CN107466322B - 突变型转氨酶及与其相关的方法和用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶、包含该转氨酶的融合蛋白、编码该转氨酶的多核苷酸、包含该多核苷酸、突变型转氨酶和/或融合蛋白的宿主细胞,用该突变型转氨酶或融合蛋白生产胺的方法、以及该突变型转氨酶或融合蛋白用于生产胺的用途。
Description
技术领域
本发明涉及相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶、包含该转氨酶的融合蛋白、编码该转氨酶的多核苷酸、包含该多核苷酸、突变型转氨酶和/或融合蛋白的宿主细胞、用该突变型转氨酶或融合蛋白生产胺的方法、以及该突变型转氨酶或融合蛋白用于生产胺的用途。
背景技术
转氨酶(也称为氨基转移酶)催化氨基转移反应,即将氨基从胺供体转移到胺受体,特别是酮的胺化以及胺的脱氨基,其中一个分子或结构域上的NH2基团与另一分子或结构域上的=O基团交换(参见方案1)。
胺化合物如手性胺是药学、农业化学或化学工业的重要组成基石。在许多这些应用中,非常重要是使用仅一种光学纯形式。化学合成已被建立起来用于生产这类化合物(例如使用过渡金属的非对称氢化),但是这些化学方法在产率、纯度和废物产生方面远远是不完美的。转氨酶催化的胺生产常是经典方法的有利替代方案,因此替代的或改进的转氨酶在该领域是有意义的。
如在使用工程化的(R)选择性转氨酶生产药物西格列汀(sitagliptin)中被很好展示的(Savile等人,2010;US 2015/0037869),通过酶介导的转氨作用生产手性胺与已建立的化学非对称合成相比是有利的。在这种情况下,通过定向进化方法全面地工程化改造了最初对所需底物无活性的胺转氨酶(ATA)。转氨酶的进一步突变在本领域中描述(Steffen-Munsberg等人,2013;Nobili等人,2015Deszcz等人,2015)。还可以使用其它酶来生产光学纯的手性胺和氨基酸,如单胺氧化酶、亚胺还原酶、氨基酸脱氢酶、解氨酶或氨基变位酶。尽管转氨酶可用于外消旋胺的动力学拆分,但从酮酸、酮或醛的非对称合成是非常重要的,因为它们可能潜在地导致理论上100%的转化,而动力学拆分模式中仅为50%的理论产率(参见方案1,图解合成以及动力学拆分)。
方案1:
残基Ra、Rb、Rc和Rd仅用于举例说明目的,应代表一般的有机残基。
然而,定向进化方法并不能使我们洞悉分子原因(例如关于较大体积底物的接受性)。转氨酶的高对映选择性推动了大、小结合口袋理论,然而,扩大小结合口袋以适应大体积的底物是不容易实现的目标,如以下事实所证明:迄今为止在文献中发现的大多数成功实例是转化甲基酮类化合物的转氨酶。
本发明的目的是设计相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶。优选地,它们应该能够接受宽范围的底物,特别是大体积的底物,特别是同时保持立体选择性,以及使用异丙胺作为供体。因此,增加的活性特别地与大体积的底物(一个例示的选择在方案2和3中描述,见下文)以及胺供体异丙胺相关。这些立体选择性转氨酶可用于从相应的酮非对称合成手性胺以及用于动力学拆分。
发明概述
令人惊奇的是,已经发现,一种突变型转氨酶相对于野生型转氨酶显示出增加的转氨酶活性,所述突变型转氨酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属(Ruegeriasp.)TM1040转氨酶;称为3FCR)至少65%相同的氨基酸序列,并且相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代,其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59),以及对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly231)。
如实施例所示,已经鉴定到转氨酶中的几个氨基酸残基,其取代增加突变型转氨酶相对于相应的野生型转氨酶的转氨酶活性。特别地,可证明,3FCR的双突变体(即,在SEQID NO:1的位置59处Tyr被Trp取代(Y59W)和位置231处Thr被Ala取代(T231A)的3FCR(称为Y59W/T231A)),对野生型接受的底物具有增加的活性(方案2中所示的胺3a和4a),并且还对胺1a测定到低活性(参见表3和4)。用转氨酶3FCR的突变体获得的结果可以通过百脉根中间根瘤菌maff303099(Mesorhizobium loti maff303099)的转氨酶(简称为3GJU)的突变体证实(参见表3)。此外,在SEQ ID NO:1的位置87处Tyr被Phe额外取代和/或位置152处Tyr被Phe额外取代的3FCR突变体(称为Y87F和Y152F),对带有两个芳香环的底物(即胺1a、3a和4a)具有增加的活性(参见表4中Y59W/Y87F/T231A和Y59W/Y87F/Y152F/T231A)。同时突变Y152F显着增加突变体的稳定性(图1)。在3FCR的转氨酶中进一步用His取代SEQ ID NO:1的位置423处的Pro(称为P423H),可以获得活性和接受的底物范围的甚至更进一步增加(参见表3和4)。可证明,具有取代Y59W、Y87F、Y152F、T231A和P423H的突变体对大体积的底物(例如胺1a、3a和4a)特别有活性。再次,用转氨酶3FCR的突变体获得的结果可以用3GJU的突变体证实(参见表3)。此外,具有突变Y59W/Y87F/Y152F/T231A的ATA-3、ATA-5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9的突变型转氨酶被证实,对胺1a、3a、4a和6a具有活性(见表5)。请注意,野生型序列ATA-3至ATA-9与野生型3FCR具有从65-70%至约90%的序列同一性。因此,可以得出结论,本发明的概念可以应用于与3FCR的序列(SEQ ID NO:1)具有65%或更高的序列同一性的所有转氨酶。另外,发现在位置87具有脂肪族疏水性氨基酸如Leu或Val(分别为Y87L或Y87V)的3FCR和3GJU突变体具有增加的活性,并且对于接受叔碳取代基(如胺2a)特别有效(参见表6)。在位置59处具有苯丙氨酸(Y59F)和/或在位置231处具有甘氨酸(T231G)的突变体显示出对双环化合物(如胺5a)增加的活性(参见表7)。此外,在位置234处Ile被Phe或Met取代的3FCR突变体(分别称为I234F和I234M)对胺5a(参见表7)和胺供体异丙胺(参见表8)具有增加的活性。在实施例5至11中证实了突变体在非对称合成和动力学拆分中维持立体选择性和适用性(见表9至10)。
因此,在第一方面,本发明提供了相对于野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶,其中突变型转氨酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列(鲁杰氏菌属TM1040转氨酶;称为3FCR)至少65%相同的氨基酸序列,其中突变型转氨酶相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代,其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59),并且对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly 231)。
发明内容
术语“转氨酶”(由生物化学国际联合会的酶学委员会(Enzyme Commission ofthe International Union of Biochemistry)分类为EC2.6.1.XX;也称为氨基转移酶)通常是指,催化胺基团从胺供体转移到胺受体的羰基上(转氨作用)的酶。转氨酶是5'-磷酸吡哆醛依赖(PLP依赖)的酶。如方案1所示,胺供体向胺受体提供氨基,以便合成所需的胺,并形成相应的酮。由于转氨酶通常具有高的立体选择性,所以氨基转移反应可以通过非对称还原提供所需的胺,和/或借助氧化脱氨基通过拆分以对映体富集的胺形式提供剩余的胺供体。ω-转氨酶(ω-TA)在本发明中是特别有意义的,因为它们能够将没有相邻羧基官能团的酮转化成手性胺,这与已知从α-酮酸合成α-氨基酸的氨基酸转氨酶不同。注意,术语胺转氨酶(ATA)优于ω-TA,因为这些酶是根据其合成能力,例如从相应的ε-醛合成L-赖氨酸的能力,来命名的。(S)-选择性ATA已经被知晓十多年了(Coffen等人,1994)。本发明的转氨酶可以是非选择性的或选择性的,如(S)选择性或(R)选择性、特别是(S)选择性的转氨酶。这些转氨酶的合适实例也在表1中给出。
术语“野生型转氨酶”涉及通常在自然界中存在的转氨酶。天然存在的野生型转氨酶的实例在下表1中给出,如SEQ ID NO:1、3和5至11(氨基酸序列)。如果引入一个或多个突变,则获得突变型转氨酶。因此,术语“突变型转氨酶”涉及其氨基酸序列不同于野生型序列的转氨酶。关于本发明的突变型转氨酶,应注意突变体是功能活性的。这意味着突变体保持其生物功能,即保持其转氨酶的酶活性。根据本发明,突变体的转氨酶活性相对于野生型的转氨酶活性增加。对应于突变体的野生型转氨酶是与突变体具有最少数量的突变差异的野生型转氨酶。可以根据本发明突变的示例性野生型转氨酶在以下列出:
-氨基转移酶(鲁杰氏菌属TM1040)(GI:499859271;简称3FCR;SEQ ID NO:1)
-转氨酶(百脉根中间根瘤菌maff303099)(GI:499217058;简称为3GJU;SEQ IDNO:3)
-转氨酶(细粒栖海洋菌(Oceanicola granulosus))(GI:494465841;简称ATA-3;SEQ ID NO:5)
-转氨酶(简纳西氏菌属(Jannaschia Sp)CCS1)(GI:499773242;简称ATA-4;SEQID NO:6)
-转氨酶(黄色杆菌科(Xanthobacteraceae))(GI:517199618;简称ATA-5;SEQ IDNO:7)
-转氨酶(红细菌科(Rhodobacteraceae)细菌RB2150_13166)(GI:126705951;简称ATA-6;SEQ ID NO:8)
-转氨酶(地中海马特尔氏菌(Martelella mediterranea)DSM 17316)(GI:516720233;简称ATA-7;SEQ ID NO:9)
-转氨酶(庞氏鲁杰氏菌(Rugeria pomeroyi)DSS-3)(GI:56677770;简称ATA-8;SEQ ID NO:10)
-转氨酶(星箭头菌(Sagittula stellata)E-37)(GI:126711082;简称ATA-9;SEQID NO:11)
可以根据本发明在其中引入本文所述突变的特别优选的野生型转氨酶是SEQ IDNO:1、3和5至11,特别是SEQ ID NO:1和3,特别是SEQ ID NO:1中所示的那些。
根据本发明,突变型转氨酶相对于没有突变的相应野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性。酶活性是酶的活性的量度。酶活性的SI单位是katal(1katal=1mol s-1)。一个更实用和常用的值是酶单位(U)=1μmol min-1。1U对应于16.67nanokatal。一个U被定义为每分钟催化1微摩尔底物转化的酶的量。测定活性时的条件通常是标准化的:通常采用25℃或30℃的温度(如实施例中)和产生最大底物转化率的pH值和底物浓度。酶的比活性是每毫克总蛋白的酶活性(以μmol min-1mg-1表示)。其是在给定条件下、给定时间内按每毫克总蛋白计,由酶形成的产物的量。比活性等于反应速率乘以反应体积除以总蛋白量。SI单位为katal kg-1,但更实用的单位是μmol min-1mg-1。比活性是在特定(通常饱和的)底物浓度下酶的持续合成能力的量度,并且对于纯酶通常是恒定的。如果酶的分子量是已知的,则可以根据比活性来计算活性酶的转化数或μmol产物sec-1μmol-1。转化数可以被视为每个酶分子每秒实行其催化循环的次数。
活性可以在酶测定法中测量随时间推移底物的消耗或产物的产生来测定。存在大量不同的测量底物和产物浓度的方法,如本领域技术人员已知的,许多酶可以以几种不同方式测定。在本发明中,将所讨论的转氨酶与适当的胺供体和适当的胺受体在有助于转氨作用的条件下培养一段时间。
酶测定法可以根据其采样方法分为两组:连续测定法(其中测定法给出连续的活性读数)和不连续测定法(其中取样、停止反应、然后测定底物/产物的浓度)。
在优选的实施方案中,本发明的转氨酶是立体选择性的,如(S)选择性或(R)选择性的,特别是(S)选择性的。“立体选择性”是指一种立体异构体比另一种立体异构体在化学或酶反应中优先形成。立体选择性可以是部分的,其中一种立体异构体的形成优于另一种立体异构体的形成,或者立体选择性可以是完全的,其中仅形成一种立体异构体。当立体异构体是对映体时,立体选择性称作对映选择性。在本领域中对映选择性通常报道为对映体过量(e.e.)(通常为百分比),其根据公式[主要对映体-次要对映体]/[主要对映体+次要对映体]计算。或者,对映体比例或er(S:R)可用于表征立体选择性。对映体比例是在对映体混合物中一种对映体(例如(S)-对映体)与另一种对映体(例如(R)-对映体)的百分比的比例。当立体异构体是非对映异构体(diastereoisomers)时,立体选择性称作非对映选择性(diastereoselectivity),两种非对映体(diastereomer)的混合物中一种非对映体的分数(通常以百分数表示),通常替代性地报道为非对映体过量(d.e.)。对映体过量和非对映体过量是立体异构体过量的类型。
在本文中对映体富集表示所需手性胺相对于不需要的手性胺的对映体比例大于50:50,优选至少70:30,甚至更优选至少95:5,最优选至少99.5:0.5,或类似地对映体过量大于0%、优选至少40%、甚至更优选至少90%、最优选至少99%。
令人惊奇的是发现,如本发明上下文中定义的突变,在野生型转氨酶中引入时,可以增加该酶相对于野生型酶的转氨酶活性。如本文详细描述的,这对于通过如下方法生产胺,特别是对于生产对映体富集的手性胺,是特别有意义的:
方法
a)在胺受体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下动力学拆分外消旋胺,
或方法
b)在胺供体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下对前手性酮进行非对称转氨,
其中突变型转氨酶或融合蛋白是立体选择性的。
特别地,增加了对选择的化合物(例如大体积的底物,这扩大了转氨酶接受的底物范围)和/或胺供体异丙胺的活性。这在本发明中是重要的,因为它允许更广泛的工业适用性,特别是在转氨酶介导的胺(如手性胺)的生产中。
已发现,本发明的转氨酶显示增加的活性,特别是对大体积的底物。根据方法a)的大体积(外消旋)胺的举例说明性实例显示在下面的方案2中。
方案2:
其化学名称为1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)、3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a)和1-苯基乙胺(6a)。
根据方法b)的大体积前手性酮的举例说明性实例显示在下面的方案3中。
方案3:
其化学名称是(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)、8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)和1-苯基乙酮(6b)。
在本领域中熟知确定酶活性的各种方法。其包括但不限于光谱测定法、荧光测定法、量热测定法、化学发光测定法、涉及光散射的测定法、辐射测定法和色谱测定法。通常在良好控制的条件(包括例如pH值、温度、盐、缓冲液和底物浓度)下进行测定法。本领域技术人员熟知用于研究酶的转氨酶活性的合适试验。等人在Analytical Chemistry(2009)中描述了合适的试验。这种直接光度测定法基于胺及其相应酮在吸收光谱上的显着差异。通常,共轭芳族酮的吸收光谱,由于其苯甲酰基部分的电子离域(这在相应的胺中是不存在的),而是独特的。该差异反映在吸收光谱的差异中,并且可以在酮和胺之间最高吸收差异的波长上监测酮的产生,这可以由本领域技术人员容易地确定。该测定法特别适用于底物1、2、3、4和6[即胺1a、2a、3a、4a和6a(参见方案2)或酮1b、2b、3b、4b和6b(参见方案3)]。对于上述测定法可能不合适的底物,如底物5a/b或异丙胺,已开发了合适的试验以筛选胺供体;其原理见于Weiβ等人在Analytical Chemistry(2014)中的描述。在该试验中,乙醛酸用作胺受体。转氨酶使用期望的胺供体通过乙醛酸的胺化来产生甘氨酸,甘氨酸随后被甘氨酸氧化酶氧化,还产生过氧化氢。过氧化氢被辣根过氧化物酶用于将苯酚氧化成1,4-苯醌,其自发通过缩合反应与4-氨基安替比林发生反应以形成在可见波长(498nm)下可检测的醌亚胺染料。苯酚可以被香草酸替代,其经历氧化脱羧和辣根过氧化物酶介导的氧化形成2-甲氧基-1,4-苯醌。除了这两个试验之外,还可以使用本领域技术人员已知的标准色谱方法,如高效液相色谱法(HPLC)、气相色谱法(GC)、超临界流体色谱法(SFC)和毛细管电泳。
此外,示例性试验还描述于实施例(参见B2部分)中,特别合适的底物是底物1至5[如胺1a至5a(参见方案2)或酮1b至5b(参见方案3)]或胺供体异丙胺(2-丙胺)。
此外,本领域技术人员知道评估一个值相对于另一个值是否增加的统计学程序,如Student氏t检验或卡方检验。对于本领域技术人员显而易见的是,当分析数据时必须减去任何背景信号。在具体实施方案中,酶活性的增加为至少约10%。在其它实施方案中,酶活性的增加至少为20%、30%、40%、50%或100%,特别是150%、200%、250%或300%。活性增加的百分比可以确定为[活性(突变型)/活性(野生型)-1]×100。
根据本发明,突变型转氨酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少65%相同的氨基酸序列。
本文所述的术语“SEQ ID NO:1”表示SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列,其代表来自鲁杰氏菌属TM1040的野生型氨基转移酶(简称3FCR)的氨基酸序列。特别地,术语“SEQ IDNO:1”是指如下所示的氨基酸序列:(请注意,根据本发明优选的取代位点用粗体/下划线标出并通过位置编号指明):
本文所用的术语“至少65%相同”或“至少65%序列同一性”是指,根据本发明的突变型转氨酶的序列具有特征如下的氨基酸序列:在100个氨基酸的链中,至少65个氨基酸残基与相应野生型序列的序列相同。根据本发明的序列同一性例如可以通过序列比对的方法以序列比较的形式确定。序列比对的方法是本领域公知的,包括已经在例如Pearson和Lipman(1988)中描述的各种程序和比对算法。此外,可从多个来源(包括国家生物技术信息中心(NCBI,Bethesda,MD)和互联网上,获得NCBI Basic Local Alignment Search Tool(BLAST),与序列分析程序blastp、blastn、blastx、tblastn和tblastx结合使用。根据本发明的突变体相对于SEQ ID NO:1的氨基酸序列的同一性百分比通常用具有标准设置的NCBIBlast blastp表征。或者,可以使用具有标准设置的软件GENEious确定序列同一性。在本发明中,所呈现的比对结果源自软件Geneious(版本R8),其中使用全局比对方案,自由端空位(free end gaps)作为比对类型,Blosum62作为成本矩阵(cost matrix)。野生型蛋白对SEQID NO:1(3FCR)(不包括标签)的同一性确定为:3GJU为71.3%、ATA-3为72.2%、ATA-4为70.7%、ATA-5为69.6%、ATA-6为71.8%、ATA-7为77.9%、ATA-8为90.8%和ATA-9为80.3%。
根据本发明,突变型转氨酶相对于野生型转氨酶具有至少两个氨基酸取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸被Trp或Phe取代(分别为Trp59或Phe59),在对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸被Ala或Gly取代(分别为Ala231或Gly231)。
在优选的实施方案中,本发明的突变型转氨酶具有一个或多个另外的突变,即:
-在对应于SEQ ID NO:1的位置87的位置处的氨基酸被疏水性氨基酸取代(HYaa87),特别是其中疏水性氨基酸是Leu(Leu87)或Val(Val87)或Phe(Phe87);和/或
-在对应于SEQ ID NO:1的位置152的位置处的氨基酸被Phe取代(Phe152),和/或
-在对应于SEQ ID NO:1的位置234的位置处的氨基酸被Phe(Phe234)或Met(M234)取代,和/或
-在对应于SEQ ID NO:1的位置423的位置处的氨基酸被His(His423)取代。
在本发明中,参照SEQ ID NO:1(即鲁杰氏菌属TM1040转氨酶(简称3FCR)的氨基酸序列),鉴定突变的位置。对于3FCR之外的转氨酶,相应突变位点可以通过进行如上所述的氨基酸比对来鉴定(例如通过使用BLAST;具有标准设置的Basic Local Alignment SearchTool,可以在http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE TYPE =BlastSearch&LINK_LOC=blasthome获得)或通过比较结构(如果有的话)并识别相应的氨基酸来鉴定。相应位置的例子在图2至4和下表中给出:
在本发明的一个实施方案中,根据本发明的突变型转氨酶可以包含一个或多个氨基酸缺失,特别是小(例如不超过10个氨基酸)的N-和/或C-末端缺失。
在一个实施方案中,根据本发明的突变型转氨酶的序列,除了本文所指定的取代之外,还可以包含一个或多个另外的氨基酸取代,特别是一个或多个保守氨基酸取代。“保守氨基酸取代”是指残基用具有相似侧链的不同残基取代,并因此通常涉及用定义的相同或相似氨基酸类型中的氨基酸取代多肽中的氨基酸。作为实例而非限制,具有脂肪族侧链的氨基酸可以被另一个脂肪族氨基酸(例如丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸)取代;具有羟基侧链的氨基酸可以被另一个具有羟基侧链的氨基酸(例如丝氨酸和苏氨酸)取代;具有芳族侧链的氨基酸被另一个具有芳族侧链的氨基酸(例如苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸和组氨酸)取代;具有碱性侧链的氨基酸被另一个具有碱性侧链的氨基酸(例如赖氨酸和精氨酸)取代;具有酸性侧链的氨基酸被另一个具有酸性侧链的氨基酸(例如天冬氨酸或谷氨酸)取代;以及疏水或亲水氨基酸分别被另一个疏水或亲水氨基酸替代。保守氨基酸取代的实例包括以下列出的那些:
在本发明的一个实施方案中,根据本发明的突变型转氨酶可以包含一个或多个氨基酸添加,特别是小(例如不超过10个氨基酸)的内部氨基酸添加。
在另一个实施方案中,根据本发明的突变型转氨酶的序列,除了本文指定的取代之外,还可以包含如上所定义的一个或多个缺失、取代或添加的组合。
然而,在另一个优选的实施方案中,本发明的突变型转氨酶至少具有突变:
-Trp59和Ala231,或
-Trp59,Phe87和Ala231;或
-Trp59,Leu87和Ala231;或
-Trp59,Val87和Ala231;或
-Trp59,Phe87,Ala231和His423;或
-Trp59,Phe87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Leu87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Val87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和His423,或
-Trp59和Gly231;或
-Trp59,Phe87和Gly231;或
-Trp59,Leu87和Gly231;或
-Trp59,Val87和Gly231;或
-Trp59,Phe87,Phe152和Gly231;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和His423;或
-Phe59,和Ala231;或
-Phe59,Phe87,和Gly231;或
-Trp59,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Leu87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Val87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Phe234和His423,或
-Trp59,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Leu87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Val87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Phe234和His423;或
-Phe59,Phe87,Gly231和Phe234,或
-Trp59,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Leu87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Val87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Met234和His423,或
-Trp59,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Leu87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Val87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Met234和His423;或
-Phe59,Phe87,Gly231和Met234。
更优选地,本发明的突变型转氨酶与相应的野生型转氨酶的差异仅在于下列突变:
-Trp59和Ala231,或
-Trp59,Phe87和Ala231;或
-Trp59,Leu87和Ala231;或
-Trp59,Val87和Ala231;或
-Trp59,Phe87,Ala231和His423;或
-Trp59,Phe87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Leu87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Val87,Phe152和Ala231;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和His423,或
-Trp59和Gly231;或
-Trp59,Phe87和Gly231;或
-Trp59,Leu87和Gly231;或
-Trp59,Val87和Gly231;或
-Trp59,Phe87,Phe152和Gly231;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和His423;或
-Phe59,和Ala231;或
-Phe59,Phe87,和Gly231;或
-Trp59,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Leu87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Val87,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Phe234和His423,或
-Trp59,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Leu87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Val87,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Phe234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Phe234和His423;或
-Phe59,Phe87,Gly231和Phe234,或
-Trp59,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Leu87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Val87,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231,Met234和His423,或
-Trp59,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Leu87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Val87,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231和Met234;或
-Trp59,Phe87,Phe152,Gly231,Met234和His423;或
-Phe59,Phe87,Gly231和Met234。
在甚至更优选的实施方案中,本发明的突变型转氨酶至少具有突变
-Trp59,Phe87,Phe152和Ala231,或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Met234,或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和H423,或
-Phe59,Phe87和Gly231。
更优选地,本发明的突变型转氨酶与相应的野生型转氨酶的差异仅在于以下突变
-Trp59,Phe87,Phe152和Ala231,或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和Met234,或
-Trp59,Phe87,Phe152,Ala231和H423,或
-Phe59,Phe87和Gly231。
突变型转氨酶的优选和具体的氨基酸序列是包含SEQ ID NO:30至38、43至51、53、55和58-64(参见图3、4和5)和57(见下文“序列”部分)中任何所定义的序列或由其组成的那些氨基酸序列。
如上所述,本发明的突变型转氨酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少65%相同的氨基酸序列。在优选的实施方案中,突变型转氨酶包含与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少70%、75%、80%、85%、90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。序列同一性如上确定。在本发明的优选实施方案中,突变型转氨酶包含与选自SEQ ID NO:1、3和5至11的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%相同的氨基酸序列。
根据本发明,突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有增加的转氨酶活性。如上所述,这对于大体积底物以及胺供体异丙胺是特别有意义的。因此,在本发明的上下文中,优选增加的对大体积底物/异丙胺的活性。用于确定对这些物质的活性是否增加的、合适的大体积测试底物是底物1至5,包括方案2所示的那些,即1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)和3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a),以及方案3中所示的那些,(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)和8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)。本领域技术人员将理解,如果对于至少一种底物或异丙胺(特别是底物1至5中的至少一种或异丙胺)的活性增加,则已经存在活性的增加。
因此,在本发明的优选实施方案中,突变型转氨酶对于至少一种选自以下的化合物的氨基转移具有增加的转氨酶活性:1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)和3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a)、3(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)和8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)和异丙胺。
在优选的实施方案中,突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少2倍增加的转氨酶活性、优选至少2.5倍增加的转氨酶活性、优选至少3倍增加的转氨酶活性、更优选至少3.5倍增加的转氨酶活性、和最优选至少4倍增加的转氨酶活性,特别是对于至少一种选自以下的化合物:1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)和3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a)、3(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)、8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)和异丙胺。
在另一方面,本发明涉及包含本发明的转氨酶的融合蛋白。
融合蛋白是通过连接两个或更多个原本分开的蛋白或肽而产生的蛋白。该过程产生具有源自每个原始蛋白的功能性质的多肽。因此,根据转氨酶的预期用途,其可以与另外的肽或蛋白组合成融合蛋白。蛋白可以通过接头或间隔融合,这增加了蛋白独立折叠并按预期发挥作用的可能性。特别是在接头使得能够进行蛋白纯化的情况下,蛋白或肽融合物中的接头有时被工程化成具有蛋白酶或化学试剂的切割位点,从而使得能够释放这两个分开的蛋白。可通过遗传工程,通过将原始蛋白融合到诱导人工蛋白二聚化或多聚化的肽结构域(例如链霉抗生物素蛋白或亮氨酸拉链)上,制备二聚体或多聚体融合蛋白。也可以制备毒素或抗体附着于其上的融合蛋白。其它融合包括添加信号序列,如脂质化信号序列、分泌信号序列、糖基化信号序列、易位信号肽等。
优选地,本发明的融合蛋白包含标签。标签附着于蛋白可以用于各种目的,例如为了简化纯化、为了帮助蛋白的正确折叠、为了防止蛋白沉淀、为了改变色谱性质、为了修饰蛋白或为了记号或标记蛋白。
目前已知有许多(亲和)标签或(亲和)标记物。通常根据其大小将其分为3类:小标签最多有12个氨基酸,中等大小的标签最多具有60个氨基酸,大标签具有多于60个氨基酸。小标签包括Arg-标签、His-标签、Strep-标签、Flag-标签、T7-标签、V5-肽-标签和c-Myc标签,中等大小的标签包括S-标签、HAT-标签、钙调蛋白结合肽、几丁质结合肽和一些纤维素结合结构域。后者可以含有多达189个氨基酸,由此可以被视为大亲和标签,如GST-和MBP-标签。为了生产特别纯的蛋白,开发了所谓的双标签或串联标签。在这种情况下,分别利用第一标签的亲和力和随后利用第二标签的亲和力,在两个分开的色谱步骤中纯化蛋白。这种双重或串联标签的实例是GST-His-标签(与多组氨酸标签融合的谷胱甘肽-S-转移酶)、6xHis-Strep-标签(与Strep-标签融合的6组氨酸残基(参见以下))、6xHis-标签100-标签(与哺乳动物MAP-激酶2的12氨基酸蛋白融合的6组氨酸残基)、8xHis-HA-标签(与血凝素表位标签融合的8组氨酸残基)、His-MBP(与麦芽糖结合蛋白融合的His-标签)、FLAG-HA-标签(与血凝素表位标签融合的FLAG-标签)和FLAG-Strep-标签。这些标签的大多数被专门开发用于纯化由原核细胞生产的蛋白。合适的标签在说明书中给出,包括SEQ ID NO:56(SHHHHHH)。
另一方面,本发明涉及编码本发明的转氨酶的核酸。
本文所用的术语“核酸”通常涉及编码本发明的突变型转氨酶的任何核苷酸分子,其可以具有可变的长度。本发明核酸的实例包括但不限于质粒、载体或可以通过标准分子生物学步骤分离的任何种类的DNA和/或RNA片段,包括例如,离子交换色谱法。本发明的核酸可用于转染或转导特定细胞或生物体。
本发明的核酸分子可以是RNA的形式(如mRNA或cRNA)或可以是DNA的形式(包括例如cDNA和基因组DNA),例如通过克隆或通过化学合成技术或其组合而产生。DNA可以是三链、双链或单链。单链DNA可以是编码链,也称为正义链,或者它可以是非编码链,也称为反义链。本文中,核酸分子还可以指例如单链和双链DNA、作为单链和双链RNA的混合物的DNA、和作为单链和双链区的混合物的RNA,包含DNA和RNA的杂合分子(其可以是单链或更典型地双链或三链、或单链和双链区的混合物)。此外,本文中,核酸分子可以指包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区。
另外,核酸可以包含一个或多个修饰的碱基。这样的核酸还可以包含例如在核糖-磷酸骨架中的修饰,以增加生理环境中这种分子的稳定性和半衰期。因此,为了稳定性或由于其它原因而修饰骨架的DNA或RNA是“核酸分子”,因为该性质是本文所需的。此外,仅列举两个实例,包含稀有碱基(如肌苷)或修饰碱基(如三苯甲基化碱基)的DNA或RNA也是本发明上下文中的核酸分子。应当理解,本领域技术人员已知为了许多有用的目的而对DNA和RNA进行的各种修饰。本文使用的术语核酸分子包括核酸分子的化学、酶学或代谢修饰形式,以及病毒和细胞(包括例如简单和复杂细胞)所特征性的DNA和RNA化学形式。
此外,可以使用标准技术(如标准克隆技术)将编码本发明的突变型转氨酶的核酸分子与任何所需的序列(如调节序列、前导序列、异源标记物序列或异源编码序列)功能地连接,产生融合蛋白。
通常通过内切核酸酶和/或外切核酸酶和/或聚合酶和/或连接酶和/或重组酶或技术人员已知的其它方法操纵核酸,可以在体外或在培养的细胞中最初形成本发明的核酸。
本发明的核酸可以包含在表达载体中,其中核酸可操作地连接到能够促进核酸在宿主细胞中表达的启动子序列。
如本文所用,术语“表达载体”通常是指可用于在细胞中表达感兴趣蛋白的任何种类的核酸分子(还参见上文关于本发明的核酸的细节)。特别地,本发明的表达载体可以是本领域技术人员已知的适于在特定宿主细胞中表达蛋白的任何质粒或载体,包括但不限于哺乳动物细胞、细菌细胞和酵母细胞。本发明的表达构建体还可以是编码本发明转氨酶的核酸,其随后用于克隆到相应载体中以确保表达。用于蛋白表达的质粒和载体是本领域公知的,并且可以从多种供应商购买,例如Promega(Madison,WI,USA)、Qiagen(Hilden,Germany)、Invitrogen(Carlsbad,CA,USA)或MoBiTec(Germany)。蛋白表达的方法是本领域技术人员公知的,并且例如描述于Sambrook等人,2000(Molecular Cloning:A laboratorymanual,第三版)中。
载体可以另外包括允许其在宿主细胞中复制的核酸序列,如复制起点、一个或多个治疗基因和/或选择性标记基因、和本领域已知的其它遗传元件,如指导编码蛋白的转录、翻译和/或分泌的调控元件。载体可用于转导、转化或感染细胞,从而使细胞表达非细胞天然的核酸和/或蛋白。载体任选地包括有助于实现核酸进入细胞的物质,如病毒颗粒、脂质体、蛋白衣壳等。在本领域中已知许多类型的合适表达载体,通过标准分子生物学技术用于蛋白表达。这样的载体可以选自常规载体类型,包括昆虫(例如杆状病毒表达系统)、或酵母、真菌、细菌或病毒表达系统。在本领域中已知的许多类型的其它合适表达载体也可用于此目的。获得这样的表达载体的方法是公知的(参见例如Sambrook等,同上)。
如上所述,编码本发明的突变型转氨酶的核酸可操作地连接到适于在宿主细胞中驱动蛋白表达的序列上,以确保蛋白的表达。然而,以下也包括在本发明内:所要求保护的表达构建体可以是中间产物,其随后被克隆到合适的表达载体以确保蛋白的表达。本发明的表达载体可以进一步包含所有种类的核酸序列,包括但不限于聚腺苷酸化信号、剪接供体和剪接受体信号、间插序列、转录增强子序列、翻译增强子序列、药物抗性基因等。任选地,药物抗性基因可以可操作地连接到内部核糖体进入位点(IRES),其可以是细胞周期特异性的或与细胞周期非依赖的。
本文所用的术语“可操作地连接”通常意味着排列基因元件使得其为了其预期的目的而一致地发挥作用,例如,其中转录由启动子启动并前行通过编码本发明蛋白的DNA序列。也就是说,RNA聚合酶将编码融合蛋白的序列转录成mRNA,然后其被剪接并翻译成蛋白。
在本发明上下文中使用的术语“启动子序列”通常是指与下游编码序列可操作地连接的任何种类的调控DNA序列,其中所述启动子能够结合RNA聚合酶并启动该编码的开放阅读框在细胞中的转录,从而驱动所述下游编码序列表达。本发明的启动子序列可以是本领域技术人员已知的任何种类的启动子序列,包括但不限于组成型启动子、诱导型启动子、细胞周期特异性启动子和细胞类型特异性启动子。
本发明的另一方面涉及宿主细胞,其包含本发明的转氨酶、本发明的融合蛋白或本发明的多核苷酸或表达载体。在本发明的一个实施方案中,在本发明的上下文中使用具有转氨酶活性的宿主细胞。特别地,任选裂解的或以其它方式透化的细胞用于转氨作用,例如在本发明的方法和用途中。本发明的“宿主细胞”可以是适于在重组DNA技术中应用的任何种类的生物体,包括但不限于适于表达一种或多种重组蛋白的各种各样的细菌和酵母菌株。宿主细胞的实例包括例如各种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)或大肠杆菌菌株。各种大肠杆菌细菌宿主细胞是本领域技术人员已知的,包括但不限于如DH5-α、HB101、MV1190、JM109、JM101或XL-1blue菌株,其可以是从不同的供应商购买,包括例如Stratagene(CA,USA)、Promega(WI,USA)或Qiagen(Hilden,Germany)。实施例中也描述了特别合适的宿主细胞,即大肠杆菌BL21(DE3)细胞。可用作宿主细胞的枯草芽孢杆菌菌株包括例如1012野生型:leuA8metB5trpC2hsdRM1和168Marburg:trpC2(Trp-),其例如可从MoBiTec(Germany)购买。
根据本发明的宿主细胞的培养是本领域技术人员已知的常规步骤。也就是说,可以将编码本发明的突变型转氨酶的核酸引入合适的宿主细胞中,以通过重组方法产生相应的蛋白。这些宿主细胞可以是能在培养中生长的任何种类的合适细胞,优选细菌细胞如大肠杆菌。第一步,该方法可以包括将相应的基因克隆到合适的质粒载体中。质粒载体被广泛用于基因克隆,并且可以容易地导入,即转染到已经制备成可暂时透过DNA的细菌细胞中。蛋白在宿主细胞中表达之后,可以收获细胞并将细胞作为起始物质用于制备含有感兴趣蛋白的细胞提取物。通过裂解细胞获得含有感兴趣蛋白的细胞提取物。通过化学或机械细胞裂解的手段制备细胞提取物的方法是本领域技术人员公知的,包括但不限于例如,低渗盐处理、匀浆或超声处理。
在另一方面,本发明提供了一种制备胺的方法,该方法包括使胺受体与本发明的突变型转氨酶或本发明的融合蛋白在胺供体的存在下反应。
本发明的反应原则上遵循方案1中给出的方案(见上文)。该方案举例说明氨基从胺供体转移到胺受体。胺供体可以是可被本发明的突变型转氨酶或融合蛋白接受的、包含可转移氨基基团的任何分子。胺受体可以是可通过本发明的突变型转氨酶或融合蛋白将氨基转移至其上的任何分子。通常,氨基(NH2)被转氨酶从伯胺(胺供体)转移到羰基(C=O)(胺受体)。一方面术语“胺受体”和“氨基受体”与另一方面“胺供体”和“氨基供体”可互换使用。
在优选的实施方案中,产生对映体富集的手性胺,该方法是
a)在胺受体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下动力学拆分外消旋胺,或
b)在胺供体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下,对前手性酮进行非对称转氨,
其中突变型转氨酶或融合蛋白是立体选择性的。
据此应理解,突变型转氨酶或融合蛋白可以作为溶液、冻干物、固定的或全细胞的催化剂使用。
方法a)
在称为动力学拆分的该方法中,外消旋胺的对映体与立体选择性转氨酶或融合蛋白(任选地在宿主细胞中)以不同的反应速率反应,得到反应性较低的对映体的对映体富集组合物。由此,该胺的外消旋混合物,对于所需的对映体而言,是对映体富集的。
外消旋胺可以具有下式
其中,
R1或R2彼此独立地表示任选取代的烷基、芳基、碳环基或杂环基;或
R1和R2与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环。
在优选的实施方案中
R1是任选取代的C1-12-烷基或芳基;
R2是任选取代的芳基或杂环基;或
R1和R2与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环,其中任选的取代基选自C1-12-烷基、C1-12-烷氧基、芳基、芳氧基、卤素、羟基或氰基。
在另一优选的实施方案中
R1是任选取代的C1-7-烷基或苯基;
R2是任选取代的苯基;或
R1和R2与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环,其中任选的取代基选自C1-7-烷基、C1-7-烷氧基、苯基、苯氧基、氯、羟基或氰基。
胺的举例说明性实例显示在方案2(上文)中。
方法a)中用于动力学拆分的合适的胺受体可以选自酮和酮羧酸。优选使用酮羧酸,如2-酮羧酸(如2-酮戊二酸、乙醛酸、丙酮酸、草酰乙酸等)及其合适的盐。最常用的并因此最优选的是2-酮羧酸的共轭碱,如2-酮戊二酸盐、丙酮酸盐、乙醛酸盐或草酸盐。
外消旋胺用突变型转氨酶或融合蛋白进行的动力学拆分可以在水性介质中方便实施,合适地所述水性介质含有生理缓冲液如CHES缓冲液,pH范围5至11、特别是7.5至10,温度范围为10℃至50℃、优选为20℃至40℃。
当使用2-酮羧酸作为胺受体时,外消旋胺与胺受体的摩尔比通常选在1.1至10、特别是1.1至2.5。当使用酮作为胺受体时,可以显著地提高该摩尔比。
方法b)
方法b需要在胺供体和立体选择性突变型转氨酶或融合蛋白(任选地在宿主细胞中)存在下对前手性酮进行非对称转氨。
前手性酮可以具有式
R3或R4彼此独立地表示任选取代的烷基、芳基、碳环基或杂环基;或
R3和R4与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环。
在优选的实施方案中
R3是任选取代的C1-12-烷基或芳基;
R4是任选取代的芳基或杂环基;或
R3和R4与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环,其中任选的取代基选自C1-12-烷基、C1-12-烷氧基、芳基、芳氧基、卤素、羟基或氰基。
在另一优选的实施方案中
R3是任选取代的C1-7-烷基或苯基;
R4是任选取代的苯基;或
R3和R4与其所连接的碳原子一起形成任选取代的单环或多环的碳环或杂环,其中任选的取代基选自C1-7-烷基、C1-7-烷氧基、苯基、苯氧基、氯、羟基或氰基。
方案3(上文)显示了前手性酮的举例说明性实例。
合适的胺供体通常可以选自非手性或手性胺或氨基酸。典型的胺是脂肪族伯胺,如异丙胺、1-苯基乙胺、2-氨基-4-苯基丁烷、邻苯二甲胺,或氨基酸如α氨基酸,甘氨酸、谷氨酸或丙氨酸。优选的胺供体是异丙胺和L-丙氨酸。
在本发明优选的实施方案中,使用有利于平衡朝向所需对映体富集的手性胺移动的体系,使胺受体和胺供体与突变型转氨酶或融合蛋白反应。
采用了各种生物催化策略,通过第二酶(例如乳酸脱氢酶、丙酮酸脱羧酶)去除形成的副产物(例如丙酮酸)、或通过丙氨酸脱氢酶进行再循环/去除,以使该非对称转氨反应的平衡发生移动。
当使用多酶系统,反应条件需要满足所涉及的所有酶的要求。反应可以方便地在水性介质中进行,适宜地所述水性介质含有生理缓冲液如CHES缓冲液,pH范围为5至11、特别是7.5至10,温度范围为10℃至50℃、优选为20℃至40℃。
前手性酮和胺供体的摩尔比取决于所用的第二酶和各反应条件。通常,前手性酮和胺供体的摩尔比可以选在1:100至1:5、特别是1:50至1:10的范围中。
应用大量过量的异丙胺作为优选的胺供体,特别是与原位去除形成的丙酮(其相应酮)相组合,可以在非对称转氨中使平衡移向目标胺的形成。添加有机助溶剂(水混溶的和不混溶的)或其它特定添加剂可改善反应。
本文中在式I的外消旋胺和式II的前手性酮中使用的术语具有以下含义。
术语“卤素”表示氟、氯、溴或碘,特别是氯。
术语“烷基”表示1至12个碳原子的单价直链或支链饱和烃基。在特别的实施方案中,烷基具有1至7个碳原子,在更特别的实施方案中具有1至4个碳原子。烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、异丁基、仲丁基或叔丁基。
术语“烷氧基”是指与氧基连接的如上定义的烷基。烷氧基的实例包括甲氧基、乙氧基、异丙氧基、正丁氧基、异丁氧基、仲丁氧基或叔丁氧基。
术语“芳基”表示包含6至10个碳环原子的单价芳族碳环单环或双环体系。芳基部分的实例包括苯基和萘基。
术语“芳氧基”表示与氧基连接的如上所定义的芳基。合适的实例是苯氧基或萘氧基。
术语“单环或多环”是指特征为一个或多个封闭的原子(主要是碳)环的化合物。这些环亚结构包括环烷烃、芳烃和其它环类。虽然“多”字面意思是“许多”,但其也包括双环、三环、四环等。
术语“碳环”是指其中所有环成员都是碳原子的饱和、部分不饱和或不饱和的环状化合物,如环己烷、萘烷或1,2-二氢萘。该化合物可以是芳族或非芳族的。简单的芳环仅由共轭平面环系统组成。典型的简单芳族化合物是苯、吲哚和环十四碳七烯。多环芳烃只含碳和氢,由多个芳环组成。实例包括萘、蒽和菲。
术语“杂环基”是指饱和、部分不饱和或不饱和的5至6元单环或8至10元双环,其可含有1、2或3个选自氮、氧和/或硫的杂原子。环系可以是芳族或非芳族的。典型的杂环残基是吡啶基、哌啶基、吡咯烷基、嘧啶基、呋喃基、吡喃基、苯并咪唑基、喹啉基或异喹啉基。
本文中用于式I的外消旋胺和式II的前手性酮的任选取代基可以选自烷基、烷氧基、芳基、芳氧基、卤素、羟基或氰基。上述优选和实例也适用于这些取代基。
另一方面,本发明涉及本发明的突变型转氨酶或本发明的融合蛋白用于酮的氨基转移的用途,特别是用于合成具有与转移的氨基结合的非对称碳原子的手性胺。
关于本发明的用途,在本公开的其它方面中使用的术语、实例和具体实施方案,也适用于该方面。特别地,根据本发明的突变型转氨酶或融合蛋白可以按照针对本发明方法所详述的进行使用。
除非另有定义,本文使用的所有技术和科学术语以及任何首字母缩略词具有与本发明领域中的普通技术人员通常理解的相同含义。分子生物学常用术语的定义可以在牛津大学出版社1994年出版的Benjamin Lewin,Genes V(ISBN 0-19-854287-9);BlackwellScience Ltd 1994年出版的Kendrew等人(编辑)的The Encyclopedia of MolecularBiology(ISBN0-632-02182-9);和VCH Publishers,Inc.1995年出版的Robert A.Meyers(编辑),Molecular Biology and Biotechnology:a Comprehensive Desk Reference(ISBN 1-56081-569-8)中找到。
本发明不限于这里描述的特定方法、方案和试剂,因为它们可以变化。在本发明的实践中可以使用与本文所述类似或等同的任何方法和材料,但是本文描述了优选的方法和材料。此外,本文使用的术语仅用于描述特定实施方案的目的,并不意图限制本发明的范围。
如本文和所附权利要求中所使用的,除非上下文另有明确规定,单数形式“a”、“an”和“the”包括复数指代。类似地,词语“包括”、“包含”和“涵盖”将被解释为包括性的而非排他性的。同样,除非上下文另有明确说明,否则词语“或”旨在包括“和”。术语“多个”是指两个或更多个。
以下附图和实施例旨在举例说明本发明的各种实施方案。因此,所讨论的具体修改不应被解释为对本发明范围的限制。本领域技术人员显而易见,在不脱离本发明范围的情况下,可以实施各种等同、改变和修改,因此应当理解,这样的等同实施方案将被包括在本发明中。
附图简述
图1:25℃在HEPES缓冲液(50mM)pH7.5中3FCR变体的热稳定性;3FCR Y59W/T231A(空心圆),3FCR Y59W/Y87F/T231A(实心圆),3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A(三角形),3FCRY59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H(正方形)。如段落B2所述,使用6a作为胺供体,评估动力学拆分模式中的活性,将孵育前的活性定义为100%。
图2:优选的野生型转氨酶3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9的序列比对。根据本发明的突变Trp59、Phe87、Phe152、Ala231、Met234和His423的位点在每个转氨酶中用下划线表示。
图3:优选的具体突变型转氨酶3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9(每个具有如所示取代的4个氨基酸)的序列比对。本发明的突变Trp59(Y59W)、Phe87(Y87F)、Phe152(Y152F)和Ala231(T231A)在每个转氨酶中通过下划线表示。
图4:优选的具体突变型转氨酶3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9(每个具有如所示取代的5个氨基酸)的序列比对。根据本发明的突变Trp59(Y59W)、Phe87(Y87F)、Phe152(Y152F)、Ala231(T231A)和His423(P423H)在每个转氨酶中通过下划线表示。
图5:优选的具体突变型转氨酶3FCR、3GJU、ATA-3、ATA-4、ATA5、ATA-6、ATA-7、ATA-8和ATA-9(每个具有如所示取代的5个氨基酸)的序列比对。根据本发明的突变Trp59(Y59W)、Phe87(Y87F)、Phe152(Y152F)、Ala231(T231A)和Met234(I234M)在每个转氨酶中通过下划线表示。
实施例
一般步骤
A 生物催化剂生产
A1 转氨酶基因获取和表达载体的构建
根据报道的转氨酶的氨基酸序列(表1中提供的NCBI GI代码)和GenScript(Piscataway,U.S.A.)的密码子优化算法OptimumGeneTM,设计并合成了转氨酶(TA)开放阅读框,用于在大肠杆菌(E.coli)中表达。在所有情况下,加入C-末端组氨酸标签(在末端带终止密码子),以利于通过金属亲和色谱法纯化表达的TA(见相应段落)。在核苷酸序列中加入限制性位点用于随后在感兴趣的载体pET22b中的克隆:5'末端为NdeI限制性,3'末端为BamHI限制性。将起始密码子(ATG)并入NdeI的限制性位点中,由此只编码一个甲硫氨酸。载体含有氨苄青霉素抗性的bla编码序列(β-内酰胺酶)。根据克隆策略,表达受lac启动子的控制。使用标准方法将得到的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中。密码子优化的基因序列和编码的多肽序列在“序列”部分提供。
用修改版本的PCR方法制备了在本发明中使用的突变体。设计引物使其具有提供所需突变的错配。对于每个反应,我们使用Pfu缓冲液、0.2mM dNTP、0.2ng/μL亲本质粒、0.2μM各引物、2%(w/w)DMSO和0.2μL Pfu Plus!聚合酶。扩增如下进行:
a)95℃,5分钟;
b)20个循环:95℃,45秒;60℃,45秒;72℃,7分钟;
c)72℃,14分钟
PCR产物在37℃下用DpnI(20μL/mL)消化2小时,然后通过在80℃加热20分钟使限制酶失活。使用标准方法将消化的PCR产物转化到大肠杆菌TOP-10细胞中。从用PCR产物转化的克隆中分离质粒,并通过DNA测序确认正确的序列。使用标准方法将具有正确突变的分离的质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)细胞中。
表1:本发明中使用的转氨酶以及野生型序列的NCBI基因标识码(GI)。
A2 转氨酶的生产
将大肠杆菌BL21(DE3)的微生物单菌落接种在试管中含有100μg/mL氨苄青霉素的3mL Luria Bertani培养基中,并在30℃以180rpm振荡培养过夜(约18h)。在300mL摇瓶中,用1%(v/v)的过夜培养物(0.3mL)接种含有100μg/mL氨苄青霉素的30mL Terrific肉汤,并在37℃以180rpm振荡培养至600nm光密度(OD600)为0.5至0.7。将培养物冷却至20℃,以最终浓度0.2mM加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)以诱导TA的表达。在20℃振荡继续过夜孵育约16小时以上。通过离心(6000g,10分钟,4℃)收获细胞,弃去上清液。将细胞沉淀物重新悬浮于含有0.1mM吡哆醛-5-磷酸(PLP)的6mL预冷(4℃)HEPES缓冲液(50mM,pH7.5)中,并超声处理(Bandelin Sonopuls HD2070;5分钟2次,间隔5分钟,50%脉冲,60%功率,始终保持在冰上),以裂解细胞。通过离心(6000g,30分钟,4℃)除去细胞碎片。将裂解物上清液用0.2μm过滤器(Millipore)过滤,并加入30%甘油在+4℃或-20℃储存。在随后的纯化步骤,在裂解缓冲液中包含0.3M NaCl。
A3 转氨酶的纯化
使用金属亲和色谱法进行蛋白纯化,其中利用所有表达的TA中的C末端HisTag以及对本领域技术人员而言的标准程序。将如段落A2中所述制备的粗裂解物加载到用裂解缓冲液(HEPES缓冲液,50mM、0.3M NaCl、0.1mM PLP)平衡后的HisTrap FastFlow 5mL柱上(该柱子装配在蛋白色谱系统上)。一旦将TA加载到柱上,应用2个柱体积的10mM咪唑洗下非特异性结合的蛋白。通过应用2个柱体积的0.3M咪唑从柱中洗脱TA。合并纯化的TA级分,然后使用以含有0.1mM PLP的HEPES(50mM,pH7.5)缓冲液平衡的Sephadex G60柱、用本领域技术人员已知的标准步骤,通过系统脱盐。加入30%甘油,将纯化的酶溶液储存在+4℃或-20℃。
B 生物催化
B1 制备感兴趣化合物的储备溶液
由于感兴趣底物的疏水性(参见方案2和3),在水溶性有机溶剂如2-丙醇或二甲基亚砜中制备储备溶液。在动力学拆分实验的标准步骤中,在2-丙醇中制备20至40mM感兴趣的酮和胺的储备溶液。当胺1和4制备为盐酸盐时,将溶液在室温下超声处理30秒(Bandeling Sonorex RK 512H)以促进分散。分散后,该均质溶液是稳定的,没有观察到胺或胺盐的沉淀。
B2 动力学拆分模式下的活性测量
使用微滴定板读取器,在TECAN200 PRO读取器中,进行活性测量。对于等人在Analytical Chemistry(2009;也见上文)中描述的直接光度测定法,酶反应在30℃在CHES缓冲液(50mM,pH9.0)中进行,总体积为200μL。将1mM感兴趣的外消旋胺(rac-amine)和2mM胺受体(优选丙酮酸盐或乙醛酸盐)加入到含有感兴趣的TA的缓冲液中(终浓度)。由于胺储备溶液是在有机溶剂中制备的,有机溶剂(2-丙醇或DMSO)的最终浓度为5%(v/v)。通过加入第二底物(丙酮酸盐)引发反应。根据对所检测的底物的比活性,酶的浓度在2至800μg/mL终浓度之间变化。以本领域技术人员已知的方法测定,针对每个化合物在最佳波长监测酮的产生。根据确切的反应条件确定的、用于每个底物的波长以及用于测定TA比活性的表观消光系数列于表2中。
表2:用于感兴趣的酮的最佳波长(nm)和表观消光系数(M-1cm-1)。不包括酮5a,因为它不能通过直接光度测定法监测。计算表观系数模拟反应条件,这是因为一些胺在监测的波长具有小的,但不是不利的,吸光度。
底物 | 最佳波长 | 表观消光系数 |
1a | 265nm | 16562M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup> |
2a | 245nm | 7953M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup> |
3a | 245nm | 9646M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup> |
4a | 340nm | 5714M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup> |
6a | 245nm | 6115M<sup>-1</sup>cm<sup>-1</sup> |
对于不能应用直接光度测定法的化合物,如底物5a/b和异丙胺,使用Weiβ等人在Analytical Chemistry(2014)中描述的试验。为了使用该试验,制备了CHES缓冲液(pH9.0,50mM)中的母混合物,其含有2mM胺5a或50mM异丙胺(胺供体)、2.4mM乙醛酸盐(胺受体)、0.12mg/mL来自嗜热地芽孢杆菌(Geobacillus kaustophilus)的甘氨酸氧化酶、5U/mL辣根过氧化物酶、3.9mM香草酸和1.2mM 4-氨基安替比林。通过将标准化至浓度1mg/mL的20μL酶溶液加入到130μL母混合物中,起始反应,并在37℃下进行1小时。由于醌亚胺染料的形成,通过498nm吸光度的增加(ε=4654M-1cm-1),测定酶活性。由于该试验依赖于三种酶的活性,因此不可能计算比活性。因此,TA的活性总是相对于参考变体来表示[活性(突变体)/活性(参考)*100)]。
实施例1:通过掺入突变改善用于动力学拆分外消旋胺1a、3a和4a的TA比活性
根据一般步骤B2节中描述的试验,使用纯化的TA,测定所提出的突变体在动力学拆分外消旋胺1a、3a、4a和6a中的比活性。在3FCR支架中鉴定了这些位置,然后转移到3GJU支架中,以证实它们对于目的胺的接受所具有的重要性。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的同一性为71.3%。表3:动力学拆分模式中3FCR和3GJU突变体的比活性(U/mg)。n.a.:无活性;n.d.:未测定。
证实了,双突变体Y59W/T231A与野生型和3FCR中的单突变体相比的优势,以及与仅具有71.3%序列同一性的酶(3GJU)相比的优势。此外,通过突变体Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H例示了其它位置的累积有益效果。
更特别地,在3FCR的支架上产生的最有意义的中间突变体具有表4所示的比活性。
表4:在动力学拆分模式中3FCR突变体的比活性(U/mg)。
在该表中,例示了,随着各突变的添加,对底物1a、3a和4a的活性逐渐增加。对这些大体积底物的活性增加不一定伴随对标准底物6a的活性增加。
在25℃评估最感兴趣的突变体的操作稳定性。将纯化的酶在特定温度下孵育在储存缓冲液(HEPES缓冲液,50mM,pH7.5,添加0.1mM PLP)中,不摇动。在特定的时间间隔,取孵育的酶的等分试样,并用一般步骤的段落B2中所述的直接测试、使用外消旋胺6a作为胺供体,监测了残留活性。每个突变体在孵育前测量的活性分别定义为100%。结果如图1所示。
将突变Y59W、Y87F、Y152F和T231A并入了通过NCBI的BLAST检索识别的几种推定的转氨酶中。在非冗余蛋白序列数据库中使用3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A的氨基酸序列进行查询。在前100个结果中没有发现具有四个突变中的任何一个;所有序列在这些位置中都是保守的,即具有Tyr 59、Tyr 87、Tyr 152和Thr 231。选择具有低至69.6%的同一性的序列(SEQ ID NO:5-11),并且定制了在相应位置中具有四个突变的合成基因(氨基酸序列分别为SEQ ID NO:32和34-38)。除ATA-4外,所有的TA都是可溶性表达的。根据一般步骤的段落B2中所述的测试、使用纯化的TA,测定了这些转氨酶对胺1a、3a、4a和6a的动力学拆分的比活性。
表5:BLAST检索中鉴定的推定转氨酶在并入Y59W/Y87F/Y152F/T231A突变后在动力学拆分模式中的比活性(U/mg)。
在3FCR中发现的并在3GJU中测试的基序可以转移到序列同一性至少65%的酶上,并产生对底物1a、3a和4a的有意义的活性。
实施例2:通过并入突变改善用于动力学拆分外消旋胺1a、2a、3a、4a和6a的TA比活性
根据一般步骤段落B2描述的试验、使用纯化的TA,测定了所提出的突变体在动力学拆分外消旋胺1a、2a、3a、4a和6a上的比活性。在3FCR支架中鉴定了这些位置,然后转移到3GJU支架中,以证实它们在接受目的胺中的重要性。SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:3的同一性为71.3%。表6:在动力学拆分模式中3FCR和3GJU突变体的比活性(U/mg)。n.a.:无活性n.d.:未测定。
位置87对于接受底物2a/b是重要的。脂肪族疏水残基如Leu或Val在该位置上是必要的,以有助于接受。该效果可以转移到同源蛋白(如3GJU,序列同一性:71.3%)。
实施例3:通过引入突变改善TA在动力学拆分外消旋胺5a上的比活性
根据一般步骤段落B2描述的试验、使用纯化的TA,测定了所提出的突变体在外消旋胺5a的动力学拆分上的比活性。在3FCR支架中鉴定了这些位置。
表7:3FCR突变体在外消旋胺5a的动力学拆分中的相对活性。3FCR Y59W/T231A的活性用作参考(100%)。为了比较,提供了对底物6a的比活性(U/mg)。
证实,3FCR支架中的Y59F和T231G取代对底物5a的活性具有有益效果。这些取代在变体Y59F/Y152F/T231G中的组合产生了目前为止相对于底物6a而言对底物5a最好的变体。此外,显示了位置234取代为Phe或Met的有益效果。
实施例4:改善TA在使用异丙胺作为胺供体方面的比活性
根据一般步骤段落B2所述的试验、使用纯化的TA,测定了所提出的突变体在使用异丙胺作为胺供体上的比活性。在3FCR支架中鉴定了这些位置。
表8:使用异丙胺作为胺供体时3FCR突变体的相对活性。3FCR Y59W/T231A的活性作为参考(100%)。为了比较,提供了对底物6a的比活性(U/mg)。
可以得出结论,位置234的取代对于在异丙胺上的活性具有有益效果。
实施例5:使用L-丙氨酸作为胺供体,手性胺1a、3a和4a的非对称合成
将含有0.5mL反应混合物(HEPES缓冲液,50mM,pH8.0)的2mL玻璃瓶在加热振荡器(Eppendorf)上在30℃孵育,振荡速度为600rpm,其中反应混合物为8mM酮(1、3或4)、200mML-丙氨酸、20%DMSO、25mM葡萄糖、5mM NADH、0.5mg/mL葡萄糖脱氢酶GDH-105(Codexis)、5μL/mL来自牛心脏的L-乳酸脱氢酶(LDH)(L2625-50KU,Sigma)、1mM PLP和目的TA。20小时后,通过将酶在90℃热变性10分钟,终止反应。将反应冷却至室温,并向反应混合物中加入等量的含有0.1%二乙胺的乙腈。将混合物在17000g下离心1分钟以除去沉淀的蛋白,将上清液过滤入入口,用于HPLC分析(Chiralpak OD-RH柱,150*4.6mm,5μm颗粒,30℃;使用含有0.1%二乙胺的50%乙腈和50%H2O的等度方法,流速为0.5mL/min)。转化定义为[总胺,mM/(总胺,mM+酮,mM)*100]。
表9:使用L-丙氨酸作为胺供体,在手性胺的非对称合成中的转化率(%)和对映体比例(er,%)。酶浓度为1.8mg/mL;n.d.:未测定
使用L-丙氨酸作为胺供体,可以在不到一天(20小时)以8mM酮的规模(用于生产手性胺1a、3a和4a),以期望的转化率和对映选择性,实现非对称合成。各种变体有效催化了反应。
实施例6:使用丙氨酸作为胺供体,胺5a的非对称合成
将含有0.5mL反应混合物(HEPES缓冲液,50mM,pH8.0)的2mL玻璃瓶在加热振荡器(Eppendorf)上在30℃孵育,振荡速度为600rpm,其中反应混合物为8mM酮5、200mM L-丙氨酸、20%DMSO、25mM葡萄糖、5mM NADH、0.5mg/mL葡萄糖脱氢酶GDH-105(Codexis)、5μL/mL来自牛心脏的L-乳酸脱氢酶(LDH)(L2625-50KU,Sigma)、1mM PLP和目的TA。20小时后,通过将酶在90℃热变性10分钟,终止反应。将反应冷却至室温,并向反应混合物中加入等量的含有0.1%二乙胺的乙腈。将混合物在17000g下离心1分钟以除去沉淀的蛋白,将上清液过滤入入口,用于HPLC分析(Chiralpak OD-RH柱,150*4.6mm,5μm颗粒,30℃;使用含有0.1%二乙胺的30%乙腈和70%H2O的等度方法,流速为0.5mL/min)。转化定义为[总胺,mM/(总胺,mM+酮,mM)*100]。
表10:使用L-丙氨酸作为胺供体,胺5a的非对称合成的转化率(%)。
使用L-丙氨酸作为胺供体,可以在不到一天(20小时),对于底物5a/b以8mM酮的规模,以期望的转化率和对映选择性,实现非对称合成。各种TA突变体有效催化了反应。
实施例7:使用丙氨酸作为胺供体,手性胺1a,(R)-(4-氯苯基)-苯甲胺的非对称合成
在53.5ml反应缓冲液(HEPES 100mM pH 8.0;4mM PLP;400mM D,L-丙氨酸)中,溶解4.5g丙酮酸还原酶混合物(5.4mg GDH-102[Codexis];21.6mg LDH-101[Codexis];126mgNAD[Roche];4.32g D-葡萄糖)。随后以溶液形式加入纯化的突变型转氨酶3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A(22ml,蛋白2.6mg/ml;见A3),并在30℃搅拌5分钟。通过加入溶解在20mlDMSO中的100mg(4-氯苯基)(苯基)甲酮,开始反应。将反应pH手动调节至8.0(2N NaOH),并通过自动添加0.1N NaOH来保持恒定。一开始,黄色的反应溶液稍微混浊。在24小时和转化率为98面积%(IPC-HPLC)后,将反应物酸化至pH2.0以沉淀酶。加入1.125g助滤剂(Dicalite),将混合物搅拌20分钟。随后,将反应混合物通过20g助滤剂(Dicalite)床过滤,用40ml 0.1N HCl洗涤滤饼。将合并的、微黄的清澈水溶液的pH调节至pH 10,溶液颜色改变为橙色,使用两次50ml TBME进行胺提取。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生122mg(122%)微黄的油状物,为标题化合物1a的粗产物。
盐酸盐形成:将粗产物溶于5ml TBME中并在搅拌下使用注射器加入350μl 2MHCl。使形成的悬浮液在室温下搅拌2小时,然后过滤(纸过滤器)。用TBME洗涤分离的盐酸盐并在室温下在高真空下干燥3小时,产生95mg(82%)白色粉末。
化学纯度HPLC:99.7面积%[210nm;X-Bridge C8;50*4.6mm,2.5μm,流2ml,45℃,A:H2O/ACN(95/5),在3分钟内50→10%,保持0.5分钟,B:ACN,在3分钟内40→80%,保持0.5分钟,C:在H2O/ACN(95/5)中100mmol醋酸铵,10%等度];手性HPLC:97.1%(R),2.9%(S)[235nm;Chrownpack CR-I(+);150*3mm,5μm,流0.4ml,40℃,A:55%在H2O中3.6g高氯酸,B:45%ACN];1H NMR(600MHz,CH3OD)δppm7.20-7.49(m,9H),5.57(s,1H);GC-MS:217(M)+。
实施例8:使用丙酮酸盐作为胺受体,动力学拆分胺2a用于制备(S)-2,2-二甲基-1-苯基丙-1-胺
在89.75ml反应缓冲液(TRIS 50mM pH8.5;1mM PLP)中随后加入129mg丙酮酸钠和纯化的突变型转氨酶3FCR Y59W/Y87L/T231A溶液(18.5ml,蛋白2.47mg/ml;见A3),并在30℃下搅拌5分钟。通过加入溶解在1ml DMSO中的100mg 2,2-二甲基-1-苯基丙-1-胺,开始反应。48小时和转化率约为55面积%(IPC-HPLC)后,将反应酸化至pH 2.0以沉淀酶,并搅拌20分钟。随后,将反应混合物通过25g助滤剂(Dicalite)床过滤,随后用去离子水和50ml TBME洗涤滤饼。相分离后,用50mlTBME萃取水相以除去2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮2b。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生25mg(26.5%;手性HPLC:99面积%)2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮2b,为黄色粘稠油状物。使用2N NaOH将水相的pH调节至12,然后用50ml TBME萃取两次。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生38mg(40%)(S)-2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-胺2a,为黄色油状物。
手性HPLC:98.1%(S),1.9%(R)[220nm;Chiracel OD-3R;150*4.6mm,3μm,流1.0ml,25℃,A:50%ACN,B:50%在950ml H2O中6.3g甲酸铵:50ml ACN];1H NMR(600MHz,CDCl3)δppm 7.27-7.31(m,4H),7.24(dt,J=6.0,2.6Hz,1H),3.71(s,1H),0.91(s,9H);GC-MS:162(M)。
实施例9:使用丙氨酸作为胺供体,非对称合成手性胺3a,(S)-1,3-二苯基丙胺
在68ml反应缓冲液(HEPES 100mM pH 8.0;4mM PLP;400mM D,L-丙氨酸)中,溶解4.5g丙酮酸还原酶混合物(5.4mg GDH-102[Codexis]);21.6mg LDH-101[Codexis];126mgNAD[Roche];4.32g D-葡萄糖)。随后加入作为溶液的纯化的突变型转氨酶3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A(6.8ml,蛋白2.6mg/ml;参见A3),并在30℃下搅拌5分钟。通过加入溶解在20ml DMSO中的100mg 1,3-二苯基丙-1-酮,开始反应。通过自动添加0.1N NaOH,将反应pH保持恒定。开始,黄色的反应溶液稍微混浊。24小时和转化率为98面积%(IPC-HPLC)后,将反应酸化至pH2.0以使酶沉淀。加入1.125g助滤剂(Dicalite),将混合物搅拌20分钟。随后,将反应混合物通过20g助滤剂(Dicalite)床过滤,并用40ml 0.1N HCl洗涤滤饼。将合并的、微黄的清澈水溶液的pH调节至pH 10,将其颜色改变为橙色,使用两次50ml TBME进行胺提取。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生95mg(95%)微黄油状物,为标题化合物3a的粗产物。
盐酸盐形成:将粗产物溶于5ml TBME中并在搅拌下使用注射器加入360μl的2MHCl。将形成的悬浮液在室温下搅拌2小时,然后过滤(纸过滤器)。用TBME洗涤分离的盐酸盐并在室温下在高真空干燥3小时,得到84mg(71%)白色粉末,为标题化合物3a的盐酸盐。
化学纯度HPLC:99.0面积%[210nm;X-Bridge C8;50*4.6mm,2.5μm,流动2ml,45℃,A:H2O/ACN(95/5),在3分钟内60→10%,保持0.5分钟,B:ACN,在3分钟内30→80%,保持0.5分钟,C:H2O/ACN(95/5)中100mmol醋酸铵,10%等度];手性HPLC:100%(S)[222nm;Chiralpak IF 3;150*4.6mm,流动1ml,40℃,A:具有0.1%二乙胺的90%庚烷,B:10%乙醇];1H NMR(600MHz,CH3OD)δppm 7.44-7.59(m,5H),7.28-7.33(m,2H),7.12-7.24(m,3H),4.24(dd,J=9.6,5.6Hz,1H),2.55(br t,J=7.9Hz,2H),2.22-2.42(m,2H);LC-MS:212(M+H)+。
实施例10:使用丙氨酸作为胺供体,非对称合成手性胺4a,(S)-苊-1-基胺
在60.5ml反应缓冲液(HEPES 100mM pH8.0;4mM PLP;400mM D,L-丙氨酸)中,溶解4.5g丙酮酸还原酶混合物(5.4mg GDH-102[Codexis]);21.6mg LDH-101[Codexis];126mgNAD[Roche];4.32g D-葡萄糖)。随后加入作为溶液的纯化的氨基转氨酶3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A(15ml,蛋白2.6mg/ml;见A3),并在30℃下搅拌5分钟。通过加入溶解在20mlDMSO中的100mg 2H-苊烯-1-酮,开始反应。将反应pH手动调节至8.0(2N NaOH),并通过自动添加0.1N NaOH而保持恒定。开始,黄色反应溶液稍微混浊。为了防止潜在的氧化芳构化,在N2气氛下和暗处进行反应。46小时和转化率为98面积%(IPC-HPLC)后,将反应酸化至pH2.0以使酶沉淀。加入5g助滤剂(Dicalite),将混合物搅拌20分钟。随后,将反应混合物通过20g助滤器(Dicalite)床过滤,用40ml 0.1N HCl和50ml TBME洗涤滤饼。将合并的、微黄的清澈水溶液的pH调节至pH10,然后使用50ml TBME进行胺萃取。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生112mg(112%)橙棕色油状物,为标题化合物4a的粗产物。
盐酸盐形成:将粗产物溶于5ml TBME中并在搅拌下使用注射器加入445μl 2MHCl。将形成的非常细的悬浮液在室温下搅拌1小时,然后离心(5分钟;4000rpm)。在倾析TBME后,将剩余的固体重悬于10ml TBME中,剧烈混合,离心(5分钟;4000rpm)并再次倾析。在40℃下真空蒸发潮湿的盐酸盐,在室温下高真空干燥3小时,产生84mg(69%)标题化合物4a的盐酸盐,为米色粉末。
化学和手性纯度HPLC:81.5%(S):18.5%(R)[232nm;Chiracel OJ-3;150*4.6mm,3μm;流动2.5ml,30℃,A:具有0.1%二乙胺的96%庚烷,B:4%乙醇];1H NMR(600MHz,CH3OD)δppm:7.90(d,J=8.1Hz,1H),7.77(d,J=8.3Hz,1H),7.54-7.70(m,3H),7.46(d,J=6.9Hz,1H),5.32(dd,J=8.1,2.7Hz,1H),3.99(dd,J=17.8,8.1Hz,1H),3.41(dt,J=17.8,1.3Hz,1H);LC-MS:171.1(M+H)+。
实施例11:使用2-丙胺作为胺供体,非对称合成胺5a,exo-3-氨基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-8-基)-苯基-甲酮
将纯化的突变型转氨酶3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M溶液(总共78ml,蛋白1.1mg/ml;参见A3)和溶于20ml DMSO的100mg 8-苯甲酰基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-酮5b在30℃下搅拌加入到82ml反应缓冲液(HEPES 50mM;2mM PLP;0.2M 2-丙胺盐酸盐;pH7.5)中。反应进行9天,使得转化率达75面积%(IPC-HPLC)。9d后,将反应酸化至pH2.0,使酶沉淀,并搅拌15分钟。随后,将反应混合物通过25g助滤剂(Dicalite)床过滤,并用50ml二氯甲烷萃取两次以除去8-苯甲酰基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-酮5b。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,产生37mg(HPLC:97面积%)8-苯甲酰基-8-氮杂-双环[3.2.1]辛-3-酮5b,为微黄油状物。使用2N NaOH将水相的pH调节至12,然后用50ml二氯甲烷萃取四次。将合并的有机相用MgSO4干燥、过滤并在40℃下真空蒸发,在60℃下高真空干燥36小时,产生60mg(60%)标题化合物5a的黄色油状物。
化学纯度HPLC:98.9面积%[210nm;X-Bridge C8;50*2.1mm,2.5μm,流动ml,40℃,A:90%在H2O/ACN(95/5)中10mmol醋酸铵,B:ACN,10%];手性SFC:100%exo[210nm;Chiralpak AD-3;150*4.6mm,5μm;流动3ml;左40℃;右42℃;A:82%CO2,B:具有0.2%2-丙胺的18%甲醇];1H NMR(600MHz,DMSO-d6,120℃)δppm 7.44(s,5H),4.29(br s,2H),3.16(dt,J=11.1,5.5Hz,1H),1.86-2.00(m,3H),1.79(ddd,J=13.2,5.1,3.0Hz,3H),1.67-1.75(m3H),1.34-1.47(m,2H);LC-MS:231(M+H)+。
序列
野生型序列(加标签):
3FCR野生型 (加标签):氨基酸 (SEQ ID NO:1+SEQ ID NO:56)
3FCR野生型 加标签:核酸 (SEQ ID NO:2)
ATGCTGAAAAACGACCAACTGGACCAATGGGACCGTGATAACTTCTTCCACCCGTCAACGCACCTGGCGCAACATGCCCGTGGCGAATCAGCTAACCGTGTGATCAAAACCGCGTCGGGCGTTTTTATTGAAGATCGCGACGGTACGAAACTGCTGGATGCTTTCGCGGGCCTGTATTGCGTTAATGTCGGCTACGGTCGTCAGGAAATTGCCGAAGCAATCGCTGATCAAGCGCGCGAACTGGCCTATTACCATAGCTATGTGGGCCACGGTACCGAAGCTTCTATCACGCTGGCGAAAATGATTCTGGATCGTGCCCCGAAAAACATGAGTAAAGTTTACTTTGGTCTGGGCGGTTCCGACGCAAACGAAACCAATGTCAAACTGATCTGGTATTACAACAATATTCTGGGCCGCCCGGAGAAAAAGAAAATTATCAGTCGTTGGCGCGGTTATCATGGCAGTGGTCTGGTTACCGGCTCCCTGACGGGTCTGGAACTGTTTCATAAAAAATTCGATCTGCCGGTGGAACAGGTTATTCACACCGAAGCCCCGTATTACTTTCGTCGCGAAGACCTGAACCAGACGGAAGAACAATTCGTCGCACACTGTGTGGCTGAACTGGAAGCGCTGATCGAACGTGAAGGCGCGGATACCATTGCGGCCTTCATCGGCGAACCGATTCTGGGTACGGGCGGTATTGTGCCGCCGCCGGCCGGTTATTGGGAAGCAATCCAGACCGTCCTGAATAAACATGATATTCTGCTGGTTGCGGACGAAGTGGTTACCGGCTTTGGTCGCCTGGGCACGATGTTCGGTTCTGATCACTATGGCCTGGAACCGGACATTATCACCATCGCGAAAGGTCTGACGTCAGCGTACGCCCCGCTGAGCGGTTCTATTGTGTCGGATAAAGTCTGGAAAGTGCTGGAACAGGGCACCGACGAAAACGGTCCGATCGGCCATGGTTGGACGTATAGCGCACACCCGATTGGTGCAGCTGCAGGTGTTGCAAATCTGAAACTGCTGGATGAACTGAACCTGGTTAGCAATGCCGGCGAAGTCGGTGCCTACCTGAACGCAACCATGGCAGAAGCTCTGTCCCAACATGCTAATGTTGGCGATGTCCGTGGCGAAGGTCTGCTGTGCGCGGTGGAATTTGTTAAAGATCGTGACAGCCGCACGTTTTTCGATGCCGCAGACAAAATCGGTCCGCAGATTTCTGCGAAACTGCTGGAACAAGATAAAATTATCGCGCGTGCCATGCCGCAGGGCGACATTCTGGGTTTTGCCCCGCCGTTCTGTCTGACCCGCGCAGAAGCTGATCAAGTCGTGGAAGGTACGCTGCGCGCTGTCAAAGCCGTTCTGGGTTCACATCACCATCACCACCACTAA
3GJU野生型 (加标签):氨基酸 (SEQ ID NO:3+SEQ ID NO:56)
3GJU野生型 加标签:核酸 (SEQ ID NO:4)
ATA-3:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:5)
ATA-4:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:6)
ATA-5:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:7)
ATA-6:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:8)
ATA-7:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:9)
ATA-8:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:10)
ATA-9:在图2中说明的氨基酸(SEQ ID NO:11)
双突变体的序列:
3FCR Y59W/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:12)
3FCR Y59W/T231G:氨基酸 (SEQ ID NO:13)
3FCR Y59F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:14)
3GJU Y59W/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:15)
3GJU Y59W/T231G:氨基酸 (SEQ ID NO:16)
3GJU Y59F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:17)
三突变体的序列:
3FCR Y59W/Y87F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:18)
3FCR Y59W/Y87L/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:19)
3FCR Y59W/Y87V/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:20)
3FCR Y59W/Y87F/T231G:氨基酸 (SEQ ID NO:21)
3FCR Y59F/Y87F/T231G:氨基酸 (SEQ ID NO:57)
3FCR Y59W/T231A/I234F:氨基酸 (SEQ ID NO:22)
3FCR Y59W/T231A/I234M:氨基酸 (SEQ ID NO:23)
3GJU Y59W/Y87F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:24)
3GJU Y59W/Y87L/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:25)
3GJU Y59W/Y87V/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:26)
3GJU Y59W/Y87F/T231G:氨基酸 (SEQ ID NO:27)
3GJU Y59W/T231A/I234F:氨基酸 (SEQ ID NO:28)
3GJU Y59W/T231A/I234M:氨基酸 (SEQ ID NO:29)
4重突变体的序列:
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/1231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:30)
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:31)
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:32)
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:33)
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:34)
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:35)
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:36)
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:37)
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/T231A:图3中所示氨基酸(SEQ ID NO:38)
3FCR Y59W/Y87L/Y152F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:39)
3FCR Y59W/Y87F/T231A/P423H:氨基酸 (SEQ ID NO:40)
3GJU Y59W/Y87L/Y152F/T231A:氨基酸 (SEQ ID NO:41)
3GJU Y59W/Y87F/T231A/P423H:氨基酸 (SEQ ID NO:42)
5重突变体的序列:
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:43)
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:44)
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:45)
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:46)
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:47)
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:48)
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:49)
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:50)
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/7231A/P423H:图4中所示氨基酸(SEQ ID NO:51)
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:53)
3GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:55)
ATA-3 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:58)
ATA-4 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:59)
ATA-5 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:60)
ATA-6 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:61)
ATA-7 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:62)
ATA-8 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:63)
ATA-9 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M:图5中所示氨基酸(SEQ ID NO:64)
3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/234F:氨基酸 (SEQ ID NO:52)
GJU Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234F:氨基酸 (SEQ ID NO:54)
参考文献
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Claims (20)
1.一种相对于天然的野生型转氨酶具有增加的转氨酶活性的突变型转氨酶,
其中所述突变型转氨酶相对于所述野生型转氨酶的差异仅在于如下氨基酸取代,
-其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸Tyr被Trp取代,并且对应于SEQID NO:1的位置231的位置处的氨基酸Thr被Ala取代;或者
-其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸Tyr被Trp取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置87的位置处的氨基酸Tyr被Phe取代,并且对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸Thr被Ala取代;或者
-其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸Tyr被Trp取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置87的位置处的氨基酸Tyr被Phe取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置152的位置处的氨基酸Tyr被Phe取代,并且对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸Thr被Ala取代;或者
-其中对应于SEQ ID NO:1的位置59的位置处的氨基酸Tyr被Trp取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置87的位置处的氨基酸Tyr被Phe取代,其中在对应于SEQ ID NO:1的位置152的位置处的氨基酸Tyr被Phe取代,对应于SEQ ID NO:1的位置231的位置处的氨基酸Thr被Ala取代,并且其中在对应于SEQ ID NO:1的位置423的位置处的氨基酸Pro被His取代;
其中所述突变型转氨酶与SEQ ID NO:1的氨基酸序列至少90%、95%、96%、97%、98%或99%相同。
2.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶由选自SEQ ID NO:12、18、30和43的氨基酸序列组成。
3.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶对于至少一种选自以下的化合物的转氨具有增加的转氨酶活性:1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)和3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a)、3(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)和8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)和异丙胺。
4.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少2倍增加的转氨酶活性。
5.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少2.5倍增加的转氨酶活性。
6.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少3倍增加的转氨酶活性。
7.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少3.5倍增加的转氨酶活性。
8.根据权利要求1所述的突变型转氨酶,其中所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有至少4倍增加的转氨酶活性。
9.根据权利要求1和4-8中任一项所述的突变型转氨酶,其中对于至少一种选自以下的化合物,所述突变型转氨酶相对于相应的野生型酶具有增加的转氨酶活性:1-(4-氯苯基)-1-苯基-1-氨基甲烷(1a)、2,2-二甲基-1-苯基-1-氨基丙烷(2a)、1,3-二苯基-1-氨基丙烷(3a)、1,2-二氢苊烯-1-胺(4a)和3-氨基-8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛烷(5a)、(4-氯苯基)-苯基-甲酮(1b)、2,2-二甲基-1-苯基-丙-1-酮(2b)、1,3-二苯基丙-1-酮(3b)、2H-苊烯-1-酮(4b)、8-苯甲酰基-8-氮杂双环[3.2.1]辛-3-酮(5b)和异丙胺。
10.一种融合蛋白,其包含权利要求1至9中任一项所述的突变转氨酶。
11.一种核酸,其编码权利要求1至9中任一项所述的突变转氨酶或权利要求10所述的融合蛋白。
12.一种宿主细胞,其包含权利要求1至9中任一项所述的突变转氨酶、权利要求10所述的融合蛋白或权利要求11的多核苷酸。
13.一种制备胺的方法,所述方法包括使胺受体与权利要求1至9中任一项的突变型转氨酶或权利要求10的融合蛋白在胺供体存在下反应。
14.根据权利要求13所述的方法,其中产生对映体富集的手性胺,所述方法是
a)在胺受体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下动力学拆分外消旋胺,或
b)在胺供体和突变型转氨酶或融合蛋白存在下对前手性酮进行非对称转氨,
其中突变型转氨酶或融合蛋白是立体选择性的。
16.根据权利要求14至15中任一项所述的方法,其中方法a)中,胺受体选自酮和酮羧酸。
18.根据权利要求14或17所述的方法,其中方法b)中,胺供体是非手性或手性胺或氨基酸。
19.根据权利要求1至9任一项所述的突变型转氨酶或权利要求10所述的融合蛋白用于生产胺的用途。
20.根据权利要求19所述的用途,用于通过动力学拆分或通过非对称转氨作用来生产对映体富集的手性胺的用途。
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