JP7022819B2 - トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 - Google Patents
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Description
主原料1:(S)-2-メチル-4-オキソピペリジン-1-t-ブチルカルボキシレート(tert-butyl(2S)-2-methy1-4-oxopiperdine-1-carboxylate)、CAS 790667-43-5。
10mLの反応フラスコにおいて、40mgのイソプロピルアミンを1mLの0.2Mのリン酸塩緩衝液に加え、pHを7.0~7.5に調整し、120mgの配列番号1トランスアミナーゼを加え、0.4mgのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、DMSO 0.2mLに溶解した40mgの
一般的には、単一部位突然変異による突然変異体の性能は、母本と大きな差がある可能性が低く、突然変異部位の組み合わせにより、より優れた突然変異体が得られ可能である。従って、DNA shufflingの方法によって突然変異部位をランダムに組換え、突然変異ライブラリーを構築し、次に、より優れた突然変異体を取得するように、スクリーニングした。
250μLの活性測定系:
2つのトランスアミナーゼ配列番号1をそれぞれ40mg用意し、一つを4℃で2h放置し、もう1つを50℃で2h保温し、次に以下の体系のように反応させた。
1000mLの反応フラスコにおいて、4gのイソプロピルアミンを100mLの0.2Mのリン酸塩緩衝液に加え、pHを7.0~7.5に調整し、凍結乾燥粉質量が0.4gの配列番号7トランスアミナーゼ、40mgのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、DMSO 20mLに溶解した4gの主原料1を滴下し、体系のpHを7.0~7.5にし、35℃±3℃の恒温で64h撹拌した。HPLCで検出したところ、変換率は、98.2%であり、反応終了後、100mLの酢酸エチルを加えて3回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、3.62gの製品を得て、収率は90.2%、e.e.値は99%であった。
1000mLの反応フラスコにおいて、4gのイソプロピルアミンを100mLの0.2Mのリン酸塩緩衝液に加え、pHを7.0~7.5に調整し、凍結乾燥粉質量が0.4gの配列番号7トランスアミナーゼ、40mgのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、DMSO 20mLに溶解した4gの主原料2を滴下し、体系のpHを7.0~7.5にし、35℃±3℃の恒温で64h撹拌した。HPLCで検出したところ、変換率は、99.1%であり、反応終了後、100mLの酢酸エチルを加えて3回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、3.75gの製品を得て、収率は93.8%、e.e.値は99%であった。
1000mLの反応フラスコにおいて、4gのイソプロピルアミンを100mLの0.2Mのリン酸塩緩衝液に加え、pHを7.0~7.5に調整し、凍結乾燥粉質量が0.2gの配列番号7トランスアミナーゼ、40mgのリン酸ピリドキサールを加え、均一に混合し後、DMSO 20mLに溶解した4gの主原料3を滴下し、体系のpHを7.0~7.5にし、35℃±3℃の恒温で64h撹拌した。HPLCで検出したところ、変換率は、99.5%であり、反応終了後、100mLの酢酸エチルを加えて3回抽出し、抽出した有機相を合併した後、硫酸マグネシウムを加えて乾燥させ、乾燥するまで回転蒸発し、3.79gの製品を得て、収率は94.8%、e.e.値は99%であった。
本発明は、例えば以下の実施形態を包含する:
[実施形態1]トランスアミナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、配列番号1に示されるアミノ酸配列が突然変異して得られたアミノ酸配列であり、前記突然変異は、第72位、第76位、第92位、第107位、第125位、第132位、第226位、第292位、第295位、第308位及び第332位の突然変異部位の少なくとも1つを含み、且つ第19位がセリンに突然変異し、第41位がセリンに突然変異し、第43位がアスパラギンに突然変異し、前記第72位のグリシンがロイシンに突然変異し、第76位のロイシンがアラニンに突然変異し、第92位のリジンがグリシンに突然変異し、第107位のロイシンがイソロイシンに突然変異し、第125位のセリンがアラニンに突然変異し、第132位のセリンがアラニンに突然変異し、第226位のアラニンがグリシンに突然変異し、第292位のバリンがシステインに突然変異し、第295位のアラニンがグリシンに突然変異し、第308位がセリンに突然変異し、第332位がセリンに突然変異し、又は、アミノ酸配列は、前記突然変異したアミノ酸配列中の前記突然変異部位を有し、且つ前記突然変異したアミノ酸配列と80%以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。
[実施形態2]アミノ酸配列は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29又は配列番号30に示されるアミノ酸配列であり、又は
アミノ酸配列は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号13、配列番号14、配列番号15、配列番号16、配列番号17、配列番号18、配列番号19、配列番号20、配列番号21、配列番号22、配列番号23、配列番号24、配列番号25、配列番号26、配列番号27、配列番号28、配列番号29又は配列番号30に示されるアミノ酸配列と95%以上の相同性を有するアミノ酸配列である、
ことを特徴とする実施形態1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体。
[実施形態3]実施形態1又は2に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするDNA分子。
[実施形態4]前記DNA分子の配列は、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59又は配列番号60に示される配列であり、又は
前記DNA分子の配列は、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号43、配列番号44、配列番号45、配列番号46、配列番号47、配列番号48、配列番号49、配列番号50、配列番号51、配列番号52、配列番号53、配列番号54、配列番号55、配列番号56、配列番号57、配列番号58、配列番号59又は配列番号60と95%以上の相同性を有する配列である、
ことを特徴とする実施形態3に記載のDNA分子。
[実施形態5]実施形態3又は4に記載のDNA分子を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
[実施形態6]pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である、
ことを特徴とする実施形態5に記載の組換えプラスミド。
[実施形態7]実施形態5又は6に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
[実施形態8]前記宿主細胞は、原核細胞、酵母又は真核細胞を含み、好ましくは、前記原核細胞は、大腸菌BL21細胞又は大腸菌DH5α形質転換受容性細胞である、
ことを特徴とする実施形態7に記載の宿主細胞。
[実施形態9]ケトン系化合物からのキラルアミンの生産における実施形態1又は2に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
[実施形態10]トランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、
前記トランスアミナーゼは、実施形態1又は2に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。
[実施形態11]前記ケトン系化合物は、
ことを特徴とする実施形態10に記載の方法。
Claims (13)
- トランスアミナーゼ突然変異体であって、
アミノ酸配列は、配列番号2、配列番号3、配列番号4、配列番号5、配列番号6、配列番号7、配列番号8、配列番号9、配列番号10、配列番号11、配列番号12、配列番号21又は配列番号29に示されるアミノ酸配列である、
ことを特徴とするトランスアミナーゼ突然変異体。 - 請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコードすることを特徴とするDNA分子。
- 前記DNA分子の配列は、配列番号32、配列番号33、配列番号34、配列番号35、配列番号36、配列番号37、配列番号38、配列番号39、配列番号40、配列番号41、配列番号42、配列番号51又は配列番号59に示される配列である、
ことを特徴とする請求項2に記載のDNA分子。 - 請求項2又は3に記載のDNA分子を含有することを特徴とする組換えプラスミド。
- pET-22b(+)、pET-22b(+)、pET-3a(+)、pET-3d(+)、pET-11a(+)、pET-12a(+)、pET-14b(+)、pET-15b(+)、pET-16b(+)、pET-17b(+)、pET-19b(+)、pET-20b(+)、pET-21a(+)、pET-23a(+)、pET-23b(+)、pET-24a(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28a(+)、pET-29a(+)、pET-30a(+)、pET-31b(+)、pET-32a(+)、pET-35b(+)、pET-38b(+)、pET-39b(+)、pET-40b(+)、pET-41a(+)、pET-41b(+)、pET-42a(+)、pET-43a(+)、pET-43b(+)、pET-44a(+)、pET-49b(+)、pQE2、pQE9、pQE30、pQE31、pQE32、pQE40、pQE70、pQE80、pRSET-A、pRSET-B、pRSET-C、pGEX-5X-1、pGEX-6p-1、pGEX-6p-2、pBV220、pBV221、pBV222、pTrc99A、pTwin1、pEZZ18、pKK232-18、pUC-18又はpUC-19である、
ことを特徴とする請求項4に記載の組換えプラスミド。 - 請求項4又は5に記載の組換えプラスミドを含有することを特徴とする宿主細胞。
- 前記宿主細胞は、原核細胞又は真核細胞を含む、
ことを特徴とする請求項6に記載の宿主細胞。 - 前記原核細胞は、大腸菌BL21細胞又は大腸菌DH5α形質転換受容性細胞であり、前記真核細胞は、酵母である、
ことを特徴とする請求項7に記載の宿主細胞。 - ケトン系化合物からのキラルアミンの生産における請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体の使用。
- トランスアミナーゼでケトン系化合物及びアミノドナーのアミノ基転移反応を触媒するステップを含むキラルアミンの生産方法であって、
前記トランスアミナーゼは、請求項1に記載のトランスアミナーゼ突然変異体である、
ことを特徴とするキラルアミンの生産方法。 - 前記ケトン系化合物は、
ことを特徴とする請求項10に記載の方法。 - 前記アミノドナーは、イソプロピルアミンであることを特徴とする請求項11に記載の方法。
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