KR102593068B1

KR102593068B1 - 돌연변이 트랜스아미나아제 및 이와 관련된 방법 및 용도

Info

Publication number: KR102593068B1
Application number: KR1020177029553A
Authority: KR
Inventors: 우베 보른쇼이어; 슈테펜 파울 한론; 한스 이딩; 이오아니스 파블리디스; 파울 슈푸어; 바이쓰 마르틴 슈테펜; 베아트 비르츠
Original assignee: 에프. 호프만-라 로슈 아게
Priority date: 2015-04-16
Filing date: 2016-04-13
Publication date: 2023-10-23
Also published as: JP2018511340A; EP3283622A1; US20160304843A1; IL254708A0; KR20170137103A; ES2744623T3; AU2016249780B2; BR112017020561B1; CN107466322B; BR112017020561A2; WO2016166120A1; MX2017013136A; CA2980407C; JP6782708B2; US10017749B2; PL3283622T3; AU2016249780A1; IL254708B; EP3283622B1; AU2016249780A9

Abstract

본 발명은 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제, 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질, 트랜스아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 돌연변이 트랜스아미나아제 및/또는 융합 단백질을 포함하는 숙주 세포, 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질에 의한 아민의 제조 방법, 및 아민의 제조를 위한 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

Description

돌연변이 트랜스아미나아제 및 이와 관련된 방법 및 용도 {MUTANT TRANSAMINASES AS WELL AS METHODS AND USES RELATING THERETO}

본 발명은 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제, 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질, 트랜스아미나아제를 코딩하는 폴리뉴클레오티드, 폴리뉴클레오티드, 돌연변이 트랜스아미나아제 및/또는 융합 단백질을 포함하는 숙주 세포, 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질에 의한 아민의 제조 방법, 및 아민을 제조하기 위한 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

트랜스아미나아제 (또한 아미노트랜스퍼라아제로 나타내어짐) 는, 트랜스아민화 반응, 즉 아민 공여체로부터 아민 수용체로의 아미노 기의 이동, 특히 아민의 탈아민화에 따른 케톤의 아민화 (여기서, 한 분자 또는 도메인 상의 NH₂ 기는 다른 분자 또는 도메인 상의 =O 기와 교환됨) 를 촉매작용한다 (참조, 도식 1).

아민 화합물 예컨대 키랄 아민은 제약, 농약 또는 화학 산업을 위한 유의미한 빌딩 블록이다. 이러한 적용 중 많은 것에서, 오로지 하나의 광학적으로 순수한 형태가 사용됨이 상당히 중요하다. 화학적 합성은 상기 화합물의 제조를 위해 확립되었으나 (예를 들어 전이 금속을 사용한 비대칭 수소첨가), 이러한 화학적 방법은 수율, 순도 및 폐기물 발생에 대해 완벽하지 못하다. 트랜스아미나아제-촉매작용된 아민 제조는 흔히 전통적 방법에 대한 유리한 대안이므로, 대안적 또는 개선된 트랜스아미나아제가 업계에서 관심을 받고 있다.

효소-매개 트랜스아민화를 통한 키랄 아민의 제조는, 조작된 (R)-선택적 트랜스아미나아제를 사용함에 의한 약물 시타그립틴 (sitagliptin) 의 제조에서 잘 나타났던 바와 같은 확립된 화학적 비대칭 합성에 비해 유익하다 (Savile 등, 2010; US 2015/0037869). 이러한 경우, 원하는 기질에 대한 초기 불활성 아민 트랜스아미나아제 (ATA) 는, 방향성 진화 방법 (directed evolution method) 을 통해 집중적으로 조작되었다. 트랜스아미나아제의 추가 돌연변이는 업계에 기재되어 있다 (Steffen-Munsberg 등, 2013; Nobili 등, 2015 Deszcz 등, 2015). 또한 기타 효소는 광학적으로 순수한 키랄 아민 및 아미노산, 예컨대 모노 아민 옥시다아제, 이민 환원효소, 아미노산 데히드로게나아제, 암모니아 라이아제 또는 아미노 뮤타아제의 제조에 사용될 수 있다. 비록 트랜스아미나아제가 라세믹 아민의 속도론적 분할 (kinetic resolution) 에 사용될 수 있기는 하지만, 케토산, 케톤 또는 알데히드로부터의 비대칭 합성이 가장 중요한데, 이는 이들이 속도론적 분할 방식에서의 오로지 50 % 의 이론적 수율과 비교하여, 이론적 100 % 전환을 잠재적으로 야기할 수 있기 때문이다 (참조, 합성 및 속도론적 분할을 예시하는 도식 1).

도식 1:

잔기 R^a, R^b, R^c 및 R^d 은 오로지 설명적 목적으로 적용되었고, 통상적인 유기 잔기를 나타낼 것이다.

그러나, 방향성 진화 접근은 예를 들어 벌키한 기질의 수용과 관련한 분자적 이유에 대한 이해를 본 발명자들에게 제공하지 않는다. 트랜스아미나아제의 높은 거울상 이성질체 선택성은, 크고 작은 빌딩 포켓의 이론에 일조하지만, 문헌에서 밝혀진 가장 큰 성공적인 실시예가 메틸케톤을 전환하는 트랜스아미나아제라는 사실에 의해 설명되는 바와 같이, 벌키한 기질을 수용하기 위해 작은 결합 포켓을 확장시키는 것은 쉽게 얻어지지 못하는 목표이다.

본 발명의 목표는 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제를 고안하는 것이었다. 바람직하게는, 이는 광범위한 기질, 특히 벌키한 기질을 특히 입체 선택성을 유지하면서 수용할 수 있고, 또한 아민 공여체로서 이소-프로필아민을 사용할 수 있어야 한다. 따라서, 증가된 활성은 특히 벌키한 기질 (예시된 선택은 도식 2 및 3 에 도시됨, 아래 참조), 및 아민 공여체 이소-프로필아민과 특히 관련이 있다. 이러한 입체선택성 트랜스아미나아제는 각각의 케톤으로부터 키랄 아민의 비대칭 합성 및 속도론적 분할에 사용될 수 있다.

놀랍게도, SEQ ID NO: 1 (루에제리아 종 (Ruegeria sp.) TM1040 트랜스아미나아제; 3FCR 로 나타내어짐) 의 아미노산 서열과 적어도 65 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고 야생형 트랜스아미나아제에 비해 둘 이상의 아미노산 치환기를 갖고, 여기서 SEQ ID NO:1 의 위치 59 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Trp 또는 Phe 로 치환 (각각 Trp59 또는 Phe59) 되고, SEQ ID NO: 1 의 위치 231 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Ala 또는 Gly 로 치환 (각각 Ala231 또는 Gly231) 되는, 돌연변이 트랜스아미나아제는, 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다.

실시예에 나타낸 바와 같이, 그 치환이 각각의 야생형 트랜스아미나아제에 비해 돌연변이 트랜스아미나아제의 트랜스아미나아제 활성을 증가시키는, 트랜스아미나아제에서의 여러 아미노산 잔기가 식별되었다. 특히, 3FCR 의 이중 돌연변이, 즉 SEQ ID NO:1 의 위치 59 에서 Trp 에 의한 Tyr 의 치환 (Y59W) 및 위치 231 에서 Ala 에 의한 Thr 의 치환 (T231A) 을 갖는 3FCR 은 (Y59W/T231A 로 나타내어짐), 야생형에 의해 수용되는 기질 (도식 2 에 나타낸 바와 같은 아민 3a 및 4a) 에 대해 증가된 활성을 가졌지만, 또한 낮은 활성 (~ 5 mU/mg) 이 아민 1a 에 대해 측정되었다 (표 3 및 4 참조). 트랜스아미나아제 3FCR 의 돌연변이에 의해 얻어진 결과는, 메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti) maff303099 의 트랜스아미나아제의 돌연변이 (3GJU 로 나타내어짐) 에 의해 확인될 수 있었다 (표 3 참조). 또한, SEQ ID NO:1 의 위치 87 에서의 Phe 에 의한 Tyr 의 추가 치환 및/또는 위치 152 에서의 Phe 에 의한 Tyr 의 추가 치환 (Y87F 및 Y152F 로 나타내어짐) 을 갖는 3FCR 돌연변이는, 2 개의 방향족 고리를 갖는 기질 (즉 아민 1a, 3a 및 4a) 에 대해 증가된 활성을 가졌다 (표 4 의 Y59W/Y87F/T231A 및 Y59W/Y87F/Y152F/T231A 참조). 동시에, 돌연변이 Y152F 는 유의하게 돌연변이의 안정성을 증가시켰다 (도 1). 심지어 더 높은 활성 증가 및 허용된 기질 범위는, 3FCR 의 트랜스아미나아제에서 SEQ ID NO: 1 의 위치 423 에서 His 에 의한 Pro 의 추가 치환 (P423H 로 나타내어짐) 에 의해 얻어질 수 있었다 (표 3 및 4 참조). 치환 Y59W, Y87F, Y152F, T231A 및 P423H 을 갖는 돌연변이는 특히 벌키한 기질 (예컨대 아민 1a, 3a 및 4a) 에 대해 활성임을 볼 수 있었다. 또다시, 트랜스아미나아제 3FCR 의 돌연변이에 의해 얻어진 결과는 3GJU 의 돌연변이에 의해 확인할 수 있었다 (표 3 참조). 또한, 돌연변이 Y59W/Y87F/Y152F/T231A 를 갖는 ATA-3, ATA-5, ATA-6, ATA-7, ATA-8 및 ATA-9 의 돌연변이 트랜스아미나아제는 아민 1a, 3a, 4a 및 6a 에 대해 활성인 것을 볼 수 있었다 (표 5 참조). 야생형 서열 ATA-3 내지 ATA-9 은 65-70 % 내지 약 90 % 범위의 야생형 3FCR 에 대한 서열 일치성 (sequence identity) 을 갖는다는 것에 유의한다. 따라서, 본 발명의 개념은 65 % 이상의 3FCR 의 서열 (SEQ ID NO: 1) 에 대한 서열 일치성을 갖는 모든 트랜스아미나아제로 전달될 수 있다는 결론이 내려질 수 있다. 또한, 위치 87 에 지방족 소수성 아미노산, 예컨대 Leu 또는 Val (각각 Y87L 또는 Y87V) 을 갖는 3FCR 및 3GJU 돌연변이는, 증가된 활성을 갖는 것으로 밝혀졌고, 아민 2a 와 같은 3차 탄소 치환기의 수용에 특히 효과적이었다 (표 6 참조). 위치 59 에 페닐알라닌 (Y59F) 및/또는 위치 231 에 글리신 (T231G) 을 갖는 돌연변이는, 아민 5a 와 같은 바이시클릭 화합물에 대해 증가된 활성을 나타낸다 (표 7 참조). 또한, 위치 234 에서 Phe 또는 Met 에 의한 Ile 의 치환을 갖는 3FCR 돌연변이 (각각 I234F 및 I234M 로 나타내어짐) 는, 아민 5a (표 7 참조) 및 아민 공여체 이소-프로필아민 (표 8 참조) 에 대해 증가된 활성을 가졌다. 비대칭 합성 및 속도론적 분할에서 유지되는 돌연변이의 입체선택성 및 적합성은 실시예 5 내지 11 에서 증명되었다 (표 9 내지 10 참조).

따라서, 제 1 양상에서 본 발명은 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제를 제공하는데, 여기서 돌연변이 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1 (루에제리아 종 (Ruegeria sp.) TM1040 트랜스아미나아제; 3FCR 로 나타내어짐) 의 아미노산 서열과 적어도 65 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이 트랜스아미나아제는 야생형 트랜스아미나아제에 비해 둘 이상의 아미노산 치환기를 갖고, 여기서 SEQ ID NO: 1 의 위치 59 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Trp 또는 Phe 에 의해 치환되고 (각각 Trp59 또는 Phe59) SEQ ID NO: 1 의 위치 231 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Ala 또는 Gly 에 의해 치환된다 (각각 Ala231 또는 Gly 231).

용어 "트랜스아미나아제" (Enzyme Commission of the International Union of Biochemistry 에 의해 EC 2.6.1.XX 로 분류됨; 아미노트랜스퍼라아제로 또한 공지됨) 은 일반적으로 아민 공여체로부터의 아민기의 아민 수용체의 카르보닐 기로의 이동 (트랜스아민화) 을 촉매작용하는 효소를 의미한다. 트랜스아미나아제는 피리독살-5'-포스페이트 의존 (PLP-의존) 효소이다. 도식 1 에서 볼 수 있는 바와 같이, 아민 공여체는 아민 수용체에 아미노 기를 제공하고 (원하는 아민이 합성되도록), 상응하는 케톤이 형성된다. 트랜스아미나아제는 흔히 높은 입체 선택성을 지니고, 트랜스아민화 반응은 비대칭 환원에 의해 원하는 아민 및/또는 거울상 이성질체적으로 강화된 아민으로서 산화적 탈아민화를 통한 분할에 의해 잔여 아민 공여체를 제공할 수 있다. ω-트랜스아미나아제 (ω-TA) 는 본 발명에서 특히 관심 대상인데, 이는 이들이 (α-케토 산으로부터 α-아미노산의 합성에 관해 공지된 아미노산 트랜스아미나아제와 대조적으로) 인접한 카르복시 관능기 없이 케톤을 키랄 아민으로 전환할 수 있기 때문이다. 용어 아민 트랜스아미나아제 (ATA) 는 ω-TA 보다 바람직한데, 이는 이러한 효소가 이의 예를 들어 상응하는 ε-알데히드로부터 L-라이신을 합성하는 능력에 관하여 명명되었기 때문임에 유의한다. (S)-선택적 ATA 는 10 년 보다 더 이전부터 이미 공지되어 있다 (Coffen 등, 1994). 본 발명의 트랜스아미나아제는 비선택적 또는 선택적, 예컨대 (S)-선택적 또는 (R)-선택적, 특히 (S)-선택적 트랜스아미나아제일 수 있다. 이러한 트랜스아미나아제의 적합한 예는 또한 표 1 에 주어져있다.

용어 "야생형 트랜스아미나아제" 는 전형적으로 자연에서 발생하는 바와 같은 트랜스아미나아제에 관한 것이다. 천연 발생 야생형 트랜스아미나아제의 예는 아래 표 1 에 및 SEQ ID NO: 1, 3 및 5 내지 11 (아미노산 서열) 로서 주어져 있다. 하나 이상의 돌연변이가 도입되는 경우, 돌연변이 트랜스아미나아제가 수득된다. 따라서, 용어 "돌연변이 트랜스아미나아제" 는 아미노산 서열이 야생형 서열과 상이한 트랜스아미나아제에 관한 것이다. 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제에 대하여, 돌연변이가 기능적으로 활성임이 주목된다. 이는 돌연변이가 그 생물학적 기능, 즉 이의 트랜스아미나아제의 효소적 활성을 유지한다는 것을 의미한다. 본 발명에 따르면, 돌연변이의 트랜스아미나아제 활성은 야생형의 트랜스아미나아제 활성에 비해 증가된다. 돌연변이에 상응하는 야생형 트랜스아미나아제는 최소 갯수의 돌연변이에 의한 돌연변이와 상이한 야생형 트랜스아미나아제이다. 본 발명에 따라 돌연변이될 수 있는 예시적 야생형 트랜스아미나아제가 하기 열거된다:

- 아미노트랜스퍼라아제 (루에제리아 종 TM1040) (GI: 499859271; 3FCR 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 1)

- 트랜스아미나아제 (메소리조비움 로티 (Mesorhizobium loti) maff303099) (GI: 499217058; 3GJU 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 3)

- 트랜스아미나아제 (오세아니콜라 그라눌로수스 (Oceanicola granulosus)) (GI: 494465841; ATA-3 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 5)

- 트랜스아미나아제 (Jannaschia Sp CCS1) (GI: 499773242; ATA-4 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 6)

- 트랜스아미나아제 (잔토박테라세아에 (Xanthobacteraceae)) (GI: 517199618; ATA-5 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 7)

- 로도박테라세아에 박테리움 (Rhodobacteraceae bacterium) RB2150_13166) (GI: 126705951; ATA-6 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 8)

- 트랜스아미나아제 (마르텔렐라 메디테라네아 (Martelella mediterranea) DSM 17316) (GI:516720233; ATA-7 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 9)

- 트랜스아미나아제 (루제리아 포메로이 (Rugeria pomeroyi) DSS-3) (GI:56677770; ATA-8 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 10)

- 트랜스아미나아제 (사기툴라 스텔라타 (Sagittula stellata) E-37) (GI:126711082; ATA-9 로 나타내어짐; SEQ ID NO: 11)

본원에서 기재된 돌연변이가 본 발명에 따라 도입될 수 있는 특히 바람직한 야생형 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1, 3 및 5 내지 11, 특히 SEQ ID NO: 1 및 3, 특히 SEQ ID NO: 1 로 명시되는 것이다.

본 발명에 따르면, 돌연변이 트랜스아미나아제는 돌연변이 없는 각각의 야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는다. 효소 활성은 효소 활성의 측정값이다. 효소 활성의 SI 단위는 카탈 (katal) (1 카탈 = 1　mol s^-1) 이다. 더 실질적이고 통상적으로 사용되는 값은 효소 단위 (U) = 1 μmol min^-1이다. 1 U 는 16.67 나노카탈에 해당한다. 1 U 는 분 당 기질 1 마이크로 몰의 전환을 촉매작용하는 효소의 양으로 정의된다. 활성을 측정할 때 조건은 일반적으로 표준화된다: 이는 일반적으로 25 ℃ 내지 30 ℃ 의 온도 (실시예와 같음) 및 최대 기질 전환율을 얻는 pH 값 및 기질 농도를 취함. 효소의 고유 활성도는 총 단백질 1 mg 당 효소의 활성 (μmol min^-1mg^-1로 표현됨) 이다. 이는 총 단백질 1 mg 당 주어진 조건 하에 주어진 양의 시간에서 효소에 의해 형성된 생성물의 양이다. 고유 활성도는 총 단백질의 질량으로 나눈 반응의 부피를 곱한 반응 속도이다. SI 단위는 카탈 kg^-1이지만, 더 실질적인 단위는 min^-1 mg^-1이다. 고유 활성도는 특정 (일반적으로 포화) 기질 농도에서 효소 처리도의 측정값이고, 일반적으로 순수한 효소에 대해 일정하다. 효소의 분자량이 공지되어 있는 경우, 활성 효소의 턴오버 (turnover) 수 또는 생성물 μmol sec^-1 μmol^-1은 고유 활성도로부터 계산될 수 있다. 턴오버 수는, 초 당 각각의 효소 분자가 그 촉매 사이클을 수행하는 횟수로서 가시화될 수 있다.

활성은 시간에 따른 기질의 소비 또는 생성물의 제조를 측정하는 효소 검정에서 측정될 수 있다. 기질 및 생성물의 농도를 측정하는 많은 수의 상이한 방법이 존재하고, 많은 효소가 당업자에 공지된 여러 상이한 방식으로 검정될 수 있다. 본 발명에서, 당해 트랜스아미나아제는 트랜스아민화에 도움이 되는 조건 하에 및 그 시간 동안 적합한 아민 공여체 및 적합한 아민 수용체와 함께 인큐베이션된다.

효소 검정은 이의 샘플링 방법에 따라 2 개의 군으로 나뉘어질 수 있다: 연속 검정 (여기서 검정은 활성의 연속적 판독을 제공함), 및 불연속 검정 (여기서 샘플이 취해지고, 반응이 중단된 후 기질/생성물의 농도가 측정됨).

바람직한 구현예에서, 본 발명의 트랜스아미나아제는 입체선택적, 예컨대 (S)-선택적 또는 (R)-선택적, 특히 (S)-선택적이다. "입체 선택적" 은 화학적 또는 효소적 반응에서 하나의 입체 이성질체의 다른 하나를 뛰어 넘는 선호적 형성을 나타낸다. 입체 선택성은 부분적 (여기서 하나의 입체 이성질체의 형성은 다른 것보다 선호됨) 일 수 있거나, 이는 완전할 수 있다 (여기서 오로지 하나의 입체 이성질체가 형성됨). 입체 이성질체가 거울상 이성질체인 경우, 입체 선택성은 거울상 선택성으로 나타내어진다. 이는 통상 업계에서 수식 [주요 거울상 이성질체 - 부수적 거울상 이성질체] / [주요 거울상 이성질체 + 부수적 거울상 이성질체] 에 따라 그로부터 계산된 거울상 이성질체적 과량 (e.e.) 으로 보고되었다 (전형적으로 백분율로서). 대안적으로 거울상 이성질체 비율 또는 er (S:R) 은 입체 선택성을 특징짓는데 사용될 수 있다. 거울상 이성질체 비율은 거울상 이성질체의 혼합물 중 한 거울상 이성질체 (예를 들어, (S)-거울상 이성질체) 의 백분율 대 다른 거울상 이성질체 (예를 들어, (R)-거울상 이성질체) 의 백분율의 비율이다. 입체 이성질체는 부분입체 이성질체이고, 입체 선택성은 부분입체 선택성, 통상 대안적으로 부분입체 이성질체적 과량 (d.e.) 로 보고되는 두 부분입체 이성질체의 혼합물 중 한 부분입체 이성질체의 분율 (전형적으로 백분율로 보고됨) 로 나타내어진다. 거울상 이성질체적 과량 및 부분입체 이성질체적 과량은 입체 이성질체적 과량의 유형이다.

이러한 맥락에서 거울상 이성질체적으로 강화된 것은 50:50 초과, 바람직하게는 적어도 70:30, 보다 더 바람직하게는 적어도 95:5, 가장 바람직하게는 적어도 99.5:0.5 의 원하는 키랄 아민 대 원치 않는 키랄 아민의 거울상 이성질체적 비율, 또는 마찬가지로 0% 초과, 바람직하게는 적어도 40%, 보다 더 바람직하게는 적어도 90%, 가장 바람직하게는 적어도 99% 의 거울상 이성질체적 과량을 나타낸다.

놀랍게도, 야생형 트랜스아미나아제에 도입된 본 발명의 맥락에서 본원에 정의된 돌연변이는 야생형 효소에 비해 효소의 트랜스아미나아제 활성을 증가시킨다. 본원에서 상술된 바와 같이, 하기 방법들에 의한 아민의 제조, 특히 거울상 이성질체적으로 강화된 키랄 아민의 제조가 특히 관심 대상이다:

a) 아민 수용체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하에 라세믹 아민의 속도론적 분할

또는

b) 아민 공여체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하에 프로키랄 케톤의 비대칭 트랜스아민화,

여기서 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질은 입체선택성임.

특히, 선택된 화합물, 예를 들어 벌키한 기질 (이는 트랜스아미나아제에 의해 허용된 기질의 스펙트럼을 증가시킴), 및/또는 아민 공여체 이소-프로필아민에 대한 활성이 증가된다. 이는 특히 아민 예컨대 키랄 아민의 트랜스아미나아제-매개 제조에서 더 폭넓은 산업상 이용 가능성에 관해 허용하기 때문에 본 발명에서 중요하다.

트랜스아미나아제가 특히 벌키한 기질에 대해 증가된 활성을 나타냈음이 밝혀졌다. 방법 a) 에 따른 벌키한 (라세믹) 아민에 대한 예시가 아래 도식 2 에 나타나 있다.

도식 2:

이의 화학 명칭은 1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노 프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a) 및 1-페닐에틸아민 (6a) 이다.

방법 b) 에 따른 벌키한 프로키랄 케톤의 예시는 아래 도식 3 에 나타나있다.

도식 3:

이의 화학명은 (4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 및 1-페닐에타논 (6b) 이다.

업계에 익히 공지된 효소 활성을 측정하는 다양한 방법이 존재한다. 이는 제한 없이, 분광계 검정, 형광 검정, 열량측정 검정, 화학발광 검정, 광산란을 포함하는 검정, 방사측정 검정, 및 크로마토그래피 검정을 포함한다. 검정은 일반적으로 예를 들어 pH 값, 온도, 염, 완충액 및 기질 농도를 포함하는 잘 제어된 조건 하에 수행된다. 효소의 트랜스아미나아제 활성을 연구하는데 적합한 시험은 당업자에 익히 공지되어 있다. 적합한 시험이 Schatzle 등에 의해 Analytical Chemistry (2009) 에서 기재된다. 이러한 직접적 측광 검정은 아민 및 이의 상응하는 케톤의 흡수 스펙트럼에서의 유의한 차이를 기반으로 한다. 일반적으로, 공액 방향족 케톤의 흡수 스펙트럼은, 상응하는 아민에는 존재하지 않는 이의 벤조일 잔기의 전자 비편재화로 인해 구별된다. 이러한 차이는 흡수 스펙트럼의 차이로 반영되고, 케톤의 생성은 당업자로부터 쉽게 측정될 수 있는 케톤과 아민 사이에서 상이한 최고 흡수의 파장으로 모니터링될 수 있다. 이러한 검정은 특히 기질 1, 2, 3, 4 및 6 [즉 아민 1a, 2a, 3a, 4a 및 6a (도식 2 참조) 또는 케톤 1b, 2b, 3b, 4b 및 6b (도식 3 참조)] 에 적합하다. 상기 언급된 검정이 적합할 수 있는 기질, 예컨대 기질 5a/b 또는 이소-프로필아민의 경우, 적합한 시험이 스크린 아민 공여체를 위해 개발되었고; 그 이론은 WeiΒ 등에 의해 Analytical Chemistry (2014) 에서 기재되었다. 이러한 시험에서, 글리옥실레이트는 아민 수용체로서 사용된다. 트랜스아미나아제는 글리옥실레이트의 아민화에 의해 글리신을 생성하기 위해 원하는 아민 공여체를 사용하고, 글리신은 이후 글리신 옥시다아제에 의해 산화되어 또한 과산화수소를 생성한다. 과산화수소는 페놀을 1,4-벤조퀴논으로 산화시키기 위한 서양고추냉이 퍼옥시다아제 (horseradish peroxidase) 에 의해 사용되는데, 이는 자발적으로 축합 반응과 함께 4-아미노안티피린과 반응하여 퀴논 이민 염료를 형성하는데, 이는 가시광 파장 (498 nm) 에서 검출될 수 있다. 페놀은 바닐산에 의해 치환될 수 있는데, 이는 2-메톡시-1,4-벤조퀴논을 위해 서양고추냉이 퍼옥시다아제에 의해 매개된 산화적 탈카르복시화 및 산화를 겪는다. 이러한 두 시험과 별개로, 당업자에 공지된 표준 크로마토그래피 방법, 예컨대 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 기체 크로마토그래피 (GC), 초임계 유체 크로마토그래피 (SFC) 및 모세관 전기영동이 또한 사용되었다.

또한, 예시적 시험은 또한 실시예 (B2 부분 참조) 에 기재되어 있고, 특히 적합한 기질은 기질 1 내지 5 [아민 1a 내지 5a (도식 2 참조) 또는 케톤 1b 내지 5b (도식 3 참조) 로서] 또는 아민 공여체 이소-프로필아민 (2-프로필아민) 이다.

또한, 당업자는 어떠한 값이 또다른 것에 비해 증가되거나 증가되지 않는지를 평가하기 위한 통계학적 과정 예컨대 스튜던트 t-시험 (Student's t-test) 또는 카이제곱 시험 (chi-square test) 을 알고 있다. 임의의 백그라운드 신호가 데이터를 분석할 때 빼져야 함은 당업자에게 명백하다. 특정 구현예에서, 효소 활성의 증가는 적어도 약 10 % 이다. 다른 구현예에서, 증가는 적어도 20 %, 30 %, 40 %, 50 % 또는 100 %, 특히 150 %, 200 %, 250 %, 또는 300 % 이다. 활성의 백분율 증가는 [활성 (돌연변이) / 활성 (야생형)-1] ^* 100 로서 측정될 수 있다.

본 발명에 따르면, 돌연변이 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열과 적어도 65 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본원에서 나타내어지는 용어 "SEQ ID NO: 1" 은 SEQ ID NO: 1 에 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 나타내고, 루에제리아 종 TM1040 으로부터의 야생형 아미노트랜스퍼라아제 (3FCR 로 나타내어짐) 의 아미노산 서열을 나타낸다. 특히, 용어 "SEQ ID NO.: 1" 은 아래 나타낸 바와 같은 아미노산 서열을 나타낸다: (본 발명에 따른 바람직한 치환 위치는 볼드체/밑줄로 나타내어져 있고 위치 번호로 명시됨에 유의하기 바람):

본원에서 사용된 용어 "적어도 65 % 동일한" 또는 "적어도 65 % 서열 일치성" 은, 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제의 서열이 100 개의 아미노산의 스트레치 (stretch) 내에서 적어도 65 개의 아미노산 잔기가 상응하는 야생형 서열의 서열과 동일함을 특징으로 하는 아미노산 서열을 갖는다는 것을 의미한다. 본 발명에 따른 서열 일치성은 예를 들어 서열 대조의 형태로 서열 정렬의 방법에 의해 측정될 수 있다. 서열 정렬 방법은 업계에 익히 공지되어 있고, 예를 들어 [Pearson and Lipman (1988)] 에 기재된 다양한 프로그램 및 정렬 알고리즘을 포함한다. 또한, NCBI 기초 로컬 정렬 검색 도구 (BLAST: Basic Local Alignment Tool) 은, 서열 분석 프로그램 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx 과 결부된 사용을 위해, National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD) 을 포함하는 여러 공급처로부터 및 인터넷에서 이용가능하다. SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열에 비해 본 발명에 따른 돌연변이의 일치성의 백분율은 전형적으로 표준 세팅을 갖는 NCBI Blast blastp 를 사용하여 특징지어진다. 대안적으로, 서열 일치성은 표준 세팅을 갖는 소프트웨어 GENEious 를 사용하여 측정될 수 있다. 본 발명에서, 나타낸 정렬 결과는 정렬 유형으로서 자유 말단 갭을 갖는 글로벌 정렬 프로토콜 (global alignment protocol), 및 코스트 매트릭스 (cost matrix) 로서 Blosum62 을 사용하여 Software Geneious (version R8) 로부터 유래된다. SEQ ID NO: 1 (3FCR) 에 대한 야생형 단백질의 일치성은, 포함된 태그 없이 3GJU 의 경우 71.3 %, ATA-3 의 경우 72.2 %, ATA-4 의 경우 70.7 %, ATA-5 의 경우 69.6 %, ATA-6 의 경우 71.8 %, ATA-7 의 경우 77.9 %, ATA-8 의 경우 90.8 %, 및 ATA-9 의 경우 80.3 % 로서 측정되었다.

본 발명에 따르면, 돌연변이 트랜스아미나아제는 야생형 트랜스아미나아제에 비해 둘 이상의 아미노산 치환기를 갖고, 여기서 SEQ ID NO: 1 의 위치 59 에 상응하는 위치에서 아미노산은 Trp 또는 Phe 로 치환 (각각 Trp59 또는 Phe59) 되고 SEQ ID NO: 1 의 위치 231 에 상응하는 위치에서 아미노산은 Ala 또는 Gly 로 치환 (각각 Ala231 또는 Gly231) 된다.

바람직한 구현예에서, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제는 하나 이상의 추가 돌연변이를 갖는데, 즉:

- SEQ ID NO: 1 의 위치 87 에 상응하는 위치에서 아미노산은 소수성 아미노산으로 치환 (HYaa87) 되고, 특히 여기서 소수성 아미노산은 Leu (Leu87) 또는 Val (Val87) 또는 Phe (Phe87) 이고; 및/또는

- SEQ ID NO: 1 의 위치 152 에 상응하는 위치에서 아미노산은 Phe 로 치환 (Phe152) 되고, 및/또는

- SEQ ID NO: 1 의 위치 234 에 상응하는 위치에서 아미노산은 Phe 로 치환 (Phe234) 또는 Met 로 치환 (M234) 되고, 및/또는

- SEQ ID NO: 1 의 위치 423 에 상응하는 위치에서 아미노산은 His (His423) 로 치환된다.

돌연변이의 위치는 SEQ ID NO: 1, 즉 루에제리아 종 TM1040 트랜스아미나아제 (3FCR 로 나타내어짐) 의 아미노산 서열을 참조로 본 발명에서 식별된다. 3FCR 이외에 트랜스아미나아제의 상응하는 돌연변이 부위는, 상기 상술된 바와 같은 아미노산 정렬의 수행에 의해 (예를 들어, 표준 세팅을 갖는 http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi?PROGRAM=blastp&PAGE_TYPE=BlastSearch&LINK_LOC=blasthome 에서 이용가능한 BLAST: 기초 로컬 정렬 검색 도구를 사용하는 것에 의함), 또는 가능한 경우 구조의 대조에 의해, 및 상응하는 아미노산의 식별에 의해 식별될 수 있다. 상응하는 위치의 예는 도 2 내지 4 및 하기 표에 나타나 있다:

본 발명의 한 구현예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제는 하나 이상의 아미노산 결손(들), 특히 작은 (예를 들어, 10 개 이하의 아미노산) N- 및/또는 C-말단 결손을 포함할 수 있다.

한 구현예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제의 서열은, 본원에서 명시된 치환 이외에 하나 이상의 추가 치환(들), 특히 하나 이상의 보존 아미노산 치환을 포함할 수 있다. "보존 아미노산 치환" 는 유사한 측쇄를 갖는 상이한 잔기에 의한 잔기의 치환을 나타내고, 이에 따라 전형적으로 아미노산의 동일한 또는 유사한 정의된 부류 내의 아미노산에 의한 폴리펩티드 내의 아미노산의 치환을 포함한다. 예로써 및 제한 없이, 지방족 측쇄를 갖는 아미노산은 또다른 지방족 아미노산, 예를 들어 알라닌, 발린, 류신 및 이소류신에 의해 치환될 수 있고; 히드록실 측쇄를 갖는 아미노산은 히드록실 측쇄를 갖는 또다른 아미노산, 예를 들어 세린 및 트레오닌에 의해 치환되고; 방향족 측쇄를 갖는 아미노산은 방향족 측쇄를 갖는 또다른 아미노산, 예를 들어 페닐알라닌, 티로신, 트립토판 및 히스티딘에 의해 치환되고; 염기성 측쇄를 갖는 아미노산은 염기성 측쇄를 갖는 또다른 아미노산, 예를 들어 라이신 및 아르기닌에 의해 치환되고; 산성 측쇄를 갖는 아미노산은 산성 측쇄를 갖는 또다른 아미노산, 예를 들어 아스파르트산 또는 글루탐산에 의해 치환되고; 소수성 및 친수성 아미노산은 또다른 소수성 또는 친수성 아미노산으로 각각 대체된다. 보존 아미노산 치환기의 예는 이하 열거된 것을 포함한다:

본 발명의 한 구현예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제는 하나 이상의 아미노산 첨가(들), 특히 작은 (예를 들어 10 개 이하의 아미노산) 내부 아미노산 첨가를 포함할 수 있다.

또다른 구현예에서, 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제의 서열은 본원에 명시된 치환기 이외에 상기 정의된 하나 이상의 결손(들), 치환(들) 또는 첨가(들) 의 조합을 포함할 수 있다.

보다 또다른 바람직한 구현예에서, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제는 적어도 하기 돌연변이를 갖는다:

- Trp59 및 Ala231, 또는

- Trp59, Phe87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Leu87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Val87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 His423; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Leu87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Val87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 His423, 또는

- Trp59 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Leu87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Val87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 His423; 또는

- Phe59, 및 Ala231; 또는

- Phe59, Phe87, 및 Gly231; 또는

- Trp59, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Leu87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Val87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Phe234 및 His423, 또는

- Trp59, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Leu87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Val87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Phe234 및 His423; 또는

- Phe59, Phe87, Gly231 및 Phe234, 또는

- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Leu87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Val87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Met234 및 His423, 또는

- Trp59, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Leu87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Val87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Met234 및 His423; 또는

- Phe59, Phe87, Gly231 및 Met234.

더 바람직하게는, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제는 오로지 하기 돌연변이에 의해서 상응하는 야생형 트랜스아미나아제와 상이하다:

- Trp59 및 Ala231, 또는

- Trp59, Phe87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Leu87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Val87 및 Ala231; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 His423; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Leu87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Val87, Phe152 및 Ala231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 His423, 또는

- Trp59 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Leu87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Val87 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Gly231; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 His423; 또는

- Phe59, 및 Ala231; 또는

- Phe59, Phe87, 및 Gly231; 또는

- Trp59, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Leu87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Val87, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Phe234 및 His423, 또는

- Trp59, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Leu87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Val87, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Phe234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Phe234 및 His423; 또는

- Phe59, Phe87, Gly231 및 Phe234, 또는

- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Leu87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Val87, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Met234 및 His423, 또는

- Trp59, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Leu87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Val87, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Met234; 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Met234 및 His423; 또는

- Phe59, Phe87, Gly231 및 Met234.

보다 더 바람직한 구현예에서, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제는 적어도 하기 돌연변이를 갖는다:

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231, 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234, 또는

Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 H423, 또는

- Phe59, Phe87 및 Gly231.

- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231, 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234, 또는

- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 H423, 또는

- Phe59, Phe87 및 Gly231.

돌연변이 트랜스아미나아제의 바람직한 및 특정 아미노산 서열은 SEQ ID NO: 30 내지 38, 43 내지 51, 53, 55 및 58-64 (도 3, 4 및 5 참조) 및 57 중 어느 하나에 정의된 바와 같은 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 것이다 (아래 "서열" 부분 참조).

상기 상술된 바와 같이, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열과 적어도 65 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 구현예에서, 돌연변이 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1 의 아미노산 서열과 적어도 70 %, 75 %, 80 %, 85 %, 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다. 서열 일치성은 상기 기재된 바와 같이 측정될 수 있다. 본 발명의 바람직한 구현예에서, 돌연변이 트랜스아미나아제는 SEQ ID NO: 1, 3 및 5 내지 11 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 아미노산 서열과 적어도 90 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함한다.

본 발명에 따르면, 돌연변이 트랜스아미나아제는 상응하는 야생형 효소에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는다. 상기 상술한 바와 같이, 이는 벌키한 기질 및 아민 공여체 이소-프로필아민에 대해 특히 관심 대상이다. 따라서, 벌키한 기질/이소-프로필아민에 대한 증가된 활성은 본 발명의 맥락에서 바람직하다. 그에 대한 활성이 증가되었는지를 측정하는데 적합한 벌키한 시험 기질은 기질 1 내지 5 이고, 도식 2 에 나타낸 것, 즉 1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노 프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 및 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a) 및 도식 3 에 나타낸 것 (4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 및 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 을 포함한다. 당업자는 기질 또는 이소-프로필아민 중 하나 이상, 특히 기질 1 내지 5 또는 이소-프로필아민 중 하나 이상에 대한 활성이 증가되는 경우 활성의 증가가 이미 존재함을 이해할 것이다.

이에 따라, 본 발명의 바람직한 구현예에서, 돌연변이 트랜스아미나아제는 (1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노 프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 및 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a), 3(4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 및 이소-프로필아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 트랜스아민화를 위한 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는다.

바람직한 구현예에서, 돌연변이 트랜스아미나아제는, 특히 1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노 프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 및 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a), 3(4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 및 이소-프로필아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물에 관하여, 상응하는 야생형 효소에 비해 적어도 2-배 증가된 트랜스아미나아제 활성, 바람직하게는 적어도 2.5-배 증가된 트랜스아미나아제 활성, 바람직하게는 적어도 3-배 증가된 트랜스아미나아제 활성, 더 바람직하게는 적어도 3.5-배 증가된 트랜스아미나아제 활성, 가장 바람직하게는 적어도 4-배 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는다.

추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질에 관한 것이다.

융합 단백질은 둘 이상의 본래 분리된 단백질 또는 펩티드를 결합시켜 생성된 단백질이다. 이러한 과정은 본래의 단백질 각각으로부터 유래된 기능적 특성을 갖는 폴리펩티드를 야기한다. 이에 따라, 트랜스아미나아제의 의도된 용도에 따라, 이는 추가 펩티드 또는 단백질과 융합 단백질에 조합될 수 있다. 단백질은 링커 또는 스페이서를 통해 융합될 수 있는데, 이는 단백질이 독립적으로 접혀지고 예상된 바와 같이 거동할 가능성을 증가시킨다. 특히 링커가 단백질 정제를 가능하게 하는 경우에, 단백질 또는 펩티드 융합물 중의 링커는 때때로 두 분리된 단백질의 유리를 가능하게 하는 프로테아제 또는 화학적 작용제를 위한 절단 부위에 의해 조작된다. 이량체성 또는 다량체성 융합 단백질은 인공 단백질 이량체화 또는 다량체화를 유도하는 펩티드 도메인의 본래의 단백질 (예를 들어, 스트렙타비딘 또는 류신 지퍼) 에 대한 융합에 의해 조작된 유전자를 통해 제조될 수 있다. 융합 단백질은 또한 이에 부착된 독소 또는 항체에 의해 제조될 수 있다. 기타 융합은 신호 서열, 예컨대 지질화 신호, 서열, 분비 신호 서열, 글리코실화 신호 서열, 전위 신호 펩티드 등의 첨가를 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 융합 단백질은 태그를 포함한다. 태그는 다양한 목적으로, 예를 들어 용이한 정제를 위해, 단백질에서의 적절한 접힘을 돕기 위해, 단백질의 침전을 방지하기 위해, 크로마토그래피 특성을 바꾸기 위해, 단백질을 개질시키기 위해, 단백질을 마킹 (marking) 또는 라벨링 (labeling) 하기 위해 부착된다.

많은 (친화성) 태그 또는 (친화성) 마커가 현재 공지되어 있다. 이는 일반적으로 그 크기에 따라 3 개의 부류로 나뉘어진다: 작은 태그는 최대 12 개의 아미노산을 갖고, 중간 크기의 태그는 최대 60 개의 아미노산을 갖고, 큰 태그는 최대 60 개 초과의 아미노산을 가짐. 작은 태그는 Arg-태그, His-태그, Strep-태그, Flag-태그, T7-태그, V5-펩티드-태그 및 c-Myc-태그를 포함하고, 중간 크기 태그는 S-태그, HAT-태그, 칼모듈린-결합 펩티드, 키틴-결합 펩티드 및 일부 셀룰로오스-결합 도메인을 포함한다. 후자는 189 개 이하의 아미노산을 함유할 수 있고 이후 예컨대 GST- 및 MBP-태그와 같이 큰 친화성 태그로서 여겨진다. 특히 순수한 단백질을 생성하기 위해, 소위 이중 태그 또는 탠덤형 태그가 개발되었다. 이러한 경우 단백질은 2 개의 별도의 크로마토그래피 단계 (각 경우 제 1 태그 및 이후 제 2 태그의 친화성을 이용함) 에서 정제된다. 상기 이중 또는 탠덤형 태그의 예는 GST-His-태그 (폴리히스티딘-태그에 융합된 글루타티온-S-트랜스퍼라아제), 6xHis-Strep-태그 (Strep-태그에 융합된 6 개의 히스티딘 잔기 (아래 참조)), 6xHis-태그100-태그 (포유류 MAP-키나아제 2 의 12-아미노산 단백질에 융합된 6 개의 히스티딘 잔기), 8xHis-HA-태그 (헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 8 개의 히스티딘 잔기), His-MBP (말토오스 결합 단백질에 융합된 His-태그), FLAG-HA-태그 (헤마글루티닌-에피토프-태그에 융합된 FLAG-태그), 및 FLAG-Strep-태그이다. 이러한 태그 대부분은 원핵 세포에 의해 생성된 단백질의 정제를 위해 특별히 개발되었다. 적합한 태그는 상세한 설명에 주어져 있고, 하나의 SEQ ID NO: 56 (SHHHHHH) 을 포함한다.

추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 트랜스아미나아제를 인코딩하는 핵산에 관한 것이다.

본원에 사용된 용어 "핵산" 은 일반적으로 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제를 인코딩하고 다양한 길이일 수 있는 임의의 뉴클레오티드 분자에 관한 것이다. 본 발명의 핵산의 예는 제한 없이, 플라스미드, 벡터, 또는 표준 분자 생물학 과정, 예컨대 예를 들어 이온-교환 크로마토그래피에 의해 단리될 수 있는 임의의 유형의 DNA 및/또는 RNA 분절(들) 을 포함한다. 본 발명의 핵산은 특정 세포 또는 유기체의 트랜스펙션 또는 형질도입에 사용될 수 있다.

본 발명의 핵산 분자는 RNA, 예컨대 mRNA 또는 cRNA 의 형태, 또는 DNA 의 형태, 예컨대 예를 들어 cDNA 및 게놈 DNA (예를 들어 클로닝에 의해 수득되거나 화학적 합성 기술에 의해 생성되거나 이의 조합에 의함) 일 수 있다. DNA 는 삼중-가닥, 이중-가닥 또는 단일-가닥일 수 있다. 단일-가닥 DNA 는 또한 전사 가닥 (sense strand) 으로 또한 공지되어 있는 코딩 가닥일 수 있거나, 이는 또한 항-전사 가닥으로 나타내어지는 비-코딩 가닥일 수 있다. 본원에서 사용된 핵산 분자는 또한 그 중에서도, 단일- 및 이중-가닥 DNA, 단일- 및 이중-가닥 RNA 의 혼합물인 DNA, 및 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물인 RNA, 단일-가닥 또는 더 전형적으로는 이중-가닥 또는 삼중-가닥, 또는 단일- 및 이중-가닥 영역의 혼합물일 수 있는 DAN 및 RNA 를 포함하는 혼성 분자를 나타낸다. 또한, 본원에서 사용된 핵산 분자는 RNA 또는 DNA, 또는 RNA 와 DNA 모두를 포함하는 삼중-가닥 영역을 나타낸다.

또한, 핵산은 하나 이상의 개질된 염기를 함유할 수 있다. 상기 핵산은 또한 예를 들어 생리학적 환경에서 상기 분자의 안정성 및 반감기를 증가시키기 위해 리보오스-포스페이트 골격에 개질물을 함유할 수 있다. 따라서 안정성을 위해 또는 다른 이유로 개질된 골격을 갖는 DNA 또는 RNA 는, 특징이 본원에 의도된 것과 같은 "핵산 분자" 이다. 또한, 드문 염기, 예컨대 단지 2 가지 예를 들자면 이노신, 또는 개질된 염기 예컨대 트리틸화 염기를 포함하는 DNA 또는 RNA 가 본 발명의 맥락 내에 있는 핵산 분자이다. 매우 다양한 변형이 당업자에 공지된 많은 유용한 목적을 수행하는 DNA 및 RNA 에 대해 이루어진다는 것에 유의해야 할 것이다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 핵산 분자는, 핵산 분자의 화학적으로, 효소적으로 또는 대사작용적으로 개질된 형태, 및 바이러스 및 세포의 DNA 및 RNA 특징의 화학적 형태, 예컨대 그 중에서도 단순 및 복합 세포를 포괄한다.

또한, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제를 인코딩하는 핵산 분자는 표준 기술 예컨대 표준 클로닝 기술을 사용하여, 임의의 원하는 서열, 예컨대 조절 서열, 선도 서열, 이종 마커 서열 또는 이종 코딩 서열에 기능적으로 연결되어, 융합 단백질을 생성할 수 있다.

본 발명의 핵산은 본래 시험관내 (in vitro) 또는 배양액 중의 세포에서, 일반적으로 엔도뉴클레아제 및/또는 엑소뉴클레아제 및/또는 폴리머라아제 및/또는 리가아제 및/또는 리콤비나아제에 의한 핵산의 처치 또는 핵산을 생성하기 위해 당업자에 공지된 기타 방법에 의해 형성될 수 있다.

본 발명의 핵산은 발현 벡터에 포함될 수 있는데, 여기서 핵산은 숙주 세포 내의 핵산의 발현을 촉진시킬 수 있는 프로모터 서열에 사용가능하게 연결된다.

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "발현 벡터" 는 일반적으로 세포에서 관심 대상인 단백질을 발현하는데 사용될 수 있는 핵산 분자의 임의의 유형을 나타낸다 (본 발명의 핵산에 대한 상기 상세한 사항을 또한 참조). 특히, 본 발명의 발현 벡터는 제한 없이, 포유류 세포, 박테리아 세포 및 이스트 세포를 포함하는 특정 숙주 세포에서 단백질을 발현하는데 적합한 당업자에 공지된 임의의 플라스미드 또는 벡터일 수 있다. 본 발명의 발현 구축물은 또한 본 발명의 트랜스아미나아제를 인코딩하고, 발현을 보장하기 위해 각각의 벡터에 후속 클로닝하는데 사용되는 핵산일 수 있다. 단백질 발현을 위한 플라스미드 및 벡터는 업계에 공지되어 있고, 다양한 공급처 예컨대 예를 들어 Promega (Madison, WI, USA), Qiagen (Hilden, Germany), Invitrogen (Carlsbad, CA, USA) 또는 MoBiTec (Germany) 로부터 시판될 수 있다. 단백질 발현의 방법은 당업자에 공지되어 있고, 예를 들어 [Sambrook 등, 2000 (Molecular Cloning: A laboratory manual, Third Edition)] 에 기재되어 있다.

벡터는 또한 이것이 숙주 세포에서 복사되는 것을 허용하는 핵산 서열, 예컨대 복제 원점 (origin of replication), 하나 이상의 치료적 유전자 및/또는 선택성 마커 유전자 및 업계에 공지된 기타 유전적 요소 예컨대 인코딩된 단백질의 전사, 해독 및/또는 분비를 지시하는 조절 요소를 포함한다. 벡터는 세포를 형질도입, 형질전환 또는 감염시켜, 세포가 세포 고유의 것 이외의 핵산 및/또는 단백질을 발현하게 하는데 사용될 수 있다. 벡터는 임의로는 세포에의 핵산의 유입을 달성하는 것을 돕기 위한 물질, 예컨대 바이러스 입자, 리포솜, 단백질 코팅 등을 포함한다. 수많은 유형의 적절한 발현 벡터가 표준 분자 생물학 기술에 의한 단백질 발현을 위해 업계에 공지되어 있다. 상기 벡터는 곤충, 예를 들어 바큐로바이러스 발현, 또는 이스트, 진균, 박테리아 또는 바이러스 발현 시스템을 포함하는 통상적인 벡터 유형 중에서 선택된다. 수많은 유형이 업계에 공지되어 있는 기타 적절한 발현 벡터는 또한 이러한 목적으로 사용될 수 있다. 상기 발현 벡터를 얻는 방법은 익히 공지되어 있다 (예를 들어 상기 Sambrook 등 참조).

상기 상술된 바와 같이, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제를 인코딩하는 서열을 단백질의 발현을 보장하기 위해 숙주 세포에서 단백질을 발현하게 하는데 적합한 서열에 사용가능하게 연결된다. 그러나, 청구된 발현 구성물이 중간 생성물을 나타낼 수 있고, 이는 이후 단백질의 발현을 보장하기 위해 적합한 발현 벡터로 클로닝된다는 것이 본 발명에 포함된다. 본 발명의 발현 벡터는 모든 유형의 핵산 서열, 예컨대 제한 없이, 폴리아데닐화 신호, 접합 공여체 및 접합 수용체 신호, 개재 서열, 전사 인핸서 서열, 해독 인핸서 서열, 약물 저항성 유전자(들) 등을 추가로 포함할 수 있다. 임의로는, 약물 저항성 유전자는 세포 주기-특이적 또는 세포 주기-독립적일 수 있는 내부 리보솜 유입 부위 (IRES: internal ribosome entry site) 에 사용가능하게 연결될 수 있다.

본원에서 사용되는 용어 "사용가능하게 연결된" 은, 유전자 요소가 예를 들어 전사가 프로모터에 의해 개시되고 본 발명의 단백질을 인코딩하는 DNA 서열을 통해 진행된다는 점에서 의도된 그 목적을 위해 협력하여 이들이 기능하도록 배열된다는 것을 의미한다. 즉, RNA 폴리머라아제는 융합 단백질을 인코딩하는 서열을 mRNA 로 전사하고, 이는 이후 접합되고 단백질로 해독된다.

본 발명의 맥락에서 사용된 용어 "프로모터 서열" 은 일반적으로 다운스트림 코딩 서열에 사용가능하게 연결된 임의의 유형의 조정 DNA 서열을 나타내는데, 여기서 상기 프로모터는 RNA 폴리머라아제를 결합하고 세포에서 인코딩된 오픈 판독 프레임의 전사를 개시하여, 상기 다운스트림 코딩 서열이 발현하게 할 수 있다. 본 발명의 프로모터 서열은 당업자에 공지된 임의의 유형의 프로모터 서열, 예컨대 제한 없이, 구성 프로모터, 유발 프로모터, 세포 주기-특이적 프로모터 및 세포 유형-특이적 프로모터일 수 있다.

본 발명의 또다른 양상은 본 발명의 트랜스아미나아제, 본 발명의 융합 단백질 또는 본 발명의 폴리뉴클레오티드 또는 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포에 관한 것이다. 본 발명의 한 구현예에서, 트랜스아미나아제 활성을 갖는 숙주 세포는 본 발명의 맥락에서 사용된다. 특히, 임의로는 용해되거나 다르게는 투과성화된 세포는 예를 들어 본 발명의 방법 및 용도에서 트랜스아민화에 사용된다. 본 발명의 "숙주 세포" 는 재조합 DNA 기술에서의 적용에 적합한 임의의 유형의 유기체일 수 있고, 제한 없이 하나 이상의 재조합 단백질(들)을 발현하는데 적합한 모든 종류의 박테리아 및 이스트 균주를 포함한다. 숙주 세포의 예는 예를 들어 다양한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 또는 대장균 (E. coli) 균주를 포함한다. 다양한 대장균 박테리아 숙주 세포는 당업자에 공지되어 있고, 제한 없이 균주 예컨대 DH5-알파, HB101, MV1190, JM109, JM101, 또는 XL-1 blue (이는 다양한 공급처 예컨대 예를 들어 Stratagene (CA, USA), Promega (WI, USA) 또는 Qiagen (Hilden, Germany) 로부터 상업 구매될 수 있음) 를 포함한다. 특히 적합한 숙주 세포, 즉 대장균 BL21 (DE3) 세포가 실시예에 또한 기재되어 있다. 숙주 세포로서 사용될 수 있는 바실러스 서브틸리스 균주는 예를 들어 1012 야생형: leuA8 metB5 trpC2 hsdRM1 및 168 Marburg: trpC2 (Trp-) (이는 예를 들어 MoBiTec (Germany) 로부터 시판됨) 를 포함한다.

본 발명에 따른 숙주 세포의 배양은 당업자에 공지된 통상적 과정이다. 즉, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제를 인코딩하는 핵산은 재조합 방식에 의해 적합한 숙주 세포(들) 에 도입되어 각각의 단백질을 생성할 수 있다. 이러한 숙주 세포는 임의의 유형의 적합한 세포, 바람직하게는 박테리아 세포 예컨대 대장균 (이는 배양에서 경작될 수 있음) 일 수 있다. 제 1 단계에서, 이러한 접근은 각각의 유전자의 적합한 플라스미드 벡터에의 클로닝을 포함할 수 있다. 플라스미드 벡터는 유전자 클로닝에 널리 사용되고, DNA 에 일시적으로 투과성이게 만들어진 박테리아 세포에 도입, 즉 트랜스펙션될 수 있다. 단백질이 각각의 숙주 세포에서 발현된 이후, 세포는 수확되고, 관심대상인 단백질을 함유하는 세포 추출물의 제조를 위한 출발 물질로서 역할할 수 있다. 관심대상인 단백질을 함유하는 세포 추출물은 세포의 용해에 의해 수득된다. 화학적 또는 기계적 세포 용해에 의해 세포 추출물을 제조하는 방법은 당업자에 익히 공지되어 있고, 제한 없이 예를 들어 저장성 염 처리, 균질화 또는 초음파처리를 포함한다.

추가 양상에서, 본 발명은 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 본 발명의 융합 단백질과 아민 수용체를 아민 공여체의 존재 하에 반응시키는 것을 포함하는, 아민의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 이론적으로 도식 1 에 제시된 도식에 따른다 (상기 참조). 도식은 아미노 기가 아민 공여체로부터 아민 수용체로 이동된다는 것을 설명한다. 아민 공여체는 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질에 의해 수용되는 이동성 아미노 기를 포함하는 임의의 분자일 수 있다. 아민 수용체는 아미노 기가 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질에 의해 이동될 수 있는 임의의 분자일 수 있다. 일반적으로, 아미노 기 (NH₂) 는 1차 아민 (아민 공여체) 로부터 카르보닐 기 (C=O) (아민 수용체) 로 트랜스아미나아제에 의해 이동될 것이다. 한편으로는 용어 "아민 수용체" 및 "아미노 수용체" 뿐만 아니라 다른 한편으로는 "아민 공여체" 및 "아미노 공여체" 가 상호교환적으로 사용된다.

바람직한 구현예에서, 거울상 이성질체적으로 강화된 키랄 아민이 제조되고,

방법은

a) 아민 수용체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하의 라세믹 아민의 속도론적 분할, 또는

b) 아민 공여체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하의 프로키랄 케톤의 비대칭 트랜스아민화이고,

여기서 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질은 입체선택성이다.

여기서 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질은 용액, 동결건조물, 고정화 또는 전 세포 촉매로서 적용될 수 있음이 이해된다.

방법 a)

속도론적 분할로 나타내어지는 이러한 방법에서, 라세믹 아민의 거울상 이성질체는 상이한 반응 속도로 입체선택성 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질 (임의로는 숙주 세포에서) 과 반응하여, 덜 반응성인 거울상 이성질체의 거울상 이성질체적으로 강화된 조성물을 생성한다. 따라서, 아민의 라세믹 혼합물은 원하는 거울상 이성질체에 대하여 거울상 이성질체적으로 강화된다.

라세믹 아민은 하기 화학식을 가질 수 있다:

[식 중,

R¹ 또는 R² 는 서로 독립적으로 임의 치환된 알킬, 아릴 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴을 나타내고; 또는

R¹ 및 R² 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함].

바람직한 구현예에서,

R¹ 은 임의 치환된 C_1-12-알킬 또는 아릴이고;

R² 는 임의 치환된 아릴 또는 헤테로시클릴이고; 또는

R¹ 및 R² 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 여기서 임의적 치환기는 C_1-12-알킬, C_1-12-알콕시, 아릴, 아릴옥시, 할로겐, 히드록실 또는 시아노로부터 선택된다.

추가 바람직한 구현예에서,

R¹ 은 임의 치환된 C_1-7-알킬 또는 페닐이고;

R² 는 임의 치환된 페닐이고; 또는

R¹ 및 R² 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 여기서 임의적 치환기는 C_1-7-알킬, C_1-7-알콕시, 페닐, 페닐옥시, 염소 히드록실 또는 시아노로부터 선택된다.

아민의 설명적 예는 (상기) 도식 2 에 나타나 있다.

방법 a) 에서 속도론적 분할에 적합한 아민 수용체는 케톤 및 케토 카르복시산으로부터 선택될 수 있다. 바람직하게는, 케토 카르복시산 예컨대 2-케토 카르복시산 예컨대 2-케토글루타르산, 글리옥실산, 피루브산, 옥살로아세트산 등, 및 이의 적합한 염이 사용된다. 흔히 사용되고 이에 따라 가장 바람직한 것은 2-케토 카르복시산 예컨대 2-케토글루타레이트, 피루베이트, 글리옥실레이트 또는 옥살로에이트의 짝염기이다.

돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질에 의한 라세믹 아민의 속도론적 분할은, 편의상 10 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 40 ℃ 의 온도 범위에서 5 내지 11, 특히 7.5 내지 10 범위의 pH 에서 CHES 완충액과 같은 생리학적 완충액을 적합하게 함유하는 수성 매질 중에서 실행된다.

아민 수용체에 대한 라세믹 아민의 몰비는 원칙적으로, 2-케토 카르복시산이 아민 수용체로서 사용될 때 1.1 내지 10, 특히 1.1 내지 2.5 의 몰비에서 선택된다. 케톤을 아민 수용체로서 사용할 때 몰비는 상당히 증가될 수 있다.

방법 b)

방법 b 는 아민 공여체 및 입체선택성 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질 (임의로는 숙주 세포에서) 의 존재 하에 프로키랄 케톤의 비대칭 트랜스아민화를 필요로 한다.

프로키랄 케톤은 하기 화학식을 가질 수 있다:

[식 중,

R³ 또는 R⁴ 은 서로 독립적으로 임의 치환된 알킬, 아릴, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴을 나타내고; 또는

R³ 및 R⁴ 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함].

바람직한 구현예에서,

R³ 은 임의 치환된 C_1-12-알킬 또는 아릴이고;

R⁴ 는 임의 치환된 아릴 또는 헤테로시클릴이고; 또는

R³ 및 R⁴ 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 여기서 임의적 치환기는 C_1-12-알킬, C_1-12-알콕시, 아릴, 아릴옥시, 할로겐, 히드록실 또는 시아노로부터 선택된다.

추가 바람직한 구현예에서,

R³ 은 임의 치환된 C_1-7- 알킬 또는 페닐이고;

R⁴ 는 임의 치환된 페닐이고; 또는

R³ 및 R⁴ 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성하고, 여기서 임의적 치환기는 C_1-7-알킬, C_1-7-알콕시, 페닐, 페닐옥시, 염소 히드록실 또는 시아노로부터 선택된다.

프로키랄 케톤에 대한 설명적 예는 (상기) 도식 3 에 나타나 있다.

적합한 아민 공여체는 일반적으로 아키랄 또는 키랄 아민 또는 아미노산으로부터 선택될 수 있다. 전형적 아민은 1차 지방족 아민 예컨대 이소-프로필아민, 1-페닐에틸아민, 2-아미노-4-페닐부탄, o-자일릴렌 디아민 또는 아미노산 예컨대 알파 아미노산 글리신, 글루탐산 또는 알라닌이다.

바람직한 아민 공여체는 이소-프로필아민 및 L-알라닌이다.

본 발명의 바람직한 구현예에서, 아민 수용체 및 아민 공여체는 원하는 거울상 이성질체적으로 강화된 키랄 아민 쪽으로의 평형을 선호하는 시스템을 사용하여 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질과 반응된다.

다양한 생체촉매 전략은 형성된 부산물, 예를 들어 피루베이트의 제 2 효소, 예를 들어 락테이트 데히드로게나아제, 피루베이트 데카르복시라아제에 의한 제거, 또는 알라닌 데히드로게나아제를 통한 재순환/제거에 의하여 비대칭 트랜스아민화의 평형을 바꾸는데 사용되었다.

다중 효소로서 시스템이 적용되고, 반응 조건은 모든 포함된 효소의 요건을 만족시키는 것이 필요하다. 편의상 반응은 10 ℃ 내지 50 ℃, 바람직하게는 20 ℃ 내지 40 ℃ 의 온도 범위에서 5 내지 11, 특히 7.5 내지 10 범위의 pH 에서 CHES 완충액과 같은 생리학적 완충액을 적합하게 함유하는 수성 매질에서 이루어진다.

프로키랄케톤 및 아민 공여체의 몰비는 사용된 제 2 효소 및 개별적 반응 조건에 의존적이다. 원칙적으로 프로키랄 케톤 및 아민 공여체의 몰비는 1:100 내지 1:5, 특히 1:50 내지 1:10 범위에서 선택될 수 있다.

바람직한 아민 공여체로서 이소-프로필아민의 많은 과량을 적용하는 것은, 비대칭 트랜스아민화에서의 평형을 특히 형성된 아세톤, 이의 상응하는 케톤의 제자리 제거와의 조합으로 표적 아민의 형성쪽으로 이동시킨다. 유기 공동-용매 (수혼화성 및 수불혼화성), 또는 기타 특정 첨가제의 첨가는 반응을 개선시킬 수 있을 것이다.

화학식 I 의 라세믹 아민 및 화학식 II 의 프로키랄 케톤에 대해 본원에서 사용된 용어는 하기 의미를 갖는다.

용어 "할로겐" 은 플루오로, 클로로, 브로모 또는 요오도, 특히 염소를 나타낸다.

용어 "알킬" 은 탄소수 1 내지 12 의 1가 선형 또는 분지형 포화 탄화수소 기를 나타낸다. 특정 구현예에서, 알킬은 1 내지 7 개의 탄소 원자를 갖고, 더욱 특정한 구현예에서 1 내지 4 개의 탄소 원자를 갖는다. 알킬의 예는 메틸, 에틸, 프로필, 이소-프로필, n-부틸, 이소-부틸, sec-부틸, 또는 tert-부틸을 포함한다.

용어 "알콕시" 는 산소 라디칼에 부착되는 상기 정의된 알킬 기를 나타낸다. 알콕시의 예는 메톡시, 에톡시, 이소-프로폭시, n-부톡시, 이소-부톡시, sec-부톡시, 또는 tert-부톡시를 포함한다.

용어 "아릴" 은 6 내지 10 개의 탄소 고리 원자를 포함하는 1가 방향족 카르보시클릭 모노- 또는 바이시클릭 고리계를 나타낸다. 아릴 잔기의 예는 페닐 및 나프틸을 포함한다.

용어 "아릴옥시" 는 산소 라디칼에 부착되는 상기 정의된 아릴 기를 나타낸다. 적합한 예는 페녹시 또는 나프틸옥시이다.

용어 "모노- 또는 폴리-시클릭 고리" 는 원자, 주로 탄소의 하나 이상의 폐쇄된 고리를 특징으로 하는 화합물을 나타낸다. 이러한 고리 하부구조는 시클로알칸, 방향족 및 기타 고리 유형을 포함한다. 비록 "폴리" 가 문자 그대로 "많은" 을 의미하기는 하지만, 이는 또한 바이시클릭, 트리시클릭, 테트라시클릭 등을 포함한다.

용어 "카르보시클릭" 은 고리 원 모두가 탄소 원자인 포화, 일부 불포화 또는 불포화 시클릭 화합물, 예컨대 시클로헥산, 데칼린 또는 1,2-디히드로나프탈렌을 나타낸다. 화합물은 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 단순 방향족 고리는 공액된 평면 고리계로만 이루어진다. 폴리시클릭 방향족 탄화수소는 오로지 탄소 및 수소를 함유하고, 다중 방향족 고리로 이루어진다. 예는 나프탈렌, 안트라센 및 페난트렌을 포함한다.

용어 "헤테로시클릴" 은 질소, 산소 및/또는 황으로부터 선택되는 1, 2 또는 3 개의 헤테로원자를 포함할 수 있는 포화, 일부 불포화 또는 불포화 5 내지 6 원 모노시클릭 고리를 나타낸다. 고리계는 방향족 또는 비방향족일 수 있다. 전형적 헤테로시클릴 잔기는 피리디닐, 피페리디닐, 피롤리딜, 피리미디닐, 푸라닐, 피라닐, 벤조이미다졸릴, 퀴놀리닐 또는 이소퀴놀리닐이다.

화학식 I 의 라세믹 아민 및 화학식 II 의 프로키랄 케톤을 위해 본원에서 사용되는 임의적 치환기는 알킬, 알콕시, 아릴, 아릴옥시, 할로겐, 히드록실 또는 시아노로부터 선택될 수 있다. 상기 열거된 바람직한 사항 및 예를 치환기에 마찬가지로 적용한다.

또다른 양상에서 본 발명은 케톤의 트랜스아민화를 위한, 특히 이동된 아미노 기에 결합된 비대칭 탄소 원자를 갖는 키랄 아민의 합성을 위한, 본 발명의 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 본 발명의 융합 단백질의 용도에 관한 것이다.

본 발명의 용도와 관련하여, 이러한 양상에 또한 적용가능한 본 개시의 기타 양상의 내용에서 사용된 용어, 예 및 특정 구현예가 인용된다. 특히 본 발명에 따른 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질은 본 발명의 방법에 대해 상술된 바와 같이 사용될 수 있다.

달리 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어 및 임의의 약어는 본 발명의 업계의 당업자에 의해 통상 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. 분자 생물학에서 통상적인 용어의 정의는 [Benjamin Lewin, Genes V, published by Oxford University Press, 1994 (ISBN 0-19-854287-9)]; [Kendrew et al. (eds.), The Encyclopedia of Molecular Biology, published by Blackwell Science Ltd., 1994 (ISBN 0-632-02182-9)]; 및 [Robert A. Meyers (ed.), Molecular Biology and Biotechnology: a Comprehensive Desk Reference, published by VCH Publishers, Inc., 1995 (ISBN 1 -56081 -569-8)] 에서 찾을 수 있다.

본 발명은 본원에 기재된 특정 방법론, 프로토콜 및 시약에 대해 제한되지 않는데, 이는 이들이 변화될 수 있기 때문이다. 비록 본원에 기재된 것과 유사하거나 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실시에서 사용될 수 있기는 하지만, 바람직한 방법 및 물질이 본원에 기재된다. 또한, 본원에서 사용된 용어는 오로지 특정 구현예를 기재하는 목적이고, 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 의도되지 않는다.

본원에서 및 첨부된 청구항에서 사용된 바와 같은, 단수 형태는 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, 복수의 언급을 포함한다. 유사하게, 단어 "포함한다", "함유한다" 및 "포괄한다" 는 배타적으로 보다는 포괄적으로 해석된다. 유사하게, 단어 "또는" 은 문맥이 명백하게 달리 나타내지 않는 한, "및" 을 포함하는 것으로 의도된다. 용어 "복수" 는 둘 이상을 나타낸다.

하기 도면 및 실시예는 본 발명의 다양한 구현예를 설명하는 것으로 의도된다. 상기와 같이, 논의되는 특정 변형은 본 발명의 범주에 대한 제한으로서 이해되지 않는다. 다양한 동등물, 변화 및 변형이 본 발명의 범주로부터 벗어나지 않으면서 이루어질 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이고, 이에 따라 상기 동등 구현예가 본원에 포함됨이 이해된다.

도면

도 1: HEPES 완충액 (50 mM) pH 7.5 에서 25 ℃ 하에 3FCR 변종의 열 안정성; 3FCR Y59W/T231A (빈 원), 3FCR Y59W/Y87F/T231A (채워진 원), 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A (삼각형), 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/ P423H (사각형). 활성은 아민 공여체로서 6a 를 사용하여 단락 B2 에 기재된 바와 같이 속도론적 분할 방식으로 평가되었고, 인큐베이션 이전의 활성은 100% 로 정의되었다.

도 2: 바람직한 야생형 트랜스아미나아제 3FCR, 3GJU, ATA-3, ATA-4, ATA5, ATA-6, ATA-7, ATA-8 및 ATA-9 의 서열 정렬. 본 발명에 따른 돌연변이 Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Met234 및 His423 을 위한 부위는 밑줄에 의해 각각의 트랜스아미나아제에서 나타내어진다.

도 3: 바람직한 특정 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR, 3GJU, ATA-3, ATA-4, ATA5, ATA-6, ATA-7, ATA-8 및 ATA-9 (각각 나타낸 바와 같이 치환된 4 개의 아미노산을 가짐) 의 서열 정렬. 본 발명에 따른 돌연변이 Trp59 (Y59W), Phe87 (Y87F), Phe152 (Y152F) 및 Ala231 (T231A) 은 밑줄에 의해 각각의 트랜스아미나아제에서 나타내어진다.

도 4: 바람직한 특정 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR, 3GJU, ATA-3, ATA-4, ATA5, ATA-6, ATA-7, ATA-8 및 ATA-9 (각각 나타낸 바와 같이 치환된 아미노산 5 개를 가짐) 의 서열 정렬. 본 발명에 따른 돌연변이 Trp59 (Y59W), Phe87 (Y87F), Phe152 (Y152F), Ala231 (T231A) 및 His423 (P423H) 은 밑줄에 의해 각각의 트랜스아미나아제에서 나타내어진다.

도 5: 바람직한 특정 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR, 3GJU, ATA-3, ATA-4, ATA5, ATA-6, ATA-7, ATA-8 및 ATA-9 (각각 나타낸 바와 같이 치환된 아미노산 5 개를 가짐) 의 서열 정렬. 본 발명에 따른 돌연변이 Trp59 (Y59W), Phe87 (Y87F), Phe152 (Y152F), Ala231 (T231A) 및 Met234 (I234M) 은 밑줄에 의해 각각의 트랜스아미나아제에서 나타내어진다.

실시예

일반적 과정

A 생촉매 제조

A1 트랜스아미나아제 유전자 획득 및 발현 벡터의 구축

트랜스아미나아제 (TA) 개방 판독 프레임은, 보고된 트랜스아미나아제의 아미노산 서열 (표 1 에 제공된 NCBI GI 코드), 및 GenScript (Piscataway, U.S.A.), OptimumGene^TM의 코돈 최적화 알고리즘을 기초로, 대장균 (E. coli) 에서의 발현을 위해 디자인 및 합성되었다. 말단에 종결 코돈을 갖는 C-말단 히스티딘 태그는, 금속 친화성 크로마토그래피를 통한 발현 TA 의 정제를 용이하게 하기 위해 모든 경우에 첨가되었다 (각각의 단락 참조). 관심 대상인 벡터, pET22b 에서 후속 클로닝을 위한 제한 부위; 5' 말단에서의 NdeI 제한 및 3' 말단에서의 BamHI 제한 서열은 뉴클레오티드 서열에 첨가되었다. 출발 코돈 (ATG) 은 NdeI 의 제한 부위에 포함되어, 오로지 하나의 코딩된 메티오닌이 존재한다. 벡터는 암피실린 저항성을 위해 bla 코딩 서열 (베타-락탐아제) 을 함유한다. 클로닝 전략에 따르면, 발현은 lac 프로모터의 제어 하에 있다. 생성된 플라스미드는 표준 방법을 사용하여 대장균 BL21 (DE3) 으로 형질전환되었다. 코돈 최적화 유전자 및 인코딩된 폴리펩티드의 서열은 "서열" 부분에서 제공된다.

본 발명에서 사용된 돌연변이는 QuikChange^® PCR 방법의 변형된 버전으로 제조되었다. 프라이머는 원하는 돌연변이를 제공하는 불일치와 함께 디자인되었다. 각 반응에 대하여, 본 출원인은 Pfu 완충액, 0.2 mM dNTP, 0.2 ng/㎕ 부모 플라스미드 (parental plasmid), 0.2 μM 의 각각의 프라이머, 2 % (w/w) DMSO 및 0.2 ㎕ 의 Pfu Plus! 폴리머라아제를 사용하였다. 증폭은 하기와 같이 수행되었다:

a) 95 ℃, 5 min;

b) 20 사이클: 95 ℃, 45 sec; 60 ℃, 45 sec; 72 ℃, 7 min;

c) 72 ℃, 14 min

PCR 생성물을 2 h 동안 37 ℃ 에서 DpnI (20 ㎕/mL) 에 의해 소화시킨 후, 제한 효소를 20 min 동안 80 ℃ 에서 가열에 의해 불활성화하였다. 소화된 PCR 생성물을 표준 방법을 사용하여 대장균 TOP-10 세포로 형질전환하였다. PCR 생성물에 의해 형질전환된 클론으로부터 플라스미드 단리를 수행하였고, 정확한 서열을 DNA 서열분석에 의해 확인하였다. 정확한 돌연변이를 갖는 단리된 플라스미드를 표준 방법을 사용하여 대장균 BL21 (DE3) 세포로 형질전환하였다.

표 1: 본 발명에서 사용된 트랜스아미나아제, 및 야생형 서열의 NCBI 유전자 인식자 코드 (GI).

A2 트랜스아미나아제의 제조

대장균 BL21 (DE3) 의 단일 미생물 집락을 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 시험 튜브에서 3 mL 루리아 베르타니 (Luria Bertani) 배지에 접종하고, 180 rpm 으로 진탕시키면서 30 ℃ 에서 밤새 (약 18 h) 성장시켰다. 300 mL 진탕 플라스크에서, 100 ㎍/mL 암피실린을 함유하는 30 mL 의 테러픽 브로스 (Terrific Broth) 를 1 % (v/v) 의 상기 밤새 배양물 (0.3 mL) 로 접종시키고, 180 rpm 에서 진탕시키면서 37 ℃ 에서 0.5 내지 0.7 의 600 nm 에서의 광학 밀도 (OD₆₀₀) 로 인큐베이션하였다. 배양액을 20 ℃ 로 냉각시키고, 이소프로필 β D-티오갈락토사이드 (IPTG) 를 0.2 mM 의 최종 농도로 첨가하여, TA 의 발현을 유도하였다. 진탕시키면서 20 ℃ 에서 밤새, 약 16 h 이상 동안 인큐베이션을 지속하였다. 원심분리 (6000 g, 10 min, 4 ℃) 를 통해 세포를 수확하고, 상청액을 버렸다. 0.1 mM 피리독살-5-포스페이트 (PLP) 를 함유하는 6 mL 의 사전-냉각된 (4 ℃) HEPES 완충액 (50 mM, pH 7.5) 에 세포 펠릿을 재현탁시키고, 초음파 (Bandelin Sonopuls HD2070; 5 분 간격으로 5 분 2 회, 50 % 펄스, 60 % 파워, 항상 얼음에서 유지함) 로 처리하여, 세포를 용해시켰다. 세포 잔해물을 원심분리 (6000 g, 30 min, 4 ℃) 로 제거하였다. 용해물 상청액을 0.2 ㎛ 필터 (Millipore) 에 의해 여과하였고, +4 ℃ 에서 또는 -20 ℃ 에서 30 % 글리세롤의 첨가와 함께 저장하였다. 후속 정제 단계의 경우, 0.3 M NaCl 은 용해 완충액에 포함된다.

A3 트랜스아미나아제의 정제

당업자에 대한 표준 방법에 의해, 모든 발현된 TA 에서 C-말단 HisTag 의 이점을 취하여, 금속 친화성 크로마토그래피를 사용하여 단백질 정제를 수행하였다. 단락 A2 에 기재된 바와 같이 제조된 미정제 용해물을, 용해 완충액 (HEPES 완충액, 50 mM, 0.3 M NaCl, 0.1 mM PLP) 과의 평형화 이후에, Akta 단백질 크로마토그래피 시스템에 장착된 HisTrap FastFlow 5mL 컬럼에 로딩하였다. 컬럼이 TA 와 함께 로딩되면, 10 mM 이미다졸 2 컬럼 부피의 적용과 함께 비특이적으로 결합된 단백질로부터 이를 세척하였다. 0.3 M 이미다졸 2 컬럼 부피의 적용에 의해 컬럼으로부터 TA 를 용리하였다. 정제된 TA 분획을 풀링하고, 이후 당업자에 공지된 표준 과정에 의해 0.1 mM PLP 을 함유하는 HEPES (50 mM, pH 7.5) 완충액으로 평형화된 Sephadex G60 컬럼을 사용하여, Akta 시스템을 통해 탈염하였다. 정제된 효소 용액을 +4 ℃ 에서 또는 -20 ℃ 에서 30 % 글리세롤의 첨가와 함께 저장하였다.

B 생촉매

B1 관심대상인 화합물의 스톡 용액 제조

관심 대상인 기질의 소수성으로 인해 (도식 2 및 3 참조), 수용성 유기 용매, 예컨대 2-프로판올 또는 디메틸술폭시드 중에서 스톡 용액을 제조하였다. 속도론적 분할 실험을 위한 표준 과정에서, 관심 대상인 아민 및 케톤의 20 내지 40 mM 스톡 용액을 2-프로판올 중에서 제조하였다. 아민 1 및 4 는 HCl-염으로서 제조되었으므로, 용액을 실온에서 30 sec 동안 초음파 처리 (Bandeling Sonorex RK 512H) 하여, 분산을 용이하게 하였다. 분산 이후, 균질 용액을 안정화시켰고, 아민 또는 아민 염의 침전은 관찰되지 않았다.

B2 속도론적 분할 방식으로의 활성 측정

미량 역가판 판독기 (microtiter plate reader) 를 사용하여, TECAN Infinite^®200 PRO 판독기에서 활성 측정을 수행하였다. Analytical Chemistry (2009; 또한 상기 참조) 에서 Schaetzle 등에 의해 기재된 직접 측광 검정의 경우, 효소적 반응이 200 ㎕ 의 총 부피에서 30 ℃ 에서 CHES 완충액 (50 mM, pH 9.0) 중에서 이루어진다. 관심대상인 1 mM 의 라세믹 아민 (rac-아민) 및 2 mM 의 아민 수용체 (바람직하게는 피루베이트 또는 글리옥실레이트) 를, 관심대상인 TA 를 함유하는 완충액에 첨가 (최종 농도) 하였다. 유기 용매 중의 아민 스톡 용액의 제조로 인해, 유기 용매 (2-프로판올 또는 DMSO) 의 최종 농도는 5 % (v/v) 이다. 반응은 제 2 기질 (피루베이트) 의 첨가에 의해 개시된다. 효소의 농도는, 시험에서 기질에 대한 특이적 활성에 따라 2 내지 800 ㎍/mL 최종 농도에서 변화하였다. 케톤의 제조는 당업자에 공지된 방법에 의해 측정되는 바와 같이, 각각의 화합물에 대한 최적 파장에서 모니터링된다. 각각의 기질에 사용된 파장, 및 정확한 반응 조건에서 측정된 TA 의 특이적 활성을 측정하는데 사용된 겉보기 소광 계수는 아래 표 2 에 제시되어 있다.

표 2: 관심 대상인 케톤에 관한 최적 파장 (nm) 및 겉보기 소광 계수 (M^-1cm^-1). 케톤 5a 는 포함되지 않는데, 이는 직접적 측광 검정에 의해 모니터링될 수 없기 때문이다. 겉보기 계수가 계산되어 반응 조건을 시뮬레이션하였는데, 이는 아민 중 일부가 모니터링되는 파장에서 부수적이지만 해롭지 않은 흡수를 가졌기 때문이다.

직접적 측광 검정이 적용될 수 없는 화합물, 예컨대 기질 5a/b 및 이소-프로필아민의 경우, Analytical Chemistry (2014) 에서 Weiss 등에 의해 기재된 시험이 사용되었다. 이러한 시험을 사용하기 위해, 2 mM 아민 5a 또는 50 mM 이소-프로필아민 (아민 공여체), 2.4 mM 글리옥실레이트 (아민 수용체), 0.12 mg/mL 게오바실러스 카우스토필루스 (Geobacillus kaustophilus) 로부터의 글리신 옥시다아제, 5 U/mL 서양고추냉이 퍼옥시다아제, 3.9 mM 바닐산 및 1.2 mM 4-아미노안티피린을 함유하는 CHES 완충액 (pH 9.0, 50 mM) 중의 마스터 믹스 (master mix) 를 제조하였다. 130 ㎕ 의 마스터 믹스에 1 mg/mL 의 농도로 정규화된 20 ㎕ 의 효소 용액의 첨가에 의해 반응을 개시하고, 이를 1 h 동안 37 ℃ 에서 수행하였다. 퀴논 이민 염료의 형성으로 인해 498 nm (ε = 4654 M^-1cm^-1) 에서 흡수의 증가에 의해 효소적 활성을 측정하였다. 이러한 시험이 3 개의 효소의 활성에 의존하므로, 고유 활성도의 계산은 불가능하다. 따라서, TA 의 활성은 항상 참조 변종에 대해 나타내어진다 [활성 (돌연변이) / 활성 (참조) ^* 100)]

실시예 1: 돌연변이의 포함에 의해 rac- 아민 1a, 3a 및 4a 의 속도론적 분할을 위한 TA 특이적 활성의 개선

정제된 TA 에 의해, 일반적 과정의 B2 부분에 기재된 시험에 따라 rac-아민 1a, 3a, 4a 및 6a 의 속도론적 분할에 대해 나타낸 돌연변이의 특이적 활성을 측정하였다. 관심 대상인 아민의 수용에서 이의 유의성의 확인을 위하여, 위치를 3FCR 골격에서 식별한 후, 3GJU 골격으로 이동시켰다. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 3 의 일치성은 71.3 % 이다.

표 3: 속도론적 분할 방식에서 3FCR 및 3GJU 돌연변이에 대한 특이적 활성 (U/mg). n.a.: 활성이 아님; n.d.: 측정되지 않음.

3FCR 에서 야생형 및 단일 돌연변이, 또한 오로지 71.3 % 의 서열 일치성을 갖는 효소 (3GJU) 에 비한 이중 돌연변이 Y59W/T231A 의 우월성은 증명된다. 그보다 더, 다른 위치의 누적 혜택 효과가 돌연변이 Y59W/Y87F/Y152F/T231A/P423H 에 의해 예시된다.

더 구체적으로는, 3FCR 의 골격에서 생성된 가장 관심대상인 중간 돌연변이는 아래 표 4 에 제시된 바와 같은 특이적 활성을 가졌다.

표 4: 속도론적 분할 방식에서 3FCR 돌연변이에 대한 특이적 활성 (U/mg)

이러한 표에서, 첨가된 각각의 돌연변이에 의한 기질 1a, 3a 및 4a 에 대한 활성의 점진적 증가가 예시된다. 이러한 벌키한 기질에 대한 활성의 증가는 반드시 표준 기질 6a 에 대한 활성과 관련될 필요는 없다.

가장 관심대상인 돌연변이의 조작 안정성을 25 ℃ 에서 평가하였다. 진탕 없이 명시된 온도에서 저장 완충액 (HEPES 완충액, 50 mM, pH 7.5, 0.1 mM PLP 의 첨가) 중에서 정제된 효소를 인큐베이션하였다. 특정 시간 간격으로, 인큐베이션된 효소의 부분 표본을 배출하고, 아민 공여체로서 rac-아민 6a 를 사용하여 일반적 과정의 단락 B2 에 기재된 직접적 시험에 의하여 유지된 활성을 모니터링하였다. 각각의 돌연변이에 대한 인큐베이션 이전에 측정된 활성을 100 % 로 각각 정의하였다. 결과를 도 1 에 제시한다.

NCBI 에서 BLAST 검색에 의해 식별된 여러 추정 트랜스아미나아제에 돌연변이 Y59W, Y87F, Y152F 및 T231A 를 포함시켰다. 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A 의 아미노산 서열을 비중복 단백질 서열 데이터베이스에서의 조회에 사용하였다. 처음 100 개의 결과에서 이러한 4 개의 돌연변이 중 임의의 것을 갖는 서열은 발견되지 않았고; 모든 서열은 이러한 위치에서 보존되었는데, 즉 Tyr 59, Tyr 87, Tyr 152 및 Thr 231 을 갖는다. 69.6 % 만큼 낮은 일치성을 갖는 서열을 선택하였고 (SEQ ID NO: 5-11), 아미노산 서열에 대해 각각의 위치에서 4 개의 돌연변이를 갖는 합성 유전자를 정렬하였다 (각각 SEQ ID NO: 32 및 34-38). ATA-4 와 별개로 모든 TA 를 가용성이게 발현시켰다. 정제된 TA 에 의해, 일반적 과정의 단락 B2 에 기재된 시험에 따라 아민 1a, 3a, 4a 및 6a 의 속도론적 분할에 관하여 트랜스아미나아제의 특이적 활성을 측정하였다.

표 5: 속도론적 분할 방식에서, Y59W/Y87F/Y152F/T231A 돌연변이를 포함하는, BLAST 검색에서 식별된 추정 트랜스아미나아제의 특이적 활성 (U/mg).

3FCR 에서 발견되고 3GJU 에서 시험된 모티프는, 적어도 65 % 의 서열 일치성을 갖는 효소로 이동될 수 있고, 기질 1a, 3a 및 4a 에 대해 관심대상인 활성을 얻을 수 있다.

실시예 2: 돌연변이의 포함에 의해 rac- 아민 1a, 2a, 3a, 4a 및 6a 의 속도론적 분할을 위한 TA 특이적 활성의 개선

정제된 TA 에 의해, 일반적 과정의 단락 B2 에서 기재된 시험에 따라 rac-아민 1a, 2a, 3a, 4a 및 6a 의 속도론적 분할에 관하여 나타낸 돌연변이의 특이적 활성을 측정하였다. 관심 대상인 아민의 수용에서 이의 유의성의 확인을 위해, 위치를 3FCR 골격에서 식별한 후 3GJU 골격에 이동시켰다. SEQ ID NO: 1 및 SEQ ID NO: 3 의 일치성은 71.3 % 이다.

표 6: 속도론적 분할 방식에서 3FCR 및 3GJU 돌연변이에 대한 특이적 활성 (U/mg). n.a.: 활성이 아님; n.d.: 측정되지 않음.

위치 87 은 기질 2a/b 의 수용에 유의미하다. 지방족 소수성 잔기 예컨대 Leu 또는 Val 은 수용을 용이하게 하기 위해 이러한 위치에서 필요하다. 효과는 상동성 단백질 (예컨대 3GJU, 서열 일치성: 71.3%) 로 이동될 수 있다.

실시예 3: 돌연변이의 포함에 의한 rac- 아민 5a 의 속도론적 분할에 대한 TA 특이적 활성의 개선

정제된 TA 에 의해, 일반적 과정의 단락 B2 에서 기재된 시험에 따라 rac-아민 5a 의 속도론적 분할에 대한 제시된 돌연변이의 특이적 활성을 측정하였다. 위치를 3FCR 골격에서 식별하였다.

표 7: rac-아민 5a 의 속도론적 분할에서 3FCR 돌연변이의 상대적 활성. 3FCR Y59W/T231A 의 활성을 참조 (100 %) 로서 사용하였다. 대조를 위해, 기질 6a 에 대한 특이적 활성 (U/mg) 이 제공된다.

기질 5a 에 대한 활성에 관하여 3FCR 골격에서 Y59F 및 T231G 치환의 이로운 효과가 증명된다. 변종 Y59F/Y152F/T231G 으로의 이의 조합은 기질 6a 에 비해 기질 5a 에 관하여 지금까지 가장 양호한 변종을 얻었다. 그보다 더, Phe 또는 Met 에 대한 위치 234 의 치환의 이로운 효과가 나타날 수 있다.

실시예 4: 아민 공여체로서 이소-프로필아민의 사용을 위한 TA 특이적 활성의 개선

정제된 TA 에 의해, 일반적 과정의 단락 B2 에 기재된 시험에 따라 아민 공여체로서 이소-프로필아민의 사용에 관해, 나타낸 돌연변이의 특이적 활성을 측정하였다. 위치를 3FCR 골격에서 식별하였다.

표 8: 아민 공여체로서 이소-프로필아민을 사용한 3FCR 돌연변이의 상대적 활성. 3FCR Y59W/T231A 의 활성을 참조 (100 %) 로서 사용하였다. 대조를 위해, 기질 6a 에 대한 특이적 활성 (U/mg) 이 제공된다.

위치 234 에서 치환기가 이소-프로필아민에 대한 활성에 이로운 효과를 갖는다는 결론이 내려질 수 있다.

실시예 5: 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용한, 키랄 아민 1a, 3a 및 4a 의 비대칭 합성

8 mM 케톤 (1, 3 또는 4), 200 mM L-알라닌, 20 % DMSO, 25 mM 글루코오스, 5 mM NADH, 0.5 mg/mL 글루코오스 데히드로게나아제 GDH-105 (Codexis), 5 ㎕/mL 소 심장으로부터의 L-락트산 데히드로게나아제 (LDH) (L2625-50KU, Sigma), 1 mM PLP 및 관심대상인 TA 의 0.5 mL 의 반응 혼합물 (HEPES 완충액, 50 mM, pH 8.0) 을 함유하는 2 mL 의 유리 바이알을, 600 rpm 의 진탕 속도로 열진탕기 (Eppendorf) 에서 30 ℃ 로 인큐베이션하였다. 20 h 이후 10 min 동안 90 ℃ 에서 효소의 열 변성에 의해 반응을 종료한다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 0.1 % 디에틸아민을 함유하는 동량의 아세토니트릴을 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 1 min 동안 17000 g 으로 원심분리하여, 침전된 단백질을 제거하고, HPLC 분석 (Chiralpak OD-RH 컬럼, 150*4.6 mm, 5 ㎛ 입자, 30 ℃ 에서; 50 % 아세토니트릴 및 0.1 % 디에틸아민을 함유하는 50 % H₂O 에 의한 등용매 방법, 0.5 mL/min 의 흐름) 을 위해 상청액을 주입구에 여과하였다. 전환은 [총 아민, mM / (총 아민, mM + 케톤, mM) ^* 100] 로 정의된다.

표 9: 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용한, 키랄 아민의 비대칭 합성에서 전환 (%) 및 거울상 이성질체 비율 (er, %). 효소 농도는 1.8 mg/mL 이었고, n.d. 는 측정되지 않았다.

하루보다 적게 (20 h) 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용하여, 원하는 전환 및 거울상 이성질체 선택성으로, 8 mM 케톤의 스케일로 비대칭 합성 (키랄 아민 1a, 3a 및 4a 의 제조를 위함) 을 수행할 수 있다. 다양한 변형이 반응을 효율적으로 촉매작용한다.

실시예 6: 아민 공여체로서 알라닌을 사용한, 아민 5a 의 비대칭 합성

8 mM 케톤 5, 200 mM L-알라닌, 20 % DMSO, 25 mM 글루코오스, 5 mM NADH, 0.5 mg/mL 글루코오스 데히드로게나아제 GDH-105 (Codexis), 5 ㎕/mL 소 심장으로부터의 L-락트산 데히드로게나아제 (LDH) (L2625-50KU, Sigma), 1 mM PLP 및 관심대상인 TA 의 0.5 mL 의 반응 혼합물 (HEPES 완충액, 50 mM, pH 8.0) 을 함유하는 2 mL 의 유리 바이알을, 600 rpm 의 진탕 속도로 열진탕기 (Eppendorf) 에서 30 ℃ 로 인큐베이션하였다. 20 h 이후 10 min 동안 90 ℃ 에서 효소의 열 변성에 의해 반응을 종료한다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 0.1 % 디에틸아민을 함유하는 동량의 아세토니트릴을 반응 혼합물에 첨가한다. 혼합물을 1 min 동안 17000 g 으로 원심분리하여, 침전된 단백질을 제거하고, HPLC 분석 (Chiralpak OD-RH 컬럼, 150*4.6 mm, 30 ℃ 에서 5 ㎛ 입자; 30 % 아세토니트릴 및 0.1 % 디에틸아민을 함유하는 70 % H₂O 에 의한 등용매 방법, 0.5 mL/min 의 흐름) 을 위해 상청액을 주입구에 여과하였다. 전환은 [총 아민, mM / (총 아민, mM + 케톤, mM) ^* 100] 로 정의된다.

표 10: 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용하는 아민 5a 의 비대칭 합성의 전환 (%).

하루보다 적게 (20 h) 아민 공여체로서 L-알라닌을 사용하여 원하는 전환 및 거울상 이성질체 선택성으로, 기질 5a/b 에 대해 8 mM 케톤의 스케일로 비대칭 합성을 수행할 수 있다. 다양한 TA 돌연변이가 반응을 효율적으로 촉매작용한다.

실시예 7: 아민 공여체로서 알라닌을 사용한, 키랄 아민 1a, (R)-(4-클로로페닐)-페닐메탄아민의 비대칭 합성

53.5 ml 반응 완충액 (HEPES 100 mM pH 8.0; 4 mM PLP; 400mM D,L-알라닌) 에서, 4.5 g 피루베이트 환원효소 믹스 (5.4 mg GDH-102 [Codexis]; 21.6 mg LDH-101 [Codexis]; 126 mg NAD [Roche]; 4.32 g D-글루코오스) 를 용해시켰다. 정제된 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A 를 이후 용액으로서 (22 ml, 단백질 2.6 mg/ml; A3 참조) 첨가하고, 30 ℃ 에서 5 분 동안 교반하였다. 20 ml DMSO 에 용해된 100 mg (4-클로로페닐)(페닐)메타논의 첨가에 의해 반응을 시작하였다. 반응 pH 를 8.0 (2N NaOH) 로 수동으로 조절하고, 0.1 N NaOH 의 자동화 첨가에 의해 일정하게 유지하였다. 초기에 황색 반응 용액이 약간 탁해졌다. 24 h 이후 및 98 면적% (IPC-HPLC) 의 전환 이후, 반응물을 2.0 으로 산성화시켜, 효소를 침전시켰다. 1.125 g 여과 보조제 (Dicalite) 를 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 20 g 여과 보조제 (Dicalite) 층을 통해 여과하고, 여과 케이크를 40 ml 0.1 N HCl 로 세척하였다. 합쳐진, 약간 황색인, 맑은 수용액의 pH 를 pH 10 으로 조절하여, 2 회의 50 ml TBME 를 사용한 아민 추출을 위해 용액 색을 오렌지색으로 바꾸었다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜 122 mg (122 %) 로 담황색 오일을 표제 화합물 1a 의 미정제 생성물로서 얻었다.

HCl-염 형성: 5 ml TBME 에 미정제 생성물을 용해시키고, 교반 하에 350 ㎕ 2 M HCl 를 주사기를 사용해 첨가하였다. 형성된 현탁액을 이의 여과 (종이 여과기) 이전에 실온에서 2 h 동안 교반시켰다. 단리된 HCl-염을 TBME 로 세척하고, 실온에서 높은 진공 하에 3 h 동안 건조시켜, 95 mg (82%) 백색 분말을 얻었다.

화학적 순도 HPLC: 99.7 면적% [210 nm; X-Bridge C8; 50*4.6 mm, 2.5 μm, 흐름 2 ml, 45 ℃, A: H₂O / ACN (95 / 5), 3 분에 50 → 10%, 0.5 min 유지, B: ACN, 3 분에 40 → 80%, 0.5 min 유지, C: H₂O/ACN (95/5) 중 100 mmol 암모늄 아세테이트, 10% 등용매]; 키랄 HPLC: 97.1% (R), 2.9% (S) [235 nm; Chrownpack CR-I(+); 150*3 mm, 5 μm, 흐름 0.4 ml, 40 ℃, A: 55% H₂O 중 과염소산 3.6 g, B: 45 % ACN]; ¹H NMR (600 MHz, CH₃OD) δ ppm 7.20 - 7.49 (m, 9 H), 5.57 (s, 1 H); GC-MS: 217 (M)⁺.

실시예 8: (S)-2,2-디메틸-1페닐프로판-1-아민의 제조를 위한 아민 수용체로서 피루베이트를 사용하는 아민 2a 의 속도론적 분할

89.75 ml 반응 완충액 (TRIS 50 mM pH 8.5; 1 mM PLP) 에서, 129 mg 나트륨 피루베이트 및 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR Y59W/Y87L/T231A 의 정제된 용액 (18.5 ml, 단백질 2.47 mg/ml; A3 참조) 를 이후 첨가하고, 30 ℃ 에서 5 분 동안 교반하였다. 1 ml DMSO 에 용해된 100 mg 2,2-디메틸-1페닐프로판-1-아민의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 48 h 및 대략 55 면적% (IPC-HPLC) 의 전환 이후, 반응물을 pH 2.0 으로 산성화하여, 효소를 침전시키고, 20 분 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 25 g 여과 보조제 (Dicalite) 층을 통해 여과하고, 이후 여과 케이크를 탈이온수 및 50 ml TBME 로 세척하였다. 상 분리 이후, 수성 상을 50 ml TBME 로 추출하여 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 2b 를 제거하였다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜, 25 mg (26.5%; 키랄 HPLC: 99 면적%) 으로 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 2b 를 황색 점성 오일로서 얻었다. 수성 상의 pH 를 2N NaOH 를 사용하여 12 로 조절하고, 이후 50 ml TBME 로 2 회 추출하였다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜, 38 mg (40%) (S)-2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-아민 2a 를 황색 오일로서 얻었다.

키랄 HPLC: 98.1% (S), 1.9% (R) [220 nm; Chiracel OD-3R; 150*4.6 mm, 3 μm, 흐름 1.0 ml, 25 ℃, A: 50% ACN, B: 950 ml H₂O : 50 ml ACN 중 50% 6.3 g 암모늄 포르메이트]; ¹H NMR (600 MHz, CDCl₃) δ ppm 7.27 - 7.31 (m, 4 H), 7.24 (dt, J=6.0, 2.6 Hz, 1 H), 3.71 (s, 1 H), 0.91 (s, 9 H); GC-MS: 162 (M).

실시예 9: 아민 공여체로서 알라닌을 사용하는 키랄 아민 3a, (S)-1.3-디페닐 프로필아민의 비대칭 합성

68 ml 반응 완충액 (HEPES 100 mM pH 8.0; 4 mM PLP; 400mM D,L-알라닌) 에, 4.5 g 피루베이트 환원효소 믹스 (5.4 mg GDH-102 [Codexis]; 21.6 mg LDH-101[Codexis]; 126 mg NAD [Roche]; 4.32 g D-글루코오스) 를 용해시켰다. 정제된 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A 를 이후 용액으로서 (6.8 ml, 단백질 2.6 mg/ml; A3 참조) 첨가하고, 30 ℃ 에서 5 분 동안 교반하였다. 20 ml DMSO 에 용해된 100 mg 1.3-디페닐 프로판-1-온의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 0.1 N NaOH 의 자동화 첨가에 의해 반응 pH 를 일정하게 유지하였다. 초기에 황색 반응 용액이 약간 탁해졌다. 24 h 및 98 면적% (IPC-HPLC) 의 전환 이후, 반응물을 pH 2.0 으로 산성화하여, 효소를 침전시켰다. 1.125 g 여과 보조제 (Dicalite) 를 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 20 g 여과 보조제 (Dicalite) 층을 통해 여과하고, 여과 케이크를 40 ml 0.1 N HCl 로 세척하였다. 2 회의 50 ml TBME 를 사용한 아민 추출을 위해, 합쳐진, 약간 황색인, 맑은 수용액의 pH 를 pH 10 으로 조절하여, 이의 색채를 오렌지색으로 바꾸었다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜, 95 mg (95%) 담황색 오일을 표제 화합물 3a 의 미정제 생성물로서 얻었다.

HCl-염 형성: 5 ml TBME 에 미정제 생성물을 용해시키고, 교반 하에 360 ㎕ 2 M HCl 을 주사기를 사용해 첨가하였다. 형성된 현탁액을 이의 여과 (종이 여과기) 이전에 실온에서 2 h 동안 교반시켰다. 단리된 HCl-염을 TBME 로 세척하고, 실온에서 높은 진공 하에 3 h 동안 건조시켜, 84 mg (71%) 로 백색 분말을 표제 화합물 3a 의 HCl 염으로서 얻었다.

화학적 순도 HPLC: 99.0 면적% [210 nm; X-Bridge C8; 50*4.6 mm, 2.5 μm, 흐름 2 ml, 45 ℃, A: H₂O/ACN (95/5), 3 분에 60 → 10%, 0.5 min 유지, B: ACN, 3 분에 30 → 80%, 0.5 min 유지, C: H₂O/ACN (95/5) 중 100 mmol 암모늄 아세테이트, 10% 등용매]; 키랄 HPLC: 100% (S) [222 nm; Chiralpak IF 3; 150*4.6 mm, 흐름 1 ml, 40 ℃, A: 90%, 0.1% 디에틸아민을 갖는 헵탄, B: 10 % 에탄올]; ¹H NMR (600 MHz, CH₃OD) δ ppm 7.44 - 7.59 (m, 5 H), 7.28 - 7.33 (m, 2 H), 7.12 - 7.24 (m, 3 H), 4.24 (dd, J=9.6, 5.6 Hz, 1 H), 2.55 (br t, J=7.9 Hz, 2 H), 2.22 - 2.42 (m, 2 H); LC-MS: 212 (M+H)⁺.

실시예 10: 아민 공여체로서 알라닌을 사용하는, 키랄 아민 4a, (S)-아세나프텐-1-일아민의 비대칭 합성

60.5 ml 반응 완충액 (HEPES 100 mM pH 8.0; 4 mM PLP; 400mM D,L-알라닌) 에서, 4.5 g 피루베이트 환원효소 믹스 (5.4 mg GDH-102 [Codexis]; 21.6 mg LDH-101[Codexis]; 126 mg NAD [Roche]; 4.32 g D-글루코오스) 를 용해시켰다. 정제된 아미노트랜스아미나아제 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A 를 이후 용액으로서 (15 ml, 단백질 2.6 mg/ml; A3 참조) 첨가하고, 5 분 동안 30 ℃ 에서 교반하였다. 20 ml DMSO 에 용해된 100 mg 2H-아세나프틸렌-1-온의 첨가에 의해 반응을 개시하였다. 반응 pH 를 8.0 (2N NaOH) 로 수동으로 조절하고, 0.1 N NaOH 의 자동화 첨가에 의해 일정하게 유지했다. 초기에 황색 반응 용액이 약간 탁해졌다. 잠재적 산화적 방향족화를 방지하기 위해, 반응은 N₂ 분위기 하에 및 어둠속에서 수행하였다. 46 h 및 98 면적% (IPC-HPLC) 의 전환 이후, 반응물을 pH 2.0 으로 산성화하여, 효소를 침전시켰다. 5 g 여과 보조제 (Dicalite) 를 첨가하고, 혼합물을 20 분 동안 여과하였다. 이후, 반응 혼합물을 20 g 여과 보조제 (Dicalite) 층을 통해 여과하고, 여과 케이크를 40 ml 0.1 N HCl 및 50 ml TBME 로 세척하였다. 50 ml TBME 를 사용한 아민 추출 이전에 합쳐진, 약간 황색인, 맑은 수용액의 pH 를 pH 10 으로 조절하였다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜, 112 mg (112%) 오렌지-갈색 오일을 표제 화합물 4a 의 미정제 생성물로서 얻었다.

HCl-염 형성: 미정제 생성물을 5 ml TBME 에 용해시키고, 교반 하에 445 ㎕ 2 M HCl 을 주사기를 사용해 첨가하였다. 형성된 매우 미세한 현탁액을 이의 원심분리 (5 min.; 4000 rpm) 전에 1 h 동안 실온에서 교반시켰다. TBME 의 따라냄 이후, 잔여 고체를 10 ml TBME 에 재현탁시키고, 강하게 혼합하고, 원심분리 (5 min.; 4000 rpm) 하고, 한 번 더 따라냈다. 습윤 HCl-염을 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시키고, 실온에서 높은 진공 하에 3 h 동안 교반하여, 84 mg (69%) 베이지색 분말을 표제 화합물 4a 의 HCl 염으로서 얻었다.

화학적 및 키랄 순도 HPLC: 81.5% (S) : 18.5% (R) [232 nm; Chiracel OJ-3; 150*4.6 mm, 3 μm; 흐름 2.5 ml, 30 ℃, A: 96%, 0.1% 디에틸아민을 갖는 헵탄, B: 4 % 에탄올]; ¹H NMR (600 MHz, CH₃OD) δ ppm : 7.90 (d, J=8.1 Hz, 1 H), 7.77 (d, J=8.3 Hz, 1 H), 7.54 - 7.70 (m, 3 H), 7.46 (d, J=6.9 Hz, 1 H), 5.32 (dd, J=8.1, 2.7 Hz, 1 H), 3.99 (dd, J=17.8, 8.1 Hz, 1 H), 3.41 (dt, J=17.8, 1.3 Hz, 1 H); LC-MS: 171.1 (M+H)⁺.

실시예 11: 아민 공여체로서 2-프로필아민을 사용한, 아민 5a, 엑소-3-아미노-8-아자-바이시클로 [3.2.1] 옥트-8-일)-페닐-메타논의 비대칭 합성

82 ml 반응 완충액 (HEPES 50 mM; 2 mM PLP; 0.2 M 2-프로필아민 히드로클로라이드; pH 7.5) 에, 정제된 돌연변이 트랜스아미나아제 3FCR Y59W/Y87F/Y152F/T231A/I234M 용액 (총 78 ml, 단백질 1.1 mg/ml; A3 참조) 및 20 ml DMSO 에 용해된 100 mg 8-벤조일-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 5b 를 30 ℃ 에서 교반 하에 첨가하였다. 9d 동안 반응이 진행되게 하여, 75 면적% (IPC-HPLC) 을 가능하게 하였다. 9d 이후, 반응물을 pH 2.0 으로 산성화하여, 효소를 침전시키고, 15 분 동안 교반하였다. 이후, 반응 혼합물을 25 g 여과 보조제 (Dicalite) 층을 통해 여과하고, 50 ml 디클로로메탄으로 2 회 추출하여, 8-벤조일-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 5b 를 제거하였다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시켜, 37 mg (HPLC: 97 면적%) 8-벤조일-8-아자-바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 5b 를 약간 황색 오일로서 얻었다. 수성 상의 pH 를 2N NaOH 를 사용해 12 로 조절하고, 이후 50 ml 디클로로메탄을 사용하여 4 회 추출하였다. 합쳐진 유기 상을 MgSO₄로 건조시키고, 여과하고, 40 ℃ 에서 진공 하에 증발시키고, 60 ℃ 에서 높은 진공 하에 36 h 건조시켜, 60 mg (60%) 을 표제 화합물 5a 의 황색 오일로서 얻었다.

화학적 순도 HPLC: 98.9 면적% [210 nm; X-Bridge C8; 50*2.1 mm, 2.5 μm, 흐름 ml, 40 ℃, A: 90 % H₂O/ACN (95/5) 중 10 mmol 암모늄 아세테이트, B: ACN, 10%]; 키랄 SFC: 100% 엑소 [210 nm; Chiralpak AD-3; 150*4.6 mm, 5 μm; 흐름 3 ml; 왼쪽 40 ℃; 오른쪽 42 ℃; A: 82% CO₂, B: 18 %, 0.2% 2-프로필아민을 갖는 메탄올]; ¹H NMR (600 MHz, DMSO-d₆, 120 ℃) δ ppm 7.44 (s, 5 H), 4.29 (br s, 2 H), 3.16 (dt, J=11.1, 5.5 Hz, 1 H), 1.86-2.00 (m, 3 H), 1.79 (ddd, J=13.2, 5.1, 3.0 Hz, 3 H), 1.67-1.75 (m 3 H), 1.34-1.47(m, 2 H); LC-MS: 231 (M+H)⁺.

서열

야생형 서열 (플러스 태그):

이중 돌연변이의 서열:

삼중 돌연변이의 서열:

사중 돌연변이의 서열:

오중 돌연변이의 서열:

참고문헌

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gtgtggctga actggaagcg ctgatcgaac gtgaaggcgc ggataccatt 660 gcggccttca tcggcgaacc gattctgggt acgggcggta ttgtgccgcc gccggccggt 720 tattgggaag caatccagac cgtcctgaat aaacatgata ttctgctggt tgcggacgaa 780 gtggttaccg gctttggtcg cctgggcacg atgttcggtt ctgatcacta tggcctggaa 840 ccggacatta tcaccatcgc gaaaggtctg acgtcagcgt acgccccgct gagcggttct 900 attgtgtcgg ataaagtctg gaaagtgctg gaacagggca ccgacgaaaa cggtccgatc 960 ggccatggtt ggacgtatag cgcacacccg attggtgcag ctgcaggtgt tgcaaatctg 1020 aaactgctgg atgaactgaa cctggttagc aatgccggcg aagtcggtgc ctacctgaac 1080 gcaaccatgg cagaagctct gtcccaacat gctaatgttg gcgatgtccg tggcgaaggt 1140 ctgctgtgcg cggtggaatt tgttaaagat cgtgacagcc gcacgttttt cgatgccgca 1200 gacaaaatcg gtccgcagat ttctgcgaaa ctgctggaac aagataaaat tatcgcgcgt 1260 gccatgccgc agggcgacat tctgggtttt gccccgccgt tctgtctgac ccgcgcagaa 1320 gctgatcaag tcgtggaagg tacgctgcgc gctgtcaaag ccgttctggg ttcacatcac 1380 catcaccacc actaa 1395 <210> 3 <211> 459 <212> PRT <213> Mesorhizobium loti maff303099 <400> 3 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Arg Gly Ala Val Glu Ala Val Cys Ala Thr Leu Gly 450 455 460 <210> 61 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Transaminase <400> 61 Met Leu Arg Asn Asp Gln Leu Ala Glu Trp Asp Arg Glu Asn Phe Phe 1 5 10 15 His Ala Ser Thr His Leu Ala Ala His Ala Arg Gly Asp Thr Pro Thr 20 25 30 Arg Ile Ile Thr Gly Gly Glu Gly Val Tyr Ile Gln Asp Arg Asp Gly 35 40 45 Ala Lys Ile Leu Asp Gly Phe Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val Gly 50 55 60 Tyr Gly Arg Arg Glu Ile Thr Asp Ala Ile Ala Ala Gln Val Ser Glu 65 70 75 80 Leu Ser Tyr Tyr His Ala Phe Ala Gly His Gly Thr Glu Ala Ser Val 85 90 95 Thr Leu Ala Lys Met Val Leu Asp Arg Ala Pro Asp Asn Met Ser Lys 100 105 110 Val Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Ser Asp Ala Asn Glu Thr Asn Ile Lys 115 120 125 Leu Ile Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Ile Ile Ser Arg Trp Arg Gly Phe His Gly Ser Gly Leu Met Thr Gly 145 150 155 160 Ser Leu Thr Gly Leu Gly Leu Phe His Ala Lys Phe Asp Leu Pro Met 165 170 175 Asp Gly Val Leu His Thr Glu Ala Pro His Tyr Leu His Arg Ala Asp 180 185 190 Arg Asn Gln Thr Glu Glu Gln Phe Ser Ala Tyr Cys Ala Ala Lys Leu 195 200 205 Glu Glu Met Ile Leu Ala Glu Gly Pro Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Pro Ile Leu Gly Ala Gly Gly Met Val Pro Pro Pro Lys Gly 225 230 235 240 Tyr Trp Ala Ala Ile Gln Ala Val Leu Arg Lys Tyr Asp Ile Leu Leu 245 250 255 Val Val Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe 260 265 270 Gly Ser Glu His Tyr Gly Leu Lys Ala Asp Leu Ile Thr Ile Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Pro Leu Ser Gly Ser Ile Val Ser Lys 290 295 300 Lys Met Trp Ala Val Leu Glu Lys Gly Thr Asp Glu Asn Gly Ala Phe 305 310 315 320 Gly His Gly Trp Thr Tyr Ser Ala His Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Val Ala Asn Leu Lys Leu Ile Asp Asp Leu Gly Leu Ile Ala Asn Ala 340 345 350 Ser Glu Thr Gly Ala Tyr Leu Lys Ser Ala Leu Gln Ala Ala Leu Gly 355 360 365 Asp His Pro Asn Val Ala Glu Ile Arg Gly Glu Gly Met Leu Ala Ala 370 375 380 Val Glu Phe Cys Ala Asp Arg Asp Asp Leu Lys Gln Phe Asp Thr Ser 385 390 395 400 Ala Thr Ile Gly Pro Arg Leu Ala Ala Glu Leu Leu Thr Arg Gly Val 405 410 415 Ile Gly Arg Ala Met Pro Gln Ser Asp Thr Ile Gly Phe Ala Pro Pro 420 425 430 Leu Cys Ile Thr Arg Ala Glu Val Asp Gln Ile Val Ala Ala Met Lys 435 440 445 Gly Ala Val Asp Ala Val Leu Pro Ala 450 455 <210> 62 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Transaminase <400> 62 Met Leu Thr Asn Asp Gln Leu Asp Arg Phe Asp Arg Glu Asn Phe Phe 1 5 10 15 His Pro Ser Thr His Leu Ala Gln His Ala Arg Gly Glu Ser Pro Ser 20 25 30 Arg Ile Val Lys Thr Ala Lys Gly Val Phe Ile Glu Asp Arg Asp Gly 35 40 45 Asn Lys Leu Leu Asp Gly Phe Gly Gly Leu Trp Cys Val Asn Val Gly 50 55 60 Tyr Gly Gln Glu Ser Ile Ile Glu Ala Ile Ala Glu Gln Ala Lys Glu 65 70 75 80 Leu Ala Tyr Tyr His Ala Phe Ala Gly His Gly Thr Glu Ala Ser Ile 85 90 95 Asn Leu Ala Lys Met Val Ile Asp Arg Ala Pro Asp His Met Ser Lys 100 105 110 Val Tyr Phe Gly Leu Ser Gly Ser Asp Ala Asn Glu Thr Asn Ile Lys 115 120 125 Leu Ile Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Ile Ile Ser Arg Trp Arg Gly Phe His Gly Ser Gly Leu Met Thr Gly 145 150 155 160 Ser Leu Thr Gly Leu Ala Gly Phe Gln Arg Lys Phe Asp Leu Pro Leu 165 170 175 Glu Arg Val Phe His Thr Thr Ala Pro Tyr Tyr Tyr Arg Arg Lys Asp 180 185 190 Leu Ala Met Ser Glu Ala Asp Phe Val Ala His Cys Val Ala Glu Leu 195 200 205 Glu Met Arg Ile Glu Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Pro Val Leu Gly Ala Gly Gly Met Val Pro Pro Pro Glu Gly 225 230 235 240 Tyr Trp Lys Ala Ile Ser Ala Val Leu Glu Lys His Asp Ile Leu Leu 245 250 255 Ile Ala Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Ser Met Phe 260 265 270 Gly Ser Asp His Tyr Gly Leu Lys Pro Asp Leu Ile Thr Ile Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Pro Leu Ser Gly Thr Ile Val Ser Asp 290 295 300 Lys Val Trp Lys Val Leu Glu Gln Gly Thr Asp Glu Asn Gly Pro Ile 305 310 315 320 Gly His Gly Trp Thr Tyr Ser Ala His Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Val Ala Asn Leu Lys Leu Ile Asp Glu Leu Gly Leu Val Lys Asn Ala 340 345 350 Ala Glu Thr Gly Ala Tyr Leu Arg Ala Ala Met Lys Asp Ala Leu Ser 355 360 365 Asp His Pro His Val Gly Asp Ile Arg Gly Glu Gly Met Leu Met Ala 370 375 380 Val Glu Phe Val Lys Asp Arg Glu Ser Arg Thr Phe Tyr Asp Pro Ser 385 390 395 400 Glu Lys Val Gly Pro Asn Leu Ala Ala Ala Leu Ile Ser Glu Gly Val 405 410 415 Ile Ala Arg Ala Met Pro Glu Gly Asp Ile Leu Gly Tyr Ala Pro Pro 420 425 430 Leu Cys Leu Thr Arg Glu Glu Ala Asp Gln Ile Val Ala Ala Thr Lys 435 440 445 Lys Ala Val Ile Ala Val Leu Gly 450 455 <210> 63 <211> 457 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Transaminase <400> 63 Met Leu Lys Asn Asp Gln Leu Asp Gln Trp Asp Arg Glu Asn Phe Phe 1 5 10 15 His Pro Ser Thr His Leu Ala Gln His Ala Arg Gly Asp Ser Ala Asn 20 25 30 Arg Val Ile Lys Thr Ala Ser Gly Val Phe Ile Glu Asp Arg Asp Gly 35 40 45 Asn Lys Leu Leu Asp Ala Phe Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val Gly 50 55 60 Tyr Gly Arg Gln Glu Ile Ala Asp Ala Ile Ala Asp Gln Ala Arg Glu 65 70 75 80 Leu Ala Tyr Tyr His Ser Phe Val Gly His Gly Thr Glu Ala Ser Ile 85 90 95 Thr Leu Ala Lys Met Ile Leu Asp Arg Ala Pro Ala Asn Met Ser Lys 100 105 110 Val Tyr Phe Gly Leu Gly Gly Ser Asp Ala Asn Glu Thr Asn Val Lys 115 120 125 Leu Ile Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Ile Ile Ser Arg Trp Arg Gly Phe His Gly Ser Gly Leu Val Thr Gly 145 150 155 160 Ser Leu Thr Gly Leu Glu Leu Phe His Lys Lys Phe Asp Leu Pro Val 165 170 175 Asn Gln Val Ile His Thr Glu Ala Pro Tyr Tyr Phe Arg Arg Ala Asp 180 185 190 Pro Asp Gln Ser Glu Ala Gln Phe Val Ala His Cys Ala Ala Glu Leu 195 200 205 Glu Ala Leu Ile Glu Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Pro Val Leu Gly Ala Gly Gly Met Val Pro Pro Pro Ala Gly 225 230 235 240 Tyr Trp Glu Ala Ile Gln Ala Val Leu Arg Lys His Asp Ile Leu Leu 245 250 255 Ile Ala Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe 260 265 270 Gly Ser Asp His Tyr Gly Ile Glu Ala Asp Ile Ile Thr Ile Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Pro Leu Ser Gly Ser Ile Ile Ser Asp 290 295 300 Lys Val Trp Lys Val Leu Glu Gln Gly Thr Asp Glu Asn Gly Pro Ile 305 310 315 320 Gly His Gly Trp Thr Tyr Ser Ala His Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Val Ala Asn Leu Lys Leu Ile Asp Arg Leu Asn Leu Val Gln Asn Ala 340 345 350 Gly Glu Thr Gly Ala Tyr Leu Asn Ala Thr Met Thr Glu Ala Leu Ala 355 360 365 Gly His Pro Asn Val Gly Glu Val Arg Gly Ala Gly Met Leu Cys Ala 370 375 380 Val Glu Phe Val Lys Asp Lys Asp Ser Arg Leu Phe Phe Asp Ala Ala 385 390 395 400 Asp Lys Ile Gly Pro Gln Ile Ser Ala Lys Leu Leu Glu Gln Asp Lys 405 410 415 Val Ile Ala Arg Ala Met Pro Gln Gly Asp Ile Leu Gly Phe Ala Pro 420 425 430 Pro Phe Cys Leu Ser Arg Ala Glu Ala Asp Gln Val Val Asp Ala Thr 435 440 445 Leu Arg Ala Val Arg Thr Val Leu Gly 450 455 <210> 64 <211> 456 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Mutant Transaminase <400> 64 Met Leu Thr Asn Asp Gln Leu Ser Gln Trp Asp Arg Glu Asn Phe Phe 1 5 10 15 His Pro Ser Thr His Leu Ala Gln His Ala Arg Gly Glu Thr Ala Thr 20 25 30 Arg Val Ile Thr Thr Gly Gln Gly Cys His Ile Glu Asp Arg Asp Gly 35 40 45 Thr Lys Leu Leu Asp Ala Phe Ala Gly Leu Trp Cys Val Asn Val Gly 50 55 60 Tyr Gly Arg Thr Glu Ile Ala Asp Ala Ile Ala Ala Gln Ala Lys Glu 65 70 75 80 Leu Ala Tyr Tyr His Ala Phe Val Gly His Gly Thr Glu Ala Ser Ile 85 90 95 Thr Leu Ser Lys Met Ile Leu Asp Arg Ala Pro Ala His Met Ser Lys 100 105 110 Val Tyr Phe Gly Leu Ser Gly Ser Asp Ala Asn Glu Thr Asn Ile Lys 115 120 125 Leu Ile Trp Tyr Tyr Asn Asn Ile Leu Gly Arg Pro Glu Lys Lys Lys 130 135 140 Ile Ile Ser Arg Trp Arg Gly Phe His Gly Ser Gly Leu Met Thr Gly 145 150 155 160 Ser Leu Thr Gly Leu Glu Leu Phe His Lys Lys Phe Asp Leu Pro Leu 165 170 175 Ala Gln Val Ile His Thr Glu Ala Pro Tyr Tyr Phe Arg Arg Pro Asp 180 185 190 Leu Ala Met Ser Glu Glu Ala Phe Ser Ala Tyr Cys Ala Ala Glu Leu 195 200 205 Glu Gln Leu Ile Glu Arg Glu Gly Ala Asp Thr Ile Ala Ala Phe Ile 210 215 220 Gly Glu Pro Val Leu Gly Ala Gly Gly Met Val Pro Pro Pro Lys Gly 225 230 235 240 Tyr Trp Glu Ala Ile Gln Pro Ile Leu Glu Lys His Asp Ile Leu Leu 245 250 255 Val Ala Asp Glu Val Val Thr Gly Phe Gly Arg Leu Gly Thr Met Phe 260 265 270 Gly Ser Asp His Tyr Gly Leu Lys Pro Asp Leu Ile Thr Ile Ala Lys 275 280 285 Gly Leu Thr Ser Ala Tyr Ala Pro Leu Ser Gly Ser Ile Val Gly Asp 290 295 300 Lys Met Trp Lys Val Leu Glu Gln Gly Thr Asp Glu Asn Gly Pro Ile 305 310 315 320 Gly His Gly Trp Thr Tyr Ser Ala His Pro Ile Gly Ala Ala Ala Gly 325 330 335 Val Ala Asn Leu Lys Leu Ile Asp Asp Met Asn Leu Val Ala Asn Ala 340 345 350 Gly Glu Thr Gly Ala His Phe Arg Lys Ala Met Thr Asp Ala Leu Gly 355 360 365 Asp His Ala Lys Val Gly Asp Ile Arg Gly Glu Gly Met Leu Cys Ala 370 375 380 Val Glu Leu Val Asp Asp Lys Asp Asn Arg Thr Phe Phe Asp Pro Ser 385 390 395 400 Gln Lys Val Gly Ala Gln Ile Ala Ser Ala Leu Leu Ser Lys Gly Val 405 410 415 Ile Ala Arg Ala Met Pro Gln Gly Asp Ile Leu Gly Phe Ala Pro Pro 420 425 430 Leu Cys Leu Thr Pro Ala Glu Ala Glu Glu Val Ala Thr Lys Thr Gly 435 440 445 Glu Ala Val Arg Asp Val Leu Gly 450 455

Claims

야생형 트랜스아미나아제에 비해 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제로서, 돌연변이 트랜스아미나아제가 SEQ ID NO: 1, 3 또는 5 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 90 % 동일한 아미노산 서열을 포함하고, 돌연변이 트랜스아미나아제가 야생형 트랜스아미나아제에 비해 둘 이상의 아미노산 치환기를 갖고, 여기서 SEQ ID NO: 1 의 위치 59 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Trp 또는 Phe 에 의해 치환되고 (각각 Trp59 또는 Phe59), SEQ ID NO: 1 의 위치 231 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Ala 또는 Gly 에 의해 치환되는 (각각 Ala231 또는 Gly 231), 돌연변이 트랜스아미나아제.
제 1 항에 있어서, 하기와 같은 돌연변이 트랜스아미나아제:
- SEQ ID NO: 1 의 위치 87 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 소수성 아미노산 (HYaa87), 또는 Leu (Leu87) 또는 Val (Val87) 또는 Phe (Phe87) 으로 치환되고; 및/또는
- SEQ ID NO: 1 의 위치 152 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Phe (Phe152) 로 치환되고, 및/또는
- SEQ ID NO: 1 의 위치 234 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 Phe (Phe234) 또는 Met (M234) 로 치환되고, 및/또는
- SEQ ID NO: 1 의 위치 423 에 상응하는 위치에서의 아미노산은 His (His423) 로 치환됨.
제 1 항에 있어서, 트랜스아미나아제가 SEQ ID NO: 1 에서의 하기 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 적어도 갖는 것인, 돌연변이 트랜스아미나아제:
- Trp59 및 Ala231, 또는
- Trp59, Phe87 및 Ala231; 또는
- Trp59, Leu87 및 Ala231; 또는
- Trp59, Val87 및 Ala231; 또는
- Trp59, Phe87, Ala231 및 His423; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231; 또는
- Trp59, Leu87, Phe152 및 Ala231; 또는
- Trp59, Val87, Phe152 및 Ala231; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 His423, 또는
- Trp59 및 Gly231; 또는
- Trp59, Phe87 및 Gly231; 또는
- Trp59, Leu87 및 Gly231; 또는
- Trp59, Val87 및 Gly231; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152 및 Gly231; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 His423; 또는
- Phe59, 및 Ala231; 또는
- Phe59, Phe87, 및 Gly231; 또는
- Trp59, Ala231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Ala231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Leu87, Ala231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Val87, Ala231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Phe234 및 His423, 또는
- Trp59, Gly231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Phe87, Gly231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Leu87, Gly231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Val87, Gly231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Phe234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Phe234 및 His423; 또는
- Phe59, Phe87, Gly231 및 Phe234, 또는
- Trp59, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Leu87, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Val87, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231, Met234 및 His423, 또는
- Trp59, Gly231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Gly231 및 Met234; 또는
- Trp59, Leu87, Gly231 및 Met234; 또는
- Trp59, Val87, Gly231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231 및 Met234; 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Gly231, Met234 및 His423; 또는
- Phe59, Phe87, Gly231 및 Met234.
제 1 항에 있어서, 트랜스아미나아제가 SEQ ID NO: 1 에서의 하기 돌연변이에 상응하는 돌연변이를 적어도 갖는 것인, 돌연변이 트랜스아미나아제:
- Trp59, Phe87, Phe152 및 Ala231, 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 Met234, 또는
- Trp59, Phe87, Phe152, Ala231 및 H423, 또는
- Phe59, Phe87 및 Gly231.
제 1 항에 있어서, 트랜스아미나아제가 SEQ ID NO: 30 내지 38, 43 내지 51, 53, 55 및 57-64 로 이루어지는 군으로부터 선택되는 서열을 포함하거나 이로 이루어지는 돌연변이 트랜스아미나아제.
제 1 항에 있어서, SEQ ID NO: 1, 3 또는 5 내지 11 중 어느 하나의 아미노산 서열과 적어도 95 %, 96 %, 97 %, 98 %, 또는 99 % 동일한 아미노산 서열을 포함하는 돌연변이 트랜스아미나아제.
제 1 항에 있어서, 1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 및 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a), 3(4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 및 이소-프로필아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물의 트랜스아민화를 위한 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제.
제 1 항에 있어서, 1-(4-클로로페닐)-1-페닐-1-아미노메탄 (1a), 2,2-디메틸-1-페닐-1-아미노 프로판 (2a), 1,3-디페닐-1-아미노프로판 (3a), 1,2-디히드로아세나프틸렌-1-아민 (4a), 및 3-아미노-8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄 (5a), (4-클로로페닐)-페닐-메타논 (1b), 2,2-디메틸-1-페닐-프로판-1-온 (2b) 1,3-디페닐프로판-1-온 (3b), 2H-아세나프틸렌-1-온 (4b), 8-벤조일-8-아자바이시클로[3.2.1]옥탄-3-온 (5b) 및 이소-프로필아민으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 하나 이상의 화합물에 관하여, 상응하는 야생형 효소에 비해 적어도 2-배 증가된 트랜스아미나아제 활성을 갖는 돌연변이 트랜스아미나아제.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 트랜스아미나아제 또는 그 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질을 코딩하는 핵산.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 트랜스아미나아제, 그 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질, 또는 그 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질을 코딩하는 핵산을 포함하는 숙주 세포.
아민 공여체의 존재 하에, 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항의 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 그 돌연변이 트랜스아미나아제를 포함하는 융합 단백질과 아민 수용체를 반응시키는 것을 포함하는 아민의 제조 방법.
제 12 항에 있어서, 거울상 이성질체적으로 강화된 키랄 아민이 제조되고, 방법이
a) 아민 수용체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하의 라세믹 아민의 속도론적 분할 (kinetic resolution); 또는
b) 아민 공여체 및 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질의 존재 하의 프로키랄 케톤의 비대칭 트랜스아민화이고,
여기서, 돌연변이 트랜스아미나아제 또는 융합 단백질이 입체선택성인 제조 방법.
제 13 항에 있어서, 방법 a) 에서 라세믹 아민이 하기 화학식을 갖는 제조 방법:

[식 중,
R¹ 또는 R² 은 서로 독립적으로 임의 치환된 알킬, 아릴, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴을 나타내고; 또는
R¹ 및 R² 는 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께, 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함].
제 13 항에 있어서, 방법 a) 에서 아민 수용체가 케톤 및 케토 카르복시산으로부터 선택되는 제조 방법.
제 13 항에 있어서, 방법 b) 에서 프로키랄 케톤이 하기 화학식을 갖는 제조 방법:

[식 중,
R³ 또는 R⁴ 는 서로 독립적으로 임의 치환된 알킬, 아릴, 카르보시클릴 또는 헤테로시클릴을 나타내거나;
R³ 및 R⁴ 은 이들이 부착되는 탄소 원자와 함께 임의 치환된 모노- 또는 폴리-시클릭 카르보시클릭 또는 헤테로시클릭 고리를 형성함].
제 13 항에 있어서, 방법 b) 에서 아민 공여체가 아키랄 (achiral) 또는 키랄 아민 또는 아미노산인 제조 방법.
제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서, 아민의 제조, 또는 속도론적 분할 또는 비대칭 트랜스아민화에 의한 거울상 이성질체적으로 강화된 키랄 아민의 제조를 위해 사용되는, 돌연변이 트랜스아미나아제.