述核酸分子在所述植物中表达。
在另一个方面，提供了一种用于产生具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
(a)将以上核酸分子或以上表达盒引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；或
(b.1)将定点核酸酶和修复基质引入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中，其中所述定点核酸酶能够在所述至少一个细胞的基因组中产生至少一个DNA双链断裂，并且所述修复基质包含以上核酸分子或其片段；或
(b.2)在允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养(b.1)的所述至少一个细胞，其中所述核酸分子从所述修复基质整合到所述玉蜀黍植物的基因组中；以及
(c)从所述至少一个细胞获得具有炭疽茎腐病抗性的所述植物。
在一些实施方案中，所述定点核酸酶包括锌指核酸酶，转录激活因子样效应物核酸酶，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/MAD7系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统在内的CRISPR/Cas系统，引导编辑系统，基于CRISPR的碱基编辑器系统，工程化归巢核酸内切酶和大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段。
还提供了一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物是根据任何以上方法鉴定的，或根据用于产生具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的以上方法产生的。
在另一个方面，提供了一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将所述抗性基因座渗入到所述玉蜀黍植物中的任何上述方法来制备。
在另一个方面，提供了一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将以上核酸分子渗入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
在另一个方面，提供了一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将核酸引入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备，其中所述核酸包含
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码具有SEQ ID NO:268或271之一的蛋白质的核苷酸序列，
viii.编码与SEQ ID NO:213或216的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列，
ix.包含SEQ ID NO:272的核苷酸序列或其片段或者由所述核苷酸序列或其片段组成的核苷酸序列，
x.编码具有单体型的炭疽茎腐病抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含表13中所列举的一个或多个多态性，或
xi.编码具有单体型的炭疽茎腐病抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在各种实施方案中，所述核酸分子编码能够在植物中赋予或提高对由真菌病原体引起的植物病害的抗性的多肽，所述多肽在所述植物中表达。
在另一个方面，提供了一种玉蜀黍植物，其中所述玉蜀黍植物根据包括以下步骤的方法来选择：
a.获得在其基因组内包含单体型的第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下中的一个或多个：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，和
xi.C16759-001-K1处的“G”；以及
b.将所述第一玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
c.评价后代植物的a.中的所述单体型或与b.中的所述单体型连锁且关联的至少一个标记等位基因；以及
d.选择具有a.中的所述单体型的后代植物。
在一些实施方案中，所述玉蜀黍植物在其基因组内包含单体型，所述单体型包含C16759-001-K1处的“G”和以下中的一个或多个：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
还提供了一种任何以上玉蜀黍植物的种子或植物部分。
具体实施方式
通过在4号和6号染色体上鉴定出两个新型玉米遗传资源，提供了用于增强对植物真菌病原体、特别是炭疽茎腐病致病性病原体的抗性的材料和分子遗传选择方法。诸如在实施例中描述了4号染色体和6号染色体上的抗性基因座。4号染色体和6号染色体上的两个抗性基因座可以一起用于对玉米植物进行育种。可替代地，可以仅使用4号染色体上的基因座对玉米植物进行育种。也可以仅使用6号染色体上的基因座对玉米植物进行育种。因此，所述基因座可以一起使用，或者作为分离的基因座(即，作为单独的性状)使用。育种者可以使用在实施例中以及贯穿本公开文本提供的信息来通过标准化标记技术(像KASP)追踪育种材料中的抗性基因座。在实施例中以及贯穿本公开文本提供的遗传表征可以允许将这两个基因座与这些染色体上的其他已知ASR抗性基因座明确区分开。
定义
除非另外定义，否则本文使用的技术和科学术语具有与本公开文本所属领域的普通技术人员通常所理解的相同的含义。
如本文所用，术语“植物”可以是整株植物、其任何部分或源自植物的细胞或组织培养物。因此，术语“植物”可以指代以下中的任一种：整株植物、植物构件或器官(包括但不限于胚芽、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果实、籽粒、穗、穗轴、皮壳、茎秆、根、根尖、花药等)、植物组织、植物细胞、植物原生质体、可以从中再生玉蜀黍植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物团块和植物种子。植物细胞是植物的细胞，其直接从种子或植物中获取，或者通过培养源自从植物中获取的细胞。谷粒旨在意指商业种植者为种植或繁殖物种以外的目的而生产的成熟种子。再生植物的后代、变体和突变体也包括在实施方案的范围内，条件是这些部分包含引入的多核苷酸。
术语“基因座”通常是指染色体的遗传限定区域，所述区域携带一个基因，或者可能携带如此紧密连锁以至于它们在遗传上表现为负责表型的单个基因座的两个或更多个基因。“基因”应当指代基因座内的特定遗传编码区，包括其相关的调节序列。
“种质”是指个体(例如，植物)、一组个体(例如，植物品系、品种或家族)或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质，或者来自个体(例如，植物)、一组个体(例如，植物品系、品种或家族)或源自品系、品种、物种或培养物的克隆的遗传物质。种质可以是生物体或细胞的一部分，或者可以与生物体或细胞分离。通常，种质提供具有特定分子组成的遗传物质，其为生物体或细胞培养物的一些或全部遗传品质提供物质基础。如本文所用，种质包括可以从中生长新植物的细胞、种子或组织，或者可以培养成整株植物的植物部分，如叶、茎、花粉或细胞。
术语“等位基因”是指出现在特定基因座处的两个或更多个不同核苷酸序列中的一个。在一条染色体上发现第一等位基因，而第二等位基因出现在该染色体的同源物上的相同位置处，例如如杂合个体的不同染色体或群体中不同纯合或杂合个体之间发生的那样。“等位基因频率”是指等位基因在群体或品系群体内的频率(比例或百分比)。可以通过平均来自群体的个体样本的等位基因频率来估计该群体内的等位基因频率。
当等位基因与性状相关联时并且当等位基因的存在是所需性状或性状形式将出现在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与所述性状“正”相关。当等位基因与性状相关联时并且当等位基因的存在是所需性状或性状形式将不出现在包含所述等位基因的植物中的指示时，所述等位基因与所述性状负相关。
在核酸扩增的上下文中，术语“扩增(amplify)”和“扩增(amplifying)”是指产生所选核酸(或其转录形式)的另外拷贝的任何过程。典型的扩增方法包括各种基于聚合酶的复制方法(包括聚合酶链式反应(PCR))、连接酶介导的方法(如连接酶链式反应(LCR))和基于RNA聚合酶的扩增(例如，通过转录)方法。
“扩增子”是扩增的核酸，例如通过经由任何可用的扩增方法(例如，PCR、LCR、转录等)扩增模板核酸而产生的核酸。
如果个体在给定基因座处仅具有一种等位基因(例如，二倍体个体在两条同源染色体中的每一条的基因座处具有相同等位基因的拷贝)，则所述个体是“纯合的”。如果在给定基因座处存在多于一种等位基因类型(例如，二倍体个体具有两个不同等位基因中的每一个的一个拷贝)，则个体是“杂合的”。术语“同质性”指示组成员在一个或多个特定基因座处具有相同的基因型。相反，术语“异质性”用于指示组内个体在一个或多个特定基因座处的基因型不同。
术语“分子标记”可以指代在鉴定连锁基因座时用作参考点的遗传标记或其编码产物(例如，蛋白质)。标记可以源自基因组核苷酸序列或源自表达的核苷酸序列(例如，源自剪接的RNA、cDNA等)，或者源自编码的多肽。术语“分子标记”还可以指代与标记序列互补或侧接标记序列的核酸序列，如用作能够扩增标记序列的探针或引物对的核酸。“分子标记探针”是可以用于鉴定标记基因座的存在的核酸序列或分子，例如与标记基因座序列互补的核酸探针。可替代地，标记探针是指能够区分存在于标记基因座处的特定等位基因(即，基因型)的任何类型的探针。
当核酸在溶液中特异性杂交(例如，根据沃森-克里克碱基配对规则)时，它们是“互补的”。本文所述的一些标记在位于插入缺失区(如本文所述的非共线区)上时也被称为杂交标记。这是因为根据定义，插入区相对于没有所述插入的植物而言是多态性。因此，标记仅需要指示插入缺失区是存在还是不存在。任何合适的标记检测技术都可以用于鉴定这样的杂交标记，例如在本文提供的例子中使用SNP技术。
如本文所用，“连锁(linked)”或“连锁(linkage)”(如与术语“可操作地连接”区分开)应当指代基因座或基因的遗传或物理连锁。如果如在单次减数分裂图谱上所确定的，基因座或基因之间的重组频率小于约50％，则认为它们是遗传连锁的。如果如在单次减数分裂图谱上所确定的，重组频率为约40％、约30％、约20％、约10％或更低，则它们逐渐更连锁。如果已经证明两个或更多个基因在单条DNA(如染色体)上，则它们是物理连锁的(或同线的)。实际上，遗传连锁的基因将是物理连锁的(或同线的)，但是确切的物理距离(核苷酸的数量)可能尚未得到证明。
如本文所用，“渗入(introgression)”或“渗入(introgressing)”应当指代通过以下方式将基因或基因座从一个品系移动到另一个品系：(1)将每个品系的个体杂交以产生群体；以及(2)选择携带所需基因或基因座的个体。选择可以在表型上进行，或者使用标记进行(标记辅助选择)。将如此选择的个体再次与所需靶品系杂交(即，回交)；可以进行两次、三次、四次、五次、六次或更多次或者甚至十次或更多次回交。在每次杂交后，重复选择过程。例如，实施方案的基因或含有所述基因的基因座可以渗入到对Cg(禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola))没有抗性或仅有部分抗性的轮回亲本中，这意味着所述轮回亲本对Cg敏感或易感或者部分敏感或易感。具有渗入的基因或基因座的轮回亲本品系然后具有增强的或新赋予的对Cg的抗性。炭疽茎腐病抗性基因座已经渗入其中的此品系在本文中被称为炭疽茎腐病抗性基因座转换体。
当渗入过程重复两次或更多次时，所述过程通常被称为“回交”。在渗入或回交中，“供体”亲本是指具有待渗入的所需基因或基因座的亲本植物。“受体”亲本(使用一次或多次)或“轮回”亲本(使用两次或更多次)是指基因或基因座将被渗入其中的亲本植物。例如，参见Ragot,M.等人,“Marker-assisted backcrossing:a practical example”,Techniques et Utilisations des Marqueurs Moleculaires Les Colloques,1995,第72卷,第45-56页和Openshaw等人,“Marker-assisted Selection in Backcross Breeding,Analysis of Molecular Marker Data”,1994,第41-43页。初次杂交产生F1代；术语“BC1”则是指轮回亲本的第二次使用，“BC2”是指轮回亲本的第三次使用，依此类推。
术语“病原体抗性”、“真菌抗性”和“病害抗性”旨在意指植物避免作为植物-病原体相互作用的结果的病害症状。也就是说，防止病原体引起植物病害和相关的病害症状，或者可替代地，最小化或减轻由病原体引起的病害症状，例如像减少胁迫和相关的产量损失。本领域技术人员将理解，本文公开的组合物和方法可以与本领域的可用于保护植物免受病原体侵袭的其他组合物和方法一起使用。
如本文所用，“真菌抗性”是指当与野生型植物对真菌病原体的抗性或耐受性相比时，对真菌病原体的抗性或耐受性增强。效果可以从对真菌病原体的影响的耐受性的略微提高(例如，部分抑制)到完全抗性使得植物不受真菌病原体的存在的影响而变化。针对特定真菌病原体或针对更广谱真菌病原体的提高水平的抗性构成了“增强的”或改善的真菌抗性。本公开文本的实施方案还将增强或改善真菌植物病原体抗性，使得植物对一种或多种真菌病原体的抗性将提高。术语“增强”是指改善、提高、放大、倍增、提升、增加等。在本文中，由于本文所述的4号和6号染色体处的基因座，本公开文本的植物被描述为对Cg的感染具有抗性，或者对Cg的感染具有“增强的抗性”。
如本文所用，当在指定核酸的上下文中使用时，术语“编码(encoding)”或“编码(encoded)”意指核酸包含指导核苷酸序列翻译成指定蛋白质所必需的信息。通过使用密码子来指定编码蛋白质所借助的信息。编码蛋白质的核酸可以在核酸的翻译区内包含非翻译序列(例如，内含子)，或者可以缺少此类间插非翻译序列(例如，如在cDNA中)。
“转化”是指将核酸片段转移到宿主生物体的基因组中，从而导致遗传稳定的遗传。含有转化的核酸片段的宿主生物体被称为“转基因”生物体。“宿主细胞”是指在其中进行重组DNA构建体的转化的细胞，并且可以包括酵母细胞、细菌细胞和植物细胞。植物转化方法的例子包括农杆菌介导的转化和粒子轰击技术。
“稳定转化”旨在意指引入植物中的核苷酸构建体整合到植物的基因组中，并且能够被其后代遗传。“瞬时转化”或“瞬时表达”旨在意指将多核苷酸引入到植物中而不整合到植物的基因组中，或者将多肽引入到植物中。
如本文所用，“核酸”包括对呈单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物的提及，并且除非另外限制，否则涵盖具有天然核苷酸的本质属性的已知类似物(例如，肽核酸)，因为它们以类似于天然存在的核苷酸的方式与单链核酸杂交。
术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用于指代氨基酸残基的聚合物。所述术语适用于一个或多个氨基酸残基是相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物。多肽可以由本文公开的核酸产生，或者通过使用标准分子生物学技术产生。例如，截短的蛋白质可以通过在适当的宿主细胞中表达重组核酸来产生，或者可替代地通过离体程序的组合(如蛋白酶消化和纯化)来产生。
如本文所用，关于指定的多核苷酸，“全长序列”意指具有天然序列的整个核酸序列。“天然序列”旨在意指内源序列，即在生物体的基因组中发现的非工程化序列。
“片段”是核苷酸序列的一部分或由其编码的氨基酸序列(和因此蛋白质)的一部分。核苷酸序列的片段可以编码蛋白质片段，其保留天然蛋白的生物活性，因此具有赋予植物真菌抗性的能力。可替代地，可用作杂交探针的核苷酸序列片段不一定编码保留生物活性的片段蛋白。因此，核苷酸序列的片段的范围可以从至少约15个核苷酸、约50个核苷酸、约100个核苷酸，直到编码实施方案的多肽的全长核苷酸序列。
术语“变体”旨在意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸内的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。可以这样构建实施方案的核酸的变体，使得保持开放阅读框。对于多核苷酸，保守变体包括由于遗传密码的简并性而编码实施方案的多肽之一的氨基酸序列的那些序列。变体多核苷酸还包括合成来源的多核苷酸，如例如通过使用定点诱变产生但仍编码实施方案的蛋白质的那些。通常，实施方案的特定多核苷酸的变体将与该特定多核苷酸具有至少约40％、约45％、约50％、约55％、约60％、约65％、约70％、约75％、约80％、约85％、约90％、约91％、约92％、约93％、约94％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高序列同一性，如通过本文别处所述的序列比对程序和参数所确定的。
如本文所用，“参考序列”是用作序列比较的基础的确定序列。参考序列可以是指定序列的子集或整体；例如，作为全长cDNA或基因序列的区段，或者完整cDNA或基因序列。
术语“比较窗口”是指多核苷酸序列的连续指定区段，其中为了两个多核苷酸的最佳比对，与参考序列(其不包含添加或缺失)相比，比较窗口中的多核苷酸序列可以包含添加或缺失(即，空位)。通常，比较窗口的长度为至少约20个连续核苷酸，并且任选地可以为约30、约40、约50、约100或更长。本领域技术人员理解，为了避免因在多核苷酸序列中包括空位所致的与参考序列的高相似性，通常引入空位罚分并从匹配数中减去空位罚分。
用于比较的序列比对方法是本领域熟知的。因此，可以使用数学算法确定任何两个序列之间的序列同一性百分比。
实施方案的核酸、多肽和标记可用于用以赋予或增强植物的真菌抗性的方法中。因此，本文公开的组合物和方法可用于鉴定对真菌病原体(如引起炭疽茎腐病的病原体)具有抗性的植物。
变体
本文所述的基因和多核苷酸可以包含在天然存在的序列以及突变形式中。同样，本文所述的蛋白质可以同时涵盖天然存在的蛋白质以及其变体和修饰形式。此类变体可以具有赋予或增强植物真菌病原体抗性的所需能力。
变体多核苷酸和蛋白质还可以包括源自诱变或重组程序(包括但不限于诸如DNA改组的程序)的序列和蛋白质。本领域技术人员可以设想将改变蛋白质所响应的病原体范围的修饰。通过这样的程序，可以操作一个或多个不同的蛋白质编码序列以产生具有所需特性的新蛋白质。以此方式，重组多核苷酸的文库由相关序列多核苷酸的群体产生，所述相关序列多核苷酸包含具有实质序列同一性并且可以在体外或体内同源重组的序列区域。例如，编码目的结构域的序列基序可以在本文所述的抗性基因与其他已知基因之间改组，以获得编码具有改善的目的特性(如增加的赋予或增强植物真菌病原体抗性的能力)的蛋白质的新基因。用于这样的DNA改组的策略是本领域已知的。参见例如，Stemmer,Proc.Natl.Acad.Sci.,1994,USA 91:10747-10751；Stemmer,Nature,1994,370:389-391；Crameri等人,Nature Biotech.,1997,15:436-438；Moore等人,J.Mol.Biol.,1997,272:336-347；Zhang等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1997,94:4504-4509；Crameri等人,Nature,1998,391:288-291；以及美国专利号5,605,793和5,837,458。
例如，本文公开的整个多核苷酸或者其一个或多个部分可以用作能够与相应的多核苷酸和信使RNA特异性杂交的探针。为了在各种条件下实现特异性杂交，此类探针包括独特的并且最佳地长度为至少约10个核苷酸、长度为至少约15个核苷酸或长度为至少约20个核苷酸的序列。此类探针可以用于通过PCR扩增来自所选生物体的相应多核苷酸。此技术可以用于从所需生物体中分离另外的编码序列，或者用作诊断测定来确定生物体中编码序列的存在。杂交技术包括对铺板DNA文库的杂交筛选。
此类序列的杂交可以在严格条件下进行。“严格条件”或“严格杂交条件”是探针将与其靶序列杂交到与其他序列相比可检测的更大程度(例如，比背景大至少2倍)的条件。严格条件是序列依赖性的，并且在不同情况下将是不同的。通过控制杂交和/或洗涤条件的严格性，可以通过同源探测来鉴定与探针100％互补的靶序列。可替代地，可以调整严格性条件以允许序列中的一些错配，从而通过异源探测检测较低程度的相似性。通常，探针的长度小于约1000个核苷酸，最佳地长度小于500个核苷酸。
本文所述的蛋白质可以以各种方式(包括氨基酸取代、缺失、截短和插入)改变。用于此类操作的方法是本领域公知的。例如，可以通过DNA中的突变来制备抗致病蛋白的氨基酸序列变体和片段。用于诱变和多核苷酸改变的方法是本领域熟知的。参见例如，Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:488-492；Kunkel等人(1987)Methods inEnzymol.154:367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编辑(1983)Techniquesin Molecular Biology(MacMillan Publishing Company,New York)和其中引用的参考文献。可以在通过引用并入本文的Dayhoff等人(1978)Atlas of Protein Sequence andStructure(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.)的模型中找到有关不影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指导。保守取代(如将一种氨基酸与具有相似特性的另一种氨基酸交换)可能是最佳的。
分子标记
分子标记可以用于各种植物育种应用中(参见Staub等人Hortscience,1996,31:729-741；和Tanksley,Plant Molecular Biology Reporter,1993,1:3-8)。为了检测重组，标记需要检测被监测群体内的差异或多态性。通过分子标记检测因多核苷酸序列差异所致的DNA水平上的差异(例如，SSR、RFLP、FLP、SNP)。基因组变异性可以具有任何起源，例如插入、缺失、复制、重复元件、点突变、重组事件或转座元件的存在和序列。分子标记可以源自基因组或表达的核酸(例如，EST)。EST通常在物种内是非常保守的，而其他DNA区域(通常是非编码的)倾向于积累多态性，因此在同一物种的个体之间可能更多变。大量的玉米分子标记是本领域已知的，并且是公开的或可从各种来源(如Maize GDB和亚利桑那基因组学研究所(Arizona Genomics Institute))获得。
标记辅助选择可以用于提高回交和渗入基因的效率。证明与影响所需表型性状的基因座连锁的分子标记可以为在植物群体里中选择所述性状提供有用的工具。在表型难以测定(例如，许多病害抗性性状)或者出现在植物发育的后期(例如，籽粒特征)的情况下尤其如此。由于DNA标记测定比田间表型分型更省力，并且占用的物理空间更少，因此可以测定大得多的群体，以增加找到具有从供体品系转移到受体品系的靶区段的重组体的机会。连锁越紧密，标记越有用，因为在标记与引起性状的基因之间发生重组的可能性较小。降低的重组率可以导致较少的假阳性。由于将需要双重组事件，具有侧接标记减少了将发生假阳性选择的机会。
可以产生各种类型的片段长度多态性或FLP标记。最常见的是，使用扩增引物来产生片段长度多态性。此类FLP标记在许多方面与SSR标记类似，不同之处在于由引物扩增的区域通常不是高度重复的区域。扩增区或扩增子在种质中仍将具有足够的变异性，这通常是因插入或缺失所致，使得由扩增引物产生的片段可以在多态个体中区分开，并且已知此类插入缺失在玉蜀黍中经常发生(Bhattramakki等人,Plant Mol Biol 2002,48,539-547)。术语“插入缺失”是指插入或缺失，其中一种品系可以被称为相对于第二品系具有插入，或者第二品系可以被称为相对于第一品系具有缺失。本文公开的MZA标记是已经被选择的扩增的FLP标记的例子，因为它们与Rcg1和Rcg1b基因靠得很近。
SNP标记检测单碱基对核苷酸取代。在所有分子标记类型中，SNP是最丰富的，因此具有提供最高遗传图谱分辨率的潜力(Bhattramakki等人,2002Plant Molecular Biology48:539-547)。可以在比SSR甚至更高的通量水平下测定SNP，如以超高通量的方式进行测定。几种方法可用于SNP基因型分型，包括但不限于杂交、引物延伸、寡核苷酸连接、核酸酶切割、微测序和编码球(coded sphere)。
序列内或跨连锁序列的多个SNP一起可以用于描述任何特定基因型的单体型。单体型可以比单个SNP更具信息性，并且可以更多地描述任何特定基因型。例如，对于MP305，单个SNP可以是等位基因“T”，但是等位基因“T”也可能出现在被用于轮回亲本的玉蜀黍育种群体中。在此情况下，单体型(例如在连锁的SNP标记处的一系列等位基因)可能更具信息性。一旦已经将独特的单体型分配给供体染色体区域，则该单体型就可以在该群体或其任何子集中使用，以确定个体是否具有特定基因。使用自动化高通量标记检测平台可以使此过程高效且有效。
本文所述的各种引物都可以用作FLP标记，以在玉米(Zea mays)的4号或6号染色体上选择炭疽茎腐病抗性基因座。示例性引物包括但不限于SEQ ID NO:95-118和120-125的那些。这些引物还可以用于在相同区域中将这些标记转化为SNP或其他在结构上相似或在功能上等效的标记(例如，SSR、CAP和插入缺失)。使用PCR，引物可以用于扩增来自代表目的群体中的多样性的个体(优选近交系)的DNA区段。可以在一个或两个方向上直接对PCR产物进行测序。然后可以比对所得序列并鉴定多态性。多态性不限于单核苷酸多态性(SNP)，而且包括插入缺失、CAP、SSR和VNTR(可变数目串联重复序列)。具体地，关于本文所述的精细图谱信息，可以容易地使用本文提供的信息来在由本公开文本中列出的引物扩增的区域内获得另外的多态SNP(和其他标记)。所描述图谱区内的标记可以与BAC或其他基因组文库杂交，或者与基因组序列电子比对，以在与所描述标记近似相同的位置中找到新序列。
核酸
在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:209的序列，和与SEQ IDNO:209的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:212的序列，和与SEQ ID NO:212的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:215的序列，和与SEQ ID NO:215的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:218的序列，和与SEQ ID NO:218的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:221的序列，和与SEQ ID NO:221的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:224的序列，和与SEQ ID NO:224的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:227的序列，和与SEQ ID NO:227的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:230的序列，和与SEQ ID NO:230的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:233的序列，和与SEQ ID NO:233的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:236的序列，和与SEQ ID NO:236的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:239的序列，和与SEQ ID NO:239的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:242的序列，和与SEQ ID NO:242的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:245的序列，和与SEQ ID NO:245的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:248的序列，和与SEQ ID NO:248的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:251的序列，和与SEQ ID NO:251的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:254的序列，和与SEQ ID NO:254的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:257的序列，和与SEQ ID NO:257的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:260的序列，和与SEQ ID NO:260的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:263的序列，和与SEQ ID NO:263的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:266的序列，和与SEQ ID NO:266的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:267的序列，和与SEQ ID NO:267的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:269的序列，和与SEQ ID NO:269的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:270的序列，和与SEQ ID NO:270的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:272的序列或其片段，和与SEQ ID NO:272的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列或其片段。
在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:1的序列，和与SEQ IDNO:1的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:20的序列，和与SEQ ID NO:20的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:23的序列，和与SEQ ID NO:23的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ IDNO:44的序列，和与SEQ ID NO:44的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含SEQ ID NO:47的序列，和与SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列。这些核酸中的任一种都可以包含来自玉米(Zea mays)的6号染色体上的抗性基因座的另外序列。还提供了包含所述核苷酸序列的玉蜀黍植物。在各种实施方案中，所述玉蜀黍植物比不包含所述核酸的可比玉蜀黍植物对茎腐病更具抗性。
在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:209互补的序列，或与和SEQ ID NO:209的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:212互补的序列，或与和SEQ IDNO:212的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:215互补的序列，或与和SEQ ID NO:215的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:218互补的序列，或与和SEQ ID NO:218的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:221互补的序列，或与和SEQ ID NO:221的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:224互补的序列，或与和SEQ ID NO:224的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:227互补的序列，或与和SEQ ID NO:227的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ IDNO:230互补的序列，或与和SEQ ID NO:230的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:233互补的序列，或与和SEQ ID NO:233的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:236互补的序列，或与和SEQ ID NO:236的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:239互补的序列，或与和SEQ IDNO:239的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:242互补的序列，或与和SEQ ID NO:242的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:245互补的序列，或与和SEQ ID NO:245的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:248互补的序列，或与和SEQ ID NO:248的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:251互补的序列，或与和SEQ ID NO:251的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:254互补的序列，或与和SEQ ID NO:254的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ IDNO:257互补的序列，或与和SEQ ID NO:257的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:260互补的序列，或与和SEQ ID NO:260的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:263互补的序列，或与和SEQ ID NO:263的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:266互补的序列，或与和SEQ IDNO:266的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:267互补的序列，或与和SEQ ID NO:267的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:269互补的序列，或与和SEQ ID NO:269的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:270互补的序列，或与和SEQ ID NO:270的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:272互补的序列，或与和SEQ ID NO:272的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:1互补的序列，或与和SEQ ID NO:1的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:20互补的序列，或与和SEQ ID NO:20的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:23互补的序列，或与和SEQ ID NO:23的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:44互补的序列，或与和SEQID NO:44的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。在一个方面，提供了以下核酸，所述核酸包含与SEQ ID NO:47互补的序列，或与和SEQ ID NO:47的核苷酸序列至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列互补的序列。这些核酸中的任一种都可以包含来自玉米(Zea mays)的6号染色体上的抗性基因座的另外序列。还提供了包含所述核苷酸序列的玉蜀黍植物。在各种实施方案中，所述玉蜀黍植物比不包含所述核酸的可比玉蜀黍植物对茎腐病更具抗性。在一些实施方案中，所述茎腐病是炭疽茎腐病。在一些实施方案中，所述茎腐病是镰孢菌茎腐病。
还提供了在严格条件下与任何以上核酸杂交的核酸。
在另一个方面，提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:211中任一个的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:211中任一个的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:214的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:214的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:217的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:217的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:220的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:220的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:223的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:223的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:226的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:226的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:229的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:229的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:232的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:232的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:235的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:235的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:238的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:238的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:241的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:241的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:244的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:244的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:247的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:247的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:250的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:250的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:253的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:253的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:256的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:256的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:259的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:259的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:262的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:262的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:265的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:265的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:268的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:268的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:271的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:271的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。
在另一个方面，提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:11-19中任一个的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:11-19中任一个的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:22的序列的蛋白质，或包含与包含SEQID NO:22的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:34-43中任一个的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:34-43中任一个的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:46的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:46的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。还提供了包含以下核苷酸序列的核酸，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:49的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:49的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。
在另一个方面，提供了以下核酸分子，所述核酸分子编码具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个单核苷酸多态性：
a.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
b.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
c.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
d.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
e.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
f.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
g.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
h.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
i.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
j.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，其中所述核酸分子编码能够在植物中赋予或提高对由真菌病原体引起的植物病害的抗性的多肽，所述多肽在所述植物中表达。
在玉米(Zea mays)的4号染色体上发现所述抗性等位基因。在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:120和121的引物、SEQ ID NO:122和123的引物或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子(例如，扩增子7)。在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生选自SEQID NO:94、101、106、109和114的扩增子(例如，扩增子2-6)。
还提供了包含以上核酸分子中的一种或多种的分离的或基本上纯化的多核苷酸组合物。“分离的”或“纯化的”多核苷酸或其生物活性部分基本上或实质上不含通常伴随所述多核苷酸或蛋白质或者与所述多核苷酸或蛋白质相互作用的组分，如在其天然存在的环境中所发现的。因此，分离的或纯化的多核苷酸在通过重组技术(例如PCR扩增)产生时基本上不含其他细胞材料或培养基，或者在化学合成时基本上不含化学前体或其他化学制品。最佳地，“分离的”多核苷酸不含在所述多核苷酸所来源的生物体的基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的序列(例如，蛋白质编码序列)(即，位于所述多核苷酸的5′和3′端的序列)。例如，在各种实施方案中，分离的多核苷酸可以含有少于约5kb、约4kb、约3kb、约2kb、约1kb、约0.5kb或约0.1kb的在所述多核苷酸所来源的细胞的基因组DNA中天然侧接所述多核苷酸的核苷酸序列。
表达盒
术语“重组构建体”、“表达盒”、“表达构建体”、“嵌合构建体”、“构建体”、“重组DNA构建体”和“重组DNA片段”在本文中可互换地使用，并且是核酸片段或者是指由核酸片段组装而成的构建体，所述核酸片段可以从不同的来源或生物体获得。重组构建体包含核酸片段的人工组合，所述核酸片段包括但不限于在自然界中未一起发现的调节和编码序列。例如，重组DNA构建体可以包含源自不同来源的调节序列和编码序列，或者源自相同来源并且以与在自然界中发现的方式不同的方式排列或可以根据本领域技术人员的需要组合的调节序列和编码序列。这样的构建体可以单独使用，或者可以与载体结合使用。如果使用载体，则载体的选择取决于将用于转化宿主细胞的方法，这是本领域技术人员所熟知的。合适的载体可以是质粒载体、病毒载体、粘粒、杆粒或人工染色体。此外，非限制性例子可以是根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的Ti质粒或源自植物病毒的病毒DNA载体。熟练技术人员清楚地知道为了成功地转化、选择和繁殖包含实施方案的任何分离的核酸片段的宿主细胞必须存在于载体上的遗传元件。可以通过扩增、DNA的Southern分析、mRNA表达的northern印迹分析、蛋白质表达的免疫印迹分析、表型分析等进行筛选以获得表现出多核苷酸或炭疽茎腐病抗性基因座的所需表达水平和模式的品系。
在各种方面，提供了包含本文所述的任何核酸和多核苷酸的表达盒。所述核酸或多核苷酸可以包含来自4号染色体上的抗性基因座的序列。所述核酸或多核苷酸可以包含来自6号染色体上的抗性基因座的序列。所述核酸或多核苷酸可以包含来自4号染色体上的抗性基因座和6号染色体上的抗性基因座两者的一个或多个序列。
在一些实施方案中，进一步提供了包含与实施方案的异源核苷酸序列可操作地连接的启动子的表达盒。实施方案的表达盒可用于产生转化的植物、植物细胞和微生物，以及用于实施本文公开的用于诱导植物真菌病原体抗性的方法。所述表达盒将包括与实施方案的多核苷酸可操作地连接的5′和3′调节序列。“可操作地连接”旨在意指两个或更多个元件之间的功能性连接。“调节序列”是指位于编码序列上游(5′非编码序列)、内部或下游(3′非编码序列)，并且可以影响相关编码序列的转录、RNA加工、稳定性或翻译的核苷酸。调节序列可以包括但不限于启动子、翻译前导序列、内含子和多腺苷酸化识别序列。例如，目的多核苷酸与调节序列(例如，启动子)之间的可操作连接是允许目的多核苷酸表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指代两个蛋白质编码区的连接时，可操作地连接指的是编码区在同一阅读框中。此外，所述盒可以含有至少一个待共转化到生物体中的另外基因。可替代地，可以在多个表达盒上提供所述一个或多个另外的基因。这样的表达盒提供有多个限制性位点和/或重组位点，用于插入编码抗致病性多肽的多核苷酸，以使其处于调节区的转录调节之下。此外，所述表达盒可以含有选择标记基因。
所述表达盒在转录的5′-3′方向上可以包括转录起始区(即，启动子)、翻译起始区、实施方案的多核苷酸、翻译终止区和任选地在宿主生物体中有功能的转录终止区。所述调节区(即，启动子、转录调节区和翻译终止区)和/或实施方案的多核苷酸对于宿主细胞或彼此而言可以是天然的/类似的。可替代地，所述调节区和/或实施方案的多核苷酸对于宿主细胞或彼此而言可以是异源的。如本文所用，关于序列，“异源”是源自外来物种的序列，或者如果来自相同物种，则通过故意的人为干预在组成和/或基因组基因座方面实质上从其天然形式修饰而来的序列。例如，与异源多核苷酸可操作地连接的启动子来自与所述多核苷酸所来源的物种不同的物种，或者如果来自相同/类似物种，则一者或两者实质上从其原始形式和/或基因组基因座修饰而来，或者所述启动子不是可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。
任选包括的终止区对于转录起始区而言可以是天然的，对于可操作地连接的目的多核苷酸而言可以是天然的，对于植物宿主而言可以是天然的，或者可以源自所述启动子、所述目的多核苷酸、所述宿主的另一种来源(即，对其而言是外来或异源的)，或其任何组合。便利的终止区可从根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒获得，如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。在特定实施方案中，使用马铃薯蛋白酶抑制剂II基因(PinII)终止子。参见例如，Keil等人,Nucl.Acids Res.,1986,14:5641-5650；和An等人,Plant Cell,1989,1:115-122，通过引用以其整体并入本文。
在实施方案的实践中可以使用多种启动子，包括目的多核苷酸序列的天然启动子。可以基于所需结果选择启动子。多种多样的植物启动子在通过引用并入本文的Potenza等人,In Vitro Cell Dev Biol—Plant,2004,40:1-22的最近综述中有讨论。例如，所述核酸可以与组成型的、组织优选的、病原体诱导型的或其他启动子组合，以在植物中表达。此类组成型启动子包括例如Rsyn7启动子的核心启动子。
从诱导型启动子、特别是从病原体诱导型启动子表达基因可能是有益的。此类启动子包括来自病原体感染后诱导的病程相关蛋白(PR蛋白)的那些；所述蛋白质例如PR蛋白、SAR蛋白、β-1,3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见WO 99/43819，将其通过引用以其整体并入本文。同样令人感兴趣的是导致在病原体感染部位处或附近局部表达蛋白质的启动子。特别令人感兴趣的是玉蜀黍PRms基因的诱导型启动子，所述基因的表达由病原体串珠镰孢菌(Fusarium moniliforme)诱导(参见例如，Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant.Path.41:189-200)。
此外，当病原体可通过伤口或虫害进入植物时，可以在实施方案的构建中使用伤口诱导型启动子。示例性伤口诱导型启动子包括但不限于马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因的启动子、wun1、wun2、win1、win2、WIP1和MPI。
化学调节启动子可以用于通过应用外源化学调节剂或试剂来调节基因在植物中的表达。根据目的，所述启动子可以是化学诱导型启动子(其中化学制品的应用诱导基因表达)或化学阻遏型启动子(其中化学制品的应用使基因表达受阻遏)。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于玉蜀黍In2-2启动子(其被苯磺酰胺除草剂安全剂激活)、玉蜀黍GST启动子(其被用作萌发前除草剂的疏水性亲电化合物激活)以及烟草PR-1a启动子(其被水杨酸激活)。其他目的化学调节启动子包括类固醇响应型启动子以及四环素诱导型和四环素阻遏型启动子。
组织特异性启动子可以用于靶向实施方案的多肽在特定植物组织内的增强表达。例如，组织特异性启动子可以用于在病害抗性特别重要的植物组织(例如像根、茎秆或叶)中表达多肽。如果必要，可以对此类启动子进行修饰以实现弱表达。维管组织优选的启动子是本领域已知的，并且包括选择性驱动例如木质部和韧皮部组织中的蛋白质表达的那些启动子。茎秆优选的启动子可以用于驱动实施方案的多肽的表达。示例性的茎秆优选的启动子包括玉蜀黍MS8-15基因启动子(参见例如，美国专利号5,986,174和国际公开号WO 98/00533)以及可见于Graham等人,(1997)Plant Mol Biol 33(4):729-735中的那些。
可以使用叶特异性启动子，如在以下文献中的任一个中描述的那些：Yamamoto等人Plant J.,1997,12(2):255-265；Kwon等人,Plant Physiol.,1994,105:357-67；Yamamoto等人,Plant Cell Physiol.,1994,35(5):773-778；Gotor等人,Plant J.,1993,3:509-18；Orozco等人,Plant Mol.Biol.,1993,23(6):1129-1138；和Matsuoka等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90(20):9586-9590。
可以使用根特异性启动子。示例性根特异性启动子包括大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因的启动子；法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.14(3):433-443(根癌农杆菌的甘露碱合酶(MAS)基因的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell 3(1):11-22(编码胞质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆的启动子，所述GS在大豆的根和根瘤中表达)。其他根特异性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子、rolB启动子。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179，将其全部通过引用而并入。
“种子优选的”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间活跃的那些启动子，如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽”启动子(在种子发芽期间活跃的那些启动子)两者。参见Thompson等人,(1989)BioEssays 10:108，通过引用并入本文。此类种子优选的启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信使)；cZ19B1(玉蜀黍19kDa玉米醇溶蛋白)；milps(肌-肌醇-1-磷酸合酶)(参见WO 00/11177和美国专利号6,225,529；通过引用并入本文)。γ-玉米醇溶蛋白启动子是优选的胚乳特异性启动子。Glob-1是优选的胚芽特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于豆β-菜豆蛋白、油菜籽蛋白(napin)、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白(cruciferin)等的启动子。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉蜀黍15kDa玉米醇溶蛋白、22kDa玉米醇溶蛋白、27kDa玉米醇溶蛋白、g-玉米醇溶蛋白、糯质基因(waxy)、超甜基因(shrunken)1、超甜基因2、球蛋白1等的启动子。还参见WO 00/12733，其中披露了来自end1和end2基因的种子优选的启动子；通过引用并入本文。
已知另外的序列修饰可增强细胞宿主中的基因表达。这些序列修饰包括消除编码假多腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复序列的序列以及其他此类可能对基因表达有害的充分表征的序列。可以将序列的G-C含量调整至给定细胞宿主的平均水平，如通过参考宿主细胞中表达的已知基因所计算的。在可能的情况下，对序列进行修饰以避免预测的发夹二级mRNA结构。
此外，表达盒可以含有5′前导序列。此类前导序列可以起到增强翻译的作用。翻译前导序列是本领域已知的，并且包括：小RNA病毒前导序列，例如EMCV前导序列(脑心肌炎病毒5′非编码区)(Elroy-Stein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:6126-6130)；马铃薯Y病毒前导序列，例如TEV前导序列(烟草蚀纹病毒)(Gallie等人,Gene,1995,165(2):233-238)、MDMV前导序列(玉米矮花叶病毒)和人免疫球蛋白重链结合蛋白(BiP)(Macejak等人,Nature,1991,353:90-94)；来自苜蓿花叶病毒(AMV RNA 4)外壳蛋白mRNA的未翻译前导序列(Jobling等人,Nature,1987,325:622-625)；烟草花叶病毒前导序列(TMV)(Gallie等人,Molecular Biology of RNA,编辑Cech(Liss,New York),1989,第237-256页)；以及玉米褪绿斑驳病毒前导序列(MCMV)(Lommel等人,Virology,1991,81:382-385)。还参见Della-Cioppa等人,Plant Physiol.,1987,84:965-968。还可以利用已知增强翻译的其他方法，例如内含子等。
在所述表达盒中，各种DNA片段可以被配置成处于正确的取向，并且适当时在正确的阅读框中。可以采用衔接子或接头来连接DNA片段。可以对表达盒进行其他修饰，以提供便利的限制性位点、去除多余的DNA、去除限制性位点等。为此，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如，转换和颠换)。
所述表达盒还可以包含用于选择转化细胞的选择标记基因。利用选择标记基因来选择转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的那些；以及赋予对除草化合物的抗性的基因，所述除草化合物如草胺磷、溴苯腈、咪唑啉酮和2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)。另外的选择标记包括表型标记，如β-半乳糖苷酶；以及荧光蛋白，如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人,BiotechnolBioeng,2004,85:610-9和Fetter等人,Plant Cell,2004,16:215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人,J.Cell Science,2004,117:943-54和Kato等人,Plant Physiol,2002,129:913-42)和黄色荧光蛋白(来自Evrogen的PHIYFPTM荧光蛋白，参见Bolte等人,J.CellScience,2004,117:943-54)。对于另外的选择标记，一般参见Yarranton,Curr.Opin.Biotech.,1992,3:506-511；Christopherson等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:6314-6318；Yao等人,Cell,1992,71:63-72；Reznikoff,Mol.Microbiol.,1992,6:2419-2422；Barkley等人,The Operon,1980,第177-220页；Hu等人,Cell,1987,48:555-566；Brown等人,Cell,1987,49:603-612；Figge等人(1988)Cell 52:713-722；Deuschle等人,Proc.Natl.Acad.Aci.USA,1989,86:5400-5404；Fuerst等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1989,86:2549-2553；Deuschle等人,Science,1990,248:480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis,University of Heidelberg；Reines等人Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1993,90:1917-1921；Labow等人,Mol.Cell.Biol.,1990,10:3343-3356；Zambretti等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:3952-3956；Baim等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1991,88:5072-5076；Wyborski等人,Nucleic Acids Res.,1991,19:4647-4653；Hillenand-Wissman,Topics Mol.Struc.Biol.,1989,10:143-162；Degenkolb等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1991,35:1591-1595；Kleinschnidt等人,Biochemistry,1988,27:1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis,University ofHeidelberg；Gossen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1992,89:5547-5551；Oliva等人,Antimicrob.Agents Chemother.,1992,36:913-919；Hlavka等人,Handbook ofExperimental Pharmacology,1985,第78卷(Springer-Verlag,Berlin)；Gill等人,Nature,1988,334:721-724。将此类公开内容通过引用并入本文。以上选择标记基因列表并不意在是限制性的。在实施方案中可以使用任何选择标记基因。
实施方案的基因可以表达为转基因，以便使植物对病原体(例如，引起茎腐病的那些)具有抗性。在一些实施方案中，所述茎腐病是炭疽茎腐病。在一些实施方案中，所述茎腐病是镰孢菌茎腐病。使用本文所述的各种不同的启动子可以允许在不同情况下以调节形式表达基因。例如，可能希望在茎秆中的表达水平更高，以增强对茎腐病的抗性。在叶枯病是个问题的环境中，可以使用在叶中具有较高表达水平的品系。然而，也可以将整个基因(天然启动子和编码序列两者)作为转基因插入。最后，使用实施方案的基因作为转基因将允许与其他性状(如昆虫或除草剂抗性)快速组合。
在某些实施方案中，实施方案的核酸序列可以与目的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以便产生具有所需表型的植物。这种堆叠可以通过DNA构建体内的基因组合来完成，或者通过与包含所述组合的另一种品系杂交来完成。例如，实施方案的多核苷酸可以与实施方案的任何其他多核苷酸或与其他基因堆叠。所产生的组合还可以包括目的多核苷酸中任一个的多个拷贝。实施方案的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因组合堆叠，以产生具有各种所需性状组合的植物，所述性状组合包括但不限于动物饲料所希望的性状，如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如hordothionin(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.165:99-106；和WO 98/20122)；和高甲硫氨酸蛋白(Pedersen等人,J.Biol.Chem.,1986,261:6279；Kirihara等人,Gene,1988,71:359；和Musumura等人,PlantMol.Biol.,1989,12:123))；增加的可消化性(例如，改性贮藏蛋白(美国专利号6,858,778)；和硫氧还蛋白(美国专利号7,009,087))，将其公开内容通过引用并入本文。实施方案的多核苷酸还可以与以下性状堆叠：昆虫、病害或除草剂抗性所希望的性状(例如，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)毒蛋白(美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；Geiser等人,Gene,1986,48:109)；凝集素(Van Damme等人,Plant Mol.Biol.,1994,24:825)；伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人,Science,1994,266:789；Martin等人,Science,1993,262:1432；Mindrinos等人,Cell,1994,78:1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂，如草丁瞵或basta(例如，bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因、GAT基因，如美国专利号7,462,481以及WO02/36782和WO03/092360中披露的那些))；以及加工或加工产品所希望的性状，如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合酶(SS)、淀粉分支酶(SBE)和淀粉脱分支酶(SDBE))；和聚合物或生物塑料(例如，美国专利号5,602,321；β-酮硫酶、聚羟基丁酸合酶和乙酰乙酰辅酶A还原酶(Schubert等人,J.Bacteriol.1988,170:5837-5847)促进聚羟基烷酸酯(PHA)的表达)，将其公开内容通过引用并入本文。还可以将实施方案的多核苷酸与提供以下性状的多核苷酸组合：农艺性状，如雄性不育(例如，参见美国专利号5,583,210)、茎秆强度、开花时间；或转化技术性状，如细胞周期调节或基因靶向(例如WO 99/61619；WO 00/17364；WO 99/25821)，将其公开内容通过引用并入本文。
这些堆叠的组合可以通过任何方法产生，包括但不限于通过任何常规或
育种方法将育种植物杂交或遗传转化。如果通过遗传转化植物来堆叠性状，则可以在任何时候以任何顺序组合目的多核苷酸序列。例如，包含一种或多种所需性状的转基因植物可以用作通过后续转化引入其他性状的靶标。可以与由转化盒的任何组合提供的目的多核苷酸同时以共转化方案引入性状。例如，如果将引入两个序列，则这两个序列可以包含在单独的转化盒中(反式)，或者包含在同一转化盒上(顺式)。序列的表达可以由相同的启动子或不同的启动子驱动。在某些情况下，可能希望引入将使目的多核苷酸的表达受阻遏的转化盒。这可以与其他阻遏盒或过表达盒的任何组合进行组合以在植物中产生所需的性状组合。
将多肽或多核苷酸引入到植物中
实施方案的方法可以涉及但不限于将多肽或多核苷酸引入到植物或植物细胞中。“引入”旨在意指向植物呈递多核苷酸。在一些实施方案中，将以这样的方式呈递所述多核苷酸，使得所述序列能够进入所述植物的细胞的内部，包括其潜在地插入到植物的基因组中。实施方案的方法不取决于用于将序列引入到植物中的特定方法，只要所述多核苷酸能够进入所述植物的至少一个细胞的内部。用于将多核苷酸引入到植物中的方法是本领域已知的，包括但不限于稳定转化方法、瞬时转化方法和病毒介导的方法。
在各种实施方案中，可以将以下多核苷酸中的一个或多个引入到所述植物中：
i.SEQ ID NO:209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266或269、优选SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267或270、优选SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271的序列的蛋白质、优选编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码与SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271的序列、优选与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在各种实施方案中，将以下多肽引入到所述植物中，所述多肽包含与SEQ IDNO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选与SEQ ID NO:268或271具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一性的序列。
转化方案以及用于将多肽或多核苷酸序列引入到植物中的方案可以根据靶向进行转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。将多肽和多核苷酸引入到植物细胞中的合适方法包括显微注射(Crossway等人,Biotechniques,1986,4:320-334)、电穿孔(Riggs等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1986,83:5602-5606)、农杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人,EMBO J.,1984,3:2717-2722)和弹道粒子加速(参见例如，Sanford等人,美国专利号4,945,050；5,879,918；5,886,244；和5,932,782；McCabe等人,Biotechnology,1988,6:923-926)；以及Lec1转化(WO 00/28058)。还参见Weissinger等人,Ann.Rev.Genet.,1988,22:421-477；Sanford等人,Particulate Science and Technology,1987,5:27-37(洋葱)；Christou等人,Plant Physiol.,1988,87:671-674(大豆)；McCabe等人,Bio/Technology,1988,6:923-926(大豆)；Finer和McMullen,In Vitro Cell Dev.Biol.,1991,27P:175-182(大豆)；Singh等人,Theor.Appl.Genet.,1998,96:319-324(大豆)；Datta等人,Biotechnology,1990,8:736-740(稻)；Klein等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1988,85:4305-4309(玉蜀黍)；Klein等人,Biotechnology,1988,6:559-563(玉蜀黍)；美国专利号5,240,855；5,322,783和5,324,646；Klein等人,Plant Physiol.,1988,91:440-444(玉蜀黍)；Fromm等人,Biotechnology,1990,8:833-839(玉蜀黍)；Hooykaas-Van Slogteren等人,Nature,1984,(London)311:763-764；美国专利号5,736,369；Bytebier等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,1987,84:5345-5349(百合科)；De Wet等人,The Experimental Manipulation of OvuleTissues,编辑Chapman等人(Longman,New York),1985,第197-209页(花粉)；Kaeppler等人,Plant Cell Reports,1990,9:415-418和Kaeppler等人,Theor.Appl.Genet.,1992,84:560-566(晶须介导的转化)；D'Halluin等人,Plant Cell,1992,4:1495-1505(电穿孔)；Li等人,Plant Cell Reports,1993,12:250-255及Christou和Ford,Annals of Botany,1995,75:407-413(稻)；Osjoda等人,Nature Biotechnology,1996,14:745-750(玉蜀黍，经由根癌农杆菌)；将其全部通过引用并入本文。
用于在植物基因组中的特定位置处靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施方案中，使用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所需基因组位置处的插入。参见例如，WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853，将其全部通过引用并入本文。简而言之，实施方案的多核苷酸可以包含在侧接两个不同的重组位点的转移盒中。将所述转移盒引入到植物或植物细胞中，所述植物或植物细胞已经稳定地将靶位点掺入到其基因组中，所述靶位点侧接与转移盒的位点相对应的两个不同的重组位点。提供了适当的重组酶，并且将所述转移盒整合在靶位点处。然后可以将目的多核苷酸从转移盒整合到植物基因组中的特定染色体位置。
可以按照常规方法使已经转化的细胞生长成植物。参见例如，McCormick等人,Plant Cell Reports,1986,5:81-84。然后可以使这些植物生长并用相同的转化品系或不同的品系授粉，并且鉴定具有所需表型特征的组成型表达的所得后代。可以生长两代或更多代，以确保稳定地维持和遗传所需表型特征的表达，然后收获种子，以确保已经实现所需表型特征的表达。以此方式，所述实施方案提供了转化的种子(也称为“转基因种子”)，其具有稳定地掺入到其基因组中的实施方案的核苷酸构建体，例如实施方案的表达盒。
这些实施方案可以用于在植物、尤其是玉米(corn/Zea mays)中赋予或增强真菌植物病原体抗性或保护免受真菌病原体侵袭。可以保护植物的不同部分免受病原体的侵袭，所述部分包括但不限于茎秆、穗、叶、根和雄穗。在实施本公开文本的实施方案中，其他植物物种也可以是令人感兴趣的，包括但不限于其他单子叶植物作物植物。
在适当的情况下，可以优化多核苷酸以增加转化生物中的表达。例如，可以使用植物优选的密码子合成多核苷酸以改善表达。用于合成植物优选的基因的方法在本领域是可获得的。参见例如，美国专利号5,380,831和5,436,391以及Murray等人,Nucleic AcidsRes.,1989,17:477-498，通过引用并入本文。
本文所述的实施方案可以有效地对抗各种植物病原体，特别是真菌病原体，例如像禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola Ces.Wils.，Cg)、轮枝镰孢菌和相关物种。本公开文本的实施方案还可以有效地对抗玉蜀黍茎腐病，包括炭疽茎腐病，其中病原体是禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola Ces.Wils.)、轮枝镰孢菌和相关物种。在一些实施方案中，所述茎腐病是镰孢菌茎腐病。
因此，实施方案的方法可以用于保护植物免受病害，特别是由植物真菌病原体引起的那些病害。当与野生型植物对真菌病原体的抗性或耐受性相比时，真菌抗性可以提供对真菌病原体的增强的抗性或耐受性。效果可以从对真菌病原体的影响的耐受性的略微提高(例如，部分抑制)到完全抗性使得植物不受真菌病原体的存在的影响而变化。针对特定真菌病原体或针对更广谱真菌病原体的提高水平的抗性构成了“增强的”或改善的真菌抗性。本公开文本的实施方案还将增强或改善真菌植物病原体抗性，使得植物对一种或多种真菌病原体的抗性将提高。术语“增强”是指改善、提高、放大、倍增、提升、增加等。在本文中，由于如本文所述的在4号和6号染色体处赋予植物抗性的基因座，本公开文本的植物被描述为对真菌如禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola Ces.Wils.)、轮枝镰孢菌和相关物种的感染具有抗性，或者对禾生炭疽菌(Colletotrichum graminicola Ces.Wils.)、轮枝镰孢菌和相关物种的感染具有“增强的抗性”。抗性可以仅由4号染色体处的基因座提供。抗性可以仅由6号染色体处的基因座提供。抗性可以由4号染色体处的基因座和6号染色体处的基因座一起提供。
鉴定和选择对茎腐病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法
在一个方面，提供了鉴定对炭疽茎腐病表现出增强的抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测
a.在6号染色体上的抗性基因座处至少两个标记的存在，所述抗性基因座包含C16759-001-K1处的“G”和以下单核苷酸多态性之一：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
b.在6号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，所述抗性基因座包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个，和/或
c.在4号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，其中所述抗性基因座包含具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个单核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，
其中(a)的所述至少两个标记和/或(b)的所述至少一个标记与6号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联，并且(c)的所述至少一个标记与4号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。在各种实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-104102206与PZE-104132759之间的染色体区间上。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。在各种实施方案中，6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266或269、优选SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267或270、优选SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271的序列、优选SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码与SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271的序列、优选与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:1、20、23、44或47的核苷酸序列，
ii.与来自i.的序列互补的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
iv.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
v.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vi.编码包含SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
vii.编码与SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:120和121的引物、SEQ ID NO:122和123的引物或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子(扩增子7)。
在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114(分别地，来自扩增子2-6中的每一个)的扩增子。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。在各种实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A或NC342。在各种实施方案中，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中既检测(A)如上文在b.下所定义的在6号染色体上的所述抗性基因座处至少一个等位基因的存在或不存在，又检测(B)如上文在c.下所定义的在4号染色体上的所述抗性基因座处至少一个标记的存在或不存在。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测C16759-001-K1处的“G”。
在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测表13中所列出的变体核苷酸多态性中的至少一个。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测以下的变体核苷酸多态性中的至少一个：与B73AGPv04参考基因组序列的6号染色体上的一个或多个位置相比，6号染色体上的位置132836954处的“A”、6号染色体上的位置132836944处的“T”、6号染色体上的位置132836869处的“A”、6号染色体上的位置132836849处的“T”、6号染色体上的位置132836845处的“T”、6号染色体上的位置132836840处的“G”、6号染色体上的位置132836830处的“T”、6号染色体上的位置132836810处的“A”、6号染色体上的位置132836805处的“CA”、6号染色体上的位置132836802处的“ATC”的缺失、6号染色体上的位置132836799处的“ATT”的缺失、6号染色体上的位置132836791处的“A”、6号染色体上的位置132836787处的“CTG”、6号染色体上的位置132836781处的“GA”、6号染色体上的位置132836776处的“T”、6号染色体上的位置132836767处的“AG”、6号染色体上的位置132836762处的“A”、6号染色体上的位置132836679处的“CGCCAA”的插入和“A”、6号染色体上的位置132836678处的“A”、6号染色体上的位置132836670处的“G”、6号染色体上的位置132836667处的“T”、6号染色体上的位置132836665处的“A”、6号染色体上的位置132836662处的“C”、6号染色体上的位置132836660处的“T”、6号染色体上的位置132836651处的“G”、6号染色体上的位置132836643处的“AAT”的缺失、6号染色体上的位置132836636处的“GCCATG”的缺失、6号染色体上的位置132836622处的“AG”、6号染色体上的位置132836620处的“AC”、6号染色体上的位置132836612处的“G”、6号染色体上的位置132836603处的“G”、6号染色体上的位置132836591处的“C”、6号染色体上的位置132836586处的“A”、6号染色体上的位置132836580处的“G”、6号染色体上的位置132836069处的“A”、6号染色体上的位置132836063处的“A”、6号染色体上的位置132836061处的“G”、6号染色体上的位置132836056处的“G”、6号染色体上的位置132836050处的“C”、6号染色体上的位置132836047处的“CGT”、6号染色体上的位置132836034处的“G”、6号染色体上的位置132836031处的“G”、6号染色体上的位置132836019处的“T”、6号染色体上的位置132836008处的“G”、6号染色体上的位置132835978处的“G”、6号染色体上的位置132835910处的“G”、6号染色体上的位置132835851处的“G”、6号染色体上的位置132835819处的“C”、6号染色体上的位置132835803处的“G”、6号染色体上的位置132835793处的“T”、6号染色体上的位置132835788处的“C”、6号染色体上的位置132835781处的“A”、6号染色体上的位置132835779处的“A”、6号染色体上的位置132835776处的“T”、6号染色体上的位置132835746处的“G”、6号染色体上的位置132835729处的“A”、6号染色体上的位置132835728处的“C”、6号染色体上的位置132835722处的“GACATC”的插入、6号染色体上的位置132835713处的“T”、6号染色体上的位置132835708处的“GAA”的缺失、6号染色体上的位置132835705处的“ATA”的缺失、6号染色体上的位置132835702处的“GAT”的缺失、6号染色体上的位置132835693处的“G”、6号染色体上的位置132835681处的“T”、6号染色体上的位置132835671处的“C”、6号染色体上的位置132835666处的“T”、6号染色体上的位置132835271处的“A”、6号染色体上的位置132835267处的“GG”、6号染色体上的位置132835147处的“T”、6号染色体上的位置132835031处的“C”、6号染色体上的位置132834960处的“A”、6号染色体上的位置132834951处的“A”、6号染色体上的位置132834946处的“AC”、6号染色体上的位置132834942处的“A”、6号染色体上的位置132834929处的“A”、6号染色体上的位置132834927处的“T”、6号染色体上的位置132834924处的“A”、6号染色体上的位置132834919处的“C”、6号染色体上的位置132834908处的“T”、6号染色体上的位置132834899处的“A”、6号染色体上的位置132834754处的“C”、6号染色体上的位置132834753处的“C”、6号染色体上的位置132834748处的“C”、6号染色体上的位置132834721处的“A”、6号染色体上的位置132834632处的“A”、6号染色体上的位置132834622处的“C”、6号染色体上的位置132834615处的“G”、6号染色体上的位置132834602处的“C”、6号染色体上的位置132834589处的“G”、6号染色体上的位置132834581处的“T”、6号染色体上的位置132834577处的“A”、6号染色体上的位置132834569处的“G”、6号染色体上的位置132834539处的“C”、6号染色体上的位置132834532处的“GAG”、6号染色体上的位置132834494处的“T”、6号染色体上的位置132834431处的“T”、6号染色体上的位置132834389处的“G”、6号染色体上的位置132834208处的“T”、6号染色体上的位置132831963处的“T”、6号染色体上的位置132831924处的“G”、6号染色体上的位置132831915处的“A”、6号染色体上的位置132831839处的“G”、6号染色体上的位置132829096处的“T”、6号染色体上的位置132828997处的“A”、6号染色体上的位置132828958处的“G”、6号染色体上的位置132828950处的“G”、6号染色体上的位置132828867处的“C”、6号染色体上的位置132827606处的“A”、6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入、6号染色体上的位置132827573处的“T”、6号染色体上的位置132827566处的“G”、6号染色体上的位置132827549处的“A”、6号染色体上的位置132827545处的“TAT”、6号染色体上的位置132827302处的“C”、6号染色体上的位置132826983处的“T”、6号染色体上的位置132826940处的“T”、6号染色体上的位置1333040380处的“T”、6号染色体上的位置1333040382处的“C”、6号染色体上的位置133040760处的“T”。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记选自SEQ ID NO:273至407。
在各种实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测以下的核苷酸多态性：SEQ ID NO:50中的位置413处的“C”、SEQ ID NO:50中的位置958处的“C”、SEQ ID NO:50中的位置971处的“C”、SEQ ID NO:50中的位置1099处的“T”、SEQ ID NO:50中的位置1154处的“A”、SEQ ID NO:50中的位置1250处的“T”、SEQ ID NO:50中的位置1607处的“G”、SEQ ID NO:50中的位置2001处的“G”、SEQ ID NO:50中的位置2598处的“A”或SEQ ID NO:50中的位置3342处的“A”。
至少一个核苷酸多态性的存在或不存在可以通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增包含本文所述的单核苷酸多态性中的一个或多个的核酸序列。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置413处的“C”，并且所述引物可以包含序列GTACCATGTGACCA(SEQ ID NO:406)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:58的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置1099处的“T”，并且所述引物可以包含序列GTAGTGTTTTGAC(SEQ ID NO:407)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:61的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ IDNO:50中的位置1250处的“T”，并且所述引物可以包含序列TGATCTCAAAGAT(SEQ ID NO:408)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:64的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置1607处的“G”，并且所述引物可以包含序列GTTATGTGCACAA(SEQ IDNO:409)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:67的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置2001处的“G”，并且所述引物可以包含序列AGATGAAGGCTGT(SEQID NO:410)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:70的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置2598处的“A”，并且所述引物可以包含序列AAGTGACATGCAG(SEQ ID NO:411)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:73的序列的引物。所述单核苷酸多态性可以是SEQ ID NO:50中的位置3342处的“A”，并且所述引物可以包含序列CATCTGATGAAAGC(SEQ ID NO:412)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:76的序列的引物。
在一些实施方案中，包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增所述等位基因的核酸序列。在一些实施方案中，所述引物包含序列AATTATGCTGATGA(SEQ ID NO:413)。这样的引物的例子是包含SEQ ID NO:85的序列的引物。
在另一个方面，提供了选择具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括根据任何上述方法鉴定所述玉蜀黍植物，以及如果检测到6号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记和/或4号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记的存在或不存在，则将所述玉蜀黍植物选择为具有炭疽茎腐病抗性。可以选择包含至少一个另外的标记等位基因的玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与所述一个或多个核苷酸多态性紧密连锁且关联。所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上可以以不超过2cM与所述核苷酸多态性连锁。所述方法可以进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁且关联。所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上可以以不超过2cM与包含C16759-001-K1处的“G”的等位基因连锁。所述另外的标记等位基因可以与包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个的等位基因连锁。
在各种实施方案中，所述方法进一步包括将所鉴定的玉蜀黍植物与另一株玉蜀黍植物回交，优选包括将6号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A的基因型中和/或将4号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A或NC342的基因型中。
在一个方面，提供了选择对炭疽茎腐病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法。获得在其基因组内包含单体型的第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下的一个或多个多态性：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”，和/或
xi.C16759-001-K1处的“G”；和/或
xii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836954处的“A”，优选通过SEQ IDNO:273的标记序列可检测，
xiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836944处的“T”，优选通过SEQ IDNO:274的标记序列可检测，
xiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836869处的“A”，优选通过SEQ IDNO:275的标记序列可检测，
xv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836849处的“T”，优选通过SEQ IDNO:276的标记序列可检测，
xvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836845处的“T”，优选通过SEQ IDNO:277的标记序列可检测，
xvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836840处的“G”，优选通过SEQ IDNO:278的标记序列可检测，
xviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836830处的“T”，优选通过SEQ IDNO:279的标记序列可检测，
xix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836810处的“A”，优选通过SEQ IDNO:280的标记序列可检测，
xx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836805处的“CA”，优选通过SEQ IDNO:281和/或282的标记序列可检测，
xxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836802处的“ATC”的缺失，优选通过SEQ ID NO:283和/或284的标记序列可检测，
xxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836799处的“ATT”的缺失，优选通过SEQ ID NO:283和/或284的标记序列可检测，
xxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836791处的“A”，优选通过SEQ IDNO:285的标记序列可检测，
xxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836787处的“CTG”，优选通过SEQID NO:286和/或287的标记序列可检测，
xxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836781处的“GA”，优选通过SEQ IDNO:288和/或289的标记序列可检测，
xxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836776处的“T”，优选通过SEQ IDNO:290的标记序列可检测，
xxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836767处的“AG”，优选通过SEQID NO:291和/或292的标记序列可检测，
xxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836762处的“A”，优选通过SEQID NO:293的标记序列可检测，
xxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836679处的“CGCCAA”的插入和“A”，优选通过SEQ ID NO:294和/或295的标记序列可检测，
xxx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836678处的“A”，优选通过SEQ IDNO:296的标记序列可检测，
xxxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836670处的“G”，优选通过SEQ IDNO:297的标记序列可检测，
xxxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836667处的“T”，优选通过SEQ IDNO:298的标记序列可检测，
xxxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836665处的“A”，优选通过SEQID NO:299的标记序列可检测，
xxxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836662处的“C”，优选通过SEQ IDNO:300的标记序列可检测，
xxxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836660处的“T”，优选通过SEQ IDNO:301的标记序列可检测，
xxxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836651处的“G”，优选通过SEQ IDNO:302的标记序列可检测，
xxxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836643处的“AAT”的缺失，优选通过SEQ ID NO:303和/或304的标记序列可检测，
xxxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836636处的“GCCATG”的缺失，优选通过SEQ ID NO:305和/或306的标记序列可检测，
xxxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836622处的“AG”，优选通过SEQID NO:307和/或308的标记序列可检测，
xl.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836620处的“AC”，优选通过SEQ IDNO:309和/或310的标记序列可检测，
xli.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836612处的“G”，优选通过SEQ IDNO:311的标记序列可检测，
xlii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836603处的“G”，优选通过SEQ IDNO:312的标记序列可检测，
xliii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836591处的“C”，优选通过SEQ IDNO:313的标记序列可检测，
xliv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836586处的“A”，优选通过SEQ IDNO:314的标记序列可检测，
xlv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836580处的“G”，优选通过SEQ IDNO:315的标记序列可检测，
xlvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836069处的“A”，优选通过SEQ IDNO:316的标记序列可检测，
xlvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836063处的“A”，优选通过SEQ IDNO:317的标记序列可检测，
xlviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836061处的“G”，优选通过SEQID NO:318的标记序列可检测，
xlix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836056处的“G”，优选通过SEQ IDNO:319的标记序列可检测，
l.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836050处的“C”，优选通过SEQ ID NO:320的标记序列可检测，
li.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836047处的“CGT”，优选通过SEQ IDNO:321和/或322的标记序列可检测，
lii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836034处的“G”，优选通过SEQ IDNO:323的标记序列可检测，
liii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836031处的“G”，优选通过SEQ IDNO:324的标记序列可检测，
liv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836019处的“T”，优选通过SEQ IDNO:325的标记序列可检测，
lv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836008处的“G”，优选通过SEQ IDNO:326的标记序列可检测，
lvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835978处的“G”，优选通过SEQ IDNO:327的标记序列可检测，
lvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835910处的“G”，优选通过SEQ IDNO:328的标记序列可检测，
lviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835851处的“G”，优选通过SEQ IDNO:329的标记序列可检测，
lix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835819处的“C”，优选通过SEQ IDNO:330的标记序列可检测，
lx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835803处的“G”，优选通过SEQ IDNO:331的标记序列可检测，
lxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835793处的“T”，优选通过SEQ IDNO:332的标记序列可检测，
lxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835788处的“C”，优选通过SEQ IDNO:333的标记序列可检测，
lxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835781处的“A”，优选通过SEQ IDNO:334的标记序列可检测，
lxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835779处的“A”，优选通过SEQ IDNO:335的标记序列可检测，
lxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835776处的“T”，优选通过SEQ IDNO:336的标记序列可检测，
lxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835746处的“G”，优选通过SEQ IDNO:337的标记序列可检测，
lxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835729处的“A”，优选通过SEQ IDNO:338的标记序列可检测，
lxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835728处的“C”，优选通过SEQID NO:339的标记序列可检测，
lxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835722处的“GACATC”的插入，优选通过SEQ ID NO:340和/或341的标记序列可检测，
lxx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835713处的“T”，优选通过SEQ IDNO:342的标记序列可检测，
lxxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835708处的“GAA”的缺失，优选通过SEQ ID NO:343和/或344的标记序列可检测，
lxxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835705处的“ATA”的缺失，优选通过SEQ ID NO:343和/或344的标记序列可检测，
lxxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835702处的“GAT”的缺失，优选通过SEQ ID NO:343和/或344的标记序列可检测，
lxxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835693处的“G”，优选通过SEQ IDNO:345的标记序列可检测，
lxxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835681处的“T”，优选通过SEQ IDNO:346的标记序列可检测，
lxxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835671处的“C”，优选通过SEQ IDNO:347的标记序列可检测，
lxxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835666处的“T”，优选通过SEQID NO:348的标记序列可检测，
lxxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835271处的“A”，优选通过SEQID NO:349的标记序列可检测，
lxxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835267处的“GG”，优选通过SEQID NO:350和/或351的标记序列可检测，
lxxx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835147处的“T”，优选通过SEQ IDNO:352的标记序列可检测，
lxxxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835031处的“C”，优选通过SEQ IDNO:353的标记序列可检测，
lxxxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834960处的“A”，优选通过SEQID NO:354的标记序列可检测，
lxxxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834951处的“A”，优选通过SEQID NO:355的标记序列可检测，
lxxxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834946处的“AC”，优选通过SEQID NO:356和/或357的标记序列可检测，
lxxxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834942处的“A”，优选通过SEQ IDNO:358的标记序列可检测，
lxxxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834929处的“A”，优选通过SEQID NO:359的标记序列可检测，
lxxxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834927处的“T”，优选通过SEQID NO:360的标记序列可检测，
lxxxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834924处的“A”，优选通过SEQID NO:361的标记序列可检测，
lxxxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834919处的“C”，优选通过SEQID NO:362的标记序列可检测，
xc.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834908处的“T”，优选通过SEQ IDNO:363的标记序列可检测，
xci.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834899处的“A”，优选通过SEQ IDNO:364的标记序列可检测，
xcii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834754处的“C”，优选通过SEQ IDNO:365的标记序列可检测，
xciii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834753处的“C”，优选通过SEQ IDNO:366的标记序列可检测，
xciv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834748处的“C”，优选通过SEQ IDNO:367的标记序列可检测，
xcv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834721处的“A”，优选通过SEQ IDNO:368的标记序列可检测，
xcvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834632处的“A”，优选通过SEQ IDNO:369的标记序列可检测，
xcvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834622处的“C”，优选通过SEQ IDNO:370的标记序列可检测，
xcviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834615处的“G”，优选通过SEQID NO:371的标记序列可检测，
xcix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834602处的“C”，
c.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834589处的“G”，优选通过SEQ ID NO:372的标记序列可检测，
ci.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834581处的“T”，优选通过SEQ IDNO:373的标记序列可检测，
cii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834577处的“A”，优选通过SEQ IDNO:374的标记序列可检测，
ciii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834569处的“G”，优选通过SEQ IDNO:375的标记序列可检测，
civ.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834539处的“C”，优选通过SEQ IDNO:376的标记序列可检测，
cv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834532处的“GAG”，优选通过SEQ IDNO:377和/或378的标记序列可检测，
cvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834494处的“T”，优选通过SEQ IDNO:379的标记序列可检测，
cvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834431处的“T”，优选通过SEQ IDNO:380的标记序列可检测，
cviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834389处的“G”，优选通过SEQ IDNO:381的标记序列可检测，
cix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834208处的“T”，优选通过SEQ IDNO:382的标记序列可检测，
cx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831963处的“T”，优选通过SEQ IDNO:383的标记序列可检测，
cxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831924处的“G”，优选通过SEQ IDNO:384的标记序列可检测，
cxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831915处的“A”，优选通过SEQ IDNO:385的标记序列可检测，
cxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831839处的“G”，优选通过SEQ IDNO:386的标记序列可检测，
cxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132829096处的“T”，优选通过SEQ IDNO:387的标记序列可检测，
cxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828997处的“A”，优选通过SEQ IDNO:388的标记序列可检测，
cxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828958处的“G”，优选通过SEQ IDNO:389的标记序列可检测，
cxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828950处的“G”，优选通过SEQ IDNO:390的标记序列可检测，
cxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828867处的“C”，优选通过SEQID NO:391的标记序列可检测，
cxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827606处的“A”，优选通过SEQ IDNO:392的标记序列可检测，
cxx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入，优选通过SEQ ID NO:393和/或394的标记序列可检测，
cxxi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827573处的“T”，优选通过SEQ IDNO:395的标记序列可检测，
cxxii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827566处的“G”，优选通过SEQ IDNO:396的标记序列可检测，
cxxiii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827549处的“A”，优选通过SEQID NO:397的标记序列可检测，
cxxiv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827545处的“TAT”，优选通过SEQID NO:398和/或399的标记序列可检测，
cxxv.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827302处的“C”，优选通过SEQ IDNO:400的标记序列可检测，
cxxvi.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826983处的“T”，优选通过SEQ IDNO:401的标记序列可检测，
cxxvii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826940处的“T”，优选通过SEQID NO:402的标记序列可检测，
cxxviii.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040380处的“T”，优选通过SEQID NO:403的标记序列可检测，
cxxix.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040382处的“C”，优选通过SEQID NO:404的标记序列可检测，或
cxxx.参考B73AGPv04的6号染色体上的位置133040760处的“T”，优选通过SEQ IDNO:405的标记序列可检测。
将所述第一玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交。评价后代植物的以上单体型或与和所述第二玉蜀黍植物杂交的所述第一玉蜀黍植物中的单体型连锁且关联的至少一个标记等位基因。选择具有所述第一玉蜀黍植物中的单体型的后代植物。
在一些实施方案中，获得所述第一玉蜀黍植物，并且所述第一玉蜀黍植物在其基因组内包含含有C16759-001-K1处的“G”以及任选地C12305-001-K1处的“C”、C12307-001-K1处的“C”、C16760-001-K1处的“G”和C12314-001-K1处的“A”中的一个或多个的单体型，和/或含有表13中所列举的变体核苷酸多态性的单体型，和/或含有以下中的一个或多个的单体型：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
还提供了根据任何以上方法选择的玉蜀黍植物。
用定点核酸酶修饰植物
本公开文本提供了用于产生具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
(a)将本文所述的任何核酸分子或本文所述的任何表达盒引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；或
(b.1)将定点核酸酶和修复基质引入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中，其中所述定点核酸酶能够在所述至少一个细胞的基因组中产生至少一个DNA双链断裂，并且所述修复基质包含本文所述的目的核酸分子和/或核酸序列；以及
(b.2)在允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养(b.1)的所述至少一个细胞，其中所述核酸分子从所述修复基质整合到所述玉蜀黍植物的基因组中；或
(c.1)引入定点核酸酶，其中所述定点核酸酶能够在所述至少一个细胞的基因组中产生至少一个DNA单链断裂，并且任选地所述修复基质包含本文所述的目的核酸分子和/或核酸序列；以及
(c.2)在允许引入本文所述的本公开文本的赋予炭疽茎腐病抗性的基因的至少一个单核苷酸多态性或允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养(c.1)的所述至少一个细胞，其中所述核酸分子从所述修复基质整合到所述玉蜀黍植物的基因组中；以及
(d)从所述至少一个细胞获得具有炭疽茎腐病抗性的所述植物。
在各种实施方案中，所述位点特异性核酸酶包括锌指核酸酶，转录激活因子样效应物核酸酶，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/MAD7系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统在内的CRISPR/Cas系统，引导编辑系统，基于CRISPR的碱基编辑器系统，工程化归巢核酸内切酶和大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段。如本文所用的位点特异性核酸酶还可以包括具有切口酶活性的突变变体(像nCas9)和/或具有非功能性的突变变体(如像dCas9的核酸酶)。
CRISPR系统(例如，CRISPR/Cas、CRISPR/Cas9、CRISPR/Cpf1、CRISPR/MAD7、CRISPR/CasX或CRISPR/CasY)在其自然环境中描述了分子复合物，其包含至少一种小的单独的非编码RNA与Cas核酸酶或另一种CRISPR核酸酶(像Cpf1核酸酶)的组合，所述核酸酶可以产生特异性DNA双链断裂。目前，CRISPR系统分为两类，包括五种类型的CRISPR系统，例如使用Cas9作为效应物的II型系统和使用Cpf1作为效应分子的V型系统。在人工CRISPR系统中，合成的非编码RNA和CRISPR核酸酶和/或任选地修饰的CRISPR核酸酶(经修饰以充当切口酶或缺乏任何核酸酶功能)可以与组合crRNA和/或tracrRNA的功能的至少一种合成或人工指导RNA或gRNA组合使用(Makarova等人,2015,同上)。由CRISPR/Cas在自然系统中介导的免疫反应需要CRISPR-RNA(crRNA)，其中控制CRISPR核酸酶的特异性激活的此指导RNA的成熟在迄今已经表征的各种CRISPR系统之间差异很大。首先，入侵DNA(也称为间隔子)整合在CRISPR基因座近端的两个相邻重复区域之间。例如，II型CRISPR系统可以编码Cas9核酸酶作为干扰步骤的关键酶，所述系统既含有crRNA，又含有反式激活RNA(tracrRNA)作为指导基序。这些杂交并形成双链(ds)RNA区域，所述区域被RNAseIII识别并且可以被切割，以便形成成熟的crRNA。然后这些又与Cas分子缔合，以便将核酸酶特异性引导到靶核酸区域。重组gRNA分子可以既包含可变DNA识别区，又包含Cas相互作用区，因此可以独立于特定的靶核酸和所需的Cas核酸酶进行特异性设计。作为另一安全机制，PAM(原型间隔子邻近基序)必须存在于靶核酸区域中；这些是直接从Cas9/RNA复合物识别的DNA继续下去的DNA序列。来自化脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的Cas9的PAM序列已经被描述为“NGG”或“NAG”(标准IUPAC核苷酸代码)(Jinek等人,″A programmable dual-RNA-guided DNAendonuclease in adaptive bacterial immunity″,Science 2012,337:816-821，通过引用以其整体并入本文)。来自金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)的Cas9的PAM序列是“NNGRRT”或“NNGRR(N)”。其他变体CRISPR/Cas9系统是已知的。因此，脑膜炎奈瑟菌(Neisseria meningitidis)Cas9在PAM序列NNNNGATT处进行切割。嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)Cas9在PAM序列NNAGAAW处进行切割。最近，已经描述了弯曲菌属(Campylobacter)的CRISPR系统的另一PAM基序NNNNRYAC(国际专利公开号WO 2016/021973 A1，通过引用以其整体并入本文)。对于Cpf1核酸酶，与由Cas9系统识别的通常富含G的PAM相比，不含tracrRNA的Cpf1-crRNA复合物有效地识别和切割前置有短的富含T的PAM的靶DNA。此外，通过使用修饰的CRISPR多肽，可以获得特异性单链断裂。Cas切口酶与各种重组gRNA的组合使用还可以借助于双DNA切割来诱导高度特异性的DNA双链断裂。此外，通过使用两种gRNA，可以优化DNA结合的特异性，因此优化DNA切割的特异性。其他CRISPR效应物(像最初为细菌描述的CasX和CasY效应物)同时可用，并且代表可以用于基因组工程目的的其他效应物(Burstein等人,″New CRISPR-Cas systems from uncultivatedmicrobes″,Nature,2017,542,237-241，通过引用以其整体并入本文)。
目前，例如，依赖于Cas9或其变体或任何嵌合形式作为核酸内切酶的II型系统已经被修饰用于基因组工程。由两种组分(指导RNA(gRNA)(也称为单指导RNA(sgRNA))和非特异性CRISPR相关核酸内切酶)组成的合成CRISPR系统可以用于通过共表达对待靶向的基因具有特异性且能够与核酸内切酶Cas9缔合的gRNA来产生敲除细胞或动物。值得注意的是，gRNA是人工分子，其包含与Cas或任何其他CRISPR效应蛋白或其变体或催化活性片段相互作用的一个结构域以及与目的靶核酸相互作用的另一个结构域，因此代表crRNA和tracrRNA的合成融合物(作为“单指导RNA”(sgRNA)或简称“gRNA”)。基因组靶标可以是任何约20个核苷酸的DNA序列，条件是靶标紧接PAM序列的上游而存在。PAM序列对于靶标结合非常重要，并且确切的序列取决于Cas9的种类，并且例如，对于化脓链球菌来源的Cas9，读为5′-NGG-3′或5′NAG 3′(标准IUPAC核苷酸代码)(Jinek等人,Science 2012,同上)。来自金黄色葡萄球菌的Cas9的PAM序列是NNGRRT或NNGRR(N)。许多其他变体CRISPR/Cas9系统是已知的，尤其包括切割PAM序列NNNNGATT的脑膜炎奈瑟菌Cas9。切割PAM序列NNAGAAW的嗜热链球菌Cas9。使用修饰的Cas核酸酶，可以将靶向的单链断裂引入到目的靶序列中。通过将这样的Cas切口酶与不同的重组gRNA组合使用，可以使用双切割系统引入高度位点特异性的DNA双链断裂。使用一种或多种gRNA可以进一步提高总体特异性并降低脱靶效应。
一旦表达，Cas9蛋白和gRNA就通过gRNA“支架”结构域与Cas9上的表面暴露的带正电荷的沟之间的相互作用形成核糖核蛋白复合物。Cas9在gRNA结合后发生构象变化，使分子从无活性的非DNA结合构象转变为有活性的DNA结合构象。重要的是，gRNA的“间隔子”序列保持与靶DNA自由相互作用。Cas9-gRNA复合物将结合任何具有PAM的基因组序列，但是gRNA间隔子与靶DNA的匹配程度决定了Cas9是否会切割。一旦Cas9-gRNA复合物结合推定的DNA靶标，在gRNA靶向序列的3′端的“种子”序列就开始退火至靶DNA。如果种子序列和靶DNA序列匹配，则gRNA将继续在3′至5′方向(相对于gRNA的极性)上退火至靶DNA。
CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9以及CRISPR/Cpf1或CRISPR/CasX或CRISPR/CasY)和其他CRISPR系统在正确设计gRNA时具有高度特异性，但尤其是特异性仍然是主要问题，特别是对于基于CRISPR技术的临床应用或靶向植物GE。CRISPR系统的特异性在很大程度上取决于与基因组的其余部分相比gRNA靶向序列对基因组靶标的特异性。因此，根据本公开文本的方法当与至少一种CRISPR核酸酶作为位点特异性核酸酶的使用组合并且进一步与合适的CRISPR核酸的使用组合时可以提供显著更可预测的GE结果。尽管CRISPR复合物可以在特定位点介导细胞或细胞系统的基因组或遗传物质的高度精确切割，但本文提出的方法提供了保证可编程且可预测的修复机制的另外控制机制。
共价和非共价缔合或附接也可以应用于CRISPR核酸序列，其可以包含多于一个部分，例如crRNA和tracrRNA部分，它们可以如上所详述彼此缔合。在一个实施方案中，修复模板(修复基质)核酸序列可以放置在目的CRISPR核酸序列内，以形成根据本公开文本的杂合核酸序列，所述杂合体可以通过共价和非共价缔合形成。
在各种实施方案中，所述位点特异性核酸酶包括转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)。TALEN可以包含与核酸酶(例如，FokI或其变体)的催化结构域融合的来自细菌黄单胞菌属(Xanthomonas)的转录激活因子样效应物(TALE)。TALE的DNA结合特异性可以通过串联排列的34/35个氨基酸的重复单元的重复可变双残基(RVD)来定义，使得一个RVD特异性识别靶DNA中的一个核苷酸。重复单元可以被组装成基本上识别任何靶序列，并且与核酸酶的催化结构域融合产生序列特异性核酸内切酶(参见例如，Boch等人(2009).Breakingthe code of DNA binding specificity of TAL-type III effectors.Science,326(5959),1509-1512；Moscou和Bogdanove(2009).A simple cipher governs DNArecognition by TAL effectors.Science,326(5959),1501-1501；以及WO 2010/079430、WO2011/072246、WO 2011/154393、WO 2011/146121、WO 2012/001527、WO 2012/093833、WO2012/104729、WO 2012/138927、WO 2012/138939)。WO 2012/138927进一步描述了具有各种催化结构域及其组合的单体(紧凑)TALEN和TALE。
待引入到玉蜀黍植物中的核酸分子可以包含同源序列。所述同源序列可以与所述核酸分子内的所述至少一个目的核酸序列物理关联。因此，所述同源序列可以是待引入的所述至少一个目的核酸序列的一部分。所述同源序列可以定位在所述至少一个目的核酸序列的5′和/或3′位置内。
所述同源序列可以包含在一个或多个相应的相邻区域的整个长度上与一个或多个核酸序列具有至少85％-100％互补性的序列，所述一个或多个核酸序列与待引入所述序列的基因组上的预定位置相邻、在预定位置的上游和/或下游。为了获得高精度，可以使用95％以上的同源性/互补性来实现高度靶向性的修复事件。如Rubnitz等人,Mol.CellBiol.,1984,4(11),2253-2258中所示，非常低的序列同源性也可能足以获得同源重组。如技术人员所已知，互补性程度将取决于待修饰的遗传物质、计划编辑的性质、基因组的复杂性和大小、潜在的脱靶位点的数量、遗传背景和待修饰的细胞或细胞系统内的环境。在某些实施方案中，所述同源序列包含至少一个间隔核苷酸。可替代地，所述间隔核苷酸可以存在于待引入的所述至少一个目的核酸序列内。
不希望受任何理论的约束，所述一个或多个同源序列可以用作模板，以通过与至少一个区域(上游和/或下游区域)具有互补性来介导同源定向修复，所述至少一个区域与待修饰的细胞系统的遗传物质内的预定位置相邻。因此，所述至少一个目的核酸序列和侧接的一个或多个同源区可以具有修复模板(RT)核酸序列的功能。在某些实施方案中，所述RT可以进一步与另一个DNA和/或RNA序列关联，如通过互补碱基配对所介导的。在一个替代实施方案中，所述RT可以与其他序列关联，所述其他序列例如载体(例如，质粒载体)的序列，所述载体可以用于在转化之前扩增RT。此外，所述RT还可以与至少部分氨基酸组分(优选位点特异性核酸酶)物理关联。这种配置和关联允许RT在物理上与双链断裂(DSB)位点靠的很近的位置(即，恰好在靶向GE事件待实现的位置)的可用性，以允许甚至更高的效率。例如，所述至少一种RT还可以与至少一种gRNA关联，所述至少一种gRNA与所述至少一种RT相互作用并且进一步与作为位点特异性核酸酶的CRISPR核酸酶的至少一部分相互作用。
如本文所用的碱基编辑器酶或碱基编辑器或碱基编辑器系统是指具有与其所来源的蛋白质相同的催化活性的蛋白质或其片段，所述蛋白质或其片段单独地或当作为分子复合物(在本文中称为碱基编辑复合物)提供时具有介导靶向碱基修饰的能力，所述靶向碱基修饰即目的碱基的转换，导致目的点突变，如果碱基转换不引起沉默突变，则这又可以导致靶向突变，更确切地说由包含待用碱基编辑器转换的位置的密码子编码的氨基酸的转换。优选地，根据本公开文本的所述至少一种碱基编辑器暂时或永久地连接到至少一种位点特异性效应物，或者任选地连接到至少一种位点特异性效应复合物的组分。连接可以是共价的和/或非共价的。
如本文所公开的任何碱基编辑器或位点特异性效应物或其催化活性片段或者碱基编辑器复合物或位点特异性效应复合物的任何组分都可以作为核酸片段引入到细胞中，所述核酸片段表示或编码DNA、RNA或蛋白质效应物，或者它可以作为DNA、RNA和/或蛋白质或其任何组合引入。目的核酸序列可以包含来自本文所述的炭疽茎腐病抗性等位基因序列的任何序列。待引入或整合到植物基因组中的目的核酸序列可以包含例如SEQ ID NO:272的核酸序列的全部或SEQ ID NO:272的核酸序列的一部分，其中目的核酸序列包含以下多态性中的一个或多个：
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834581处的“T”，优选通过SEQ ID NO:373的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834577处的“A”，优选通过SEQ ID NO:374的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834569处的“G”，优选通过SEQ ID NO:375的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834539处的“C”，优选通过SEQ ID NO:376的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834532处的“GAG”，优选通过SEQ ID NO:377和/或378的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834494处的“T”，优选通过SEQ ID NO:379的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834431处的“T”，优选通过SEQ ID NO:380的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834389处的“G”，优选通过SEQ ID NO:381的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834208处的“T”，优选通过SEQ ID NO:382的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831963处的“T”，优选通过SEQ ID NO:383的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831924处的“G”，优选通过SEQ ID NO:384的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831915处的“A”，优选通过SEQ ID NO:385的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831839处的“G”，优选通过SEQ ID NO:386的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132829096处的“T”，优选通过SEQ ID NO:387的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828997处的“A”，优选通过SEQ ID NO:388的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828958处的“G”，优选通过SEQ ID NO:389的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828950处的“G”，优选通过SEQ ID NO:390的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828867处的“C”，优选通过SEQ ID NO:391的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827606处的“A”，优选通过SEQ ID NO:392的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入，优选通过SEQ IDNO:393和/或394的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827573处的“T”，优选通过SEQ ID NO:395的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827566处的“G”，优选通过SEQ ID NO:396的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827549处的“A”，优选通过SEQ ID NO:397的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827545处的“TAT”，优选通过SEQ ID NO:398和/或399的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827302处的“C”，优选通过SEQ ID NO:400的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826983处的“T”，优选通过SEQ ID NO:401的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826940处的“T”，优选通过SEQ ID NO:402的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040380处的“T”，优选通过SEQ ID NO:403的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040382处的“C”，优选通过SEQ ID NO:404的标记序列可检测，或
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置133040760处的“T”，优选通过SEQ ID NO:405的标记序列可检测。
此外或可替代地，待引入或整合到植物基因组中的目的核酸序列可以包含SEQ IDNO:50的核酸序列的全部或SEQ ID NO:50的核酸序列的一部分，其中目的核酸序列包含以下多态性中的一个或多个：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在某些实施方案中，目的核酸序列与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有任何以上核苷酸序列的表达盒。
所述方法可以有效地将目的序列引入或整合到所述玉蜀黍植物的细胞的4号或6号染色体中。引入目的序列可以足以赋予从修饰的玉蜀黍细胞培养的玉蜀黍植物对真菌病原体(例如，引起炭疽茎腐病的真菌病原体)的抗性。为了检测目的序列是否已经整合到所述细胞的4号或6号染色体中，可以使用引物对所述细胞或其后代的基因组DNA进行PCR扩增。在一些实施方案中，所述引物检测表13的变体核苷酸。在一些实施方案中，所述引物检测选自SEQ ID NO:58-78中任一个的变体核苷酸。在一些实施方案中，在使用SEQ ID NO:120和121的引物、SEQ ID NO:122和123的引物或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，目的核酸序列不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子(扩增子7)。在一些实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，目的核酸序列不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114的扩增子。在某些实施方案中，目的核酸序列与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有任何以上核苷酸序列的表达盒。
目的核酸序列可以包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266或269、优选SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:210、213、216、219、222、225、228、231、234、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267或270、优选SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
在某些实施方案中，目的核酸序列与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有以上核苷酸序列i)至viii)中任一个的表达盒。引入目的序列可以足以赋予从修饰的玉蜀黍细胞培养的玉蜀黍植物对真菌病原体(例如，引起炭疽茎腐病的真菌病原体)的抗性。
目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:211中任一个的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:211中任一个的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:214的序列的蛋白质，或包含与包含SEQID NO:214的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:217的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:217的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:220的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:220的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:223的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:223的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ IDNO:226的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:226的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:229的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:229的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:232的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:232的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有任何以上核苷酸序列的表达盒。
目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:235的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:235的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:238的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:238的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:241的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ IDNO:241的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:244的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:244的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ IDNO:247的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:247的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:250的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:250的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:253的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ IDNO:253的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:256的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:256的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:259的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:259的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:262的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:262的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:265的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:265的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQID NO:268的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:268的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。可替代地，目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:271的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:271的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有任何以上核苷酸序列的表达盒。
目的核酸序列可以包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:1、20、23、44或47的核苷酸序列，
ii.与来自i.的序列互补的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
iv.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
v.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vi.编码包含SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
vii.编码与SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在某些实施方案中，目的核酸序列与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接。在某些实施方案中，目的核酸序列可以包含含有以上核酸i)至vii)中任一个的表达盒。引入目的序列可以足以赋予从修饰的玉蜀黍细胞培养的玉蜀黍植物对真菌病原体(例如，引起炭疽茎腐病的真菌病原体)的抗性。
目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:11的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:11的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:12的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:12的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:13的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:13的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:14的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:14的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:15的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:15的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:16的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:16的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:17的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:17的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:18的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ IDNO:18的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:19的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:19的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。
目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:22的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:22的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:34的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:34的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:35的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:35的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:36的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:36的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:37的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:37的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:38的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:38的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:39的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:39的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:40的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ IDNO:40的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:41的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:41的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:42的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:42的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:43的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:43的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:46的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:46的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。目的核酸序列可以包含以下核苷酸序列，所述核苷酸序列编码包含SEQ ID NO:49的序列的蛋白质，或包含与包含SEQ ID NO:49的序列的蛋白质至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的序列的蛋白质。
在各种实施方案中，同源定向修复由非同源末端连接(NHEJ)介导。不希望受理论的约束，在真核细胞中，通过用于修复由环境胁迫和细胞DNA加工机器错误引起的DNA DSB的强大且部分冗余的机制来确保基因组完整性。在大多数真核细胞中以及在相应的细胞周期的大多数阶段，非同源末端连接(NHEJ)DNA修复途径是最主要的修复形式。第二种途径使用相似DNA序列的同源重组(HR)来修复DSB。通过从配对染色体的重复同源区进行模板化以精确修复DSB，此途径通常可以在细胞周期的S和G2阶段中使用。然而，与靶标具有同源性的人工提供的修复模板(RT)也可以用于在称为同源定向修复(HDR)或基因靶向的过程中修复DSB。通过此策略，可以在真核细胞的基因组中引入非常精确的靶向变化。
NHEJ是动物和植物中的主要细胞核反应，其不需要同源序列，但是通常容易出错，因此可能具有诱变性(Wyman C.,Kanaar R.“DNA double-strand break repair:all'swell that ends well”,Annu.Rev.Genet.,2006,40,363-83)。已知经典NHEJ和备份NHEJ途径依赖于不同的机制，其中两种途径都容易出错。通过HDR进行修复需要同源性，但是那些使用完整染色体来修复断裂染色体的HDR途径(即双链断裂修复和合成依赖性链退火)非常准确。在经典DSB修复途径中，3'端侵入完整的同源模板，然后充当DNA修复合成的引物，最终导致双霍利迪连结体(dHJ)的形成。dHJ是当侵入链的延伸“捕获”并从第二个DSB端合成DNA时形成的四链分支结构。单独的HJ经由以两种方式之一切割而被解析。合成依赖性链退火是保守的，并且仅导致非交换事件。这意味着所有新合成的序列都存在于同一分子上。与NHEJ修复途径不同，在合成依赖性链退火中，在链侵入和D环形成后，新合成的侵入链部分从模板上移开并返回到另一DSB端的非侵入链的加工端。非侵入链的3'端被延伸和连接以填充空位。还有另一尚未完全表征的HDR途径，称为断裂诱导的修复途径。此途径的主要特征是在DSB处仅存在一个可以用于修复的侵入端。
在各种实施方案中，同源定向修复由微同源介导的末端连接(MMEJ)介导。不希望受理论的约束，MMEJ已经被认为是真核生物中一种独特的DSB修复类型。此途径仅需要非常短(2-14bp)的同源区，并且像单链退火一样，它通常会留下缺失。MMEJ也已经在遗传上与同源重组和NHEJ途径区分开，并且在哺乳动物细胞中充当NHEJ的备份(Kwon,T.,Huq,E.和Herrin,D.L.(2010).Microhomology-mediated and nonhomologous repair of adouble-strand break in the chloroplast genome of Arabidopsis.Proceedings ofthe National Academy of Sciences of the United States of America,107(31),13954-13959)。
对茎腐病具有抗性的玉蜀黍植物
在一个方面，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述抗性基因座位于4号染色体上，并且其中所述抗性基因座根据本文所述的任何方法渗入到所述玉蜀黍植物中。在各种实施方案中，所述玉蜀黍植物不进一步包含在6号染色体上发现的与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座。在各种实施方案中，所述玉蜀黍植物仅具有一个与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，所述抗性基因座位于4号染色体上。
在一个方面，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述抗性基因座位于6号染色体上，并且其中所述抗性基因座根据本文所述的任何方法渗入到所述玉蜀黍植物中。所述玉蜀黍植物不进一步包含在4号染色体上发现的与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座。
在一个实施方案中，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含4号染色体上的与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中位于4号染色体上的所述抗性基因座包含编码具有单体型的Rcg1抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在一个实施方案中，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含6号染色体上的与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中位于6号染色体上的所述抗性基因座包含编码具有单体型的炭疽茎腐病抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836954处的“A”，优选通过SEQ ID NO:273的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835713处的“T”，优选通过SEQ ID NO:342的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835708处的“GAA”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835705处的“ATA”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835702处的“GAT”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835693处的“G”，优选通过SEQ ID NO:345的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835681处的“T”，优选通过SEQ ID NO:346的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835671处的“C”，优选通过SEQ ID NO:347的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835147处的“T”，优选通过SEQ ID NO:352的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835031处的“C”，优选通过SEQ ID NO:353的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834924处的“A”，优选通过SEQ ID NO:361的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827606处的“A”，优选通过SEQ ID NO:392的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入，优选通过SEQ IDNO:393和/或394的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827573处的“T”，优选通过SEQ ID NO:395的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827566处的“G”，优选通过SEQ ID NO:396的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827549处的“A”，优选通过SEQ ID NO:397的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827545处的“TAT”，优选通过SEQ ID NO:398和/或399的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827302处的“C”，优选通过SEQ ID NO:400的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826983处的“T”，优选通过SEQ ID NO:401的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826940处的“T”，优选通过SEQ ID NO:402的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040380处的“T”，优选通过SEQ ID NO:403的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040382处的“C”，优选通过SEQ ID NO:404的标记序列可检测，或
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置133040760处的“T”，优选通过SEQ ID NO:405的标记序列可检测。
在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ IDNO:50的位置1099处的“T”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ IDNO:50的位置2598处的“A”的单核苷酸多态性。在一些实施方案中，编码Rcg1抗性等位基因的核酸分子具有单体型，所述单体型包含参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”的单核苷酸多态性。
在一个相关方面，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含6号染色体上的与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，但是不进一步包含4号染色体上的抗性基因座或含有来自4号染色体上的所述抗性基因座的序列的核酸。所述玉蜀黍植物包含以下核酸中的一个或多个：
i.SEQ ID NO:209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266或269、优选SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，或
ii.具有SEQ ID NO:210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267或270、优选SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，
viii.编码与SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
可替代地，所述玉蜀黍植物包含以下核酸中的一个或多个：
i.SEQ ID NO:1、20、23、44或47的核苷酸序列，
ii.与来自(i)的序列互补的核苷酸序列，
iii.与来自(i)或(ii)的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
iv.根据遗传密码的简并性，与根据(i)、(ii)或(iii)的核酸序列不同的核苷酸序列，
v.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vi.编码包含SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列的蛋白质的核苷酸序列，
vii.编码与SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:120和121的引物、SEQ ID NO:122和123的引物或SEQ ID NO:124和125的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生根据SEQ ID NO:119的扩增子。
在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，所述核酸分子不产生选自SEQ IDNO:94、101、106、109和114的扩增子。
在另一个方面，提供了以下玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的两个抗性基因座，其中一个抗性基因座位于6号染色体上，并且其中另一个抗性基因座位于4号染色体上。所述玉蜀黍植物包含以下核酸中的一个或多个：
i.SEQ ID NO:209、212、215、218、221、224、227、230、233、236、239、242、245、248、251、254、257、260、263、266或269、优选SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:210、213、216、219、222、225、228、231、234、237、240、243、246、249、252、255、258、261、264、267或270、优选SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.或ii.的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，
viii.编码与SEQ ID NO:211、214、217、220、223、226、229、232、235、238、241、244、247、250、253、256、259、262、265、268或271、优选SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
所述玉蜀黍植物还包含编码具有单体型的炭疽茎腐病抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836954处的“A”，优选通过SEQ ID NO:273的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836944处的“T”，优选通过SEQ ID NO:274的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836869处的“A”，优选通过SEQ ID NO:275的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836849处的“T”，优选通过SEQ ID NO:276的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836845处的“T”，优选通过SEQ ID NO:277的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836840处的“G”，优选通过SEQ ID NO:278的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836830处的“T”，优选通过SEQ ID NO:279的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836810处的“A”，优选通过SEQ ID NO:280的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836805处的“CA”，优选通过SEQ ID NO:281和/或282的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836802处的“ATC”的缺失，优选通过SEQID NO:283和/或284的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836799处的“ATT”的缺失，优选通过SEQID NO:283和/或284的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836791处的“A”，优选通过SEQ ID NO:285的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836787处的“CTG”，优选通过SEQ ID NO:286和/或287的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836781处的“GA”，优选通过SEQ ID NO:288和/或289的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836776处的“T”，优选通过SEQ ID NO:290的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836767处的“AG”，优选通过SEQ ID NO:291和/或292的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836762处的“A”，优选通过SEQ ID NO:293的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836679处的“CGCCAA”的插入和“A”，优选通过SEQ ID NO:294和/或295的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836678处的“A”，优选通过SEQ ID NO:296的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836670处的“G”，优选通过SEQ ID NO:297的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836667处的“T”，优选通过SEQ ID NO:298的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836665处的“A”，优选通过SEQ ID NO:299的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836662处的“C”，优选通过SEQ ID NO:300的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836660处的“T”，优选通过SEQ ID NO:301的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836651处的“G”，优选通过SEQ ID NO:302的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836643处的“AAT”的缺失，优选通过SEQID NO:303和/或304的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836636处的“GCCATG”的缺失，优选通过SEQ ID NO:305和/或306的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836622处的“AG”，优选通过SEQ ID NO:307和/或308的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836620处的“AC”，优选通过SEQ ID NO:309和/或310的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836612处的“G”，优选通过SEQ ID NO:311的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836603处的“G”，优选通过SEQ ID NO:312的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836591处的“C”，优选通过SEQ ID NO:313的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836586处的“A”，优选通过SEQ ID NO:314的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836580处的“G”，优选通过SEQ ID NO:315的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836069处的“A”，优选通过SEQ ID NO:316的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836063处的“A”，优选通过SEQ ID NO:317的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836061处的“G”，优选通过SEQ ID NO:318的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836056处的“G”，优选通过SEQ ID NO:319的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836050处的“C”，优选通过SEQ ID NO:320的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836047处的“CGT”，优选通过SEQ ID NO:321和/或322的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836034处的“G”，优选通过SEQ ID NO:323的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836031处的“G”，优选通过SEQ ID NO:324的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836019处的“T”，优选通过SEQ ID NO:325的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132836008处的“G”，优选通过SEQ ID NO:326的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835978处的“G”，优选通过SEQ ID NO:327的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835910处的“G”，优选通过SEQ ID NO:328的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835851处的“G”，优选通过SEQ ID NO:329的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835819处的“C”，优选通过SEQ ID NO:330的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835803处的“G”，优选通过SEQ ID NO:331的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835793处的“T”，优选通过SEQ ID NO:332的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835788处的“C”，优选通过SEQ ID NO:333的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835781处的“A”，优选通过SEQ ID NO:334的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835779处的“A”，优选通过SEQ ID NO:335的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835776处的“T”，优选通过SEQ ID NO:336的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835746处的“G”，优选通过SEQ ID NO:337的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835729处的“A”，优选通过SEQ ID NO:338的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835728处的“C”，优选通过SEQ ID NO:339的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835722处的“GACATC”的插入，优选通过SEQ ID NO:340和/或341的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835713处的“T”，优选通过SEQ ID NO:342的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835708处的“GAA”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835705处的“ATA”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835702处的“GAT”的缺失，优选通过SEQID NO:343和/或344的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835693处的“G”，优选通过SEQ ID NO:345的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835681处的“T”，优选通过SEQ ID NO:346的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835671处的“C”，优选通过SEQ ID NO:347的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835666处的“T”，优选通过SEQ ID NO:348的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835271处的“A”，优选通过SEQ ID NO:349的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835267处的“GG”，优选通过SEQ ID NO:350和/或351的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835147处的“T”，优选通过SEQ ID NO:352的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132835031处的“C”，优选通过SEQ ID NO:353的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132834951处的“A”，优选通过SEQ ID NO:355的标记序列可检测，
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参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831915处的“A”，优选通过SEQ ID NO:385的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132831839处的“G”，优选通过SEQ ID NO:386的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132829096处的“T”，优选通过SEQ ID NO:387的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828997处的“A”，优选通过SEQ ID NO:388的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828958处的“G”，优选通过SEQ ID NO:389的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828950处的“G”，优选通过SEQ ID NO:390的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132828867处的“C”，优选通过SEQ ID NO:391的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827606处的“A”，优选通过SEQ ID NO:392的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入，优选通过SEQ IDNO:393和/或394的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827573处的“T”，优选通过SEQ ID NO:395的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827566处的“G”，优选通过SEQ ID NO:396的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827549处的“A”，优选通过SEQ ID NO:397的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827545处的“TAT”，优选通过SEQ ID NO:398和/或399的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132827302处的“C”，优选通过SEQ ID NO:400的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826983处的“T”，优选通过SEQ ID NO:401的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置132826940处的“T”，优选通过SEQ ID NO:402的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040380处的“T”，优选通过SEQ ID NO:403的标记序列可检测，
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置1333040382处的“C”，优选通过SEQ ID NO:404的标记序列可检测，或
参考B73AGPv04的6号染色体上的位置133040760处的“T”，优选通过SEQ ID NO:405的标记序列可检测。
可替代地，所述玉蜀黍植物包含以下核酸中的一个或多个：
i.SEQ ID NO:1、20、23、44或47的核苷酸序列，
ii.与来自(i)的序列互补的核苷酸序列，
iii.与来自(i)或(ii)的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列，
iv.根据遗传密码的简并性，与根据(i)、(ii)或(iii)的核酸序列不同的核苷酸序列，
v.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vi.编码包含SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列的蛋白质的核苷酸序列，
vii.编码与SEQ ID NO:11-19、22、34-43、46或49的序列具有至少80％或85％、优选至少90％、91％、92％、93％、94％或95％、更优选至少96％、97％、98％或99％同一性的蛋白质的核苷酸序列。
所述玉蜀黍植物还包含编码具有单体型的Rcg1抗性等位基因的核酸分子，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
i.参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
ii.参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
iii.参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
iv.参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
v.参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
vi.参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
vii.参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
viii.参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
ix.参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
x.参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
还提供了任何以上玉蜀黍植物的种子或植物部分。
渗入
当基因通过标记辅助选择渗入时，不仅引入了所述基因，而且引入了侧接区域(Gepts,Crop Sci,2002,42:1780-1790)。这被称为“连锁累赘”。在供体植物与受体植物高度不相关的情况下，如在被从MP305(外来来源)渗入到优良近交系中的Rcg1基因座的情况下，这些侧接区域携带可能编码农艺学上不希望的性状的另外基因。即使在回交到优良玉米品系的多个循环后，这种“连锁累赘”也可能导致产量下降或其他有害的农艺特征。这有时也被称为“产量累赘”。侧接区域的大小可以通过另外的回交来减小，但是这并不总是成功的，因为育种者不能控制区域的大小或重组断点(Young等人,Genetics,1998,120:579-585)。在经典育种中，通常仅偶然选择到有助于减小供体区段大小的重组(Tanksley等人,Biotechnology,1989,7:257-264)。即使以这种类型的回交进行20次回交后，预期可能仍会找到仍然与被选择基因连锁的相当大条的供体染色体。然而，在采用标记的情况下，可以选择那些在目的基因附近经历过重组的稀有个体。在150株回交植物中，基于单次减数分裂图距，有95％的机会至少一株植物在基因的1cM内经历过交换。标记将允许明确鉴定那些个体。在300株植物再进行一次回交的情况下，将有95％的机会在基因另一侧的1cM单次减数分裂图距内发生交换，基于单次减数分裂图距在靶基因周围小于2cM产生区段。这在采用标记的情况下可以两代完成，而在不采用标记的情况下平均将需要100代。当已知基因的确切位置时，可以利用围绕所述基因的一系列侧接标记来在不同的群体大小中选择重组。例如，在较小的群体大小中，可以预期重组在进一步远离所述基因，因此将需要更远端的侧接标记来检测重组。
在一个方面，提供了将与炭疽茎腐病抗性相关的基因座渗入到玉蜀黍植物中的方法，所述方法包括：
a.筛选具有至少一个标记的群体，以确定来自所述群体的一株或多株玉蜀黍植物是否包含与炭疽茎腐病抗性相关的所述基因座，其中所述筛选包括用于检测6号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定，其中所述抗性基因座包含具有单体型的炭疽茎腐病抗性等位基因，所述单体型包含选自表13的变体核苷酸的一个或多个核苷酸多态性，和/或用于检测4号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定，其中所述抗性基因座包含具有单体型的Rcg1抗性等位基因，所述单体型包含选自以下的一个或多个核苷酸多态性：
-参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1250处的“T”，
-参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”，
-参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”，和
-参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”；以及
b.从所述群体中选择包含与炭疽茎腐病抗性相关的所述基因座的至少一株玉蜀黍植物；以及
c.将所述至少一株玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
d.评价后代植物的与炭疽茎腐病抗性相关的所述至少一个标记；以及
e.选择具有与炭疽茎腐病抗性相关的所述等位基因的后代植物。
在一些实施方案中，所述一个或多个核苷酸多态性选自：
与B73AGPv04参考基因组序列的6号染色体上的位置相比，6号染色体上的位置132836954处的“A”、6号染色体上的位置132836944处的“T”、6号染色体上的位置132836869处的“A”、6号染色体上的位置132836849处的“T”、6号染色体上的位置132836845处的“T”、6号染色体上的位置132836840处的“G”、6号染色体上的位置132836830处的“T”、6号染色体上的位置132836810处的“A”、6号染色体上的位置132836805处的“CA”、6号染色体上的位置132836802处的“ATC”的缺失、6号染色体上的位置132836799处的“ATT”的缺失、6号染色体上的位置132836791处的“A”、6号染色体上的位置132836787处的“CTG”、6号染色体上的位置132836781处的“GA”、6号染色体上的位置132836776处的“T”、6号染色体上的位置132836767处的“AG”、6号染色体上的位置132836762处的“A”、6号染色体上的位置132836679处的“CGCCAA”的插入和“A”、6号染色体上的位置132836678处的“A”、6号染色体上的位置132836670处的“G”、6号染色体上的位置132836667处的“T”、6号染色体上的位置132836665处的“A”、6号染色体上的位置132836662处的“C”、6号染色体上的位置132836660处的“T”、6号染色体上的位置132836651处的“G”、6号染色体上的位置132836643处的“AAT”的缺失、6号染色体上的位置132836636处的“GCCATG”的缺失、6号染色体上的位置132836622处的“AG”、6号染色体上的位置132836620处的“AC”、6号染色体上的位置132836612处的“G”、6号染色体上的位置132836603处的“G”、6号染色体上的位置132836591处的“C”、6号染色体上的位置132836586处的“A”、6号染色体上的位置132836580处的“G”、6号染色体上的位置132836069处的“A”、6号染色体上的位置132836063处的“A”、6号染色体上的位置132836061处的“G”、6号染色体上的位置132836056处的“G”、6号染色体上的位置132836050处的“C”、6号染色体上的位置132836047处的“CGT”、6号染色体上的位置132836034处的“G”、6号染色体上的位置132836031处的“G”、6号染色体上的位置132836019处的“T”、6号染色体上的位置132836008处的“G”、6号染色体上的位置132835978处的“G”、6号染色体上的位置132835910处的“G”、6号染色体上的位置132835851处的“G”、6号染色体上的位置132835819处的“C”、6号染色体上的位置132835803处的“G”、6号染色体上的位置132835793处的“T”、6号染色体上的位置132835788处的“C”、6号染色体上的位置132835781处的“A”、6号染色体上的位置132835779处的“A”、6号染色体上的位置132835776处的“T”、6号染色体上的位置132835746处的“G”、6号染色体上的位置132835729处的“A”、6号染色体上的位置132835728处的“C”、6号染色体上的位置132835722处的“GACATC”的插入、6号染色体上的位置132835713处的“T”、6号染色体上的位置132835708处的“GAA”的缺失、6号染色体上的位置132835705处的“ATA”的缺失、6号染色体上的位置132835702处的“GAT”的缺失、6号染色体上的位置132835693处的“G”、6号染色体上的位置132835681处的“T”、6号染色体上的位置132835671处的“C”、6号染色体上的位置132835666处的“T”、6号染色体上的位置132835271处的“A”、6号染色体上的位置132835267处的“GG”、6号染色体上的位置132835147处的“T”、6号染色体上的位置132835031处的“C”、6号染色体上的位置132834960处的“A”、6号染色体上的位置132834951处的“A”、6号染色体上的位置132834946处的“AC”、6号染色体上的位置132834942处的“A”、6号染色体上的位置132834929处的“A”、6号染色体上的位置132834927处的“T”、6号染色体上的位置132834924处的“A”、6号染色体上的位置132834919处的“C”、6号染色体上的位置132834908处的“T”、6号染色体上的位置132834899处的“A”、6号染色体上的位置132834754处的“C”、6号染色体上的位置132834753处的“C”、6号染色体上的位置132834748处的“C”、6号染色体上的位置132834721处的“A”、6号染色体上的位置132834632处的“A”、6号染色体上的位置132834622处的“C”、6号染色体上的位置132834615处的“G”、6号染色体上的位置132834602处的“C”、6号染色体上的位置132834589处的“G”、6号染色体上的位置132834581处的“T”、6号染色体上的位置132834577处的“A”、6号染色体上的位置132834569处的“G”、6号染色体上的位置132834539处的“C”、6号染色体上的位置132834532处的“GAG”、6号染色体上的位置132834494处的“T”、6号染色体上的位置132834431处的“T”、6号染色体上的位置132834389处的“G”、6号染色体上的位置132834208处的“T”、6号染色体上的位置132831963处的“T”、6号染色体上的位置132831924处的“G”、6号染色体上的位置132831915处的“A”、6号染色体上的位置132831839处的“G”、6号染色体上的位置132829096处的“T”、6号染色体上的位置132828997处的“A”、6号染色体上的位置132828958处的“G”、6号染色体上的位置132828950处的“G”、6号染色体上的位置132828867处的“C”、6号染色体上的位置132827606处的“A”、6号染色体上的位置132827596处的“AGTTCATAATAAAGTGATAGAGTT”(SEQ ID NO:414)的插入、6号染色体上的位置132827573处的“T”、6号染色体上的位置132827566处的“G”、6号染色体上的位置132827549处的“A”、6号染色体上的位置132827545处的“TAT”、6号染色体上的位置132827302处的“C”、6号染色体上的位置132826983处的“T”、6号染色体上的位置132826940处的“T”、6号染色体上的位置1333040380处的“T”、6号染色体上的位置1333040382处的“C”或6号染色体上的位置133040760处的“T”。
在各种实施方案中，用于筛选的所述至少一个标记位于表13中所列举的变体核苷酸多态性中的任一个和/或以下多态性中的任一个的5cM内：参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”、参考SEQ IDNO:50的位置1250处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”或参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在各种实施方案中，用于筛选的所述至少一个标记位于表13中所列举的变体核苷酸多态性中的任一个和/或以下多态性中的任一个的1cM内：参考SEQ ID NO:50的位置413处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置958处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置971处的“C”、参考SEQ ID NO:50的位置1099处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1154处的“A”、参考SEQ IDNO:50的位置1250处的“T”、参考SEQ ID NO:50的位置1607处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2001处的“G”、参考SEQ ID NO:50的位置2598处的“A”或参考SEQ ID NO:50的位置3342处的“A”。
在各种实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-104102206与PZE-104132759之间的染色体区间上。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。在各种实施方案中，6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
在各种实施方案中，在借助于SEQ ID NO:95和96的引物、SEQ ID NO:97和98的引物、SEQ ID NO:99和100的引物、SEQ ID NO:101和102的引物、SEQ ID NO:103和104的引物、SEQ ID NO:105和106的引物、SEQ ID NO:107和108的引物、SEQ ID NO:109和110的引物、SEQ ID NO:111和112的引物、SEQ ID NO:113和114的引物、SEQ ID NO:115和116的引物或SEQ ID NO:117和118的引物进行聚合酶链式反应扩增后，4号染色体上的所述抗性基因座不产生选自SEQ ID NO:94、101、106、109和114的扩增子。
在各种实施方案中，4号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A或NC342。在各种实施方案中，6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
茎秆分割机仪器
关于本文所述的对植物进行选择和育种的各种实施方案，可以通过使用茎秆分割机仪器(100)来测定植物的茎腐病。所述茎秆分割机仪器可以提高分析玉米植物的茎腐病的速度和复现性。所述茎秆分割机仪器可以以允许改善对茎腐病程度的定量分析的方式可复现地分割玉米茎秆。
所述茎秆分割机仪器包括主体(101)，优选金属主体，其包括孔(102)，所述孔被配置成允许将玉米茎秆(200)刚好放入孔中。所述金属主体可以由铝、钢、铜或任何其他合适的金属构成。所述金属主体可以由固态金属(如固态铝)制成。所述孔可以置于坚固主体的中心中或附近。
所述茎秆分割机仪器包括定位在孔上方的刀片(103)。所述刀片具有足够的锋利度和强度，以便能够分割和/或打开玉米茎秆。在各种实施方案中，所述刀片在孔上方居中。在各种实施方案中，所述刀片通过固定元件(107)固定。在各种实施方案中，所述刀片定位在滚轴(106)的轴的方向上(如图3、图5和图6所示)或垂直于滚轴的轴定位(如图4所示)，定位在允许分割和/或打开玉米茎秆的任何其他方向。在各种实施方案中，所述刀片是可拆除的，以进行磨刀。
所述茎秆分割机仪器包括在刀片下方的两个滚轴(104)。所述滚轴被配置成向茎秆施加压缩力。压缩力能够使茎秆居中到孔中。然后所述茎秆分割机仪器能够在中间一致地切割具有可变直径的茎秆。在各种实施方案中，这两个滚轴中的一个或两个被弹簧张紧，所述弹簧位于从分割机主体中的中心孔在滚轴的任一侧上水平钻出的通道中。在各种实施方案中，这两个滚轴中的一个或两个具有凹形跑合面(108)和/或粗糙化以使茎秆居中到孔中并夹住茎秆。
为了切割玉米茎秆，所述茎秆分割机最初定位在玉米茎秆上方，使得玉米茎秆的顶部刚好放入孔中。施加向下的力允许所述茎秆分割机切割玉米茎秆。当施加向下的力时，玉米茎秆通过孔向上移动，使得刀片切入茎秆的中心。
所述茎秆分割机仪器可以包括从包括孔的主体(101)的外顶部延伸的手柄(105)。所述手柄可以延伸到约50cm的长度。所述手柄可以具有约35cm、40cm、45cm、50cm、55cm或60cm的长度。延伸的手柄可以使得使用者在使用者站立的同时能够将茎秆一直向下推着通过所述仪器直至地面。
实施例
还通过以下实施例描述和展示了本公开文本。然而，在本说明书中的任何地方使用这些和其他实施例仅是说明性的，并且绝不限制本公开文本或任何示例性术语的范围和含义。同样，本公开文本不限于这里描述的任何特定的优选实施方案。实际上，本公开文本的许多修改和变化在阅读本说明书后对于本领域技术人员而言可以是清楚的，并且可以在不脱离本公开文本的精神或范围的情况下做出此类变化。因此，本公开文本将仅由所附权利要求的条款以及那些权利要求授权的等同物的全部范围来限制。
实施例1.与ASR相关的两个重要QTL的鉴定
通过用培养的真菌的孢子人工感染茎秆来筛选数百个近交系对ASR的抗性。接种源是在印第安纳州中部从感染的茎秆中获得的。将接种源纯化并在燕麦粉琼脂培养基上培养。在21天收获孢子，将其与水共混并用粗棉布过滤。将浓度归一化为6x 105ml-1。样地长3.3米、行宽0.76米，并且重复了两次。在抽丝后一周内，将0.5ml接种物注射到茎秆的支持根上方的第一个节间中。使用Socorex DosysTM注射器，其3.18mm直径的针的尖端被填充，并且在侧面钻出0.51mm的孔以进行侧流。用无绳电钻在茎秆中预先钻出直径3.97mm的孔。在接种后，将孔用凡士林覆盖。在刚达到黑层成熟后，用枝剪切断从穗到地面的茎秆部分，将其打捆，加条形码，并且带入内部，以用带锯分割并进行评级。
评级由三个得分组成。第一个得分是根据1到9标度的接种部位处的感染强度，其中9表示完全腐烂的接种节间(1x权重)。第二个得分是变黑超过10％的茎节的数量。第三个得分是变黑超过50％的茎节的数量。通过分别对这些得分以1:2:3加权来生成综合得分。观察到近交来源NC262A和NC342具有抗性超过四年，其得分始终低于10，而易感近交系的得分高于32。这些近交系的种子是从爱荷华州国家遗传资源计划玉米资料库(NationalGenetic Resources Program maize repository at Iowa State，GRIN)获得的。它们具有相同的祖源，其可追溯到Coker 811A x C1034。先前没有报道过这些基因型对ASR具有抗性。它们不与已知来源Mp305共享祖源。与已知来源的分子区别示于以下实施例3中。
从杂交NC262A x MN8产生定位群体。(MN8是中度易感近交系。)该群体进行了三次自花授粉，以产生具有310个F2:S2家系的群体。在增强的平衡不完全区组设计中对这些家系进行了两年的试验，每年重复两次。在每个子块中，两个具有中等ASR易感性的近交系用作重复对照。如上所述进行接种和评级。这两年的茎腐病综合得分如下表1所示，更高的值表示植物中更多的腐烂：
表1.两年的茎腐病综合得分
| 平均值 | 15.77 |
| 最小值 | 5.15 |
| 最大值 | 32.21 |
| 方差 | 19.19 |
P＝0.028，通过Cramer-Von Mises正态性检验
在具有30,000个所查询单核苷酸多态位点(SNP)的Affymetrix定制玉蜀黍芯片上对这些品系的一批六株植物进行了基因型分型。使用RQTL(QGene.org)进行复合区间分析。参见Broman KW,Wu H,Sen
Churchill GA(2003)R/qtl:QTL mapping in experimentalcrosses.Bioinformatics 19:889-890。复合区间定位揭示了两个非常重要的QTL，如下表2所示：
表2.按R/qtl得出的数量性状基因座分析结果
使用这些结果，选择了五个ASR抗性品系的后代，这些后代对于4号染色体上的易感(MN8)等位基因而言是杂合的，和/或在6号染色体上的支持区间中是杂合的。这样，可以更好地分离出6号染色体基因座的作用。选择了这些品系并进行自花授粉，以在该区域中找到另外的重组并绘制精细图谱。在田间测定了S4品系，重复三次，每次重复中接种六株植物。每个家系五株植物还进行了自花授粉以得到S5，供以后使用。测试了351个品系的ASR抗性，重复三次，每次重复有五到六株植物，使用增强的平衡不完全区组设计。
对比了茎腐病反应分布的涵盖平均值之上和之下大约1.5的标准差的尾部中的家系的等位基因频率(NC262A SNP相比于MN8 SNP)。在那些尾部(抗性尾部中有43个品系，并且易感尾部有36个品系)中，具有最高对比度的SNP基因座在IBM4 map v2上在85.92与86.25cM之间相对于预期1:1比率的卡方偏差为29.3(P<0.0001)。这些边界分别在SNP标记Affx-90199961与PZE-106073551之间。
Affx-90199961的序列为：
ACACATACCACCTTGCTCTCTTCACGAGCTGAAATGCACAACCGAACAACGTTTTCCCGCCCATTTTTTTTTTTGTTCTTCCAGCAGCGTCTTACCAACCNTATAACTGCAGATGTGTACAGGCGCGCATACTGACAGAGAGCGTAGAATGNTACAGCAGTGTGGTCCTTTGTCGATTTTATATTAATTTGTATGAC(SEQ ID NO:415)。
PZE-106073551的序列为：
CTATTACCTCCACCAAAAGGGACGATACATGGCTCTCTGTCCACCCGTCGTCATGTTTGCCCTATGCTCATGGCTCACCTACGTGCTCATCAAGAACTACNACCGCTCTCTTAATATCACCGTATTCATAACGGTCGTCTTGGCATTCCTGGAGTTATACCAGCTCTACTTGTACATAGCCTCTGGTTGGTTCAAGGTGGC(SEQ ID NO:416)。
PZE-104115065的序列为：
TTTTGGTGATCTTCATCTGTTGCTACCAAAAAACAGTTAAAAGACAAACA[T/C]GCT GCATATCTCAAAGTTTCAAGGTTGGAGAAGTTCTTTCATGAACTGTC(SEQ ID NO:417)。
还在具有至少3个个体的家系中对比了NC262A与MN8等位基因。这是用137个此类家系进行的有力分析。在逐步线性混合模型中分析了狭窄区域中的所有26个SNP。在该模型中，将SNP作为固定效应处理，并且将家系作为随机效应处理：
得分＝平均值+SNP+家系+残差
结果(表3)与卡方分析几乎相同，卡方分析涉及最具抗性和易感的尾部。一个高显著性区间从PZE.106072681(P<1.25E-16)延伸到PZE.106074560(P<4.26E-14)。在此区间内，相对于预期1:1比率的最大偏差在ZmSYNBREED_54946_787(P<2.10E-25)与ZmSYNBREED_54956_986(P<1.58E-25)之间。
表3：在该非常重要的区间中用137个此类家系进行的分析的结果
然后选择了132个家系的S5自花授粉后代，这些后代对于用于进行基因型分型的此区间的全部或部分而言是杂合的，以在此区间内鉴定另外的重组，以进一步描绘QTL位置。在此区域内用14个基因富含的KASP SNP(LCG，英国米德尔塞克斯)对5,022株植物(加上亲本对照)进行了基因型分型。借助PCR，KASP技术在所查询碱基处为每个多态性放置了不同的荧光。
然后对那些在此区域内显示出重组的植物进行了表型分型。与茎秆分割程序分开，按所述的进行表型分型。
然后使用这些结果验证并进一步缩小该区间。
选择了以上定位阶段的90个S6后代，其基因型在该区域中是纯合的并显示出过去有重组。它们的S5祖先在先前的测试阶段具有一系列表型。如下对这些后代进行了表型分型，重复三次，每次重复有六株植物。在开花时，将3x 105个禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)孢子小心地接种到所有植物的下茎秆中。然后在生理成熟时如上所述小心地将它们分割开，然后如上所述进行表型评分并根据1到9标度进行评级。9分指示真菌生长没有扩散，而1分指示植物完全腐烂。
还选择了55个杂合且已经在各种标记之间重组的S6品系。对这些品系进行了表型分型，重复6次，每次重复有6株接种的植物，以解释变异性。使用这些品系的平均值进行分析。使用3种等位基因类别(AA、AB和BB)的平均值进行分析，其中A表示来自抗性亲本的区段，并且B表示来自易感亲本的区段。
由于复制水平较低，家系内的正交对比(近等值线)是不确定的。进行了更有力的分析，其中将所有更具抗性的尾部与平均值的更易感的“尾部”进行了比较。根据相同的1到9标度，选择了茎腐病评级超过7或在5.5之下的先验定界值，因为从视觉上看，这些组代表相当具抗性的集合(超过7)与相当易感的集合(在5.5之下)。对于茎腐病，在R2阶段进行评级是最佳的，因为在后期进行评级将导致一些中间家系表现为完全易感。
使用卡方分析逐标记对S6品系的“尾部”进行了对比。在哈迪-温伯格平衡下，如果没有标记-性状关联，则预期每个标记基因座处的尾部之间的等位基因频率相等。偏离H-W平衡表明存在连锁抗性基因。结果示于下表4中。
表4.定位群体S6品系的不同表型尾部的卡方对比分析。
来自以上分析的结果表明，抗性的一个或多个因果基因位于AGP v4.0物理图谱位置chr6:129032506与chr6:129436586之间，距离为404,080个碱基对。
为了进一步缩小定位区间，在一个位置再次对新的纯合子重组植物(来自15个家系的76株植物)进行了表型分型，每株重组植物重复两次和重复三次。在左侧位点有四株重组植物并且右侧位点有三株重组植物的情况下，可以确定新的区间是从标记PZE-106073330(B73AGPv04 132828359bp)到Affx-90423958(B73AGPv04 133070737)(进一步参见下表11)。
实施例2.茎秆分割机仪器的开发
开发了一种茎秆分割机仪器，目的是在田间更安全且有效地分割茎秆。该茎秆分割机具有坚固的铝制主体，所述铝制主体在中间具有使切断的茎秆穿过的孔。参见例如，图5和图6。刀片在孔上方居中，以分割开茎秆。刀片是可易于拆除的，以进行磨刀。在操作期间，该茎秆分割机最初定位在玉米茎秆上方，使得玉米茎秆的顶部刚好放入孔中。
在刀片的下方是两个滚轴，它们推进茎秆以使其居中，使得可变直径茎秆的切口始终位于中间。这些滚轴被弹簧张紧，所述弹簧位于从分割机主体中的中心孔在滚轴的任一侧上水平钻出的通道中。
该茎秆分割机通过向玉米茎秆施加向下的力来切割玉米茎秆。
该茎秆分割机装置具有从外顶部向上延伸的50cm的手柄，以使得使用者能够在站立时将切断的茎秆一直向下推至地面。手柄示于图3中。
贯穿本文所述的实施例，通过用致病生物体(例如，禾生炭疽菌(Colletotrichumgraminicola)或轮枝镰孢菌)接种茎秆来对玉米茎秆进行表型分型。在生理成熟时，用修枝器在约0.7m高的地方切断接种的植物。通过将茎秆分割开以进行视觉评级来评估内部腐烂的程度。
实施例3.对4号染色体上的抗性基因座的评价
进行PCR扩增以扩增4号染色体上的序列，特别是在美国专利号8,062,847中描述的那些，将其通过引用以其整体并入本文。对于由SEQ ID NO:50覆盖的基因区间，五个重叠的扩增子共同来自5'端(附录1)。然而，Mp305在该区间的末端产生了扩增子，而NC262A和NC342则没有。
根据图2所示的扩增子序列的比较可以鉴定出在Mp305和DW1035之间与NC262a和NC342之间的几个单核苷酸多态性(SNP)。特别地，表5显示了图2所示的扩增子内在Mp305和DW1035之间与NC262a和NC342之间的十个示例性多态性。在两种情况下，SNP导致氨基酸序列的改变，如表5中标题为“效果”的列所示。
表5.
| SNP | 扩增子 | 外显子/内含子 | 多态性 | 效果 |
| 1 | 2 | 内含子 | A→C | 沉默 |
| 2 | 2 | 内含子 | G→C | 沉默 |
| 3 | 2 | 内含子 | C→T | 沉默 |
| 4 | 2 | 内含子 | C→A | 沉默 |
| 5 | 2 | 内含子 | A→T | 沉默 |
| 6 | 3 | 外显子2 | A→G | 赖氨酸(L)→精氨酸(R) |
| 7 | 4 | 外显子2 | A→G | 沉默 |
| 8 | 4/5 | 外显子2 | G→A | 沉默 |
| 9 | 6 | 外显子2 | C→A | 丝氨酸(S)→精氨酸(R) |
| 10 | 6 | 外显子2 | A→C | 沉默 |
在美国专利号8,062,847的表7中，显示Mp305及其抗性后代在SEQ ID NO:50的位置1308处具有C。其他基因型缺少含有此碱基的片段，并且在其他位置处具有多态性。在Mp305、其后代DW1035以及NC262A和NC342中包括新型插入片段。在该专利中测试的其他基因型以及在表6中进行基因型分型和显示的那些缺少这些扩增子。
重要的是要注意，Mp305和DW1035的扩增子超出了该专利中指定的区域，而NC262A和NC342则没有。NC262A和NC342在所有五个扩增子上都具有一定的同一性水平。这些品系在4号染色体上具有两个不同的等位基因，如表3和表4进一步所证明。除了具有较短的插入片段以外，在它们之间还有至少10个SNP。
在4号染色体上的等位基因变体NC262A和NC342中鉴定出所选SNP。参考SEQ IDNO:50(与美国专利号8,062,847的SEQ ID NO:1相同)确定共有序列位置。使用公开的序列，分析了美国专利号8,062,847的表7中描绘的碱基。数据示于下表6中，“NA”表示“未扩增”。用于检测4号染色体中的SNP的引物序列示于表7中。
表6.
表7.用于检测表6的SNP的标记：4号染色体引物
表6中的数据表明，来自NC262A和NC342的抗性等位基因是相同的。这些抗性等位基因与来自Mp305的抗性等位基因是等位的，但是由于其截短的长度和许多SNP而在状态上不同。使用这些标记，这些等位基因仅在位置1308处相似。
对于NC262A或NC342等位基因，在此基因区域之外使用KASP标记经由标记辅助回交(MABC)对具有ASR抗性的近交系进行选择是有效的。
实施例4.对6号染色体上的抗性基因座中的基因的评价
如上所述，已经对6号染色体上的区域进行精细定位。表8显示了候选基因，其抗性表型已经在精细定位的区域中被鉴定为与6号染色体上的性状紧密相关联。
表8. 6号染色体上的ASR基因座中的候选基因
基因的参与可以通过几种手段来验证。已经通过自交获得的定位群体产生了许多对近等基因品系，其供体或易感亲本片段在S5子代之间不同。对大约这样的16对的对比表型进行正交比较将进一步确认哪个片段含有致病基因。此外，通过定量PCR对基因进行表达分析将揭示差异表达。
将使用从提取自受感染的茎节区域的RNA产生的cDNA文库。一个这样的基因是钙依赖性蛋白激酶(CDPK)的基因。
通过经由诱变(即TILLING(定向诱导基因组局部突变(Targeted Induced LocalLesions in Genomes)))敲除推定的抗性基因，也显示出组成型或诱导的抗性(Gilchrist,E.等人,TILLING is an effective reverse genetics technique for C.elegans.BMCGenomics,2006,7(1),262.)。在此类情况下，终止密码子、移码或非同义突变使得基因产物无效。
在6号染色体上，通过引用以其整体并入本文的专利公开案WO/2015088970描述了对与本文所述的单体型相关的ASR抗性的选择。分析了上表6中描绘的碱基。表9所示的在6号染色体上发现的抗性来源在以粗体描绘的碱基处具有多态性。在等位基因变体NC262A中鉴定出在WO 2015/088970中未描述的另外SNP，并且示于下表9中。表9所示的6号染色体上的基因座(C16759-001-K1)是在WO 2015/088970中未描述的独特等位基因。
表9.与WO 2015/088970相比的6号染色体上的基因座SNP标记
| 基因座SNP | NC262A | WO 2015088970 |
| C12305-001-K1 | C:C | C:C |
| C12307-001-K1 | C:C | C:C |
| C16759-001-K1 | G:G | A:A |
| C16760-001-K1 | G:G | G:G |
| C12314-001-K1 | A:A | A:A |
用于检测这些SNP的引物序列示于表10中。
表10.用于检测表9中的SNP的引物序列
可以通过几种手段来验证候选基因在炭疽茎腐病抗性中的参与。已经通过自交获得的定位群体产生了许多对近等基因品系，其供体或易感亲本片段在S5子代之间不同。对大约这样的16对的对比表型进行正交比较将进一步确认哪个片段含有致病基因。此外，通过定量PCR对基因进行表达分析将揭示差异表达。通过经由诱变(即TILLING(定向诱导基因组局部突变))敲除推定的抗性基因，也可以显示出组成型或诱导的抗性(Gilchrist,E.等人,TILLING is an effective reverse genetics technique for C.elegans.BMCGenomics,2006,7(1),262.)。在此类情况下，终止密码子、移码或非同义突变使得基因产物无效。
如表11所示，通过鉴定另外的重组体，对6号染色体上的QTL进行进一步定位。基于这些重组体，已经将炭疽茎腐病抗性候选基因列表缩小为两个基因：根据B73AGPv04的注释鉴定的Zm00001d037650和Zm00001d037651。
表11：6号染色体上的炭疽茎腐病抗性候选基因
根据玉蜀黍参考基因组的不同形式，这两个候选基因在6号染色体上的位置示于表12中。例如，表12显示了这些基因在较旧的基因组参考B73AGPv02(标识符：GRMZM2G002656和GRMZM2G145589)和最新的参考B73AGPv05(标识符：Zm00001e031194和Zm00001e031197)中的注释。
表12：炭疽病抗性候选基因的注释
注意到这些基因座的序列注释在B73AGPv04与B73AGPv05序列之间有变化。候选基因Zm00001e031194在NC262A基因型中的基因组序列(ZmNC262Av2c_OGOO1508HC.1)提供于SEQ ID NO:266中。候选基因Zm00001e031194在NC262A基因型中的推定cDNA提供于SEQ IDNO:267(ZmNC262Av2c_OGOO1508HC.1)中。由SEQ ID NO:267编码的蛋白质提供于SEQ IDNO:268中。候选基因Zm00001e031197在NC262A基因型中的基因组序列(ZmNC262Av2c_OGOO1512HC.1)提供于SEQ ID NO:269中。候选基因Zm00001e031197在NC262A基因型中的cDNA提供于SEQ ID NO:270(ZmNC262Av2c_OGOO1512HC.1)中。由SEQ ID NO:270编码的蛋白质提供于SEQ ID NO:271中。
两个候选基因Zm00001e031194和Zm00001e031197都位于源自NC262A的重叠群(称为MA_NC262A_v2.重叠群81)上。新标记位置PZE-106073330-Affx-90423958之间的完整基因组序列示于SEQ ID NO:272中。源自来源NC262A的此重叠群可以用作用于筛选抗性基因座的标记的靶标。表13列出了可用于鉴定炭疽茎腐病抗性基因座并在育种选择期间跟踪炭疽茎腐病抗性基因座的根据B73AGPv04基因组序列编号的多态性。
表13：有用的多态性
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本公开文本的范围不受本文所述的具体实施方案的限制。实际上，根据前述描述和附图，除了本文所述的那些以外，本公开文本的各种修改对于本领域技术人员而言也将变得清楚。此类修改旨在落入所附权利要求的范围内。应进一步理解的是，所有值都是近似的，并且是为了描述而提供的。
贯穿本申请引用了专利、专利申请、出版物、产品说明书和方案，将其公开内容出于所有目的通过引用以其整体并入本文。
通过引用并入
将本文引用的所有参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请都出于所有目的通过引用以其整体而并入。然而，提及本文引用的任何参考文献、文章、出版物、专利、专利公开案和专利申请并非并且不应当被视为承认或以任何形式暗示它们构成有效的现有技术或形成世界上任何国家公知常识的一部分。
本公开文本的编号实施方案
尽管有所附权利要求，但本公开文本阐述了以下编号实施方案：
1.一种鉴定对炭疽茎腐病表现出增强的抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测
a.在6号染色体上的抗性基因座处至少两个标记的存在，所述抗性基因座包含C16759-001-K1处的“G”和以下单核苷酸多态性之一：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
b.在6号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，所述抗性基因座包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个，
其中(a)的所述至少两个标记和/或(b)的所述至少一个标记与6号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联。
2.根据实施方案1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。
3.根据实施方案1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。
4.根据实施方案1所述的方法，其中6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
5.根据实施方案1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
6.根据实施方案1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
7.根据实施方案1所述的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测在来自实施方案1(b)的6号染色体上的所述抗性基因座处至少一个等位基因的存在或不存在。
8.根据实施方案1-7中任一项所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测C16759-001-K1处的“G”。
9.根据实施方案1至8中任一项所述的方法，其中至少一个核苷酸多态性的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增包含所述核苷酸多态性中的一个或多个的核酸序列。
10.根据实施方案9所述的方法，其中所述核苷酸多态性选自表13中所列举的变体核苷酸。
11.根据实施方案1至10中任一项所述的方法，其中包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增所述等位基因的核酸序列。
12.根据实施方案11所述的方法，其中所述引物包含序列AATTATGCTGATGA(SEQIDNO:413)。
13.一种选择具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括按照根据实施方案1至12中任一项所述的方法鉴定所述玉蜀黍植物，以及如果检测到6号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记的存在或不存在，则将所述玉蜀黍植物选择为具有炭疽茎腐病抗性。
14.根据实施方案13所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与所述一个或多个核苷酸多态性紧密连锁且关联。
15.根据实施方案14所述的方法，其中所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与所述单核苷酸多态性连锁。
16.根据实施方案13至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁且关联。
17.根据实施方案16所述的方法，其中所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁。
18.根据实施方案13至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含表13中所列举的变体核苷酸多态性的所述等位基因连锁且关联。
19.根据实施方案1至17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所鉴定的玉蜀黍植物与另一株玉蜀黍植物回交，优选包括将6号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A的基因型中。
20.一种将与炭疽茎腐病抗性相关的等位基因渗入到玉蜀黍植物中的方法，所述方法包括：
a.用检测6号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定筛选群体，所述抗性基因座包含：
(i)以下单核苷酸多态性：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16759-001-K1处的“G”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
(ii)表13中所列举的变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
b.从所述群体中选择至少一株玉蜀黍植物，所述至少一株玉蜀黍植物包含6号染色体上的所述抗性基因座或包含C16759-001-K1处的“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
c.将所述至少一株玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
d.评价后代植物中C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的存在；以及
e.选择具有C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的后代植物。
21.根据实施方案20所述的方法，其中所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的所述“G”的5cM内。
22.根据实施方案20所述的方法，其中所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的所述“G”的1cM内。
23.根据实施方案20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。
24.根据实施方案20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。
25.根据实施方案20所述的方法，其中6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ IDNO:272或其片段。
26.根据实施方案20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％序列同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
27.根据实施方案20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
28.一种选择对炭疽茎腐病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
a.获得在其基因组内包含单体型的第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下单核苷酸多态性中的一个或多个：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16759-001-K1处的“G”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
表13中所列举的变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
b.将所述第一玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
c.评价后代植物的a.中的所述单体型或与b.中的所述单体型连锁且关联的至少一个标记等位基因；以及
d.选择具有a.中的所述单体型的后代植物。
29.根据实施方案28所述的方法，其中在(a)中获得在其基因组内包含单体型的所述第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下中的一个或多个：C16759-001-K1处的“G”或表13中所列举的变体核苷酸多态性。
30.一种核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
i.SEQ ID NO:266、267、269、270或272的核苷酸序列，
ii.具有SEQ ID NO:212或215的编码序列的核苷酸序列，
iii.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
iv.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
v.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
vi.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
vii.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
viii.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
31.一种表达盒，所述表达盒包含与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接的根据实施方案30所述的核酸分子。
32.一种用于在玉蜀黍植物中赋予或提高对炭疽茎腐病的抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将根据实施方案30所述的核酸分子引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；
(b)任选地从所述至少一个细胞再生或生长植物，以及
(c)使所述核酸分子在所述植物中表达。
33.一种用于产生具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将根据实施方案30所述的核酸分子或根据实施方案31所述的表达盒引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；或
(b.1)将定点核酸酶和修复基质引入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中，其中所述定点核酸酶能够在所述至少一个细胞的基因组中产生至少一个DNA双链断裂，并且所述修复基质包含根据实施方案30所述的核酸分子或其片段；
(b.2)在允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养(b.1)的所述至少一个细胞，其中所述核酸分子从所述修复基质整合到所述玉蜀黍植物的基因组中；以及
(c)从所述至少一个细胞获得具有炭疽茎腐病抗性的所述植物。
34.根据实施方案33所述的方法，其中所述定点核酸酶包括锌指核酸酶，转录激活因子样效应物核酸酶，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统在内的CRISPR/Cas系统，工程化归巢核酸内切酶和大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段。
35.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物是按照根据实施方案1-19中任一项所述的方法鉴定的，或按照根据实施方案33或实施方案34所述的方法产生的。
36.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括按照根据实施方案20-27中任一项所述的方法将所述抗性基因座渗入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
37.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将根据实施方案30所述的核酸分子渗入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
38.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将根据实施方案30所述的核酸分子引入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
39.一种根据实施方案35-38中任一项所述的玉蜀黍植物的种子或植物部分。
Claims (39)
1.一种鉴定对炭疽茎腐病表现出增强的抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测
a.在6号染色体上的抗性基因座处至少两个标记的存在，所述抗性基因座包含C16759-001-K1处的“G”和以下单核苷酸多态性之一：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
b.在6号染色体上的抗性基因座处至少一个标记的存在，所述抗性基因座包含表13中所列举的变体核苷酸多态性中的至少一个，
其中(a)的所述至少两个标记和/或(b)的所述至少一个标记与6号染色体上的所述抗性基因座紧密连锁且关联。
2.根据权利要求1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。
3.根据权利要求1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。
4.根据权利要求1所述的方法，其中6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
5.根据权利要求1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
ix.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
x.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
xi.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
xii.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
xiii.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
xiv.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
xv.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
xvi.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
6.根据权利要求1所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
7.根据权利要求1所述的方法，所述方法包括在所述玉蜀黍植物中检测在来自权利要求1(b)的6号染色体上的所述抗性基因座处至少一个等位基因的存在或不存在。
8.根据权利要求1-7中任一项所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座处的所述至少一个标记检测C16759-001-K1处的“G”。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中至少一个核苷酸多态性的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增包含所述核苷酸多态性中的一个或多个的核酸序列。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述核苷酸多态性选自表13中所列举的变体核苷酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法，其中包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因的存在或不存在通过用引物对存在于所述玉蜀黍植物中的核酸进行聚合酶链式反应扩增来检测，所述引物被配置成特异性扩增所述等位基因的核酸序列。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述引物包含序列AATTATGCTGATGA(SEQ IDNO:413)。
13.一种选择具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括按照根据权利要求1至12中任一项所述的方法鉴定所述玉蜀黍植物，以及如果检测到6号染色体上的所述抗性基因座处所述至少一个标记的存在或不存在，则将所述玉蜀黍植物选择为具有炭疽茎腐病抗性。
14.根据权利要求13所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与所述一个或多个核苷酸多态性紧密连锁且关联。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与所述单核苷酸多态性连锁。
16.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁且关联。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述另外的标记等位基因在基于单次减数分裂的遗传图谱上以不超过2cM与包含C16759-001-K1处的“G”的所述等位基因连锁。
18.根据权利要求13至15中任一项所述的方法，所述方法进一步包括选择包含至少一个另外的标记等位基因的所述玉蜀黍植物，所述至少一个另外的标记等位基因与包含表13中所列举的变体核苷酸多态性的所述等位基因连锁且关联。
19.根据权利要求1至17中任一项所述的方法，所述方法进一步包括将所鉴定的玉蜀黍植物与另一株玉蜀黍植物回交，优选包括将6号染色体上的所述抗性基因座回交到不是NC262A的基因型中。
20.一种将与炭疽茎腐病抗性相关的等位基因渗入到玉蜀黍植物中的方法，所述方法包括：
a.用检测6号染色体上的抗性基因座处的至少一个标记的核酸测定筛选群体，所述抗性基因座包含：
(i)以下单核苷酸多态性：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16759-001-K1处的“G”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
(ii)表13中所列举的变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
b.从所述群体中选择至少一株玉蜀黍植物，所述至少一株玉蜀黍植物包含6号染色体上的所述抗性基因座或包含C16759-001-K1处的“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
c.将所述至少一株玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
d.评价后代植物中C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的存在；以及
e.选择具有C16759-001-K1处的所述“G”和/或表13中所列举的所述变体核苷酸多态性中的一个或多个的后代植物。
21.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的所述“G”的5cM内。
22.根据权利要求20所述的方法，其中所述至少一个标记位于C16759-001-K1处的所述“G”的1cM内。
23.根据权利要求20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于标记PZE-106066805与PZE-106075546之间的染色体区间上。
24.根据权利要求20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座位于根据B73AGPv05基因组序列编号的139646631与139889078之间的染色体区间上。
25.根据权利要求20所述的方法，其中6号染色体的所述抗性基因座包含SEQ ID NO:272或其片段。
26.根据权利要求20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
ix.SEQ ID NO:266或269的核苷酸序列，
x.具有SEQ ID NO:267或270的编码序列的核苷酸序列，
xi.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
xii.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
xiii.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
xiv.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
xv.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
xvi.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％序列同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
27.根据权利要求20所述的方法，其中6号染色体上的所述抗性基因座源自NC262A。
28.一种选择对炭疽茎腐病表现出抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括：
a.获得在其基因组内包含单体型的第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下单核苷酸多态性中的一个或多个：
-C12305-001-K1处的“C”，
-C12307-001-K1处的“C”，
-C16759-001-K1处的“G”，
-C16760-001-K1处的“G”，
-C12314-001-K1处的“A”；和/或
表13中所列举的变体核苷酸多态性中的一个或多个；以及
b.将所述第一玉蜀黍植物与第二玉蜀黍植物杂交；
c.评价后代植物的a.中的所述单体型或与b.中的所述单体型连锁且关联的至少一个标记等位基因；以及
d.选择具有a.中的所述单体型的后代植物。
29.根据权利要求28所述的方法，其中在(a)中获得在其基因组内包含单体型的所述第一玉蜀黍植物，所述单体型包含以下中的一个或多个：C16759-001-K1处的“G”或表13中所列举的变体核苷酸多态性。
30.一种核酸分子，所述核酸分子包含选自以下的一个或多个核苷酸序列：
ix.SEQ ID NO:266、267、269、270或272的核苷酸序列，
x.具有SEQ ID NO:212或215的编码序列的核苷酸序列，
xi.与来自i.或ii.的序列互补的核苷酸序列，
xii.与来自i.、ii.或iii.的序列具有至少80％同一性的核苷酸序列，
xiii.根据遗传密码的简并性，与根据i.、ii.或iii.的核酸序列不同的核苷酸序列，
xiv.在严格条件下与根据i.、ii.或iii.的核酸序列杂交的核苷酸序列，
xv.编码包含SEQ ID NO:268或271的序列的蛋白质的核苷酸序列，或
xvi.编码包含与SEQ ID NO:268或271的序列具有至少80％同一性的序列的蛋白质的核苷酸序列。
31.一种表达盒，所述表达盒包含与异源调节元件、优选与异源启动子可操作地连接的根据权利要求30所述的核酸分子。
32.一种用于在玉蜀黍植物中赋予或提高对炭疽茎腐病的抗性的方法，所述方法包括以下步骤：
(d)将根据权利要求30所述的核酸分子引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；
(e)任选地从所述至少一个细胞再生或生长植物，以及
(f)使所述核酸分子在所述植物中表达。
33.一种用于产生具有炭疽茎腐病抗性的玉蜀黍植物的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)将根据权利要求30所述的核酸分子或根据权利要求31所述的表达盒引入或渗入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中；或
(b.1)将定点核酸酶和修复基质引入到玉蜀黍植物的至少一个细胞中，其中所述定点核酸酶能够在所述至少一个细胞的基因组中产生至少一个DNA双链断裂，并且所述修复基质包含根据权利要求30所述的核酸分子或其片段；
(b.2)在允许进行同源定向修复或同源重组的条件下培养(b.1)的所述至少一个细胞，其中所述核酸分子从所述修复基质整合到所述玉蜀黍植物的基因组中；以及
(c)从所述至少一个细胞获得具有炭疽茎腐病抗性的所述植物。
34.根据权利要求33所述的方法，其中所述定点核酸酶包括锌指核酸酶，转录激活因子样效应物核酸酶，包括CRISPR/Cas9系统、CRISPR/Cpf1系统、CRISPR/CasX系统、CRISPR/CasY系统在内的CRISPR/Cas系统，工程化归巢核酸内切酶和大范围核酸酶和/或其任何组合、变体或催化活性片段。
35.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物是按照根据权利要求1-19中任一项所述的方法鉴定的，或按照根据权利要求33或权利要求34所述的方法产生的。
36.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括按照根据权利要求20-27中任一项所述的方法将所述抗性基因座渗入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
37.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将根据权利要求30所述的核酸分子渗入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
38.一种玉蜀黍植物，所述玉蜀黍植物包含与炭疽茎腐病抗性相关的抗性基因座，其中所述玉蜀黍植物通过包括将根据权利要求30所述的核酸分子引入到所述玉蜀黍植物中的方法来制备。
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Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| CB02 | Change of applicant information |
Address after: Indiana, USA Applicant after: Aige Trust Gene Co.,Ltd. Applicant after: Limagalan Europe Simplified AG Applicant after: Kwassat Co. Address before: Indiana, USA Applicant before: Aige Trust Gene Co.,Ltd. Applicant before: Lima Grande Europe AG Applicant before: Kwassat Co. |
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| CB02 | Change of applicant information |