CN105273013B

CN105273013B - 一种制备短小蛇根草苷的方法

Info

Publication number: CN105273013B
Application number: CN201410235324.3A
Authority: CN
Inventors: 萧伟; 王振中; 丁岗; 李兆亮; 刘文君; 孟兆青; 孙林; 杨彪; 齐晓辉
Original assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 2014-05-29
Filing date: 2014-05-29
Publication date: 2018-05-22
Anticipated expiration: 2034-05-29
Also published as: CN105273013A

Abstract

本发明属于药物化学领域，公开了一种制备短小蛇根草苷的方法。本发明所述制备短小蛇根草苷的方法以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。由于异长春花苷内酰胺在胆木中含量非常高，且采用柱层析方法即可分离获得异长春花苷内酰胺，因此本发明所述制备短小蛇根草苷的方法原料来源广泛。而且本发明所述制备方法操作简单、绿色环保，同时短小蛇根草苷收率大于70％。

Description

一种制备短小蛇根草苷的方法

技术领域

本发明属于药物化学领域，具体涉及一种制备短小蛇根草苷的方法，尤其涉及一种以异长春花苷内酰胺为原料制备短小蛇根草苷的方法。

背景技术

胆木(Nauclea officinalis Pierre ex Pitard)为茜草科乌檀属乔木，又名药乌檀、山熊胆、熊胆树，主要分布广东、广西和海南等地区，为我国重点保护的珍稀野生植物种之一。胆木以枝、干、皮入药，味苦、性寒，具有清热解毒、消肿止痛作用。我国南方民间常用于感冒发热、急性扁桃体炎、咽喉炎、乳腺炎、肺炎、肠炎、痢疾、湿疹、皮疹、脓疡、尿路感染、胆囊炎、下肢溃疡、脚癣感染等病的治疗，同时也是一味黎族医学常用植物药，收载于《黎族医药》。临床有以胆木心材为原药材制备的“胆木注射液”和“胆木浸膏片”，用于急性扁桃腺炎、急性咽喉炎、急性结膜炎及上呼吸道感染的治疗。

胆木中主要含有生物碱和五环三萜等多种化合物成分，其中以生物碱类成分居多，主要为吲哚类生物碱，包括异长春花苷内酰胺、短小蛇根草苷、3-表短小舌根草苷和喜果苷等。其中异长春花苷内酰胺为胆木中主要生物碱，具有抗肿瘤、抗菌、抗疟疾等生物活性。胆木中异长春花苷内酰胺含量非常高，采用柱层析方法可以分离获得异长春花苷内酰胺。

而短小蛇根草苷(pumiloside，PML)为喹啉酮类生物碱，也是胆木的主要活性成分之一，分子式为C₂₆H₂₈N₂O₉，分子量为513，溶于甲醇,难溶于水和乙酸乙酯，具有抗菌、抗肿瘤、抗增殖等多种作用，其作为抗肿瘤药物喜树碱生物合成的重要中间体，有较大的研究价值。

目前短小蛇根草苷的主要来源为从胆木中分离提取，但是胆木中短小蛇根草苷含量较低，从胆木中分离纯化短小蛇根草苷较困难。因此，提供一种原料来源广泛的制备短小蛇根草苷的方法具有重要意义，可以为合成抗肿瘤药物喜树碱及制备抗菌、抗肿瘤、抗增殖的药物提供重要原料。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种原料来源广泛的制备短小蛇根草苷的方法，所述制备方法原料来源广泛，操作简单，绿色环保，短小蛇根草苷收率高。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

一种制备短小蛇根草苷的方法为以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。

优选的，所述制备方法具体为异长春花苷内酰胺用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次用水、10％～30％乙醇、40％～60％乙醇洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱液，浓缩干燥即得。

优选的，还包括对收集的40％～60％乙醇洗脱液进行脱水处理的步骤。

优选的，还包括甲醇结晶的步骤。

优选的，在充入氧气后还包括灭菌的步骤。

优选的，所述100℃～150℃灭菌0.3h～1h。。

优选的，所述密封容器为西林瓶。

优选的，所述光照为自然光。

优选的，所述光照处理时间为7天

优选的，所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂。

由上述技术方案可知，本发明提供了一种制备短小蛇根草苷的方法。本发明所述制备短小蛇根草苷的方法以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。由于异长春花苷内酰胺在胆木中含量非常高，且采用柱层析方法即可分离获得异长春花苷内酰胺，因此本发明所述制备短小蛇根草苷的方法原料来源广泛。而且本发明所述制备方法操作简单、绿色环保，同时短小蛇根草苷收率大于70％。

附图说明

图1示实施例1不同处理的异长春花苷内酰胺溶液的HPLC分析图，横坐标为出峰时间，单位为min，其中A为充入O₂在避光条件下保存7天后的样品；B为充入N₂在光照条件下保存7天后的样品；C为充入空气在光照条件下保存7天后的样品；D为充入O₂在光照条件下保存7天后的样品；

图2示实施例2充入O₂在光照条件下保存7天后制备得到的异长春花苷内酰胺主要降解物的HPLC图，横坐标为出峰时间，单位为min，其中，A为1号色谱峰洗脱液分析图；B为1号色谱峰洗脱液放置3天后的分析图；C为2号色谱峰洗脱液分析图。

具体实施方式

本发明实施例公开了一种制备短小蛇根草苷的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。

为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：

申请人在研究异长春花苷内酰胺(strictosamide)水溶液对光照射的稳定性时，发现异长春花苷内酰胺在光照和充氧气的条件下发生了降解。HPLC检测异长春花苷内酰胺的水溶液，在光照和氧气的作用下，主要有2个降解产物，结果见图1。通过HPLC方法对降解产物进行分离。其中分离得到的1号降解产物在洗脱液中不稳定，重新分离仍然难以得到含单一色谱峰的洗脱液(见图2)。而将含有2号色谱峰的洗脱液浓缩、干燥，甲醇结晶，得白色的棒状结晶。对得到的白色的棒状结晶进行结构鉴定，1HNMR、13CNMR、HRMS结果表明其为短小蛇根草苷。

因此本发明提供了一种制备短小蛇根草苷的方法，以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷。

其中，上述反应的反应式如下：

进一步的，在一些实施方案中，所述制备方法具体为异长春花苷内酰胺用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次用水、10％～30％乙醇、40％～60％乙醇洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱液，浓缩干燥得到短小蛇根草苷。

按照本发明，所述制备短小蛇根草苷的方法中，所述溶解为超声波超声溶解。

本发明所述制备方法中将滤液装于密封容器中以保证密封条件。其中，在一些实施方案中，所述密封容器为西林瓶。

本发明所述制备方法中，所述在含有氧气的条件可以是持续通入氧气，也可以一次通入过量的氧气以保持含有氧气的条件。

在一些实施方案中，本发明所述制备方法中，所述光照为自然光。

在一些实施方案中，本发明所述制备方法中，所述光照为日光灯作为光源照射。

进一步的，本发明所述制备方法中，所述光照处理时间优选为5-10天。更优选为7天。

按照本发明，由于需要在光照条件下放置，且光照时间较长，因此为排除微生物影响，所述制备方法优选在充入氧气后还包括灭菌的步骤，以对异长春花苷内酰胺溶液进行灭菌。

进一步的，所述灭菌优选为高温灭菌。在一些实施方案中为100℃～150℃灭菌0.3h～1h。在一些具体实施例中为121℃灭菌20min。

大孔吸附树脂是一类不含交换基团且有大孔结构的高分子吸附树脂，具有良好的大孔网状结构和较大的比表面积，可以通过物理吸附从水溶液中有选择地吸附有机物。大孔吸附树脂理化性质稳定，不溶于酸、碱及有机溶剂，对有机物选择性好，不受无机盐等离子和低分子化合物的影响。本发明所述制备方法采用大孔吸附树脂吸附分离异长春花苷内酰胺降解反应液中的短小蛇根草苷。

按照本发明，所述大孔吸附树脂优选为非极性大孔吸附树脂。更优选为非极性苯乙烯型大孔吸附树脂，如HPD100、D-101、XAD-1、XAD-2、XAD-4。进一步的，所述大孔吸附树脂优选为HPD100大孔吸附树脂。

异长春花苷内酰胺降解反应液经大孔吸附树脂吸附后，需要经过洗脱液洗脱后才能获得短小蛇根草苷。所述洗脱具体为依次用水、10％～30％乙醇、40％～60％乙醇洗脱。其中水和10％～30％乙醇洗脱可以除去结合在大孔吸附树脂上的杂质。40％～60％乙醇洗脱大孔吸附树脂收集得到含有短小蛇根草苷的洗脱液。其中，上述乙醇溶液为乙醇的水溶液，所述百分比除特别说明外均为体积百分比。

申请人采用HPLC法对降解产物进行检测，结果显示含1号峰的洗脱液放置3天后1号峰的比例降低，2号峰的比例明显增加，表明1号峰可转化为2号峰。因此本发明所述制备方法在浓缩干燥前还包括脱水的步骤，以利于异长春花苷内酰胺氧化后的杂质峰转化为短小蛇根草苷，提高洗脱液中短小蛇根草苷的含量。具体为异长春花苷内酰胺用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，灭菌，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次用水、10％～30％乙醇、40％～60％乙醇洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱液，脱水，浓缩干燥得到短小蛇根草苷。

在某些具体实施利中，所述制备方法具体为异长春花苷内酰胺用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，灭菌，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，脱水，浓缩干燥得到短小蛇根草苷。

优选的，所述脱水具体为加热回流，收集回流液。

进一步的，所述制备方法还包括纯化步骤。所述纯化具体优选为甲醇结晶。短小蛇根草苷粗品经甲醇结晶得到短小蛇根草苷纯品。

为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明进行详细说明。其中实施例涉及的仪器与试剂如下：Aglient1100高效液相色谱仪，配备DAD检测器(美国Aglient公司)；Aglient1260制备液相色谱仪，配备MWD检测器(美国Aglient公司)；Aglient1290液质联用仪，配备DAD检测器、Q-TOF6538质谱仪(美国Aglient公司)；MettlerAE240电子分析天平(梅特勒-托利多仪器-上海有限公司)；YXQ-LS-30SⅡ型立式压力蒸汽灭菌锅(上海博讯实业有限公司)。异长春花苷内酰胺原料药(纯度大于98％，江苏康缘药业股份有限公司)；HPD100大孔吸附树脂(沧州宝恩有限公司)；色谱纯乙腈(美国TEDIA公司)；水为Milli-Q超纯水；其它试剂均为分析纯。

实施例1：异长春花苷内酰胺水溶液光照射稳定性研究

取异长春花苷内酰胺适量，用超纯水超声溶解，配制成约1.2mg/ml的溶液，滤过，将滤液分装至10ml的西林瓶中，分成三组，第一组向溶液中充入氮气，第二组向溶液中充入氧气，第三组为空气，压塞，轧盖，灭菌(温度：121℃；时间20min)。由于光照时间较长，为排除微生物影响，优选对异长春花苷内酰胺溶液进行高温灭菌。样品放至室温后取样，HPLC检测灭菌前后样品中异长春花苷内酰胺含量，然后将三组样品分别置于室温自然光照处和避光处保存，7天后分别取样，HPLC检测异长春花苷内酰胺含量。色谱条件：色谱柱为Penomenex C18(4.60×250mm，5μm)；流动相为乙腈-0.1％磷酸水，梯度洗脱条件为0～30min，乙腈15％～32％，30～50min，乙腈32％～95％；流速1mL/min；柱温30℃；检测波长226nm；进样量5μL。HPLC检测结果见表1、图1。

表1异长春花苷内酰胺在不同情况下的含量

注：灭菌前异长春花苷内酰胺的含量为100％

由表1结果可见，异长春花苷内酰胺在灭菌前后，含量无明显变化；避光放置后的三组样品中异长春花苷内酰胺含量均无明显变化，说明异长春花苷内酰胺水溶液在避光条件下稳定。而自然光下放置的样品中，充氧气和空气的样品中异长春花苷内酰胺含量明显降低，其中充氧气组降解率达58％，而充氮气组含量变化不明显，说明异长春花苷内酰胺的降解与光照和氧气有关。由图1可知，异长春花苷内酰胺在水溶液中主要产生2个降解产物。

实施例2：

称取异长春花苷内酰胺原料0.7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至20ml西林瓶中，充入氧气，压塞，轧盖，灭菌(温度：121℃；时间20min)。样品置于自然光照处放置7天，将反应液过HPD100大孔吸附树脂柱，依次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得含有主要降解物(图1中1号色谱峰和2号色谱峰)的干膏262mg；干膏用甲醇溶解，通过制备液相分离，流动相为乙腈-水(15:85)，分别收集含有1号、2号色谱峰的洗脱液。分离得到的1号降解产物在洗脱液中不稳定，重新分离仍难得到含单一色谱峰的洗脱液(见图2)。并且将含1号峰的洗脱液放置3天后1号峰的比例降低，2号峰的比例明显增加，表明1号峰可转化为2号峰。将含有2号色谱峰的洗脱液浓缩、干燥，干膏用甲醇结晶，得白色的棒状结晶58mg。

结构鉴定2号降解物的具体参数如下：HRMS calcd for C₁₈H₁₈O₆[M+H]⁺:513.18856，found513.18676.¹H NMR(DMSO-d6，500MHz)，δ:12.07(s，1H，NH)，8.13(d，J＝8.1Hz，1H，H-9)，7.67(m，1H，H-11)，7.60(d，J＝8.2Hz，1H，H-12)，7.35(m，1H，H-10)，7.05(d，J＝2.6Hz，1H，H-17)，5.81(m，1H，H-19)，5.48(dd，J＝17.1Hz，1.8Hz，1H，H-18)，5.40(d，J＝1.5Hz，1H，H-21)，5.35(dd，J＝17.1Hz，1.8Hz，1H，H-18)，4.77(br-d，J＝12.0Hz，1H，H-13)，4.55(d，J＝7.9Hz，1H，H-1’)，4.48(d，J＝14.0Hz，1H，H-5)，4.33(d，J＝14.0Hz，1H，H-5)，3.71(m，1H，H-6’)，3.44(m，1H，H-6’)，3.26(m，1H，H-15)，3.19(m，2H，H-5’，H-3’)，3.02(m，2H，H-4’，H-2’)，2.66(m，1H，H-20)，2.50(overlapped，H-14)，2.02(m，1H，H-14).¹³C NMR(DMSO，126MHz)δ172.9(C-7)，163.9(C-22)，149.5(C-2)，145.0(C-17)，140.3(C-13)，132.5(C-19)，131.5(C-11)，125.2(C-8)，124.7(C-9)，123.2(C-10)，120.4(C-18)，118.3(C-12)，112.9(C-6)，108.9(C-16)，97.8(C-1’)，94.8(C-21)，77.2(C-5’)，76.3(C-3’)，73.1(C-2’)，69.9(C-4’)，61.0(C-6’)，59.4(C-3)，47.40(C-5)，43.6(C-20)，28.1(C-14)，23.6(C-15).以上数据与短小蛇根草苷(pumiloside)基本一致。

实施例3：

称取异长春花苷内酰胺原料0.7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至20ml西林瓶中，持续通入氧气，100℃灭菌60min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反应液过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得粗品0.6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶，产率70％，纯度90％。对制得的粗品进行结构鉴定，结果同实施例2。

实施例4：

称取异长春花苷内酰胺原料0.7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至20ml西林瓶中，充入氧气，121℃灭菌20min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反应液过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、30％乙醇、60％乙醇洗脱，收集60％乙醇洗脱液，浓缩，干燥，得粗品0.6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶，产率72％，纯度95％。对白色棒状结晶进行结构鉴定，结果同实施例2。

实施例5：

称取异长春花苷内酰胺原料0.7g，用500ml超纯水超声溶解，滤过，滤液分装至20ml西林瓶中，充入氧气，150℃灭菌20min，然后样品置于自然光照处放置7天，将反应液过HPD100大孔吸附树脂柱，之后依次用水、20％乙醇、40％乙醇洗脱，收集40％乙醇洗脱液，加热回流，回流液浓缩，干燥，得粗品0.6g，粗品用甲醇结晶，得白色棒状结晶0.5g，产率75％，纯度95％。对白色棒状结晶进行结构鉴定，结果同实施例2。

以上实施例的说明只是用于帮助理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.一种制备短小蛇根草苷的方法，其特征在于，以异长春花苷内酰胺为原料，在含有氧气的密封条件下光照放置得到短小蛇根草苷；所述制备方法具体为异长春花苷内酰胺用水溶解，滤过，滤液装于密封容器中，充入氧气，光照处理后大孔吸附树脂吸附，之后依次用水、10％～30％乙醇、40％～60％乙醇洗脱，收集40％～60％乙醇洗脱液，浓缩干燥即得。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，还包括对收集的40％～60％乙醇洗脱液进行脱水处理的步骤。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，还包括甲醇结晶的步骤。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，在充入氧气后还包括灭菌的步骤。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述灭菌为100℃～150℃灭菌0.3h～1h。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述密封容器为西林瓶。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照为自然光。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述光照处理时间为7天。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述大孔吸附树脂为HPD100大孔吸附树脂。