JP7462795B2 - トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用 - Google Patents
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Description
本発明は、酵素生産の分野に関し、詳細に言えば、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用に関する。
キラルアミンは、多くの重要な生物活性分子の構造単位であり、多くのキラル薬物の合成における肝心な中間体である。多くの重要な神経系薬、心臓血管薬、抗高血圧薬、抗感染薬などは、いずれもキラルアミンを中間体として合成されたものである。キラルアミンの調製は、主に、化学還元の方法により実現され、反応には、反応条件が過酷であり、有毒の遷移状態金属触媒を使用し、製品の立体選択性が低いなどの欠点がある。現在、製薬業界では、生体触媒法によるキラル化合物の調製が広く適用されており、広い将来性を有する。
ω－トランスアミナーゼは、ケトン基質を触媒し、立体選択性のアミノ基転移作用により、キラルアミンを効率よく調製することができる。高い選択性、高い形質転換率、及び穏やかな反応条件などの利点を有しているため、研究者らから大きな注目を集めている。しかし、工業的に適用される場合、ほとんどの野生トランスアミナーゼには、触媒効率が低く、立体選択性が悪く、安定性が弱いなどの欠点があり、それにより、実際に適用できるトランスアミナーゼは多くない。
特許文献１には、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．由来のω－トランスアミナーゼ突然変異体Ｌ１０７Ｉが開示され、当該突然変異体は、アセトフェノン化合物を高い選択性で触媒して、キラルアミン製品を得ることができ、下記式のとおりに反応する。
本発明の主な目的は、従来のトランスアミナーゼが工業化生産に適していないという問題を解決するために、トランスアミナーゼ突然変異体及びその使用を提供することである。
上記の目的を実現するために、本発明の一態様によれば、トランスアミナーゼ突然変異体を提供し、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較して、当該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｌ１６６、Ｋ１４９、Ｋ１４６、Ａ１６８、Ｈ７３、Ｆ１３３、Ｈ８２、Ｅ２４、Ｖ１９４、Ｔ２９４、Ａ２９５、Ｇ２３５及びＦ２３６のうちの少なくとも１つの突然変異部位を含む。
さらに、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｌ１６６Ｉ／Ｖ、Ｋ１４９Ｑ／Ｖ／Ｃ／Ｉ／Ｗ／Ｍ／Ｙ／Ｈ／Ｌ／Ｆ／Ｒ、Ｋ１４６Ｒ／Ｍ／Ａ／Ｐ、Ａ１６８Ｍ／Ｖ／Ｉ／Ｓ／Ｐ／Ｆ、Ｈ７３Ｔ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｒ／Ｗ／Ｍ／Ｋ／Ｓ、Ｆ１３３Ｓ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ａ／Ｄ、Ｈ８２Ｓ／Ｑ／Ｅ／Ｔ／Ｙ、Ｅ２４Ｖ／Ｓ／Ａ／Ｆ、Ｖ１９４Ｉ／Ｓ／Ａ／Ｈ／Ｎ、Ｔ２９４Ｑ／Ｗ／Ｖ／Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｙ／Ｆ、Ａ２９５Ｓ／Ｙ／Ｉ／Ｍ／Ｇ、Ｇ２３５Ｙ／Ｈ及びＦ２３６Ｉ／Ｔ／Ｐ／Ｍ／Ｖ／Ｄ／Ｓ、Ｙ９Ｎ、Ｓ１３２Ｋ、Ｒ１４５Ｋ／Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｙ、Ｌ１５１Ｒ／Ｍ／Ａ、Ｔ１７８Ｍのうちの少なくとも１つの突然変異部位を含み、「／」は「又は」を示し、又は、トランスアミナーゼ突然変異体は、上記の突然変異部位を含み、かつ、突然変異部位を有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。
さらに、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、下表における組合せの突然変異部位のいずれか１つを有する。
上記の目的を実現するために、本発明の第３態様によれば、上記のいずれか１つのＤＮＡ分子が連結されている組換えプラスミドを提供する。
上記の目的を実現するために、本発明の第４態様によれば、上記のいずれか１つの組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。
さらに、宿主細胞には、原核細胞又は真核細胞が含まれ、好ましくは、原核細胞が大腸菌である。
上記の目的を実現するために、本発明の第５態様によれば、キラルアミンの生産方法を提供し、当該方法は、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体を採用してケトン化合物
さらに、Ｒ１及びＲ２は、炭素原子の数が１～２０である、任意選択で置換されたか又は置換されていないアルキル基、任意選択で置換されたか又は置換されていないアラルキル基、又は、任意選択で置換されたか又は置換されていないアリール基である。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、炭素原子の数が１～１０である、任意選択で置換されたか又は置換されていないアルキル基、任意選択で置換されたか又は置換されていないアラルキル基、又は、任意選択で置換されたか又は置換されていないアリール基である。好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、メトキシ、エトキシ、カルボキシ、カルボキシメチル、カルボキシエチル又はメチレンジオキシによって置換されることを言う。
さらに、ケトン化合物は
本発明の技術案を適用すれば、本発明の突然変異体は、ケトン基質のアミノ基転移反応に対する触媒活性を向上させ、キラルアミンの工業化生産の使用に適する。
なお、本願の実施例及び実施例における特徴は、矛盾がない場合、互いに組み合わせることができる。以下、実施例を参照して本発明を詳細に説明する。
「天然に存在する」又は「野生型」は、「突然変異体」と対照的なものであり、自然界で発見する形態を指す。例えば、天然に存在するか又は野生型のポリペプチド又はポリヌクレオチド配列は、生物体に存在する配列であり、自然界の供給源から単離することができ、かつ、人工によって意図的に修飾又は改変されていないものである。
本願は、例えば細胞、核酸又はポリペプチドの「組換え」に関わる時、すでに自然界に存在しない方式で修飾した細胞、核酸又はポリペプチド、又は、自然界に存在する形態と同じであるが、合成材料から及び／又は組換え技術を使用した処理により調製又は派生した細胞、核酸又はポリペプチド、又は、天然或いは内因性形態に対応する細胞、核酸又はポリペプチドを言う。ここで、非限定的な実例には、細胞において内因性（非組換え）形態以外の遺伝子を発現するか又は内因性遺伝子を異なるレベルで発現する組換え細胞が含まれる。
「配列同一性の百分率」とは、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列間の比較を言い、比較ウィンドウを跨って最適なアラインメントの２本の配列を比較することで決定し、ここで、ポリヌクレオチド配列又はアミノ酸配列の比較ウィンドウにおける部分は、参照配列と比較して、２つの配列の最適なアラインメントのための添加又は欠失（即ち、ギャップ）を含み得る。百分率は次のように計算してもよい。２つの配列の、同じ核酸塩基或いはアミノ酸残基が出現する位置の数を決定することにより、一致する位置の数を生成し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得る。選択可能に、百分率は次のように計算してもよい。２つの配列の、同じ核酸塩基或いはアミノ酸残基が出現する位置の数又は核酸塩基或いはアミノ酸残基がギャップと整列する位置の数を決定することにより、一致する位置の数を生成し、一致する位置の数を比較ウィンドウ内の位置の総数で割り、その結果に１００を掛けて、配列同一性の百分率を得る。ここで、「参照配列」とは、配列比較の基礎として使用される指定配列を言う。参照配列は、より大きな配列のサブセット、例えば全長遺伝子又はポリペプチド配列のセグメントであってもよい。
部位特異的突然変異とは、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）などの方法により、ターゲットＤＮＡフラグメント（ゲノムであっても、プラスミドであってもよい）に、塩基の添加、削除、点突然変異などを含む所望の変化（通常は、好ましい方向を特徴付ける変化である）を導入することを言う。部位特異的突然変異は、ＤＮＡによって発現されるターゲットタンパク質の性状及び特徴付けを迅速かつ効率よく向上させることができ、遺伝子研究作業において非常に有用な手段である。
酵素の定方向進化は、タンパク質に対する不合理な設計であり、特別な進化条件を人為的に作成し、自然の進化メカニズムを模倣し、インビトロで遺伝子を改変し、エラープローンＰＣＲ、ＤＮＡシャッフリング（ＤＮＡ ｓｈｕｆｆｌｉｎｇ）などの技術を適用し、高効率のスクリーニングシステムと組み合わせて、所望の特性を有する新しい酵素を取得する。
本願は、従来の技術におけるトランスアミナーゼの酵素活性を向上させ、酵素の使用量を減らし、後処理の難度を低減するために、酵素進化の方法により、Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．由来のω－トランスアミナーゼ突然変異体Ｌ１０７Ｉ（配列番号１）を進化させる。
Ａｃｔｉｎｏｂａｃｔｅｒｉａ ｓｐ．由来のω－トランスアミナーゼ突然変異体Ｌ１０７Ｉ（配列番号１）の配列は次のとおりである。
飽和突然変異は、ターゲットタンパク質のコーディング遺伝子を改変することにより、短時間で、標的部位のアミノ酸が他の１９種類のアミノ酸によってそれぞれ置換された突然変異体を取得する方法の１つである。この方法は、タンパク質を定方向に改変する強力なツールであるだけでなく、タンパク質の構造－機能関係を研究する重要な手段でもある。飽和突然変異は、単一点突然変異よりも理想的な進化物を取得できる傾向がある。これらの部位特異的突然変異法では解決できない問題を得意とするのは、まさに飽和突然変異法の独特の点である。
飽和突然変異で活性が向上した突然変異体を取得したことを基に、より性状に優れた突然変異体を取得するために、有益なアミノ酸部位を組み合わせることができる。組合せの突然変異における２点突然変異の構築方法は単一点突然変異の構築方法と同様に、フルプラスミドＰＣＲ法を用いて構築する。２つ以上の部位が同時に突然変異する多点突然変異は、オーバーラップエクステンションを用いてＰＣＲを増幅させることにより行われ、多点突然変異を含む突然変異遺伝子を取得し、両端を制限酵素で切断した後、発現ベクターに連結して、大腸菌細胞内に形質転換し、１００μｇ／ｍＬのアンピシリンを含有するＬＢ培養皿に塗り、３７℃で一晩培養して、組合せの突然変異体を取得し、配列を測定して、同定した。
飽和突然変異及び組合せの突然変異により取得した突然変異プラスミドは、大腸菌細胞内に形質転換され、大腸菌内で発現される。その後、超音波で細胞を破砕する方法により粗酵素液を取得する。トランスアミナーゼが発現を誘導する最適条件は、２５℃、０．２ｍＭのＩＰＴＧ、及び一晩誘導である。
活性が大幅に向上したトランスアミナーゼ突然変異体を取得した後、それに対して、エラープローンＰＣＲの方法を使用してランダム突然変異を行い、高品質の突然変異体ライブラリを構築し、適切なハイスループットスクリーニング法を開発し、ライブラリをスクリーニングして、活性が一層向上した突然変異体を取得する。
エラープローンＰＣＲは、エラープローン条件でのＰＣＲ、即ち、複製されたＤＮＡ配列にエラーを生じさせやすいＰＣＲ技術を意味し、ミスマッチＰＣＲ又は傾向エラーＰＣＲとも呼ばれる。具体的には、忠実度の低いＴａｑＤＮＡポリメラーゼを利用すること及びＰＣＲ反応条件を変えることにより、ＤＮＡ複製の忠実度が低下し、新たなＤＮＡ鎖の合成過程において塩基ミスマッチが増加し、それにより、増幅生成物に多くの点突然変異が発生するインビトロでＤＮＡ配列の変異を誘導する方法を言う。
エラープローンＰＣＲは、現在、最も簡単で、効率的な遺伝子のインビトロランダム突然変異誘発技術であり、その原理は次のとおりである。ミスマッチの可能性は塩基の異性化によって提供され、ＤＮＡを構成する４種類の塩基は、いずれにも互変異性体が存在し、ここで、グアニン（Ｇ）、シトシン（Ｃ）及びチミン（Ｔ）の３種類の酸素含有塩基は、ケトン型及びエノール型の２種類の互変異性体を有する。アデニン（Ａ）及びチミンの２種類の窒素含有塩基は、アミン型及びイミン型の２種類の互変異性体を有する。Ｇ、Ｃ及びＴは、主にケトン型構造で存在し、エノール型構造の比率が極めて低く、Ａ及びＴの２種類の窒素含有塩基上の窒素原子は、主に、アミノ基（ＮＨ２）状態で存在し、イミン基（ＮＨ）状態で存在する比率が極めて低い。異なる異性体間の水素原子の位置の違い、及び、同じ位置における電子雲のずれ方向の違いにより、塩基の対合形態を改変することが可能になり、こうなると、複製後の娘鎖にミスマッチが発生する可能性がある。例えば、チミンは、ケトン型構造で存在する場合にはアデニンに対合され、エノール型構造で存在する場合にはグアニンに対合され、こうなると、ＡはＣに対合でき、ＴはＧに対合できる不安定な塩基対が発生することにより、ミスマッチになる。
既知のいくつの耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのうち、ＴａｑＤＮＡポリメラーゼのミスマッチ率が最も高い。Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼは、発現された耐熱性ＤＮＡポリメラーゼのうち、活性が最も高いものであり、５’－３’除去酵素活性を有するが、３’－５’除去酵素活性を有さないため、合成時に、一部の単一ヌクレオチドのミスマッチに対して補正機能がなく、したがって３’－５’校正活性を有するＤＮＡポリメラーゼよりもミスマッチが発生する確率が高い。４種類の濃度の異なるｄＮＴＰの使用、Ｍｎ２＋の添加、Ｍｇ２＋濃度の向上などを含む様々な方法で、ＤＮＡポリメラーゼの忠実度を低下させることができる。いくつかの突然変異誘発方法で増幅されたＤＮＡ鎖の塩基を変異させるメカニズムはそれぞれ異なる。ＭｎＣ１２は、ＤＮＡポリメラーゼの突然変異誘発因子であり、Ｍｎ２＋の追加により、ポリメラーゼのテンプレートに対する特異性を低下させ、ミスマッチ率を向上させることができ、４種類のｄＮＴＰｓの濃度の不均衡によって、塩基が誤って取込まれる確率が高くなり、ミスマッチを実現し、Ｍｇ２＋は、Ｔａｑ酵素を活性化する作用を有し、Ｍｇ２＋濃度を、通常の使用量を超えるまで上げると、非相補的な塩基対を安定させることができ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼの使用量を上げること、及び各サイクルの伸長時間を延長することにより、ミスマッチ末端が伸長する確率が高くなり、開始テンプレート濃度を下げ、後続でのＰＣＲサイクルの変異テンプレートの割合が増える。
したがって、上記の研究結果を基に、出願者は、本願の技術案を提案した。本願の典型的な実施形態では、トランスアミナーゼ突然変異体を提供し、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較して、当該トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、Ｌ１６６、Ｋ１４９、Ｋ１４６、Ａ１６８、Ｈ７３、Ｆ１３３、Ｈ８２、Ｅ２４、Ｖ１９４、Ｔ２９４、Ａ２９５、Ｇ２３５及びＦ２３６のうちの少なくとも１つの突然変異部位を含む。本発明の突然変異体は、ケトン基質のアミノ基転移反応に対する触媒活性を向上させ、キラルアミンの工業化生産の使用に適する。
好ましい実施例では、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、さらに、Ｌ１６６Ｉ／Ｖ、Ｋ１４９Ｑ／Ｖ／Ｃ／Ｉ／Ｗ／Ｍ／Ｙ／Ｈ／Ｌ／Ｆ／Ｒ、Ｋ１４６Ｒ／Ｍ／Ａ／Ｐ、Ａ１６８Ｍ／Ｖ／Ｉ／Ｓ／Ｐ／Ｆ、Ｈ７３Ｔ／Ｎ／Ｃ／Ｑ／Ｒ／Ｗ／Ｍ／Ｋ／Ｓ、Ｆ１３３Ｓ／Ｑ／Ｍ／Ｒ／Ａ／Ｄ、Ｈ８２Ｓ／Ｑ／Ｅ／Ｔ／Ｙ、Ｅ２４Ｖ／Ｓ／Ａ／Ｆ、Ｖ１９４Ｉ／Ｓ／Ａ／Ｈ／Ｎ、Ｔ２９４Ｑ／Ｗ／Ｖ／Ａ／Ｅ／Ｒ／Ｙ／Ｆ、Ａ２９５Ｓ／Ｙ／Ｉ／Ｍ／Ｇ、Ｇ２３５Ｙ／Ｈ及びＦ２３６Ｉ／Ｔ／Ｐ／Ｍ／Ｖ／Ｄ／Ｓ、Ｙ９Ｎ、Ｓ１３２Ｋ、Ｒ１４５Ｋ／Ｐ／Ｓ／Ｍ／Ｙ、Ｌ１５１Ｒ／Ｍ／Ａ、Ｔ１７８Ｍのうちの１つの突然変異部位を含み、「／」は「又は」を示し、又は、前記トランスアミナーゼ突然変異体は、上記の突然変異部位を含有し、かつ、上記の突然変異部位を有するアミノ酸配列と８０％以上、好ましくは９０％以上、より好ましくは９５％以上の同一性を有するアミノ酸配列である。上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、アミノ基転移反応の触媒活性を一層向上させることができる。
より好ましい実施例では、トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、前記表の組合せの突然変異部位のいずれか１つを有する。
本願の第２種類の典型的な実施形態では、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体をコーディングするＤＮＡ分子を提供する。当該ＤＮＡ分子がコーディングした上記のトランスアミナーゼ突然変異体は、ケトン基質に対して、非常に良いアミノ基転移触媒活性を有する。
本発明の上記ＤＮＡ分子は、さらに、「発現カセット」の形態で存在してもよい。「発現カセット」とは、特定のヌクレオチド配列の適切な宿主細胞における発現を指示できるＤＮＡ及びＲＮＡ配列を包含する線状又は環状の核酸分子を言う。一般的に言えば、目標ヌクレオチドに有効に連結されたプロモーターを含み、それは、任意選択で、終止信号及び／又は他の調節エレメントに有効に連結されたものである。発現カセットは、さらに、ヌクレオチド配列の正確な翻訳に必要な配列を含んでもよい。コーディング領域は、通常、目標タンパク質をコーディングするが、センス又はアンチセンス方向において、例えばアンチセンスＲＮＡ又は非翻訳ＲＮＡなどの目標機能ＲＮＡもコーディングする。目標ポリヌクレオチド配列を含む発現カセットは、キメラであってもよく、その成分の少なくとも１つが、少なくとも１つの他の成分と異種であることを意味する。発現カセットは、さらに、天然に存在するものであってもよいが、異種発現のための有効な組換えで形成して得られる。
本願の第３種類の典型的な実施形態では、上記のいずれか１つのＤＮＡ分子を含有する組換えプラスミドを提供する。上記の組換えプラスミドにおけるＤＮＡ分子を、組換えプラスミドの適切な位置に置くことにより、上記のＤＮＡ分子を正確にかつスムーズに複製、転写又は発現することができる。
本発明が上記のＤＮＡ分子を限定するときに、限定用語として「含有」を使用したが、ＤＮＡ配列の両端にその機能と関連のない他の配列を任意に追加できることを意味するのではない。当業者であれば、組換え操作の要件を満たすために、ＤＮＡ配列の両端に、適切な制限酵素の切断部位を添加するか、又は開始コドン、終止コドンなどを追加する必要があり、そのため、クローズド式記述で限定する場合、これらの状況を真にカバーすることはできないことを知っている。
本発明に使用される用語「プラスミド」には、二本鎖又は一本鎖の線状又は環状形態の任意のプラスミド、コスミド、バクテリオファージ又はアグロバクテリウム核酸分子が含まれ、組換え発現プラスミドが好ましく、原核発現プラスミドであっても、真核発現プラスミドであってもよいが、原核発現プラスミドが好ましく、一部の実施形態において、組換えプラスミドは、ｐＥＴ－２２ａ（＋）、ｐＥＴ－２２ｂ（＋）、ｐＥＴ－３ａ（＋）、ｐＥＴ－３ｄ（＋）、ｐＥＴ－１１ａ（＋）、ｐＥＴ－１２ａ（＋）、ｐＥＴ－１４ｂ（＋）、ｐＥＴ－１５ｂ（＋）、ｐＥＴ－１６ｂ（＋）、ｐＥＴ－１７ｂ（＋）、ｐＥＴ－１９ｂ（＋）、ｐＥＴ－２０ｂ（＋）、ｐＥＴ－２１ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ａ（＋）、ｐＥＴ－２３ｂ（＋）、ｐＥＴ－２４ａ（＋）、ｐＥＴ－２５ｂ（＋）、ｐＥＴ－２６ｂ（＋）、ｐＥＴ－２７ｂ（＋）、ｐＥＴ－２８ａ（＋）、ｐＥＴ－２９ａ（＋）、ｐＥＴ－３０ａ（＋）、ｐＥＴ－３１ｂ（＋）、ｐＥＴ－３２ａ（＋）、ｐＥＴ－３５ｂ（＋）、ｐＥＴ－３８ｂ（＋）、ｐＥＴ－３９ｂ（＋）、ｐＥＴ－４０ｂ（＋）、ｐＥＴ－４１ａ（＋）、ｐＥＴ－４１ｂ（＋）、ｐＥＴ－４２ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ａ（＋）、ｐＥＴ－４３ｂ（＋）、ｐＥＴ－４４ａ（＋）、ｐＥＴ－４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９、ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ－Ａ、ｐＲＳＥＴ－Ｂ、ｐＲＳＥＴ－Ｃ、ｐＧＥＸ－５Ｘ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－１、ｐＧＥＸ－６ｐ－２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎ１、ｐＥＺＺ１８、ｐＫＫ２３２－１８、ｐＵＣ－１８又はｐＵＣ－１９から選択される。より好ましくは、上記の組換えプラスミドはｐＥＴ－２２ｂ（＋）である。
本願の第４種類の典型的な実施形態では、上記のいずれか１つの組換えプラスミドを含有する宿主細胞を提供する。本発明の使用に適する宿主細胞には、原核細胞、酵母又は真核細胞が含まれるが、これらに限定されない。好ましくは、原核細胞は、グラム陰性細菌又はグラム陽性細菌などの真正細菌である。より好ましくは、原核細胞は、大腸菌ＢＬ２１細胞又は大腸菌ＤＨ５αコンピテント細胞である。
本願の第５種類の典型的な実施形態では、キラルアミンの生産方法を提供し、当該方法は、上記のいずれか１つのトランスアミナーゼ突然変異体を採用してケトン化合物
好ましい実施例では、Ｒ１及びＲ２は、炭素原子の数が１～２０である、任意選択で置換されたか又は置換されていないアルキル基、任意選択で置換されたか又は置換されていないアラルキル基、又は、任意選択で置換されたか又は置換されていないアリール基である。好ましくは、Ｒ１及びＲ２は、炭素原子の数が１～１０である、任意選択で置換されたか又は置換されていないアルキル基、任意選択で置換されたか又は置換されていないアラルキル基、又は、任意選択で置換されたか又は置換されていないアリール基である。好ましくは、置換とは、ハロゲン原子、窒素原子、硫黄原子、ヒドロキシ、ニトロ、シアノ、メトキシ、エトキシ、カルボキシ、カルボキシメチル、カルボキシエチル又はメチレンジオキシによって置換されることを言う。
より好ましい実施例では、ケトン化合物は
より好ましい実施例では、アセトフェノン化合物が
以下、具体的な実施例を参照しながら、本願の有益な効果についてさらに説明する。
下記の実施例に言及される原料は次のとおりである。
原料１：
原料２：
原料３：
原料４：
（実施例１）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを３００ｍｇ加え（具体的には表１を参照）、均一に混ぜ、総体積は１５００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
表１の結果から分かるように、単一部位突然変異体の形質転換効果は、母材と比較してある程度向上したが、最も理想的な効果には達していなかった。有益な突然変異部位を組み合わせることにより、突然変異体活性を一層向上させることができる。
（実施例２）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを２１０ｍｇ加え（具体的には、表２を参照）、均一に混ぜ、総体積は１５００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを２１０ｍｇ加え（具体的には、表２を参照）、均一に混ぜ、総体積は１５００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
表２の結果から分かるように、突然変異体活性が一層向上したが、最適な効果には達していなかった。反復飽和突然変異の進化方法により、活性が向上する突然変異部位を重ね合わせることにより、進化中に、進化結果が全体的な最高点に到達できず、局所的な最高点に限定されることを回避し、活性が向上した突然変異体を取得することができる。
（実施例３）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを６０ｍｇを加え（具体的には、表３を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを６０ｍｇを加え（具体的には、表３を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
（実施例４）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを６０ｍｇ加え（具体的には表４を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを６０ｍｇ加え（具体的には表４を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
表４の結果から分かるように、反復飽和突然変異の使用によって、突然変異体活性が大幅に向上する。次のステップでは、引き続きランダム突然変異（エラープローンＰＣＲ）により、突然変異体活性をさらに向上させ、工業生産に使用できる最終的な突然変異体を得る。
（実施例５）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを３０ｍｇ加え（具体的には、表５を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを３０ｍｇ加え（具体的には、表５を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２倍量のメタノールを反応系に加え、均一に混ぜ、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して、上澄みを採取し、ＨＰＬＣで検出し、波長は２１０ｎｍである。一部の突然変異体の反応特性は以下のとおりである。
（実施例６）
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを３０ｍｇ加え（具体的には、表６を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２ｍＬの酢酸エチルを反応系に加え、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して抽出し、上澄みを採取し、ＨＰＬＣでｅｅ値を検出した。突然変異体の反応特性は次のとおりである。
５ｍＬの反応フラスコに、原料１、原料２、原料３及び原料４をそれぞれ３０ｍｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１８１μＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．９ｍｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを３０ｍｇ加え（具体的には、表６を参照）、均一に混ぜ、総体積は９００μＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、２ｍＬの酢酸エチルを反応系に加え、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して抽出し、上澄みを採取し、ＨＰＬＣでｅｅ値を検出した。突然変異体の反応特性は次のとおりである。
２Ｌの反応フラスコに、原料１及び原料２をそれぞれ２０ｇ加え、ｐＨ８．５のＴｒｉｓ－Ｃｌ（０．１Ｍ）、１２０ｍＬのイソプロピルアミン塩酸塩（６Ｍ）、０．６ｇのＰＬＰを加え、トランスアミナーゼを２０ｇ加え（具体的には、表６を参照）、均一に混ぜ、総体積は６００ｍＬであり、３０℃、２００ｒｐｍのシェーカーで１６ｈ反応させた。反応終了後、反応系に６００ｍＬの酢酸エチルを加え、１２０００ｒｐｍで３ｍｉｎ遠心分離して抽出した。サンプルを後処理し、ＨＰＬＣで検出して、収率、純度及びｅｅ値を測定した。
上記の説明は、本発明の好ましい実施例にすぎず、本発明を限定することを意図するものではなく、当業者にとって、本発明は様々な修正及び変更が可能である。本発明の精神及び原則の範囲内で行われたいかなる修正、同価置換、改善などは、いずれも本発明の保護範囲に含まれるべきである。
Claims (8)
- トランスアミナーゼ突然変異体であって、前記トランスアミナーゼ突然変異体のアミノ酸配列は、配列番号１に示されるアミノ酸配列と比較して、以下の組合せ部位のいずれか１つで突然変異する、
トランスアミナーゼ突然変異体。
- 請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体をコーディングする、
ＤＮＡ分子。 - 請求項２に記載のＤＮＡ分子が連結されている、
組換えプラスミド。 - 請求項３に記載の組換えプラスミドを含有する、
宿主細胞。 - 前記宿主細胞は原核細胞又は真核細胞を含み、前記原核細胞は大腸菌である、
請求項４に記載の宿主細胞。 - 請求項１に記載のトランスアミナーゼ突然変異体を採用してケトン化合物のアミノ基転移反応を触媒して、生成物を生成することを含み、
前記ケトン化合物は
キラルアミンの生産方法。 - 前記ハロゲンがフッ素原子である、
請求項６に記載の方法。 - 前記アセトフェノン化合物が
請求項６に記載の方法。
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