CN115873910B - 转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用以及内酰胺类化合物的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用以及内酰胺类化合物的合成方法，该转氨酶来源于Actinobacteria sp.的ω‑转氨酶突变体。内酰胺类化合物的合成方法包括：将酮酸酯类化合物分散在缓冲液中与氨基供体混合，在转氨酶以及任选的辅酶的作用下，酮酸酯类化合物与氨基供体发生反应，得到内酰胺类化合物。应用本申请的技术方案，采用本申请提供的转氨酶作为合成内酰胺类化合物的催化剂，不仅合成工艺简单，反应条件温和，而且使用有机试剂较少，污染较低，同时底物的转化率以及产物的纯度均大幅提高，能够满足制药领域的要求，为人工合成内酰胺类化合物提供了一种新思路。
Description
技术领域
本发明涉及有机合成技术领域，具体而言，涉及转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中应用以及内酰胺类化合物的合成方法。
背景技术
内酰胺类化合物是有机化学中的关键化合物，因为它们存在于许多生物活性产品中，也作为包括合成聚合物在内的更复杂结构的有价值的中间体。除了β-内酰胺类（阿兹替丁-2-酮）构成目前批准的最重要的一类抗生素外，合成γ-内酰胺（吡咯烷酮）和δ-内酰胺类（哌啶-2-酮）近年来引起了广泛关注，因为这些含氮杂环化合物存在于需要生物活性的化合物中。
γ-内酰胺和δ-内酰胺类结构不仅存在于天然产物及其衍生物中，也是许多临床药物分子的重要组成部分。由于β-内酰胺抗生素类药物的巨大成功，γ-内酰胺和δ-内酰胺类化合物在制药领域也有着广阔的应用前景，同时有机化学家发展了许多内酰胺的合成方法，如羧基和胺基的分子内环合、N-烷基化等。但是这些合成方法一般需要手性金属催化剂，合成路线长，大量使用有机试剂，造成环境污染严重，不仅生产成本高，而且产物的光学纯度难以达到制药领域的要求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的主要目的在于提供转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用以及内酰胺类化合物的合成方法，以解决现有内酰胺类化合物的合成方法采用手性金属作为催化剂，合成路线长，大量使用有机试剂，造成环境污染严重，不仅生产成本高，而且产物的光学纯度难以达到制药领域要求的问题。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用，该转氨酶来源于Actinobacteria sp .的ω-转氨酶突变体，包括包括ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149Y+H73N、ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+H73R、ω-转氨酶突变体L107I+ F133S+K149Q+K146R+L166I、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R+R145K+T294A或ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R中的至少一种。
进一步地，转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R。
进一步地，内酰胺类化合物包括β-内酰胺类化合物、γ-内酰胺类化合物或δ-内酰胺类化合物中的至少一种；其中，β-内酰胺类化合物包括阿兹替丁-2酮及其衍生物；γ-内酰胺类化合物包括吡咯烷酮及其衍生物；δ-内酰胺类化合物包括哌啶-2-酮及其衍生物。
为了实现上述目的，根据本发明的另一个方面，提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该合成方法包括：将酮酸酯类化合物分散在缓冲液中与氨基供体混合，在转氨酶以及任选的辅酶的作用下，酮酸类化合物与氨基供体发生反应，得到内酰胺类化合物，其中，转氨酶以及内酰胺类化合物均具有上述本发明第一方面中的相同含义，在此不再赘述。
进一步地，该酮酸酯类化合物具有如下式（Ⅰ）所示结构：
式（Ⅰ）；
其中，n为0~2之间的整数，R1选自H或*NHCbz；R2选自甲基、正丙基或乙丙基。
进一步地，缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、磷酸钠缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液中的至少一种。
进一步地，酮酸酯类化合物与缓冲液的质量体积比为1:20~30g/mL。
进一步地，氨基供体包括异丙胺、苯乙胺、丙氨酸中的至少一种。
进一步地，氨基供体与酮酸酯类化合物的摩尔比为1:1~3。
进一步地，辅酶为磷酸吡哆醛。
进一步地，辅酶与酮酸酯类化合物的质量比为0.1~0.5:10。
进一步地，转氨酶与酮酸酯类化合物的质量比为2~5:10。
进一步地，上述酮酸酯类化合物与氨基供体发生反应的温度为25~50℃，时间为20~30h，优选为20~24h。
应用本申请的技术方案，采用本申请提供的转氨酶作为合成内酰胺类化合物的催化剂，不仅合成工艺简单，反应条件温和，而且使用有机试剂较少，污染较低，同时底物的转化率以及产物的纯度均大幅提高，能够满足制药领域的要求，为人工合成内酰胺类化合物提供了一种新思路。
具体实施方式
需要说明的是，在不冲突的情况下，本申请中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
如本申请背景技术所分析的，现有采用手性金属为催化剂合成内酰胺的方法，存在合成路线长，大量使用有机试剂，造成环境污染严重，不仅生产成本高，而且产物的光学纯度难以达到制药领域要求的问题，为了解决该问题，本申请提供了一种转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用以及内酰胺类化合物的合成方法。
在本申请的一种典型实施方式中，提供了转氨酶在催化合成内酰胺类化合物中的应用，该转氨酶来源于Actinobacteria sp .的ω-转氨酶突变体，包括ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149Y+H73N、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+H73R、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+L166I、ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R+R145K+T294A或ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R中的至少一种。
上述关于Actinobacteria sp .的ω-转氨酶突变体已在中国专利CN111235127B中公开。
应用本申请的技术方案，采用本申请提供的转氨酶作为合成内酰胺类化合物的催化剂，不仅合成工艺简单，反应条件温和，而且使用有机试剂较少，污染较低，同时底物的转化率以及产物的纯度均大幅提高，能够满足制药领域的要求，为人工合成内酰胺类化合物提供了一种新思路。
此外，本申请提供的转氨酶是来源于放线菌的转氨酶突变体，其是发明人从300种酶中筛选得到，其对于催化合成内酰胺类化合物具有优异的转化率和选择性。
上述内酰胺类化合物的具体类型不作具体限制，本领域常用的内酰胺化合物均可，包括但不限于β-内酰胺类化合物、γ-内酰胺类化合物或δ-内酰胺类化合物中的任意一种或两种以上的混合物；其中，β-内酰胺类化合物包括但不限于阿兹替丁-2酮；γ-内酰胺类化合物包括但不限于吡咯烷酮；δ-内酰胺类化合物包括但不限于哌啶-2-酮。
为了进一步提高合成内酰胺化合物的效率，优选转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R，其作为催化剂催化内酰胺类化合物的合成，以进一步提高合成效率。
在本申请的第二种典型实施方式中，还提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该合成方法包括：将酮酸酯类化合物分散在缓冲液中与氨基供体混合，在转氨酶以及任选的辅酶的作用下，酮酸酯类化合物与氨基供体发生反应，得到内酰胺化合物；其中，转氨酶以及内酰胺类化合物均具有上述第一种典型实施方式中的相同含义，在此不再赘述。
应用本申请的技术方案，本申请提供的内酰胺类化合物的合成，在转氨酶的催化作用下，酮酸酯类化合物在缓冲溶液中与氨基供体混合进行反应，得到内酰胺类化合物，不仅合成工艺简单，反应条件温和，而且使用有机试剂较少，污染较低，同时底物的转化率以及产物的纯度均大幅提高，能够满足制药领域的要求，为人工合成内酰胺类化合物提供了一种新思路。
上述酮酸酯类化合物的具体类型不作具体限制，本领域作为底物合成内酰胺类化合物的酮酸酯类化合物均可，优选为式（Ⅰ）所示结构的化合物时，其制备得到的内酰胺类化合物的产率更高，纯度也更高。
式（Ⅰ）；
上述式（Ⅰ）中，n为0~2之间的整数，如0、1或2；R1选自H或*NHCbz（Cbz为苄氧羰基的缩写）；R2选自甲基、正丙基或乙丙基。
上述采用缓冲液作为底物的溶剂，更利于控制反应体系的pH，进而提高合成效率。缓冲液的类型也不做具体限制，包括但不限于Tris-HCl缓冲液、磷酸钠缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液中的任意一种或两种以上缓冲液形成的混合缓冲液。
为了进一步促进酮酸酯类化合物与氨基供体反应，优选酮酸酯类化合物与缓冲液的质量体积比为1:20~30 g/mL。
典型但非限制性的，酮酸酯类化合物与缓冲液的质量体积比如为1:20 g/mL、1:22g/mL、1:25 g/mL、1:28 g/mL、1:30 g/mL或任意两个数值组成的范围值。
在本申请的一些实施例中，缓冲溶液为Tris-HCl缓冲液时，调节反应体系的pH为8.0~9.0更利于酮酸酯化合物与氨基供体进行反应，提高合成效率。调节反应体系pH的物质为碱性物质，该碱性物质包括但不限于氢氧化钠溶液。
在本申请的一些实施例中，缓冲溶液为磷酸钠缓冲液时，调节反应体系的pH为7.3~8.7，更利于酮酸酯化合物与氨基供体进行反应，提高合成效率。调节反应体系pH的物质为碱性物质，该碱性物质包括但不限于氢氧化钠溶液。
在本申请的一些实施例中，缓冲溶液为硼酸-氢氧化钠缓冲溶液时，调节反应体系的pH为8.5~9.0，更利于酮酸酯化合物与氨基供体进行反应，提高合成效率。调节反应体系pH的物质为碱性物质，该碱性物质包括但不限于氢氧化钠溶液。
上述氨基供体的具体类型也不作具体限制，本领域常用的氨基供体均可。从进一步提高合成效率的角度出发，优选氨基供体包括异丙胺、苯乙胺、丙氨酸中的任意一种或两种以上的混合物。
为了进一步提高酮酸酯类化合物的转化率，优选氨基供体与酮酸酯类化合物的摩尔比为1:1~3。
典型但非限制性的，优选氨基供体与酮酸酯类化合物的摩尔比如为1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.8、1:2、1:2.2、1:2.5、1:2.8、1:3或任意两个数值组成的范围值。
上述辅酶用于与转氨酶配合，进一步提高内酰胺类化合物的合成效率。辅酶包括但不限于磷酸吡哆醛。
为了进一步提高合成效率，优选辅酶与酮酸酯类化合物的质量比为0.1~0.5:10。
典型但非限制性的，辅酶与酮酸酯类化合物的质量比如为0.1:10、0.2:10、0.3:10、0.4:10、0.5:10或任意两个数值组成的范围值。
为了进一步提高合成效率，转氨酶与酮酸酯类化合物的质量比为2~5:10。
典型但非限制性的，转氨酶与酮酸酯类化合物的质量比如为2:10、2.5:10、3:10、3.5:10、4:10、4.5:10、5:10或任意两个数值组成的范围值。
为了进一步合成效率以及内酰胺类化合物的产率，优选反应的温度为25~50℃，时间为20~30h，尤其是当反应时间为20~24h，更有利于在保证合成效率的基础上，减少能耗。
典型但非限制性的，上述酮酸酯类化合物与氨基供体的反应温度如为25℃、30℃、32℃、35℃、38℃、40℃、42℃、45℃、48℃、50℃或任意两个数值组成的范围值；反应的时间如为20h、22h、24h、26h、28h、30h或任意两个数值组成的范围值。
在本申请的一些实施例中，内酰胺类化合物的合成方法包括：步骤S1，将酮酸酯类化合物分散在缓冲液中与氨基供体混合，在转氨酶以及任选的辅酶作用下，酮酸酯类化合物与氨基供体发生反应，得到内酰胺类化合物产物体系；步骤S2，将内酰胺类化合物产物体系进行后处理，得到内酰胺类化合物。
为了进一步提高后续处理效率，优选上述后处理包括以下步骤：S21，将内酰胺类化合物产物体系降温至室温，并加入酸性物质调节体系的pH至≤1终止反应，得到待提纯产物体系；步骤S22，将待提纯产物体系进行提纯，得到内酰胺类化合物。
在本申请的一些具体实施例中，优选上述步骤S22包括：（1）向待提纯体系中加入硅藻土搅拌后过滤，收集滤液；（2）将滤液调整pH至11~12，再采用二氯甲烷萃取多次，得到第一有机相；（3）第一有机相用饱和碳酸钠溶液水洗多次，分液后去除水相，得到第二有机相；（4）第二有机相加入无水硫酸镁干燥，干燥后抽滤，得到滤饼；（5）滤饼用二氯甲烷冲洗，滤液缩干，得到的固体即为内酰胺类化合物。
下面将结合实施例和对比例进一步说明本申请的有益效果。
实施例1
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（1）所示结构：
式（1）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mL Tris-HCl缓冲液（100mmol/L，pH=9.0），酮酸酯类化合物均匀分散于Tris-HCl缓冲液中，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，然后依次加入19g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用12mol/L的盐酸调节pH至8.5~9.0，最后加入2g转氨酶，并调节pH至8.5~9.0，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R；（2）将待反应体系的温度升温至30~35℃，反应20h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH为1终止反应，得到待提纯体系；向待提纯体系中加入2g/g的硅藻土搅拌1~2h后过滤，收集滤液；在滤液中加入氢氧化钠溶液调节滤液的pH为11.0~12.0，再采用300mL二氯甲烷萃取滤液2次，得到第一有机相；第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液水洗两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（1）所示内酰胺类化合物。
实施例2
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（2）所示结构：
式（2）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mLTris-HCl缓冲液（100mmol/L，pH=8.5），酮酸酯类化合物均匀分散于Tris-HCl缓冲液中，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，然后依次加入19g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用10mol/L的氢氧化钠调节pH至8.0~8.5，最后加入4g转氨酶，并调节pH至8.0~8.5，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至35~40℃，反应24h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH≤1终止反应，得到待提纯体系；将待提纯体系过2cm厚的硅藻土垫，滤饼用200mL纯化水洗涤2次，得水溶液；在水溶液中添加碳酸钠固体至饱和，用300mL二氯甲烷萃取2次，得到第一有机相；将第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液洗涤两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（2）所示内酰胺类化合物。
实施例3
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（3）所示结构：
式（3）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物250mL磷酸钠缓冲液（100mmol/L，pH=8.0），酮酸酯类化合物均匀分散于磷酸钠缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.5~8.0，然后依次加入15.9g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用浓盐酸调节pH至7.5~8.0，最后加入4g转氨酶，并调节pH至7.5~8.0，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至25~30℃，反应24h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH≤1终止反应，得到待提纯体系；将待提纯体系过2cm厚的硅藻土垫，滤饼用200mL纯化水洗涤2次，得水溶液；在水溶液中添加碳酸钠固体至饱和，用300mL二氯甲烷萃取2次，得到第一有机相；将第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液洗涤两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（3）所示内酰胺类化合物。
实施例4
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（4）所示结构：
式（4）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mLTris-HCl缓冲液（200mmol/L，pH=8.0），酮酸酯类化合物均匀分散于Tris-HCl缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.0~8.5，然后依次加入9.6g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用浓盐酸调节pH至8.5~9.0，最后加入2g转氨酶，并调节pH至8.0~8.5，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至40~50℃，反应20h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，得到待提纯体系；向待提纯体系中加入101g氯化钠固体，100mL（10V）乙酸乙酯和5g（0.5wt%）硅藻土，搅拌30~60min，得到混合液；将混合液进行抽滤，有机相待合并，水相待萃取；滤饼用10mL（1V）乙酸乙酯搅洗滤饼，抽滤，有机相待合并；水性用50mL（5V）乙酸乙酯溶液萃取两次，有机相待合并浓缩，水相弃置；将有机相合并后用50mL（5V）饱和氯化钠溶液水洗三次，再浓缩至无馏分，加入50mL（5V）正庚烷降温析晶，抽滤，得到的淡黄色粉状产品即为式（4）所示内酰胺类化合物。
实施例5
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（5）所示结构：
式（5）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mL 磷酸钠缓冲液（200mmol/L，pH=8.0），酮酸酯类化合物均匀分散于磷酸钠缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.8~8.2，然后依次加入20.5g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用12mol/L的浓盐酸调节pH至7.8~8.2，最后加入2g转氨酶，并调节pH至7.8~8.2，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至30~40℃，反应20h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH为1终止反应，得到待提纯体系；向待提纯体系中加入2g/g的硅藻土搅拌1~2h后过滤，收集滤液；在滤液中加入氢氧化钠溶液调节滤液的pH为11.0~12.0，再采用300mL二氯甲烷萃取滤液2次，得到第一有机相；第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液水洗两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（1）所示内酰胺类化合物。
实施例6
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（2）所示结构：
式（6）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物，250mL硼酸-氢氧化钠钠缓冲液（200mmol/L，pH=9.0），酮酸酯类化合物均匀分散于硼酸-氢氧化钠缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，然后依次加入17.2g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用12mol/L的浓盐酸调节pH至8.5~9.0，最后加入2g转氨酶，并调节pH至8.5~9.0，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至40~45℃，反应24h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH≤1终止反应，得到待提纯体系；将待提纯体系过2cm厚的硅藻土垫，滤饼用200mL纯化水洗涤2次，得水溶液；在水溶液中添加碳酸钠固体至饱和，用300mL二氯甲烷萃取2次，得到第一有机相；将第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液洗涤两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（6）所示内酰胺类化合物。
实施例7
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（7）所示结构：
式（7）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mL磷酸钠缓冲液（200mmol/L，pH=7.5），酮酸酯类化合物均匀分散于磷酸钠缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至7.3~7.7，然后依次加入17.2g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用浓盐酸调节pH至7.3~7.7，最后加入2g转氨酶，并调节pH至7.3~7.7，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至35~40℃，反应24h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，然后向四口烧瓶中滴加浓盐酸至体系的pH≤1终止反应，得到待提纯体系；将待提纯体系过2cm厚的硅藻土垫，滤饼用200mL纯化水洗涤2次，得水溶液；在水溶液中添加碳酸钠固体至饱和，用300mL二氯甲烷萃取2次，得到第一有机相；将第一有机相用300mL饱和碳酸钠溶液洗涤两次，分液后去除水相，得到第二有机相；在第二有机相中加入10g无水硫酸镁进行干燥后抽滤，得到滤饼；将滤饼用二氯甲烷冲洗后，滤液缩干，得到的固体即为式（7）所示内酰胺类化合物。
实施例8
本实施例提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，该内酰胺类化合物具有如下式（8）所示结构：
式（8）；
该内酰胺类化合物的合成方法按照以下步骤进行：
（1）向1L四口圆底瓶中，加入10g酮酸酯类化合物、250mL磷酸钠缓冲液（200mmol/L，pH=8.5），酮酸酯类化合物均匀分散于磷酸钠缓冲液中，用5mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.3~8.7，然后依次加入10.1g的异丙胺，0.3g磷酸吡哆醛，用浓盐酸调节pH至8.3~8.7，最后加入2g转氨酶，并调节pH至8.3~8.7，得到待反应体系；其中转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R；
（2）将待反应体系的温度升温至40~45℃，反应20h，得到产物体系；
（3）将产物体系降温至室温，得到待提纯体系；向待提纯体系中加入101g氯化钠固体，100mL（10V）乙酸乙酯和5g（0.5wt）硅藻土，搅拌30~60min，得到混合液；将混合液进行抽滤，有机相待合并，水相待萃取；滤饼用10mL（1V）乙酸乙酯搅洗滤饼，抽滤，有机相待合并；水性用50mL（5V）乙酸乙酯溶液萃取两次，有机相待合并浓缩，水相弃置；将有机相合并后用50mL（5V）饱和氯化钠溶液水洗三次，再浓缩至无馏分，加入50mL（5V）正庚烷降温析晶，抽滤，得到的淡黄色粉状产品即为式（8）所示内酰胺类化合物。
实施例9-14
实施例9-14分别提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，采用内酰胺类化合物均同式（1）所示结构，其采用ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149Y+H73N、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+H73R、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+L166I、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R+R145K+T294A作为转氨酶。
上述内酰胺类化合物的合成方法均按照以下步骤进行：
（1）向10mL烧瓶中，加入100mg酮酸酯类化合物2.5mLTris-HCl缓冲液（100mmol/L，pH=9.0），酮酸酯类化合物均匀分散于Tris-HCl缓冲液中，用10mol/L的氢氧化钠溶液调节pH至8.5~9.0，然后依次加入19mg的异丙胺，3mg磷酸吡哆醛，用12mol/L的盐酸调节pH至8.5~9.0，最后加入20mg转氨酶，并调节pH至8.5~9.0，得到待反应体系；步骤（2）~（3）同实施例1，在此不再赘述。
实施例15~20
实施例15~20分别提供了一种内酰胺类化合物的合成方法，其内酰胺类化合物均同式（1）所示结构采用的内酰胺类化合物均同式（1）所示结构，且分别采用苯乙胺、丙氨酸、苄氨、异丁胺、仲丁胺、1-甲基-3-苯基丙胺作为氨基供体。
上述内酰胺类化合物的合成方法均同实施例9，在此不再赘述。
实施例21~22
实施例21~22与实施例1的不同之处在于，所加入的转氨酶的用量分别为1g、0.5g。
实施例23~24
实施例23~24与实施例1的不同之处在于，所加入的磷酸吡哆醛的用量分别为0.1g、0.02g。
对比例1~3
对比例1~3与实施例1的不同之处在于，分别采用酶ATA-013、酶ATA-033、酶TA-P2-B01替换转氨酶ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149H+K146R作为催化剂。
对比例4
本对比例与实施例1的不同之处在于，未加入辅酶磷酸吡哆醛。
试验例1
分别测定上述实施例1~3、5~7制备得到的内酰胺类化合物的产品质量，核磁内标，手性纯度以及收率，结果如下表1所示。
表1
试验例2
分别测定上述实施例4和8制备得到的内酰胺类化合物的产品质量，核磁内标，纯度、de值以及收率，结果如下表2所示。
表2
试验例3
分别测定实施例9-15制备得到的内酰胺类化合物的手性纯度以及20h转化率，结果如下表3所示。
表3
试验例4
分别测定实施例15~20制备得到的内酰胺类化合物的手性纯度以及转化率率，结果如下表4所示。
表4
试验例5
分别测定实施例21~24以及对比例1制备得到的内酰胺类化合物的手性纯度以及20h转化率率，结果如下表5所示。
表5
试验例6
分别测定实施例1以及对比例1-3制备得到的内酰胺类化合物的手性纯度以及20h转化率，结果如下表6所示。
表6
从以上的描述中，可以看出，本发明上述的实施例实现了如下技术效果：采用本申请提供的转氨酶作为合成内酰胺类化合物的催化剂，不仅合成工艺简单，反应条件温和，而且使用有机试剂较少，污染较低，同时底物的转化率以及产物的纯度均大幅提高，能够满足制药领域的要求，为人工合成内酰胺类化合物提供了一种新思路。
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (7)
1.一种内酰胺类化合物的合成方法，其特征在于，所述合成方法包括：将酮酸酯类化合物分散在缓冲液中与氨基供体混合，在转氨酶以及辅酶的作用下，酮酸酯类化合物与氨基供体发生反应，得到所述内酰胺类化合物；
所述转氨酶为来源于Actinobacteria sp .的ω-转氨酶突变体，所述转氨酶选自ω-转氨酶突变体L107I+ L166I+A168I+K149Y+H73N、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+H73R、ω-转氨酶突变体L107I+F133S+K149Q+K146R+L166I、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R+R145K、ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R+R145K+T294A或ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R中的至少一种；
所述转氨酶的序列如下：
MTISKDIDYSTSNLVSVAPGAIREPTPAGSVIQYSDYELDESSPFAGGAAWIEGEYVPAAEARISLFDTGFGHSDLTYTVAHVWHGNIFRLKDHIDRVFDGAQKLRLQSPLTKAEVEDITKRCVSLSQLRESFVNITITRGYGARKGEKDLSKLTSQIYIYAIPYLWAFPPEEQIFGTSAIVPRHVRRAGRNTVDPTVKNYQWGDLTAASFEAKDRGARTAILLDADNCVAEGPGFNVVMVKDGKLSSPSRNALPGITRLTVMEMADEMGIEFTLRDITSRELYEADELIAVTTAG GITPITSLDGEPLGDGTPGPVTVAIRDRFWAMMDEPSSLVEAIEY；
所述内酰胺类化合物包括β-内酰胺类化合物、γ-内酰胺类化合物或δ-内酰胺类化合物中的至少一种；其中，β-内酰胺类化合物包括阿兹替丁-2酮及其衍生物；γ-内酰胺类化合物包括吡咯烷酮及其衍生物；δ-内酰胺类化合物包括哌啶-2-酮及其衍生物；
所述酮酸酯类化合物的结构如下式（Ⅰ）所示：
式（Ⅰ）；
其中，所述n为0~2之间的整数，R1选自H或*NHCbz；R2选自甲基、正丙基或异丙基；
所述缓冲液包括Tris-HCl缓冲液、磷酸钠缓冲液或硼酸-氢氧化钠缓冲液中的至少一种；
所述辅酶为磷酸吡哆醛；
所述氨供体包括异丙胺、苯乙胺、丙氨酸中的至少一种。
2.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，所述转氨酶为ω-转氨酶突变体L107I+L166I+A168I+K149H+K146R。
3.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
所述酮酸酯类化合物与所述缓冲液的质量体积比为1:20~30 g/mL。
4.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
所述氨基供体与所述酮酸酯类化合物的摩尔比为1:1~3。
5.根据权利要求1所述的合成方法，其特征在于，
所述辅酶与所述酮酸酯类化合物的质量比为0.1~0.5:10。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述转氨酶与所述酮酸酯类化合物的质量比为2~5:10。
7.根据权利要求1至5中任一项所述的合成方法，其特征在于，所述反应的温度为25~50℃，时间为20~30h。
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