CN101490249A - 提高平衡反应的产量的方法和系统 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及提高平衡反应的产量的方法和系统。在一些实施方式中，该方法包括一旦达到平衡就从反应混合物中除去酶，再选择性地加入酶和反应物以促进生成产物的反应的进行，以及任选地将稳定的中间产物、副产物和/或联产物循环返回到反应混合物中。在一些实施方式中，该方法包括将所需的产物从反应混合物中纯化出来，以及选择性地将反应混合物中的一种或多种组分，例如原始反应物、中间产物、联产物或副产物循环返回到反应混合物中，以期提高滴定度。本发明还提供了实现该方法的系统。在一些实施方式中，使用该方法和系统统用于提高由多步骤平衡途径制备的莫那亭和莫那亭衍生物的产量。

Description

提高平衡反应的产量的方法和系统
优选权声明
本申请要求2006年5月24日提交的美国临时专利申请No.60803105的优选权，该申请的全部内容以引用的方式加入本文。
技术领域
本发明涉及提高包含平衡反应的多步骤途径的所需产物的产量的方法和系统。在一些实施方式中，所述所需产物为高强度甜味剂，莫那亭。
背景技术
莫那亭(Monatin)是一种具有如下化学式的高强度甜味剂：
Figure A200780027087D00081
由于有多种不同的命名习惯，莫那亭已知有多种可选择的化学名称，包括：2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸；4-氨基-2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)戊二酸；4-羟基-4-(3-吲哚基甲基)谷氨酸；和，3-(1-氨基-1，3-二羧基-3-羟基-丁-4-基)吲哚。
莫那亭包括两个手性中心，从而具有四种可能的立体异构构型：R，R构型(“R，R立体异构体”或“R，R莫那亭”)；S，S构型(“S，S立体异构体”或“S，S莫那亭”)；R，S构型(“R，S立体异构体”或“R，S莫那亭”)和S，R构型(“S，R立体异构体”或“S，R莫那亭”)。
WO 2003/091396 A2(以引用的方式加入本文)特别公开了在体内和体外制备莫那亭的多肽、途径和微生物。WO 2003/091396 A2(参见，例如，图1-3和11-13)和美国专利申请No.2005/282260中描述了通过多步骤途径(包括用多肽(蛋白质)或酶进行生物转化)由色氨酸制备莫那亭。所述的一个途径包括将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸(“I-3-P”)(反应(1))；将吲哚-3-丙酮酸转化为2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(莫那亭前体，“MP”)(反应(2))；以及将MP生物(例如使用酶)转化为莫那亭(反应(3))。
在南非的德兰士瓦地区(Transvaal Region)的Schlerochiton ilicifolius植物的根的皮中可以发现莫那亭的某些异构体形式。但是，在干皮中存在的莫那亭(以其酸的形式以吲哚表示)的浓度约为0.007重量％。参见美国专利Nα.4975298。从该植物中提取莫那亭的方法目前还是未知的。
至少部分由于具有甜性，可以是莫那亭的经济来源。因而，对提高合成途径(例如莫那亭合成途径)的效率有持续的需求，包括上述生物多步骤途径。
发明内容
本发明提供了用于通过生物合成途径合成所需最终产物的方法和系统。根据一种实施方式，将以至少一种途径的中间产物(否则该中间产物将会在合成途径结束时中除去)的形式捕获的碳释放，并将该碳转化为所需最终产物的方式通过改变原始的途径将该碳转化为需要的末产物。本领域的一般技术人员可以理解的是，此处所用的术语“碳”代表相关化合物。就是说，语句“将碳转化为所需产物”指的是将含碳的化合物转化为所需的产物。
在一种实施方式中，将中间产物和未反应的组分循环再利用，减少浪费，提高产物的碳收率。就是说，这种产物的净除去(net removal)可以干扰平衡，和不除去产物相比，对于给定量的原始反应物，可以生成更多的产物。这样可以提高生产的经济效益。
在本发明的另一种实施方式中，将反应混合物中的一种或多种组分循环使用，以使产量高于平衡产量。就是说，当进行一系列反应以生成所需产物的时候，也可能发生不希望的副反应，有些是不可逆的，有些是可逆的。当副反应不可逆或基本上不可逆时，副反应中消耗的碳是不能回收用于所需途径的。另一方面，如果不控制该不可逆的副反应，它们可能最终超过所需反应的速度。因此，较易变化的中间产物和副产物可以被稳定以防止分解。因而，在本发明的一种实施方式中，将易变化的或不稳定的中间产物和副产物转化为更稳定的组分而变稳定，这些组分可以循环利用返回到原始反应物的混合物中。将不稳定的中间产物转化为产物或更稳定的化合物可以进一步保持碳，提高产物的产率。
当副反应可逆时，可以将可逆的副反应的产物循环利用返回到原始反应物的混合物中，以防止或减少其它的原反应物损失到不需要的副产物的生产中。例如，通过加入与原始反应物平衡的量的不希望的副产物，最终结果是不希望的副反应不再发生。
在一种具体的实施方式中，通过以下由色氨酸生产莫那亭：将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸(“I3P”)，使I3P与丙酮酸反应生成α-酮酸莫那亭(“MP”)，然后将MP反应生产莫那亭，其中，每个反应由一种或多种酶促进。伴随产物生成途径也可能发生竞争反应。例如，在确认的生成莫那亭的过程中，丙酮酸也可能与自身发生反应生成4-羧基-4-甲基-2-酮戊二酸(“HMO”)，由与将色氨酸转化为I3P相同的酶可以将HMO转化为4-羟基-4-甲基谷氨酸(“HMG”)。因此，提高经济效益的方法不仅包括将莫那亭产物中直接含有的化合物循环利用，而且还包括将副反应的副产物循环利用。这样回收的副产物可以转化为用于生产莫那亭的化合物。
在一种实施方式中，在分离和/或回收前，将较不稳定的化合物转化为更稳定的化合物。“较不稳定”和“更稳定”指的是在所选择的分离和回收条件下，该化合物发生分解的可能性。在一些实施方式中，例如，在由色氨酸生成莫那亭时，在分离和回收前，将α-酮酸中间产物转化为相应的氨基酸。在一种具体的实施方式中，当用上述途径制备莫那亭时，将较不稳定的化合物转化为更稳定的化合物的方法可以为：首先，使生成莫那亭的反应进行到平衡，接着除去莫那亭生成途径中含有的酶，然后加入促进MP转化和色氨酸转化的一种或多种酶，同时加入额外的丙氨酸。选择性地加入适当的酶和丙氨酸负载可以使得较不稳定的MP形成额外的，更稳定的莫那亭，较不稳定的I3P被转化为更稳定的色氨酸，然后可以回收色氨酸再用于生成莫那亭。
因此，在一种实施方式中，本发明的方法分几个阶段中进行。在第一阶段，合成途径包括将原始底物X转化为途径中的一种或多种中间产物(Y1-Yn，其中，Y1将转化为Y2，Y2将转化为中间产物Y3，等等，直到生成最后的中间产物Yn)。然后，将中间产物Yn转化为产物Z。X到Y1-Yn的转化以及然后到Z的转化可以在一个混合物或组合物中进行，一般地，至少部分地是同时的。在第二阶段，在第一阶段开始一段需要的时间之后，将第一阶段中的至少一种或者全部促进酶反应或化学反应(例如，将X转化为Y1，将Y1转化为Y2，将Y2转化为Y3，等等，直到将Y(n-1)转化为Yn，然后将Yn转化为Z)的分子实体除去，或者将其抑制、分解或钝化，或者使其失去功能。在第三阶段，通过添加或再次添加能够促进中间产物Yn转化为产物Z的分子实体，将第二阶段后仍然存在于混合物中的至少一种中间产物Y转化为产物Z。
在另一种实施方式中，在第三阶段，将中间产物Yn转化为产物Z。
在另一种实施方式中，提供了一种合成途径，其中产物Z为莫那亭。
在另一种实施方式中，在第三阶段之前，从反应混合物中除去所有能够促进该途径的反应的分子实体。
在另一种实施方式中，在第三阶段，将中间产物Yn转化为产物Z。
在另一种实施方式中，只将促进要结束的中间步骤反应(例如，将Yn-1转化为Yn的反应)的分子实体从反应混合物除去，或者将其抑制、分解或钝化。
在另一种实施方式中，在第三阶段，将能够促进这些途径中的一个或多个反应的多于一种分子实体加回到混合物中。
在某些实施方式中，和单独通过平衡过程相比，使用此处提供的方法可以提高多步骤平衡过程的产物的总量或滴度。例如，产物的浓度或滴度可以提高1.7倍，或者在某些情况下，浓度或滴度可以提高2倍。由给定的底物得到的产物的摩尔产率(生成的产物的摩尔数除以提供的原始底物的摩尔数)可以提高1.7倍，或者在某些情况下，可以提高2倍。如果将底物循环使用(特别是在第三阶段中加入的额外底物)，和单独通过平衡过程相比，也可以提高总体碳收率(产物中含碳的量除以提供的底物中含碳的量)。
本发明还包括使用本发明的方法的制备莫那亭的系统，以及用于这种制备的装置。在一些实施方式中，由多步骤途径制备莫那亭的方法包括使包含一种或多种反应物与一种或多种促进剂的第一组合物反应，在该莫那亭生成途径中形成莫那亭和一种或多种中间产物。使第一组合物反应一定的时间，例如，直到达到平衡。在该一定的时间之后，将所述一种或多种促进剂除去、抑制、钝化或分解，然后通过向在生成莫那亭的反应步骤中包括的组合物中加入促进剂，或者通过将生成莫那亭的反应步骤中包括的促进剂解除抑制或再活化，来提高该途径中的莫那亭的生成量。在一些实施方式中，除了将适当的促进剂加入、解除抑制或再活化外，向该组合物中加入能够使莫那亭生成步骤向生成莫那亭的方向进行的额外的化合物。
在一些实施方式中，制备莫那亭的方法包括在具有至少两个或者至少三个反应步骤的途径中制备莫那亭，其中，反应步骤中的一个生成莫那亭，其它反应步骤限制可用于莫那亭生成反应步骤的莫那亭途径中间产物的量，至少包括在需要的时间之后限制该途径的步骤，例如，在该途径达到平衡之后，随后将组分(例如，促进剂、反应物或两者一起)返回到该途径中，以使莫那亭生成步骤向生成莫那亭的方向进行。“折衷处理一个反应(compromising a reaction)”指的是干扰一个反应，使它不能发生或降低该反应的效率。
发明内容不是意在限制随附的权利要求的范围。
附图说明
图1为说明根据本发明的一种实施方式制备莫那亭的方法流程图；
图2为说明根据本发明的一种实施方式制备莫那亭的系统的方块示意图；
图3为说明根据本发明的不同实施方式制备莫那亭的不同组分分离的系统的方块示意图；
图4为说明根据本发明的不同实施方式制备莫那亭的不同组分分离的系统的方块示意图；
图5为说明根据本发明的不同实施方式制备莫那亭的不同组分分离的系统的方块示意图；
图6为说明根据本发明的不同实施方式制备莫那亭的不同组分分离的系统的方块示意图；
图7为说明根据本发明的不同实施方式制备莫那亭的不同组分分离的系统的方块示意图。
具体实施方式
此处所用的“包括(including)”指的是“包含(comprising)”，“包括(including)”指的是“包括但不限于”，除非上下文中明显有另外含义。此处所用的词组“例如(for example)”或者“例如(such as)”不是用于限定，指的是“例如但不限于”。此外，除非明确另有指明，单数形式的“一个”或“所述”包括所提及物的复数。例如，提及的“包括酶”指的是包括一种或多种酶。术语“约”包括存在任何测量中的实验误差范围。除非另有说明，即使没有明确地使用“约”一词，所有的测量数值应当认为在其之前具有“约”一词。
此处所用的术语“分离”和“除去”是可以替换使用的。因此，例如，从组合物中分离莫那亭与从组合物中除去莫那亭相同。一般的技术人员可以理解的是，分离和除去不需要彻底地分离和除去，而是例如，在一些分离中，例如用膜过滤只有实现粗略分离，因为可能有些从所需组分中流到不需要的组分中。因此“分离”和“除去”只表示分离后所需组分比分离或除去前更纯了。
除非另有指明，此处所用的术语“莫那亭”不限于莫那亭的任何特定的异构体。
分析“莫那亭”包括分离一个组合物中莫那亭的存在。除非另有指明，莫那亭组合物中的莫那亭不限于莫那亭的任何特定的异构体。因此，除非另有指明，含有“莫那亭”的组合物包括含有莫那亭的四种异构体中的任何或全部的异构体的组合物，例如，含有莫那亭的全部四种异构体的组合物、含有莫那亭的异构体的任何组合的组合物(例如，只含有莫那亭的R，R和S，S异构体的组合物)以及只含有莫那亭的一种异构体形式的组合物。
除非另有指明，凡是在说明书和权利要求中指明的化学名称(例如，“莫那亭”或“莫那亭前体”)时，应该理解为包括术语“和/或其盐”。例如，短语“将吲哚-3-丙酮酸转化为莫那亭前体”应该理解为“将吲哚-3-丙酮酸和/或其盐转化为莫那亭前体和/或其盐”。一般技术人员会得知在各种列举的反应条件下，实际上在莫那亭合成反应中存在或可能存在所列化合物的盐，所述化合物包括反应物、底物、中间产物和产物。
术语“多肽”和“蛋白质”可以替换使用。除非上下文另外明确表明，术语“多肽”不限于一条肽链，而是包括链的多聚体(例如，同源的或异源的二聚体、三聚体、四聚体，等等)，如果这种多聚体形式是促进(例如，催化)该多肽参与的反应所必需的。
“生物转化”是由例如多肽和下文所述的其它促进剂促进的由一种化合物(底物)到不同的化合物(产物)的转化。生物转化包括酶促进(催化)的由一种或多种底物到一种或多种产物转化的酶反应。“生物学合成”或“生物合成”是包括至少一个生物转化的合成。
此处以酶进行举例说明对能够用于促进生物合成途径(例如，合成莫那亭的合成途径)的多肽。但是，应该理解的是，其它分子实体可以用作促进剂以进行需要的反应，包括催化抗体和具有RNA组分分的促进剂，例如，催化RNA或核酶。具有醛缩酶活性的催化抗体是可以商购得到的(醛缩酶抗体38C2，Aldrich编号为47995-0和48157-2)。在Wagner，J.等，Science15：1797-1800(1995)和Zhong，G.等，Angew Chem.Int.Ed.Engl.16：3738-3741(1999)中描述了具有醛缩酶活性的催化抗体的制备，在Gramatikova，S.I.等，J.Biol.Chem.271：30583-30586(1996)中描述了具有转氨酶活性的催化抗体。此外，在美国专利No.6846654中描述了使用催化抗体催化反应的应用。
多步骤途径是相互连接的一系列反应，后序的反应使用前面的反应的至少一种产物。例如，在一个途径中，第一个反应的底物转化为一种或多种产物，这些产物中的至少一种可以用作第二个反应的底物。然后第二个反应也生成一种或多种产物，这些产物中的至少一种可以用作第三个反应的底物，等等。在多步骤途径中，途径中的一个、一些、或全部的反应可以由酶催化，或者由大分子实体(如催化抗体或催化RNA)促进。途径中的一个、一些、或全部的反应可以是可逆的。生物合成是包括至少一个反应步骤由酶催化或者由大分子实体(如催化抗体或催化RNA)促进的合成。多步骤平衡途径是途径中的至少一个反应(即：步骤)为平衡反应或可逆反应的多步骤途径。
根据本发明的实施方式，在合成途径(例如，莫那亭合成途径)开始合成产物(产物的例子是莫那亭)后，改变合成途径中的一个或多个反应。通过除去至少一种促进剂或者另外折衷处理该途径(例如，通过阻止促进剂发生作用，或者减轻降低促进剂发挥其功能的能力)改变或者“破坏”该途径。例如，可以通过除去、抑制或破坏促进途径中的特定中间产物反应的酶来改变或“破坏”该途径。途径的改变还包括改变反应条件以使以前的可逆反应变为不可逆反应，或者至少使这种反应的平衡发生移动，例如，向右，向合成所需产物的方向(例如，向合成莫那亭方向)移动，但是优选是不再建立原始途径的反应的方式。如通过此处的例子可以理解的，原始途径的再建立(或者类似的术语，例如，原始途径的再生)指的是原始途径中的全部步骤的再活化。
在一种实施方式中，该改变使得途径具有大大降低的合成能力，或者不再能合成所需最终产物(例如，莫那亭)，这时只提供用于该途径的第一个反应的底物。该改变优选可检测地减少或阻止通过完整的途径合成最终产物。由于该改变发生在开始合成产物之后，在途径发生改变后，最初的反应已经发生的混合物中含有在途径发生改变的时候存在混合物(包含改变后的反应(优选为非功能性的)的产物)中的该途径的一定量的各种中间产物。
根据本发明的一种实施方式，通过向反应混合物中重新加入一种或多种适当的促进剂(例如，一种或多种酶)，使至少一种中间产物被捕获并转化为所需最终产物，所述促进剂能够促进该中间产物转化为所需最终产物(例如，莫那亭)或者转化为最终产物的前体(例如，莫那亭的前体(MP))，而不使得原始途径再生，或者在不使得原始途径再生的条件下。在一种实施方式中，在将组分加回到混合物中以促进中间产物转化为最终产物(例如，向莫那亭)之前，将钝化的反应的产物与生成它的促进剂(例如，与酶)分离。在一种实施方式中，将底物(例如，反应物、中间产物和产物)与酶分离、所述底物形成第二反应混合物，并且酶被循环返回到第一反应混合物中。最后，至少将能够促进生成产物的步骤(一般是该多步骤途径的最后步骤)的酶加入到或者再次加入到第二混合物中。在另外的实施方式中，向第二混合物中加入引起产物生成步骤朝向所需产物制备方向的其它组分(例如，反应物)。
如一般技术人员可以理解的，组分的分离(例如，将反应物与促进剂分离)可能是不彻底的，反应混合物中可能仍然留有一部分促进剂。同样地，此处所用的术语“提纯”或者类似术语(例如，纯化)表示已经从所需样品中除去了杂质，但不需要绝对纯净。更确切地，“提纯”意在用作一个相对的术语，除非文中另有指明。因此，例如，从含有莫那亭的组合物中提纯莫那亭指的是：和含有莫那亭的组合物相比，在提纯后的莫那亭中，莫那亭相对于杂质的浓度更高了。
本发明的一种实施方式的例子是，将用于制备所需最终产物(例如，莫那亭)的反应材料放在一起形成第一混合物。这些反应材料包括合适的底物、辅助因子、酶、缓冲成分等，通常，该途径的所有必需组分反应，进行所需最终产物的生物合成，此处以莫那亭的合成为例。开始时，至少存在用于第一种酶的底物，如果需要可以提供其它中间底物。
在这种示例性的实施方式中，通过这种途径使最终产物(该途径生成的所需最终产物，例如，莫那亭)的生产进行所需的时间。可以在生成的过程中从该混合物中除去最终产物(例如，莫那亭)，或者，可以使最终产物在第一混合物中累积，例如，直到达到平衡。在所需的时间，将通过上述途径的最终产物的合成折衷处理，通过抑制或者钝化或者除去一种或多种特定的反应的一种或多种酶或者促进剂以使它改变或者完全停止。所述除去、钝化或抑制是由于抑制、钝化或除去一种或多种促进剂，使得通过原始途径进行的最终产物合成不再进行，或者仅以较低的速度进行。由该被除去、抑制或钝化的促进剂进行的反应称为折衷处理。折衷处理一个反应的非限定性例子包括从反应混合物中除去(或者分离，在此处分离和除去可以替换使用)促进该反应的酶。折衷处理一个反应的另一个非限定性例子包括从反应混合物除去酶发生作用所必需的辅助因子。在一种实施方式中，由使用具有镁或磷酸盐辅助因子的酶的途径制备莫那亭时，可以通过除去镁或磷酸盐(例如，使用脱盐柱)将酶钝化来将反应折衷处理。
在途径中生成中间产物的任何反应都可以作为折衷处理的目标。在一种实施方式中，将途径中的一个生成中间产物的可逆反应折衷处理。在一种实施方式中，至少将具有最小平衡常数或者平衡常数低(例如，约为1或者更小)的反应折衷处理。在一种实施方式中，被折衷处理的反应至少为在途径中与最后一个反应相邻的反应。但是，可以改变或者折衷处理途径中能够提供一种或多种中间产物的反应中的任何一个、任何几个或者全部反应。在一些实施方式中，以降低不稳定的中间产物的浓度的方式进行反应。例如，在某个莫那亭制备途径中，干扰生成α-羰基羧酸2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸的反应，以降低该中间产物的浓度。在某个莫那亭制备途径中，以通过向反应中加入氨基供体的增浓物将α-羰基羧酸吲哚-3丙酮酸、4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸(“HMO”)和2-羟基-2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸转化为它们相应的氨基酸的方式进行反应。
为了将需要的反应(例如，需要的中间反应)改变或折衷处理，可以从组合物中除去或抑制一种或多种促进剂(例如，催化途径中的可逆中间反应的酶)。这样得到的组合物含有特别是途径的中间产物，而不含有将该中间体催化转化为最终产物(例如，莫那亭)所必需的酶。
在将需要的反应折衷处理后(例如，将它的促进剂除去、抑制或钝化)，可以向该混合物中补充能将一种或多种反应中间产物转化为最终产物(例如，莫那亭)的组分。该补充的组分使组合物保持在一种状态下，在该状态下中间反应被折衷处理(例如，缺失、抑制或钝化)以使得原始途径不能以初始的活化形式简单地完成。通过在“被破坏”的途径中重建反应，促进中间产物(缺失的促进剂的产物，例如，缺失的酶的产物)转化为最终产物或者产物的前体，将留在中间产物或其下游阶段的碳能够被回收到最终产物中。这种转化能够重建从中间产物到最终产物的部分原始途径，或者建立从中间产物到最终产物的不同的反应途径。因此，使所需最终产物(例如，莫那亭)的合成变得更有效，使途径的中间产物损失或浪费更少。如果将加入的额外的反应组分回收使用，这样会因为产率的提高而导致更经济的生产。
在将中间产物转化为最终产物后得到的反应混合物可以直接用于任何适用的目的。可选择地，可以使用本领域公知的方法，通过萃取、提纯或分离将最终产物或含有这种最终产物(例如，莫那亭)的组合物从第一和/或第二反应混合物分离，对含有该最终产物(例如，莫那亭)的组合物或制剂进行进一步的处理。
在此处的讨论中，所提及的三个阶段不是意在排除加入其它阶段，只是为了便于描述本发明的方法的时序。
因此，在一种实施方式中，本发明可以描述为一种分几个阶段进行的合成一种化合物(例如，莫那亭)的途径。在第一阶段，该途径包括将初始底物X转化为途径中的一种或多种中间产物(Y1-Yn，其中，中间产物Y1将转化为中间产物Y2，中间产物Y2将转化为中间产物Y3，等等，直到生成最后的中间产物Yn)。然后，将中间产物Yn转化为产物Z，例如，莫那亭。X到Y1-Yn的转化以及然后到Z的转化可以在一个混合物或组合物中进行，一般地，至少部分地是同时的。在第二阶段，在第一阶段开始一段需要的时间之后，将反应混合物中的进行或促进酶反应或化学反应(例如，将X转化为Y1，将Y1转化为Y2，将Y2转化为Y3，等等，直到将Y(n-1)转化为Yn，然后将Yn转化为Z)的分子实体除去，或者将其抑制、分解或钝化，或者折衷处理使其失去功能或者大大地降低其功能。在第三阶段，通过添加或再次添加能够促进Yn转化为产物(例如，莫那亭)或转化为其中间产物的分子实体，将第二阶段后仍然存在于混合物中的中间产物Yn转化为产物(例如，莫那亭)或者能够转化为产物(例如，莫那亭)的中间产物。
在具体的实施方式中，例如，如上所述或者如本说明书的其它地方所述，其中由色氨酸经过多步骤生物合成反应制备莫那亭，该过程的目标可以是积聚MP。在一种实施方式中，这可以通过切断由I3P生成MP的反应实现，例如，通过除去(抑制或钝化)促进该途径的其它反应的酶，或者通过除去、抑制或钝化所有酶，然后再加入、启动或者再活化促进I3P转化为MP的酶，并向MP形成反应中加入反应底物中的一种。在一种实施方式中，从反应混合物中提纯制得的MP。
因此，在一种实施方式中，在三个阶段中合成最终产物(例如，莫那亭)。在第一阶段，所有用于合成途径的组分存在于一个混合物中，使其生成最终产物(例如，莫那亭)。在第二阶段，将促进或催化途径中的各种反应的促进剂、较大的大分子(例如多肽或酶)与全部或者一些代谢产物(例如，莫那亭和莫那亭合成途径中的化学中间产物)分离，或者折衷处理一种或全部这些大分子的活性，以阻止该一种或全部促进剂发生作用。在第三阶段，将新的促进剂或者原始促进剂中的一些(例如，途径的酶中的一些)加入到或者加回到代谢产物混合物中，其中，加入的促进剂中的至少一种能够只促进合成途径中某个(些)需要的反应。新的促进剂或原始促进剂中的一些优选地含有促进最终产物(例如，莫那亭本身)的合成的至少一种促进剂(例如，酶)。但是，该新的促进剂或原始促进剂中的一些中缺少促进最终产物(例如，莫那亭)的合成途径中的至少一个早期步骤的一种或多种促进剂(例如，缺少一种或多种酶)。加入或再加入不存在早期促进剂的新促进剂(例如，途径中的最后一种酶)能够利用原本存在于作为中间产物的混合物中的碳，并且将这些碳转化为最终产物(例如，转化为莫那亭)，从而提高了转化途径的总体产率。
在一些实施方式中，本发明的方法特别用作使用可逆途径的合成途径(例如，莫那亭合成途径)。这样的可逆途径可以导致用来生成产品的碳反而转移到相反的反应的无用循环。因此，在使用可逆反应时，不是彻底完成由底物到产物的转化，而是一定量的产物可能转化回底物。
在一些实施方式中，本发明的方法通过在第三阶段中将可能和其它反应组分一起废弃，或者将在试图的循环中被分解的前体转化为最终产物(例如，莫那亭)，来将碳损失最小化。在一种非常优选的实施方式中，在第三阶段加入能够催化由最终产物的中间前体转化为最终产物(例如，将莫那亭前体转化为莫那亭)的酶。
在另一种实施方式中，可以在第三阶段加入酶，该酶能够将途径中的任何中间产物转化为最终产物(例如，莫那亭)，或者转化为能够生成最终产物(例如，莫那亭)但是不重建原始途径的途径。因此，例如，可以加入酶以将中间产物Y1转化为绕开该途径的阻断的下游中间产物，或者将该中间产物转化为最终产物(例如，将MP转化为莫那亭)，而不允许由Y1到Y2的转化。
在加入最终促进剂(例如，最终酶)时，可以加入一种或多种辅助底物或辅助因子，以进一步使最终反应向合成最终产物(例如，莫那亭)的方向进行。同样，可以按照需要使用一种或多种促进剂(例如，一种或多种酶)促进(即：催化)第一和/或第三阶段的各个反应，包括同一类的不同酶或者不同类的酶。可以分别加入或者一起(例如，作为“混合物”(例如，“酶混合物”)或者含有全部或者一些所需的促进剂或酶的组合)加入促进相同反应的多种促进剂(例如，多种酶)。
促进本发明的途径的反应的促进剂(例如，酶)可以在溶液中，共同在反应混合物中。通过膜过滤，特别是超滤可以很容易地从途径混合物中除去溶液中的蛋白质促进剂(例如，酶)，该膜能够截留具有与反应混合物中的需要从中分离的蛋白质至少相同高的分子量的物质，但是允许较低分子量的物质(尤其是，底物、产物和途径的中间产物)通过该膜。
也可以通过色谱法很容易地从反应混合物的低分子量底物、产物和中间产物中分离蛋白质促进剂(例如，溶液中的酶)，所述色谱法例如柱色谱法、例如尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法或亲和色谱法，其中，亲和剂根据需要选择性地与一种或多种促进剂(例如，酶)结合，以从混合物中除去这种蛋白或者除去所有促进剂。
可选择地，根据需要可以将一种或多种促进剂(例如，一种或多种酶)固定在固体载体上。可以通过从剩余的混合物中分离出该固体载体很容易地将提供在固体载体上的促进剂从途径混合物中除去。例如，参见实施例10、13和16。
可选择地，可以以包含的方式提供一种或多种促进剂(例如，一种或多种酶)，包含在截留促进剂(例如，截留酶)但允许小分子量的分子(例如，底物、中间产物和最终产物和其它反应组分)自由流动的半透膜中。例如，可以通过从剩余的混合物中除去该膜而很容易地从途径混合物中除去以包含方式(例如，在膜内)提供的促进剂(例如，酶)。
在一种实施方式中，在第一阶段，以固定或包含的方式提供只催化途径中在第三阶段缺失或大大抑制的中间步骤的促进剂(特别是酶)。
在另一个实施例中，催化途径中在第三阶段缺失或大大抑制的中间步骤的促进剂(特别是酶)可以作为融合蛋白提供，其中，该融合伴侣具有能够除去、钝化或抑制该融合蛋白的性质，这种方式使得实现了阻止或大大抑制在第三阶段由中间产物Yn转化为最终产物(例如，莫那亭)。例如，通过依靠融合伴侣与对其表现出亲合力的底物之间发生亲合反应的方法，融合伴侣可以赋予除去该融合蛋白的能力。
此外，在该途径中，通过选择性地抑制促进反应的促进剂(例如，酶)，可以将要被折衷处理的一个或多个反应折衷处理。抑制可以是可逆的或者不可逆的。优选地，抑制剂为选择性的抑制剂，即，在需要的反应条件下，该用于抑制的试剂优选地对存在的一种或多种促进剂(或酶)的抑制大于可能存在的其它促进剂(或酶)。此外，该抑制剂可以是能够从反应混合物中除去的，例如，或者通过抑制剂的降解或钝化，例如，通过特殊波长的光，或者通过物理地除去该抑制剂，包括，例如，通过渗析或过滤(包括超滤)除去该抑制剂。例如，可以通过金属螯合剂(例如，EDTA(乙二胺四乙酸))抑制II型醛缩酶。
在本发明的一种实施方式的一个实施例中，使用生物转化合成莫那亭的一种途径由包括至少如下三个可逆的平衡反应的途径来表示：
Figure A200780027087D00212
Figure A200780027087D00213
其中，例如，当希望使用L-色氨酸作为起始原料但最终使用D-色氨酸(使用消旋酶从L-色氨酸)制备R，R莫那亭时，色氨酸反应可以任选地包括加入另外的酶(消旋酶)。
在这种途径中，在反应1中，色氨酸和丙酮酸通过酶在可逆的反应中转化为吲哚-3-丙酮酸(I-3-P)和丙氨酸。如上所述的例子所示，使用酶(在此处即为转氨酶)促进(催化)这种反应。在反应(1)中，色氨酸提供氨基(给丙酮酸)并且变为I-3-P。在反应(1)中，氨基受体为丙酮酸，该丙酮酸在转氨酶作用下转变为丙氨酸。对于反应(1)，优选的氨基受体为丙酮酸，对于反应(3)，优选的氨基供体为丙氨酸。在反应(1)中吲哚-3-丙酮酸的形成还可以通过使用其它α-酮酸(例如，草酰乙酸和α-酮戊二酸)作为氨基受体的酶。类似地，从MP(反应3)形成的莫那亭可以通过使用利用除丙氨酸之外的氨基酸作为氨基供体。这包括但不限于天冬氨酸、谷氨酸和色氨酸。
在反应(1)中使用的一些酶还可以用于反应(3)中。在上述的示例性反应中，所提到的转氨酶可以用于反应(1)和(3)中。反应(2)(由醛缩酶介导的从吲哚-3-丙酮酸形成MP)的平衡常数小于1，即醛缩酶催化的反应有利于生成吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸的分裂反应，而不是有利于生成莫那亭的α-酮前体(即MP)的加成反应。据认为转氨酶介导的从色氨酸形成吲哚-3-丙酮酸的反应(反应(1))和从MP形成莫那亭的反应(反应(3))的平衡常数各自接近1。因此，为了增加产生的莫那亭的量，并增加莫那亭制备的经济性，需要移去形成莫那亭的反应中的一种或多种产物和/或增加底物的量。例如，当莫那亭一形成就移走将有利于形成比醛缩酶和转氨酶催化的反应达到平衡时所获的更多的莫那亭；和/或，例如，增加反应(1)或者反应(3)的一种底物的量将促进反应(1)或反应(3)的第二种底物的转化。
在一些实施方式中，本发明提供一种提高平衡反应中的产物浓度(或者滴度)的新方法，例如提高到平衡量的1.2倍、1.3倍、1.4倍、1.5倍、1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍、或者2倍。在一些实施方式中，这可以通过使多步骤的途径中的一个或者多个反应按照所需要的方向进行。在一些实施方式中，促进反应朝积累更多的产物的方向进行，而在其它的实施方式中，促进反应朝积累更多的底物的方向进行。根据本发明的一个实施方式，将反应原料聚集在一起形成第一混合物。对于上述的反应(1)，这些反应物包括色氨酸(可以是L-色氨酸、D-色氨酸或者它们的混合物)、丙酮酸、转氨酶和任选地包括消旋酶(对于上述的第一反应中采用L-色氨酸但D-色氨酸是需要的)、和所列出的对于反应(2)的醛缩酶。在反应(1)中形成的丙氨酸(可以是L-丙氨酸、D-丙氨酸或者它们的混合物)可以与反应(2)中形成的MP反应产生反应(3)中的莫那亭和丙酮酸。在上述的途径中，反应(3)可以通过与促进第一反应的转氨酶相同的转氨酶催化。可以使所述混合物达到平衡状态，在该平衡状态中，形成包含在第一混合物中的平衡量的莫那亭。如果在这个阶段莫那亭仅保留在第一混合物中，从这种混合物中移去莫那亭是可能，并且是更有效的，并且导致其它可用的反应物(包括任何不稳定的中间产物)的损失或者浪费更少。根据本发明的这个实施方式，所有的或者至少部分的第一混合物被超滤以产生截留物和渗透物。在超滤方案中，通过适当选择滤器的截留分子量，具有比第一混合物中的其它成分相对较大分子量的酶(转氨酶和醛缩酶)不能通过滤器，即它们不能通过滤器的膜而被截留，从而形成截留物。其它的组成，例如，色氨酸、丙酮酸、丙氨酸、MP和I-3-P具有的分子量可以使它们通过滤器，从而形成渗透物。
在一种实施方式中，然后将转氨酶和任选的将消旋酶(在这种情况下为丙氨酸消旋酶)连同增加量的丙氨酸加入到超滤的渗透物中，形成第二混合物。优选使用丙氨酸消旋酶，例如，当使用D-色氨酸作为起始原料，并且需要过量的D-丙氨酸时，这可以通过加入L-丙氨酸和促进L-丙氨酸向D-丙氨酸的转化丙氨酸消旋酶获得。应当加入丙氨酸以使其过量，或者至少不是限制的。优选加入的丙氨酸的浓度至少使转氨酶在所需要的条件下能以其最大速度(Vmax)或者接近其最大速度作用。可以使用酶的Km估计所需要的丙氨酸的浓度，以确保丙氨酸的浓度对所述酶饱和。在本实施方式中，所述酶(转氨酶)催化反应(1)和反应(3)。然而，不存在醛缩或者不存在等效的促进剂时能防止反应(2)以明显的速度反应，或者至少降低反应(2)的反应速度。此外，过量的丙氨酸驱使反应(3)按照优选的方向进行，产生更多的莫那亭。此外，增加的丙氨酸的浓度也推动反应(1)按照相反方向进行产生色氨酸和丙酮酸。这是有用的，部分因为I-3-P为特别不稳定的反应物，它能降解为污染反应产物。MP也是混合物中相对不稳定的成分。最终结果是驱使反应(3)朝生成莫那亭的方向进行；并驱使反应(1)逆向产生起始反应物色氨酸的方向进行；并选择性地抑制反应(2)，这使总的反应顺序朝逆方向进行，非所需地将MP转化为I-3-P和丙酮酸。然后将莫那亭从第二混合物中通过纯化方法除去。
在另一个优选的顺序中，含有转氨酶和醛缩酶的截留物可以循环应用到第一混合物或者容器中，在该容器中“新”的第一混合物将进行反应或者正在进行反应。这能增加总的方法效率，对于给定的莫那亭产出，利用较少量的这些酶。
在另一个优选的顺序中，使用用于纯化其它氨基酸的方法进行将莫那亭从第二混合物中移去的纯化工艺。由于莫那亭在结构和化学上与谷氨酸相似，可以使用本领域公知的用于从发酵液中纯化氨基酸谷氨酸的方法。WO 2003/091396的实施例16描述了从复杂的生物培养基中分离莫那亭的方法。在该实施例中，使用两种离子交换色谱步骤。首先，在低pH下进行强阳离子交换色谱法(例如可从Bio-Rad获得的AG50WX-8树脂(H型))将氨基酸与有机酸分离。氨基酸化合物如莫那亭的氨基部分是带电的，因此被结合到树脂上。任合污染性的有机酸不能结合到树脂上，在低pH下流过树脂。从阳离子交换树脂洗脱的氨基酸然后可以在中性pH下使用阴离子交换色谱法(例如DEAE树脂)相互分离，例如分离色氨酸、丙氨酸和莫那亭。在移去莫那亭后的保留的成分可以循环到第一混合物和第二混合物中。这包括将例如色氨酸、丙酮酸和减少量的MP和I-3-P循环到第一混合物中，将丙氨酸循环到第二混合物中。减少量是指反应(3)被驱动朝正方向进行以及反应(1)被驱动朝逆方向进行的情况。循环使用这些反应物进一步增加了总体方法的效率。当在酸性条件下将莫那亭从反应混合物中纯化或者移去，增加总体方法的效率更为明显。MP和I-3-P在酸性环境中分解。因此，在这种实施方式中，如果将莫那亭从第一反应混合物中移去，而不进行超滤和形成第二混合物，这些反应物至少损失一部分，降低了产生莫那亭的效率并增加了纯化的难度，因为形成了反应副产物。
可以通过本发明的方法实现这种益处。对于给定量的原料，增加了产生莫那亭的量；循环使用反应物增加方法的效率；并且在进行有害的分解之前移去或循环利用不稳定的并能产生不需要的副产物的反应物(例如，α-羰基羧酸)。然而，不是所有本发明的的实施方式都需要包括所列出的益处。一些实施方式不包括任何这里所述的益处，一些实施方式可以包括一种或者多种此处所述的益处。
根据本发明的一种实施方式，提供了一种制备莫那亭的方法，该方法包括从色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸；从吲哚-3-丙酮酸制备2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(＂莫那亭前体＂或＂MP＂)；和从MP制备莫那亭。例如，如果底物是L-色氨酸(也称为S-色氨酸)，产生吲哚-3-丙酮酸的反应可以通过使用对S-氨基酸具有底物选择性的酶进行促进。如果需要莫那亭的2S异构体，采用吲哚-3-丙酮酸和丙酮酸反应形成MP的S-异构体的反应可以通过采用具有S-选择性醛缩酶活性的酶进行促进。类似地，如果需要莫那亭的4S异构体，由MP产生莫那亭的反应可以通过采用对L-氨基酸底物具有选择性的酶进行促进。类似地，其它异构体产物可以通过使用具有不同底物选择性的酶分别制备。例如，在一些情况下，莫那亭的2R或4R异构体是优选的产物时，可以使用对R-底物具有底物立体选择性的酶促进形成优选的产物。术语“立体选择性”意指对酶对一种立体异构体具有更强的特异性、更强的活性或者同时具有更强的特异性与更强的活性。可以使用对一种立体异构体比对另一种立体异构体具有有限活性的立体选择性酶。“有限”活性意指最小的或者不明显的活性，例如根据试验测定。
在涉及一系列反应时(例如前述的段落)，本发明不需要每个步骤都明确地进行，这些步骤可以暗含地进行就足够了。换句话说，例如制备莫那亭的方法，包括由色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸、由吲哚-3-丙酮酸制备2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫那亭前体”或“MP”)和由MP制备莫那亭，其中，各个反应由适当的酶促进，该制备莫那亭的方法的进行可以通过将色氨酸与酶组合并设定条件使得发生列举的这些反应。在这个的例子中，色氨酸可以反应生成吲哚-3-丙酮酸，由色氨酸反应生成的吲哚-3-丙酮酸可以反应生成MP，由吲哚-3-丙酮酸反应生成的MP可以反应生成莫那亭。例如，所述方法还可以通过以下例子进行：在适于色氨酸生成反应发生的条件下提供能够产生色氨酸的化合物，并在这些反应适于发生的条件下将所述化合物与能促进这一系列反应发生的酶混合。例如，可以提供能天然地产生大量的L-色氨酸(或者D-色氨酸)的微生物作为色氨酸的来源。例如，通过提供L-色氨酸和具有广谱特异性的氨基酸消旋酶活性或者色氨酸消旋酶活性的酶以及适合L-色氨酸向D-色氨酸转化的条件，可以提供D-色氨酸。
在某些实施方式中，可以设计特定的改变(permutation)以更经济地生产莫那亭(例如R，R莫那亭)。例如，使用L-色氨酸而不使用D-色氨酸或者L-色氨酸和D-色氨酸的组合作为起始原料。而且选择特定形式的色氨酸并不影响在莫那亭混合物中最终莫那亭化合物的手性(因为，色氨酸反应形成不具有手性的吲哚-3-丙酮酸)；有些可以优选使用L-色氨酸作为起始原料，至少因为L-色氨酸目前比D-色氨酸更便宜并且更易于获得。
在另一种实施方式中，本发明提供了制备莫那亭的方法，该方法包括由L-色氨酸制备D-色氨酸、由D-色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸、由吲哚-3-丙酮酸制备R-MP和由R-MP制备R，R莫那亭。由L-色氨酸制备D-色氨酸的反应可以被色氨酸消旋酶及其功能类似物促进。类似地，由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应和由MP生成莫那亭的反应可以被相同的酶所促进。吲哚-3-丙酮酸的反应可以被具有R-特异性醛缩酶活性的酶所促进，从而形成R-MP。由D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应和由R-MP生成R，R莫那亭的反应可以被相同的酶所促进。
在本发明的一些实施方式中，提供了用于制备莫那亭的方法，该方法包括由L-色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸、由吲哚-3-丙酮酸制备2-羟基2-(吲哚-3基甲基)-4-酮戊二酸(“莫那亭前体”或“MP”)和由MP制备莫那亭。由L-色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸的反应被对L-色氨酸底物比对R-MP、R，R莫那亭或二者具有更强特异性的、更强活性的酶所促进。对L-色氨酸底物比对MP或莫那亭具有更强的特异性的和/或更强的活性的酶的实例包括但不限于，L-色氨酸转氨酶、L-芳族氨基酸转氨酶、L-天冬氨酸转氨酶、和L-氨基酸氧化酶。根据该实施方式，吲哚-3-丙酮酸的反应被具有R-特异性的醛缩酶活性的酶所促进，然后生成R-MP。根据某些实施方式，对D-氨基酸具有特异性活性的转氨酶(称为D-转氨酶)对R-MP底物比对吲哚-3-丙酮酸具有更强特异性的、更强的活性或者具有更强的特异性和更强的活性。在某些其它的实施方式中，D-转氨酶对吲哚-3-丙酮酸底物具有有限活性。
根据某些实施方式，提供了一种消旋酶，该消旋酶能够促进作为L-色氨酸转氨基反应的氨基酸副产物形成的(或者从作为色氨酸反应副产物的另一种氨基酸形成的)氨基酸从一种异构体形式变为另一种异构体形式的差向异构化。这种酶的非限制性实例包括谷氨酸消旋酶(EC 5.1.1.3)或能够促进L-谷氨酸向D-谷氨酸转化的的功能类似物，天冬氨酸消旋酶(EC5.1.1.13)或能够促进L-天冬氨酸向D-天冬氨酸转化的功能类似物，丙氨酸消旋酶(EC 5.1.1.1)或者能够促进L-丙氨酸向D-丙氨酸转化的功能类似物。
根据本发明的其它的实施方式，提供了用于制备莫那亭的方法，在该方法中，当L-色氨酸转化为吲哚-3丙酮酸时，α-酮酸底物形成L-氨基酸；吲哚-3丙酮酸反应生成MP(MP可以包括R-MP和S-MP，尽管优选仅包括或者主要为R-MP)；并且在R-MP转化为R，R莫那亭时，L-氨基酸反应重新生成(也称为“循环”)α-酮酸底物。R-MP和L-氨基酸形成R，R莫那亭的反应被立体转化转氨酶促进。以这种方式，可以使用L-色氨酸转氨酶反应的产物L-氨基酸作为底物用于MP向莫那亭的转氨反应。与MP向莫那亭转化的反应相偶合的反应的产物(即，草酰乙酸、丙酮酸、和/或α-KG)能够用作与L-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应相偶合的反应的起始原料。可以使用的立体转化转氨酶的非限制性的例子可以包括：D-苯基甘氨酸转氨酶(EC 2.6.1.72，也可称为D-4羟基苯基甘氨酸转氨酶)、D-甲硫氨酸转氨酶(EC 2.6.1.41，也可以称作D-蛋氨酸-转氨酶和D-蛋氨酸丙酮酸转氨酶)和它们的类似物。
还有一些实施方式可以见2007年3月6提交的美国专利申请序列No.11/714,279(参见，例如，图1和3)，在此以引入的方式将其全文加入本文。在某些实施方式中，制备莫那亭的总途径包括由色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸的反应、由吲哚-3-丙酮酸制备MP的反应、和由MP制备莫那亭(包括R，R莫那亭)的反应。对于本领域的普通的技术人员来说，显然可以对该途径进行的各种改变而不超出本说明书公开的总的范围。
在一种这样的实施方式中，可以对该途径进行改变以增加R，R型莫那亭的产量而减少S，S型莫那亭、R，S型莫那亭、S，R型莫那亭的产量。尤其是，用于L-色氨酸反应的转氨酶对该反应比对MP和4S莫那亭的反应具有更高的活性和/或特异性，或者氧化酶对L-色氨酸比对4R莫那亭具有更高的活性和/或特异性；促进吲哚-3-丙酮酸反应的酶是R-特异性的醛缩酶；和促进MP反应的酶是广谱特异性的D-酶，优选使用该酶以更有效地对MP的R异构体起作用。在某些情况下，可以间接地而不是直接地从L-色氨酸制备吲哚-3-丙酮酸。更具体地说，将L-色氨酸转化为D-色氨酸，然后将D-色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸。
在特定的实施方式中，使用色氨酸消旋酶将L-色氨酸转化为D-色氨酸。然后通过广谱特异性的D-转氨酶使D-色氨酸与丙酮酸反应，以生成吲哚-3-丙酮酸和D-丙氨酸。通过R-特异性醛缩酶使吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸反应生成R-α-酮酸莫那亭(R-MP)；通过广谱特异性的D-转氨酶使R-MP和D-丙氨酸反应生成R，R莫那亭和丙酮酸。
L-色氨酸向D-色氨酸的转化可以通过色氨酸消旋酶或其功能类似物促进。具有色氨酸消旋酶的酶的实例包括来自假单胞菌(Pseudomonas)和气单胞菌(Aeromonas)的广谱活性的消旋酶(Kino，K.etat.，AppliedMicrobiology and Biotechnology(2007)，73(6)，1299-1305；Inagaki，K.et at，Agricultural and Biological Chemistry(1987)，51(1)，173-80)。对于消旋酶、醛缩酶和转氨酶的其它实例可以参见例如，2007年3月6号提交的美国专利申请序列No.11/714,279。
上述论述的制备途径具有一定的优点，包括即使当所需产物是R，R莫那亭时，也可以在生成吲哚-3-丙酮酸的反应中使用与生成莫那亭作为产物的反应中相同的酶。例如，在一些情况下，L-转氨酶(或者适当的L-酶)可以促进生成吲哚-3-丙酮酸的反应，而D-转氨酶可以促进生成莫那亭的反应。与此形成对照，某些可以促进生成吲哚-3-丙酮酸的反应的D-转氨酶还可以促进生成莫那亭的反应。因此，当在生成吲哚-3-丙酮酸的反应及在生成莫那亭的反应中需要使用相同的酶时，可以优选使用广谱特异性的D-转氨酶。在某些情况下，当选择对吲哚-3-丙酮酸比对R-MP具有限制活性和/或特异性的D-转氨酶时，莫那亭的制备将更有效率。
上述途径中的另一个优点是与生成吲哚-3-丙酮酸的反应相偶合的反应的氨基酸产物可以用作与生成莫那亭的反应相偶合的反应的底物。例如，如果L-色氨酸反应生成吲哚-3-丙酮酸，并且同时草酰乙酸、α-酮戊二酸和/或丙酮酸反应生成L-氨基酸，和R-MP形成莫那亭的反应与利用D-氨基酸作为底物的反应相偶合，然后生成吲哚-3-丙酮酸的反应的L-氨基酸在所述的条件下不循环利用于与R-MP反应相偶合的反应中。与此形成对照的是，如果D-色氨酸生成吲哚-3-丙酮酸的反应与形成D-氨基酸产物的反应相偶合，则可以将D-氨基酸循环利用于与R-MP反应相偶合的反应中。这就可以在第一步中使用非化学计量的氨基受体，并且首先生成第三步中所需要的氨基供体。在特定的实施方式中，所述D-氨基酸是D-丙氨酸。
本领域的普通技术人员从本发明的公开内容可以知道如何以各种方法实施本发明以提高R，R莫那亭的产率。例如，本领域的普通技术人员从本发明的公开内容可以知道本发明的用于制备R，R莫那亭的实施方式包括：在适当条件下提供反应物和促进剂的第一反应混合物以使第一混合物制备R，R莫那亭；至少移去促进与直接生成莫那亭的途径中的步骤(通常为该途径中的最后一步)竞争的反应的酶，或者至少以干扰反应导致不稳定的中间产物的浓度降低的方式移去酶，或者在第一反应进行了所需的时间后(例如，达到平衡)移去所有的酶；随后加入至少一种能促进所述途径中产生莫那亭的步骤(通常为该途径中的最后一步)的酶，并任选地加入其它成分，这些成分的浓度增加有助于产生莫那亭的步骤的平衡朝生成莫那亭的方向移动，从而增加产量或者R，R莫那亭。参见，例如实施例9和14。
在特定的实施方式中，使用色氨酸消旋酶将L-色氨酸转化为D-色氨酸。然后通过广谱特异性的D-转氨酶使D-色氨酸与丙酮酸反应，以生成吲哚-3-丙酮酸和D-丙氨酸。通过R-特异性醛缩酶使吲哚-3-丙酮酸与丙酮酸反应生成R-α-酮酸莫那亭(R-MP)；通过广谱特异性的D-转氨酶使R-MP和D-丙氨酸反应生成R，R莫那亭和丙酮酸。为了增加R，R型莫那亭的产量，从该反应中移去一种或者多种酶(例如，R-特异性醛缩酶)以抑制或者减慢与生成R，R莫那亭相竞争的反应。在某些实施方式中，向剩余的反应混合物中补充用于生成莫那亭的酶(例如，D-转氨酶)，并且在特定的情况下，还加入氨基供体(例如，D-丙氨酸)。
本发明的方法流程图如图1所示，并且本发明的示例性系统的块状图如图2所示。图2明确了用于制备莫那亭的途径，但是不意图将其限制到实施所述途径的特定的方法或者系统。例如，当在体外实施时，途径中的任合反应不是发生在活的完整的细胞中。可供选择地，所述方法可以结合在体外和体内方法实施。例如，在反应(1)中通过色氨酸的去氨基作用生成的氨基酸可以用于反应(3)中，以从MP生成莫那亭，因而实施者不需要明确地提供这些氨基酸。此外，实施者在实施时不需要明确地提供所述的每一种组分(例如，反应物和酶)，只要提供或者存在足够的组分，或者组分的来源以及反应条件以便使所述途径能够潜在地进行即可。例如，可以预期的是，利用L-色氨酸作为起始原料实施的途径不仅包括提供L-色氨酸的实施方式，而且包括提供在一定条件下能产生L-色氨酸的化合物的实施方式，所述一定条件是适合于从所述化合物生成L-色氨酸的条件，并将所述化合物与能促进该反应的酶或者能促进从所述化合物转化为L-色氨酸的一系列反应的酶组合。因此，例如，对于如上反应(1)、(2)和(3)的示例性实施方式，反应混合物不必仅包括这三种反应的反应物和产物。还可以存在第二反应和/和副产物(例如，由醛缩酶催化的一个丙酮酸分子与另一丙酮酸分子的加成反应，4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸，或者＂HMO＂)。HMO还可以进行转氨基反应以生成4-羟基-4-甲基戊二酸(＂HMG＂)。可以将HMG循环利用到反应混合物1中以防止可用于生成莫那亭的反应的丙酮酸和氨基的损失中。
现在参照图1，如方块1所示，向第一反应容器中加入至少一种反应物和至少一种酶。图2涉及用于进行图1中概括的方法的示例性系统。如图2所示，制备并纯化转氨酶(或者在亚系统10中提供)，和制备并纯化醛缩酶(或者在亚系统12中提供)。可以通过导管16、18将这些催化剂转移到第一反应容器14中。在另外的实施方式中，必需的酶可以来自单一来源，并通过单一的导管加入到第一反应容器中。起始原料L-色氨酸(或者，D-色氨酸，或者L-色氨酸和D-色氨酸的混合物)通过导管22从色氨酸源20转移到第一反应容器14中，而起始原料丙酮酸通过导管26从丙酮酸源24转移到第一反应容器14中。如果需要，起始原料L-丙氨酸(或者，D-丙氨酸，或者L-丙氨酸和D-丙氨酸的混合物)通过导管59从L-丙氨酸源46转移到第一反应容器14中。可以使用其它的导管28、30将其它的反应物或者组合物转移到第一反应容器14中。如图1的方块2所示，至少一种反应物和至少一种酶反应形成第一反应混合物。
如图1的方块3所示，在预定的时间后，存在第一反应混合物中的至少一种酶被钝化。所述酶的钝化可以包括抑制酶或者从第一反应混合物中移去/分离所述酶。图2说明了一种示例性的系统，其中，通过超滤将所述酶从第一反应混合物中分离。尽管在这个实施方式中采用超滤的方法，可以采用本领域的技术人员公知的其它分离系统和方法从第一反应混合物中移去/分离所述酶，例如，固定化酶。第一反应容器14通过导管34连接到超滤系统32。含有平衡反应(1)、(2)和(3)的成分的第一反应混合物在所需要的时间通过导管34被转移到超滤系统32中。所述超滤系统将第一反应混合物分离成含有大分子的酶(转氨酶和醛缩酶)的截留物和含有第一反应混合物中的其它成分的渗透物。这些酶可以通过导管36直接或者间接地循环利用到第一反应容器中。例如，这些酶可以彼此分离并循环利用，或者以适当的量分别使用。渗透物可以通过导管38转移到第二反应容器40中。
如图1的方块4所示，在使至少一种酶钝化后，将失活的混合物加入到第二反应容器中。在第二反应容器中还加入另外的酶，所有成分反应形成第二反应混合物，分别如方块5和方块6所示。如图2所示的实例，以渗透物加入到第二反应容器中的成分包括色氨酸、丙酮酸、丙氨酸、MP、I-3-P和莫那亭。进口导管42和44将附加的试剂或者试剂的量转移到第二反应容器40中。这些附加的试剂可以包括，例如，得自连接到进口导管42的丙氨酸源46的丙氨酸、和得自连接到进口导管44的转氨酶源48的转氨酶或者其它酶。在第二反应容器40中存在的反应物形成第二反应混合物，并且是那些参与平衡反应(1)和(3)，但不参与平衡反应(2)，这是因为没有醛缩酶。所述第二反应混合物含有的莫那亭比第一反应混合物中的莫那亭的浓度高。
随后对所述第二反应混合物进行纯化以移去所需产物莫那亭，如方块7所示。如图2所示的实例，所述第二反应混合物通过导管50被转移到莫那亭的纯化亚系统52中。其它的成分通过例如导管57被加入到纯化系统中，以在所述的纯化系统中形成反应纯化混合物。莫那亭的纯化亚系统是公知的，并通常在酸性环境中进行。一种典型的系统包括阳离子交换色谱。可以通过导管54将莫那亭从纯化系统52中移去。在其它成分中，丙氨酸可以通过导管56除去。可以使用导管56将丙氨酸循环到丙氨酸源46中以及第二反应容器40中(或者通过导管58转移到第一反应容器14)。其它的成分(例如，色氨酸和丙酮酸)可以循环到第一反应器14中。色氨酸可以通过导管60转移到色氨酸源20中，而丙酮酸通过导管62转移到丙酮酸源24中。
如图2的反应纯化混合物所示的各种纯化方法的实例可以参见图3-7。这些图涉及了各种工艺，如超滤、阳离子交换色谱、阴离子交换色谱、非极性合成吸附色谱、以及脱盐。在一些超滤实施方式中，膜的有效截留分子量为约10kda、20kda、30kda、或者50kda。在一些实施方式中，膜的材料为再生的纤维素、聚砜醚、陶瓷、不锈钢、或任何其它合适的材料。在一些阳离子交换色谱实施方式中，阳离子交换柱为H+型强酸性阳离子交换树脂，该阳离子交换柱具有用磺酸功能化的苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，并且交联度为约2-12％。在一些实施方式中，用腐蚀性的溶液(如KOH溶液、NaOH溶液、NH4OH溶液、或它们的组合)进行洗脱，然后用酸(HC1、碳酸、硫酸、硝酸、甲酸、柠檬酸或者乙酸)中和。在一些阴离子交换色谱实施方式中，阴离子交换柱为强阴离子交换树脂(例如聚甲基丙烯酸酯聚合物)，以使对氢氧化物、乙酸盐或者碳酸盐的非特异性结合降到最低。在一些实施方式中，用氢氧化钾、碳酸氢铵、乙酸钾、氢氧化钠、氢氧化钠、碳酸氢钠、碳酸氢钾、乙酸铵、氢氧化铵、或者它们的组合进行洗脱，然后用例如HCl、碳酸、硫酸、硝酸、甲酸、柠檬酸或者乙酸中和。在一些实施方式中，非极性合成吸附树脂是苯乙烯-二乙烯基苯共聚物，该共聚物的比表面积至少为600m2/g、或者甚至为1000m2/g，或者更高；孔的半径为约150埃或者更小。在一些实施方式中，用水或者乙醇水溶液(浓度为15％体积/体积或者更低)洗涤柱子。在一些实施方式中，脱盐包括蒸发(如果所述盐是挥发性的，例如像处理碳酸氢铵一样)或者可以通过流过非极性合成吸附柱进行。参见图3，反应混合物2经过超滤系统(参见，例如实施例17)，获得含有酶的截留物和含有底物、中间产物、产物以及第一反应混合物的其它小分子的渗透物。然后使超滤的渗透物流过阳离子交换树脂。分离丙酮酸使它循环到第一反应混合物中。在进行阳离子交换后，将所得到的混合物脱盐，然后使之流过阴离子交换树脂(参见，例如实施例18)。阴离子交换柱能够将所需的产物莫那亭与反应物色氨酸和丙氨酸分离。采用SDVB树脂(参见，例如实施例20)对产物莫那亭进一步进行纯化。还采用SDVB树脂对反应物色氨酸和丙氨酸进行纯化，然后分别循环到反应混合物1或者2中。
参见图4，反应纯化混合物可以采用所图3所示的改进的方法进行纯化。如图3所示，反应混合物2首先用超滤进行纯化，但在这种情况下，渗透物首先采用特殊膜(specialty membrane)纯化步骤(NP)(参见，实施例19)进行纯化，其中，将所述膜设计为能从大的化合物中分离小的化合物。NP可以从反应混合物中分离色氨酸和所需产物莫那亭。可以通过SDVB树脂将莫那亭与色氨酸相互分离。NP分离的残留成分可以采用电渗析进行进一步纯化(参见，例如实施例21)。这种方法纯化和分离的丙酮酸和丙氨酸可以循环利用，并分别进一步用于反应混合物1和2中。
图5说明了纯化的另一种方法。如上述的实施例，在反应混合物2的纯化的第一步为超滤。在超滤后，通过能将氨基酸与有机酸分离的阳离子交换树脂将丙酮酸与渗透物分离。然后可以将反应物循环到反应混合物1中。将经过阳离子交换后的残余反应混合物通过NP膜以将丙氨酸从反应混合物分离。如上所述，丙氨酸可以循环到反应混合物2中。将残余的反应混合物通过SDVB树脂以分离和纯化色氨酸和所需产物莫那亭。
反应混合物2的另一个纯化实例可以参见图6。在将反应混合物2进行最初的超滤后，采用阳离子交换树脂再一次将丙酮酸移出，以循环到反应混合物1中。在进行阳离子交换后，将残余的反应混合物通过SDVB树脂以分离和纯化循环使用的丙氨酸和色氨酸以及所需产物莫那亭。本领域的普通技术人员可以理解的是：根据树脂的负载容量，该方法(在图中或在其它地方进行说明)可以需要进行多于一个SDVB树脂和/或多于一个的SDVB树脂处理步骤。将莫那亭与丙氨酸分离的实例如实施例20所示。
在另一个实施例中，图7详细地描述了反应混合物2的改变的另一种纯化方法。在超滤后，将阳离子交换与梯度缓冲液洗脱的步骤结合以分离三种级分(fraction)(参见，例如实施例22)。在一种级分中，通过水冲洗移去丙酮酸。在另一种级分中，将丙氨酸和色氨酸移去，然后在如上所述的将丙氨酸和色氨酸循环到反应混合物1和2之前通过SDVB树脂处理。将最后一种级分也通过SDVB树脂理以分离反应混合物中的盐和所需产物莫那亭。
反应混合物2的纯化的另一个实施例是先采用阴离子交换树脂，然后通过脱盐柱。在将反应混合物2进行最初的超滤后，在一定条件下进行阴离子交换色谱，所述一定条件是丙氨酸和色氨酸不结合并能过循环到反应混合物1中。初时的反应混合物1中的有机酸和莫那亭结合，然后可以通过梯度选择性洗脱。如上所述采用SDVB树脂对莫那亭进行脱盐。
必要时可以对如图2所示的方块图进行改变，可以用能用于本发明可供选择的实施方式中的任何的酶或它们的组合，或者底物或它们的组合代替所述的酶和底物。例如，可以用能促进合成途径中的一个或者多个反应的任何的酶或酶的组合代替由亚系统10提供的示例性的转移酶和由亚系统12提供的示例性的醛缩酶。以类似的方式，L-色氨酸源20和丙酮酸源24可以替换成提供由系统10和/或12所提供的酶的合适底物。例如，＂L-色氨酸＂可以为＂D-色氨酸＂或者D-色氨酸源、或L-色氨酸和D-色氨酸的混合物。如另一个实施例所述，＂L-丙氨酸＂可以是＂D-丙氨酸＂，或者L-丙氨酸和D-丙氨酸的混合物，或者适用于各种莫那亭生成途径的其它氨基酸。
用于本发明方法的将色氨酸转变为吲哚-3丙酮酸(反应1)的酶的实例包括酶种类(EC)为2.6.1.27、1.4.1.19、1.4.99.1、2.6.1.28、1.4.3.2、1.4.3.3、2.6.1.5、2.6.1.-、2.6.1.1、2.6.1.21和3.5.1.-的酶。这些种类的酶包括的多肽如：色氨酸转氨酶(参见，例如实施例7)，该酶能将L-色氨酸和α-KG(即，α-酮戊二酸，也称为2-酮戊二酸)转变为吲哚-3丙酮酸和氨基酸，例如L-谷氨酸；D-色氨酸转氨酶，该酶能将D-色氨酸和2-氧基酸(2-oxo acid)转变为吲哚-3丙酮酸和氨基酸；色氨酸脱氢酶，该酶能将L-色氨酸和NAD(P)转变为吲哚-3丙酮酸、NH3和NAD(P)H；D-氨基酸脱氢酶，该酶能将D-氨基酸和FAD转变为吲哚-3丙酮酸、NH3和FADH2；色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶，该酶能将L-色氨酸和苯基丙酮酸转变为吲哚-3-丙酮酸和L-苯丙氨酸；L-氨基酸氧化酶，该酶能将L-氨基酸、H2O和O2转变为2-氧基酸、NH3和H2O2；D-氨基酸氧化酶，该酶能将D-氨基酸、H2O和O2转变为2-氧基酸、NH3和H2O2；和色氨酸氧化酶，该酶能将L-色氨酸、H2O和O2转变为吲哚-3丙酮酸、NH3和H2O2。这些种类的酶还包括酪氨酸(芳族)转氨酶、天冬氨酸转氨酶、D-氨基酸(或者D-丙氨酸)转氨酶、和广谱性(多底物)转氨酶，该酶具有多种转氨酶活性，一些这种酶能将色氨酸和2-氧基酸转化为吲哚-3丙酮酸和氨基酸。此外，这些种类的酶包括苯丙氨酸脱氨酶，该酶在水存在的情况下能将色氨酸转化为吲哚-3-丙酮酸和铵。
用于本发明方法的将吲哚-3-丙酮酸转变为MP(反应2)的酶的实例包括酶的种类为4.1.3.-、4.1.3.16、4.1.3.17、和4.1.2.-。这些种类的酶包括碳-碳合成酶/裂解酶，如催化两分子羧酸底物缩合的醛缩酶(参见，例如实施例8、11、和12)；肽种类EC 4.1.3.-为利用氧基-酸底物(例如吲哚-3-丙酮酸)作为亲电子试剂形成碳-碳键的合成酶/裂解酶；EC 4.1.2.-为利用醛底物(例如苯甲醛)作为亲电子试剂形成碳-碳键的合成酶/裂解酶。例如，KHG[2-酮-4-羟基戊二酸]醛缩酶(EC 4.1.3.16)和ProA醛缩酶(EC 4.1.3.17)是公知的能将吲哚-3丙酮酸和丙酮酸转变为MP。尽管ProA醛缩酶可以被认为只能识别来源于睾丸酮丛毛单胞菌(comamonas testosteroni)的4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸(HMG)醛缩酶；除非另有说明，此处使用的术语ProA醛缩酶意指任何具有4-羟基-4-甲基-2-酮戊二酸醛缩酶活性的多肽。ProA醛缩酶合适的例子包括美国专利公开No.2005/0282260中的睾丸酮丛毛单胞菌ProA(相应于SEQ ID NO 65(核酸序列)，该专利以引用的方式加入本文；和美国专利公开No.2005/0282260中的SEQ ID NO：66(氨基酸序列)；和苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)(HMG醛缩酶)ProA(NCBI登记号：CAC46344)；或者与以下序列具有同源性的序列的酶：美国专利公开No.2005/0282260中的睾丸酮丛毛单胞菌ProA(相应于SEQ ID NO 65(核酸序列)，美国专利公开No.2005/0282260中的SEQ ID NO：66(氨基酸序列)和/或苜蓿中华根瘤菌(HMG醛缩酶)ProA(NCBI登记号：CAC46344)，和/或SEQ ID NO：1(核酸序列)或SEQ ID NO：2(氨基酸序列)编码的醛缩酶，和/或实施例8中描述的醛缩酶。例如，合适的酶的氨基酸序列可以与睾丸酮丛毛单胞菌ProA(SEQ ID NO：66，美国专利公开No.2005/0282260)和/或苜蓿中华根瘤菌ProA(NCBI登记号：CAC46344)，和/或SEQ ID NO：2，和/或实施例8中描述的醛缩酶的氨基酸序列具有至少约40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、和/或99％的同源性。MP还可以通过化学反应(例如，醛醇缩合反应)产生。
用于本发明方法的将MP转变为莫那亭(反应3)的酶的实例包括酶的种类为：色氨酸转氨酶(2.6.1.27)、色氨酸脱氢酶(1.4.1.19)、D-氨基酸脱氢酶(1.4.99.1)、谷氨酸脱氢酶(1.4.1.2-4)、苯丙氨酸脱氢酶(EC 1.4.1.20)、色氨酸-苯基丙酮酸转氨酶(2.6.1.28)、或转氨酶家族(2.6.1.-)的普通成员，例如，天冬氨酸转氨酶(EC 2.6.1.1)、酪氨酸(芳族)转氨酶(2.6.1.5)、D-色氨酸转氨酶、或D-丙氨酸(也称为D-天冬氨酸或者D-氨基酸)转氨酶(2.6.1.21)(参见，WO 03/091396 A2的图2)。也可以采用化学反应进行所述的反应。酮酸(MP)的氨化通过采用氨和氰基硼氢化钠的还原性氨化实现。WO2003/091396 A2中的图11-13给出了可以用于将MP转变为莫那亭的其它的多肽以及提供了从吲哚-3-丙酮酸或者色氨酸制备莫那亭的增加的产量。
本文提供了用于增加在多步平衡反应中的产物总的产率大于仅采用平衡方法获得的产率的方法。在某些实施方式中，这种方法可以包括使平衡反应中的成分(例如，反应物和促进剂)进行一段时间(例如，达到平衡)。之后，可以通过移去一种或多种促进剂(例如，酶)改变该反应。这种促进剂可以包括那些促进与生成产物的反应竞争的反应的促进剂。例如，这种竞争性反应可以包括在平衡过程中的任何逆反应。在某些情况下，只改变竞争性的反应，而在其它的情况下，改变或破坏所有的反应。一旦这些反应被改变或破坏，直接生成产物的反应通过加入促进产物生成的促进剂重新开始，例如通常向混合物中加入参与多步途径的最后一步反应的促进剂以重新启动所述途径的最后一步的反应。
本领域的普通技术人员在阅读本发明的公开内容后将能理解本文中描述的方法可以改变成制备莫那亭的衍生物，因为在制备莫那亭的衍生物中可以使用类似的途径和酶。例如，所述衍生物可以包括在2006年10月20号提交的美国申请序列号11/58，4016所述描述的物质，该专利申请的全文通过引用加入本文。这种衍生物可以具有以下的结构：
Figure A200780027087D00361
其中，Ra、Rb、Rc、Rd、和Re各自独立为选自以下基团的任何取代基：氢原子、羟基、C1-C3烷基、C1-C3烷氧基、氨基、或者卤原子(例如，碘原子、溴原子、氯原子或者氟原子)。然而，Ra、Rb、Rc、Rd、和Re不能同时都为氢。可供选择地，Rb和Rc，和/或Rd和Re可以一起分别形成C1-C4亚烷基。
本文所述的用于本发明的方法系统可以是自动化的、或者半自动化的。此外，本发明提供了使用本文所述的制备莫那亭的方法或者系统的装置，以及使用该装置的方法。这种装置包括：第一反应容器、分离容器和第二反应容器。所述第一反应容器包括一个或多个送料管或者导管，该送料管或者导管能够提供将要存在于第一反应容器中的混合物的成分(一种或多种酶和/或一种或多种底物或其它成分)。所述分离容器包含第一反应混合物的方式使得截留所需的酶、蛋白质或者促进剂，同时将所需成分从第一反应容器中转移到第二反应容器。所述第二反应容器也可以包括一个或多个送料管或者导管以用于添加蛋白质/酶或者成分；所述第二反应容器还可以包括一个或多个出料口(outlets)，以便于将第二反应混合物中的一些成分循环到第一反应容器中，以及便于收集所需最终产物。
所述分离容器可以是所述第一反应容器的一部分，或者是所述第二反应容器的一部分，或者是独立于第一反应容器和第二反应容器的独立的容器。
所述装置可以进一步包括用于控制成分向所述容器中输入或输出的控制器；用于调节温度、pH和其它的物理反应条件的控制器；和用于控制整体装置的一个或多个方面的计算机。
本发明的一些方法通过以下实施例说明。尽管在本文中公开了许多实施方式，但本领域的技术人员在阅读本发明的全部公开内容后能够容易地理解本发明还可以存在其它的实施方式。从本文所描述的说明书中可以知道，能对本发明的各个方面进行改变，并且所有这些改变不会背离本发明的忠旨和范围。因此，附图和说明书的全部内容应当被认为是一些本质的描述，而不是用于限制本发明的范围。
实施例1、通过分批补料发酵制备HIS6-HEXaspC转氨酶
原料
细菌生长培养基成分从Difco、Fisher Scientific或VWR获得；其它的试剂为分析纯或者可商购的最高纯度的产品。在New Brunswick Scientific(Edison，NJ)BioFlo 
Figure A200780027087D00371
发酵罐中进行发酵。采用具有JLA-16.250或者JA-25.50转头的Beckman(Fullerton，CA)
Figure A200780027087D00372
 J-25I离心机进行离心。
美国专利公开No.2005/0282260(通过引用加入本文)描述了编码大肠杆菌的aspC转氨酶(HEXaspC)的衍生物的基因(该基因在编码序列中具有六处突变)的克隆。所述酶为由Onuffer和Kirsch等(Protein Science 4：1750-1757(1995))首先进行了描述。所述氨基酸的变化导致了该酶比原始酶具有更广谱的底物特异性，并显示出对芳族氨基酸具有增加的活性。
在2.5-L级别的发酵罐中以分批补料发酵方法生产带有氨基末端HIS6-纯化标记的转氨酶HEXaspC，所述分批补料发酵方法能获得高细胞浓度以及所需蛋白质的高水平表达。大肠杆菌菌株BL21(DE3)::HEXaspCpET30(Xa/LIC)的生长方法以及结果如下所述：从新鲜的培养板(含有0.05mg/mL的卡那霉素的LB琼脂培养基)开始，细胞在含有0.05mg/mL的卡那霉素的5mLLuria-Bertani肉汤中生长，温度为37℃、转速为225rpm培养6-8小时。将1mL的培养物分别转移到具有相同的培养基的2个100-mL等份试样中，使细胞在37℃、转速为225rpm过夜(16-18小时)培养。在具有2.5升含有以下物质的培养基中接种5％(体积/体积)的过夜培养物；所述物质为(每升)：2.0g/L(NH4)2SO4、8.0g/LK2HPO4、2.0g/L NaCl、1.0g/L二水柠檬酸三钠、1.0g/L MgSO4.7H2O、0.025g/LCaCl2·2H2O、0.05g/L FeSO4·7H2O、0.4ml/L Neidhardt微量元素、2.0g/L葡萄糖和0.5mg/mL卡那霉素。在接种两小时后，使用60％(重量/体积)的葡萄糖溶液进行葡萄糖指数补料。以所需的速度提供补料以满足微生物以指数生长速度(0.15小时-1)生长的需要。当二氧化碳释放速度(CER)达到100mmoles/L/h(在接种约20小时后，相对应的细胞生物量为15-16gDCW/L)时，通过以快速注射添加2g/L乳糖(以20％的溶液添加)以诱导基因的表达。在诱导时，补料方式从60％(重量/体积)的葡萄糖溶液变为50％(重量/体积)的葡萄糖+10％(重量/体积)的乳糖溶液，而补料速度不变。“50％(重量/体积)的葡萄糖+10％(重量/体积)的乳糖溶液”的补料维持6小时。在发酵结束时，细胞的浓度为31g DCW/L，估算酶表达水平为总蛋白质的38％(通过Bio-Rad(Hercules，CA)ExperionTM系统软件计算(参见下文))。在转速为5000-7000×g下离心10分钟收集细胞，并以湿细胞体的形式在-80℃冷冻。
实施例2、HIS6-HEXaspC转氨酶的纯化
使用Microfluidics(Newton，MA)匀浆器将细胞破碎。采用Bio-Rad(Hercules，CA)ExperionTM Pro260系统或者通过在Mini 
Figure A200780027087D00381
 3室装置进行Bio-Rad 4-15％ SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳分析蛋白质的表达。通过Bio-Rad Bio-SafeTM G-250考马斯兰染色使凝胶中的蛋白质显影，然后用水脱色。用GE Healthcare(Piscataway，NJ)Chelating SepharoseTM Fast Flow树脂纯化HIS6-标记的酶。采用GE Healthcare PD10柱用于交换蛋白质溶液中的缓冲液。蛋白质溶液通过Millipore/Amicon(Billerica，MA)
Figure A200780027087D00391
Plus-70离心过滤设备(MWCO(截留分子量)10kDa)浓缩。采用Pierce(Rockford，IL)BCATM分析试剂盒并以牛血清白蛋白作为标准确定蛋白质的浓度。在具有JLA-16.250或JA-25.50转头的Beckman(Fullerton，CA)
Figure A200780027087D00392
 J-25I离心机中进行离心。所有的试剂为分析纯或者为可商购的纯度最高的产品。
为了制备含有HIS6-HEXaspC转氨酶的无细胞提取物，将细胞悬浮在3-4体积的100mM磷酸钾溶液(pH 7.8，含有0.05mM磷酸吡哆醛(PLP))中，然后使用Microfluidics匀浆器(在20,000psi下3次)破碎细胞，同时保持悬浮体的温度低于15℃。随后的所有纯化的步骤在4℃下进行。将细胞提取物在15,000×g下离心20分钟以除去细胞碎片。将20-25mL等份的无细胞提取物加入45mL的Chelating SepharoseTM Fast Flow Resin(镍(II)形式)(如上文所述)柱中，在此之前将该柱用含有200mM的氯化钠和0.05mM的PLP的100mM磷酸钾平衡。为了产生镍型树脂，使用150mL的的200mM的硫酸镍(II)六水合物洗涤树脂，并随后使用150mL蒸馏水洗涤。加载样品后，用150mL的含有25mM的咪唑的平衡缓冲液、150mL的含有50mM的咪唑的平衡缓冲液和150mL的含有500mM的咪唑的平衡缓冲液洗涤/洗脱所述柱。在最后一次洗涤中洗脱HIS6-HEXaspC蛋白质。按照生成厂商说明，用
Figure A200780027087D00393
 Plus-70离心过滤装置(MWCO 10 kDa)将500mM的咪唑洗涤液浓缩至15-20mL。先用100mM的pH为7.8的磷酸钾(含有0.05mM PLP)平衡一次性PD10柱(2.5mL样品每柱)后，通过该柱除去咪唑和氯化钠。每柱用3.5mL的相同缓冲液洗脱纯化的转氨酶。使用Pierce BCATM分析试剂盒测定各种级分中的蛋白质浓度。使用ExperionTM微毛细管芯片系统(Microcapillary Chip System)或利用4-15％的SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶电泳来测定各个级分的纯度和在无细胞提取物级分中的表达水平。通常，该方法产生约150mg的酶(从600-700mg的总蛋白质中)，所述酶的纯度通过ExperionTM软件估算为85-95％。在使用前将等份(1-5mL)纯化的酶储存在-80℃下。
实施例3、睾丸酮丛毛单胞菌proA醛缩酶的表达和纯化
原料
使用Overnight ExpressTM System II(EMD Biosciences/Novagen；Madison，WI)培养细胞和诱导基因表达。所有其它的原料与HIS6-HEXaspC转氨酶的纯化中所使用的那些物质相同。编码睾丸酮丛毛单胞菌proA醛缩酶的衍生物的基因的克隆描述在美国专利公开No.2004/0063175中。
在培养瓶中使用含有0.05mg/mL的卡那霉素的Overnight ExpressTMSystem II(溶液1-6)制备具有氨基末端HIS6-纯化标记的proA醛缩酶。该表达系统诱导IPTG-可诱导系统的表达而不需要监测细胞的生长。在接种200mL等份的来自BL21(DE3)::睾丸酮丛毛单胞菌proA pET30(Xa/LIC)的液态培养物或平板培养物的培养物(在1L培养瓶中)后，在30℃下以转速为225rpm摇动过夜对培养物进行培育。当OD600达到最小值6时，按照上文所述通过离心收集细胞。
按照上文所述，采用100mM磷酸钾溶液(pH 7.8，含有200mM NaCl)作为悬浮缓冲液制备表达proA醛缩酶的细胞提取物。在一些情况下，还可以向所述缓冲液中加入4mM MgCl2。
按照上述方法纯化蛋白质，将从4个培养瓶的细胞中获得的细胞提取物加载到45mL的Chelating SepharoseTM Fast Flow Resin(镍(II)形式)柱中，在此之前将该柱用含有200mM的氯化钠的100mM磷酸钾(pH7.8)平衡。在含有500mM咪唑的平衡缓冲液级分中蛋白质被洗脱。按照上述方法对该级分进行浓缩，然后通过PD10柱除去咪唑，该PD10柱事先用100mM的pH为7.8的磷酸钾(含有200mM氯化钠和4mM MgCl2)进行平衡。使用Pierce BCATM分析方法测定各种级分中的蛋白质浓度。使用BioRadExperionTM微毛细管芯片系统或利用4-15％的SDS-PAGE梯度凝胶电泳来测定各个级分的纯度和在无细胞提取物级分中的表达水平。通常，该方法产生大于200mg的酶，所述酶的纯度通过ExperionTM软件估算为85-90％。在使用前将等份(1-5mL)纯化的酶储存在-80℃下。
实施例4、从色氨酸和丙酮酸小规模地生物催化制备S，S-莫那亭
原料
所有的试剂为分析纯或者为可商购的纯度最高的产品。用于催化形成S，S-莫那亭的酶按照实施例2和3所述的方法进行纯化。
方法和结果
建立了从L-色氨酸和丙酮酸小规模地生物催化制备S，S-莫那亭的方法。在15mL的具有螺帽的塑料管中进行酶反应。在标准方法中采用含有50mM L-色氨酸、200mM丙酮酸、4mM MgCl2、0.05mM PLP的磷酸钾溶液(pH 7.8)，含有的这种溶液的管在室温下伴随温和的混合进行孵育。加入酶溶液引发反应(终体积为10mL)，其中纯化的睾丸酮丛毛单胞菌proA醛缩酶的浓度为0.05g/L，HIS6-HEXaspC转氨酶的浓度为0.5g/L。磷酸钾的终浓度为25mM，所述的磷酸钾包括来自酶溶液中的磷酸钾。加入洗涤剂吐温
Figure A200780027087D00411
和 X-100(0.01-1％)以最大限度地减少酶的沉淀。在加入酶后，反应迅速进行，并且反应速度随时间的推移减慢。在3-5小时时，加入第二等份的50mML-色氨酸，反应持续到24小时。通过检测L-色氨酸、L-丙氨酸、莫那亭、莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。按照如实施例6中的柱后荧光衍生化方法检测莫那亭、色氨酸、丙氨酸的浓度。按照如实施例6中描述了莫那亭前体和丙酮酸的分析方法。从10mL规模的试验中获得的典型结果如表1所示。
表1：小规模地制备S，S-莫那亭
Figure A200780027087D00413
实施例5、从色氨酸和丙酮酸在实验室规模(bench-scale)以改进的生物催化制备S，S-莫那亭
原料
所有的试剂为分析纯或者为可商购的纯度最高的产品。用于催化形成S，S-莫那亭的酶按照实施例2和3所述的方法进行纯化。实验室规模的生物催化反应在INFORS(Bottmingen，Switzerland)的0.7L生物反应器中进行。采用具有YM10膜的Amicon(Millipore；Billerica，MA)超滤搅拌式室(ultrafiltration stirred cell)(Model 8200)或者采用Millipore
Figure A200780027087D00421
 50cm2超滤膜组件(ultrafiltration cartridge)(MWCO 10,000)从反应混合物中移去蛋白质。
方法和结果
实验室规模的生物催化反应在0.7L的反应器中进行，控制温度、pH、和搅拌。通过在氮氛下进行反应以将氧气催化的中间产物吲哚-3-丙酮酸的降解降到最少。
混合物1(第一反应混合物)：在反应器中制备含有50mM L-色氨酸、200mM丙酮酸、4mM MgCl2、和0.05mM PLP的磷酸钾溶液(pH 7.8)(300mL)；将温度控制在30℃，搅拌速度为250rpm。可以在反应器的顶部空间通入氮气或者喷射到液体中以将反应溶液中的氧气浓度降到最小。监控pH，并使之在反应过程中在7.5-7.8。在一些试验中，加入洗涤剂吐
Figure A200780027087D00422
80以将酶沉淀降低到最小。加入酶溶液引发反应，其中纯化的睾丸酮丛毛单胞菌proA醛缩酶的浓度为0.05g/L，HIS6-HEXaspC转氨酶的浓度为0.5g/L。磷酸钾的终浓度为25mM，所述的磷酸钾包括来自酶溶液中的磷酸钾。在3-5小时时，向反应器加入第二等份的50mM L-色氨酸。通过检测L-色氨酸、L-丙氨酸、莫那亭、莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。对于色氨酸、莫那亭、丙氨酸，采用柱后荧光衍生化方法检测。采用砷酸盐-硼酸盐分光光度方法分析吲哚-3-丙酮酸的浓度。该方法不能进行定量，但能够定性地监测吲哚-3-丙酮酸的减少或者形成。所有的分析方法描述在实施例6中。
超滤：过夜孵育(18-24小时)后，通过超滤将蛋白质从反应混合物中移去。将反应混合物在隔绝空气的情况下转移到超滤搅拌室(ultrafiltrationstirred cell)中，在密闭的瓶中收集脱除了蛋白质的溶液，所述瓶在使用之前用氮气吹扫除去了氧气。在超滤步骤中，保持覆盖氮气。然后将等份的脱蛋白质的反应溶液(200mL)在隔绝空气的情况下转移到0.7L的发酵罐中。可供选择地，可以使用
Figure A200780027087D00431
超滤膜组件(cartridge)通过将反应混合物经过膜组件循环而从反应混合物中脱除蛋白质，并在第二个密闭的用氮气净化的0.7L反应器中收集渗透物。
混合物2(第二反应混合物)：向脱除了蛋白质的溶液加入过量的L-丙氨酸(使L-丙氨酸的初始浓度为0.5M或1.5M，如下文的表2所述)和0.5g/L纯化的HIS6-HEXaspC转氨酶。将温度保持在30℃、pH为7.5-7.8，和搅拌速度为250rpm。将氮气持续地通入到顶端空间以保持厌氧的环境。通过检测L-色氨酸、L-丙氨酸、莫那亭、莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。按照如实施例6中所述的砷酸盐-硼酸盐分光光度方法分析吲哚-3-丙酮酸的减少。典型反应的结果如表2所示。
表2：实验室规模制备S，S-莫那亭
Figure A200780027087D00432
表2的结果表明：当向脱除蛋白质的反应混合物1中加入过量的氨基供体(L-丙氨酸)和转氨酶时，形成的S，S-莫那亭可以增加到1.7-倍。
在这种条件下，存在反应混合物1中的大量莫那亭前体被胺化形成莫那亭，而吲哚-3-丙酮酸被转化为更稳定的色氨酸(如表2所示的色氨酸浓度的增加)。与小规模的反应1相比，实验室规模的方法产生的莫那亭的滴度增加的原因至少部分是由于从反应混合物中除去了氧气以及增加的反应温度。尽管在小规模和实验室规模的方法中均加入洗涤剂以将蛋白质的沉淀降低在最小，但当存在洗涤剂时在较大规模的反应中没有显著的产品浓度增加，这和在小规模的方法中观察到的一样。
实施例6、莫那亭、莫那亭前体、色氨酸、丙氨酸、丙酮酸、HMO、HMG、和吲哚-3-丙酮酸的检测
LC/MS/MS多级反应检测(Multiple Reaction Monitoring，MRM)分析莫那亭和色氨酸。
使用
Figure A200780027087D00441
液相色谱串联质谱(LC/MS/MS)仪器对从生化反应得到的混合物进行莫那亭和色氨酸分析，该仪器包括Waters2795液相色谱仪，该Waters2795液相色谱仪具有顺序放置在色谱仪和
Figure A200780027087D00442
Quattro 
Figure A200780027087D00443
三重四极杆质谱仪之间的Waters 996光电二极阵列(Waters996 Photo-Diode Array(PDA))吸光度检测器。LC分离是在40℃下使用Xterra MS C8反相色谱柱(2.1mm×250mm)而进行的。LC流动相由A)和B)组成，所述A)为含有(i)0.05％(体积/体积)的三氟乙酸或者(ii)0.3％的甲酸和10mM的甲酸铵的水，所述B)为含有(i)0.05％(体积/体积)的三氟乙酸或者(ii)0.3％的甲酸和10mM的甲酸铵的甲醇。
如果LC流动相由A)含有0.05％(体积/体积)的三氟乙酸的水，和B)含有0.05％(体积/体积)的三氟乙酸的甲醇组成，梯度洗脱过程为：0-4分钟，5％B-35％B线性洗脱；4-6.5分钟，35％B-60％B线性洗脱；6.5-7分钟，60％B-90％B线性洗脱；7-11分钟，90％B等度洗脱；11-12分钟，90％B-95％B线性洗脱；12-13分钟，95％B-5％B线性洗脱；在每两次洗脱之间再平衡2分钟。流速为0.25毫升/分钟，在200-400nm监测PDA吸光度。所有的ESI-MS参数的优化和选择是基于被研究的分析物的质子化分子离子([M+H]+)的产生、以及特征片段离子的形成。下列仪器参数用于莫那亭和色氨酸的LC/MS/MS多级反应监测(MRM)分析：毛细管(Capillary)：3.5kV；锥管(Cone)：40V；Hex 1：20V；孔(Aperture)：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：500L/h；锥管气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口(entrance)：-5V；碰撞能量：8；出口(exist)：1V；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：3.5；倍增器：650。使用五个莫那亭特异性母-子MRM跃迁(transition)特异性检测体外反应的莫那亭。监测的跃迁为：从293.1到158.3、从293.1到168.2、从293.1到211.2、从293.1到230.2、和从293.1到257.2。用从204.7到146.4的MRM跃迁来监测色氨酸。对于莫那亭和色氨酸的内部标准定量，分析具有四个不同的分析物与d5-色氨酸和d5-莫那亭的比例的四个校准标准物。将这些数据进行线性最小平方分析，以形成莫那亭和色氨酸的标定曲线。向各样品中添加固定量的d5-色氨酸和d5-莫那亭(根据WO03/091396A2的方法由d5-色氨酸来合成d5-莫那亭)，结合使用响应率(莫那亭/d5-莫那亭；色氨酸/d5-色氨酸)与上述标定曲线来计算混合物中各分析物的量。
如果LC流动相为A)含有0.3％甲酸和10mM甲酸铵的水，和B)含有0.3％甲酸和10mM甲酸铵的甲醇，梯度洗脱过程为：0-8.5分钟，5％B-45％B线性洗脱；8.5-9分钟，45％B-90％B线性洗脱；9-12.5分钟，90％B-90％B等度洗脱；12.5-13分钟，95％B-5％B线性洗脱；在每两次洗脱之间再平衡4分钟。流速为0.27毫升/分钟，在210-400nm监测PDA吸光度。所有的ESI-MS参数优化和选择是基于产生的被研究的分析物的质子化分子离子([M+H]+)、以及形成的特征片段离子。用于此第二种流动相的仪器参数与上述相同。使用四个莫那亭特异性母-子MRM跃迁和一个色氨酸特异性母-子跃迁特异性检测体外和体内反应的莫那亭。监测的跃迁为：从293.1到158.0、从293.1到168.0、从293.1到211.5、和从293.1到257.0。用从205.2到146.1的MRM跃迁来监测色氨酸。对于莫那亭和色氨酸的内部标准定量，分析含有各个分析物与d5-色氨酸和d5-莫那亭的四个不同比例的四个标定标准物。将这些数据进行线性最小平方分析，以形成莫那亭和色氨酸的标定曲线。向各样品中添加固定量的d5-色氨酸和d5-莫那亭(根据WO03/091396 A2的方法由d5-色氨酸来合成d5-莫那亭)，结合使用响应率(莫那亭/d5-莫那亭；色氨酸/d5-色氨酸)与上述标定曲线来计算混合物中各分析物的量。监测d5-色氨酸和d5-莫那亭的母-子质量跃迁(mass transition)分别为从210.2到151.1、和从298.1到172.0。
莫那亭的手性LC/MS/MS(MRM)测量
通过用1-氟-2，4-二硝基苯基-5-L-丙氨酸酰胺(FDAA)将莫那亭衍生化，接着用反相LC/MS/MS MRM测量来实现对生物化学反应合成的莫那亭的立体异构体分布的测定。
用FDAA对莫那亭的衍生化
向50μL样品或标准物中添加200μL 1％溶于丙酮中的FDAA溶液。添加40μL 1.0M的碳酸氢钠，在偶尔混合的情况下将混合物在40℃下孵育1小时。移出样品并冷却，并用20μL 2.0M的HCl中和(可能需要更多的HCl来中和缓冲的生物混合物)。完成脱气后，样品可以用于LC/MS/MS分析。
LC/MS/MS多级反应监测测定莫那亭立体异构体的分布
使用前几节所述的LC/MS/MS仪器来进行分析。LC分离能够分离莫那亭(特别是FDAA-莫那亭)的全部四种立体异构体，所述LC分离在40℃下在Phenomenex 
Figure A200780027087D00461
2.0×250mm(3μm)C18反相色谱柱上进行。LC流动相由A)含有0.05％(质量/体积)的醋酸铵和B)乙腈组成。洗脱为：0-2分钟，13％B等度洗脱；2-15分钟，13％B-30％B线性洗脱；15-16分钟，30％B-80％B线性洗脱；16-21分钟，80％B等度洗脱；以及21-22分钟，80％B-13％B线性洗脱；在每两次洗脱之间再平衡8分钟。流速为0.23mL/分钟，在200-400nm监测PDA吸光度。所有的ESI-MS参数优化和选择是基于产生的FDAA-莫那亭的质子化分子离子([M-H]-)、以及特征片段离子的形成。
在负离子ESI/MS模式下使用下列仪器参数用于莫那亭的LC/MS分析：毛细管：2.0kV；锥管：25V；Hex 1：10V；孔：0V；Hex 2：0V；源温度：100℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂气体：500L/h；锥管气体：50L/h；低质量分辨率(Q1)：12.0；高质量分辨率(Q1)：12.0；离子能量：0.2；入口：-5V；碰撞能量：20；出口：1V；低质量分辨率(Q2)：12；高质量分辨率(Q2)：12；离子能量(Q2)：3.0；倍增器：650。使用三个FDAA-莫那亭特异性母-子跃迁特异性检测体外和体内反应的FDAA-莫那亭。监测莫那亭的跃迁为：从543.6到268.2、从543.6到499.2、和从543.6跃迁到525.2。。确定FDAA-莫那亭立体异构体是基于与纯化的莫那亭立体异构体相比较的色谱保留时间以及质谱数据。
氨基酸(包括色氨酸、莫那亭、丙氨酸、和HMG)的液相色谱柱后荧光检测
对于色氨酸、莫那亭、和丙氨酸的方法
用于检测生物反应中的氨基酸的具有柱后荧光检测的液相色谱法Waters 2690 LC系统或者组合有Waters 474扫描荧光检测器的类似系统和Waters柱后反应模块上进行(LC/OPA方法)。在60℃下在负载Interaction-Sodium的离子交换柱上进行LC分离。流动相A为Pickering Na328缓冲液(Pickering Laboratories，Inc.；MountainView，CA)。流动相B为Pickering Na740缓冲液。梯度洗脱过程为：0-20分钟，0％B-100％B；20-30分钟，100％B等度洗脱；和30-31分钟，100％B-0％B线性洗脱；每两次洗脱之间再平衡20分钟。流动相的流速为0.5mL/分钟。OPA柱后衍生溶液的流速为0.5毫升/分钟。荧光检测器的激发波长(EX)设定为338nm和发射波长(Em)为425nm。使用正亮氨酸作为分析的内标物。氨基酸的鉴定是基于纯化标准物的色谱保留时间数据。
对于HMG的方法
采用含有C18作为填充原料的固相提取(SPE)组件以0.6％乙酸作为洗脱液纯化来自生物化学反应的样品。然后将收集来自SPE的级分(fraction)的体积调到已知的体积，然后采用荧光检测器和HPLC柱后邻苯二甲醛(OPA)衍生物化进行分析。可以依次采用Waters2695液相色谱系统和两个Phenomenex AquaC18柱(2.1mm×250mm柱具有5μm的颗粒；2.1mm×150mm柱具有3μm的颗粒)进行色谱分离。柱温为40℃，并且柱的等度洗脱流速为0.18mL/min。流动相为0.6％的乙酸。OPA柱后衍生化和检测系统由Waters Reagent Manager(RMA)、反应线圈室(reaction coilchamber)、用于控制反应线圈室的温度控制模块，以及Waters 2847Florescent检测器组成。OPA流速设定为0.16ml/min，并且反应线圈室的温度设定为80℃。荧光检测器的激发波长设定为348nm和发射波长为450nm。按照实验的需要设定其它的参数控制检测器的灵敏度(例如，信号的增加和减弱)。HMG的定量基于谷氨酸的摩尔相应(molarresponse)。
通过LC-UV/Vis检测莫那亭(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氨基戊二酸)和色氨酸
使用Waters2690液相色谱系统和2.1mm×150mm Agilent EclipseXDB-C18 5.0μm反相色谱柱进行液相色谱分离，其中，流速为0.22ml/min，梯度条件如下：
 
时间(min) A％ B％
0.0 95 5
4.5 40 60
11.0 5 95
11.5 95 5
20.0 95 5
流动相A为0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵，流动相B为在50/50(体积/体积)甲醇/乙腈中的0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵。柱温为40℃。采用Waters 996光电二极管阵列(PDA)在280nm下进行检测。通常采用的校准范围为10-500ppm。
采用LC/MS检测莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)
采用Waters 2690液相色谱系统和2.1mm×50mm Agilent EclipseXDB-C18 1.8μm反相色谱柱进行液相色谱分离，其中，流速为2.5mL/min，梯度条件如下：
 
时间(min) A％ B％
0.00 95 5
0.2 95 5
1.2 5 95
4.5 5 95
5.0 95 5
10 95 5
流动相A为0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵，流动相B为在50/50(体积/体积)甲醇/乙腈中的0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵。柱温为40℃。
以负电喷雾电离模式(-ESI)操作的Micromass ZQ四极质谱仪的参数按以下设置：毛细管：2.2kV；锥管：35V；提取器(Extractor)：4V；RF透镜：1V；源温度：120℃；去溶剂化温度：380℃；去溶剂化气体：600L/h；锥管气体：关闭(Off)；低质量分辨率：15.0；高质量分辨率：15.0；离子能量：0.2；倍增器：650。建立单离子监控MS试验选择性地检测m/z 290.3、210.3、184.3、和208.4。m/z 208.4是内标d5-色氨酸的脱质子的分子[M-H]-离子。
采用LC/MS/MS检测莫那亭的前体
采用Waters液相色谱系统和2.1mm×50mm Agilent Eclipse XDB-C181.8μm反相色谱柱进行液相色谱分离，其中，流速为0.25mL/min，梯度条件如下：
 
时间(分钟) A％ B％
0.00 95 5
0.7 95 5
3.0 5 95
4.0 5 95
4.3 95 5
6.0 95 5
流动相A为0.3％(体积/体积)的甲酸和10rmM的甲酸铵，流动相B为在50/50(体积/体积)甲醇/乙腈中的0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵。柱温为40℃。
以负电喷雾电离模式(-ESI)操作的用于LC/MS/MS多级反应监测(MRM)试验的Waters Premier XE三重四极杆质谱仪的参数按以下设置：毛细管：3.0kV；锥管：25V；提取器：3V；RF透镜：0V；源温度：120℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：650L/h；锥管气体：47L/小时；低质量分辨率(Q1)：13.5；高质量分辨率(Q1)：13.5；离子能量(Q1)：0.5V；入口：1V；碰撞能量：18V；出口1：19；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：2.0；倍增器：650。检测四个母-子MRM跃迁以选择性地检测莫那亭前体(MP)和d5-莫那亭前体(d5-MP)；d5-MP被用作内标(I.S.)。所述四个MRM跃迁为：从290.1到184.1、从290.1到210.1、从290.1到228.1、和从295.1到189.1。这些跃迁中的两个跃迁(对于MP为从290.1到184.1，对于d5-MP为从295.1到189.1)被用于形成标准曲线以及用于定量的目的。从290.1到210.1和从290.1到228.1被用于定性地第二次确定MP。
采用具有折射率检测的HPLC确定丙酮酸
采用具有折射率检测器的高效液相色谱(HPLC)系统检测丙酮酸和其它的有机酸(例如，α-酮戊二酸)。该系统由Waters 2690和Waters 2414折射率检测器组成。
在一些情况下，采用
Figure A200780027087D00501
 HPX-87H、300 x 7.8mm离子排除柱并在35-60℃等度洗脱以分离化合物。洗脱液为0.01N硫酸水溶液，流速为0.5-0.6mL/min。待分析的样品用流动相稀释以保证酸为未离解的形式。在将样品通过0.2μm过滤器过滤后对样品进行分析。注射体积为10μL。建立丙酮酸浓度为0.6-5g/L的具有良好线性关系的标准曲线用于每种酸。
在实施例中描述的下游过程中，采用Waters 2690液相色谱系统和两个4.6mm×250mm Restek Aqueous Allure-C18 5.0μm反相色谱柱，在流速为0.8mL/min的条件下进行液相色谱分离。流动相为50mM磷酸盐缓冲液(用磷酸将pH调节到2.5)，在等度条件下进行。柱温为50℃。RI检测器在50℃下运行，且灵敏度设定为32。采用500-2500ppm的标准曲线。
采用四硼酸钠检测吲哚-3-丙酮酸
该方法检测烯醇式吲哚-3-丙酮酸的硼酸盐复合物。
将标准溶液或者含有吲哚-3-丙酮酸的反应混合物样品(0.005mL)分别加入到置于96-孔微滴定板的0.2mL的含有0.5mM EDTA和0.5mM砷酸钠的50mM四硼酸钠(pH 8.5)中。然后将微滴定板30℃下孵育，然后在327nm检测吸收值。由于产生的颜色不稳定，因此，所有的检测均应在加入吲哚-3-丙酮酸溶液后的恰好第30分钟时进行。采用溶解在100％的乙醇中的吲哚-3-丙酮酸(0-10mM)作为标准曲线。在两个分析之间时将这些溶液保存在-20℃。
采用羟胺衍生方法和UPLC/MS分析HMO
HMO分析可以通过首先从预先稀释的生物反应样品中移出一个等份，然后通过使用对硝基苄基羟胺(NBHA)氢氯化物(用吡啶制备)在声波室温水浴中衍生25分钟。在衍生结束后，用水将反应混合物进一步稀释到已知的体积，然后进行超效液相色谱(ultra performance liquid chromatography)质谱(UPLC/MS)。在UPLC/MS系统中包括光电二极管阵列(PDA)检测器，设定为检测260-499nm波长区。使用前述的Waters UPLC系统和2.1mm×100mm Agilent EclipseXDB-C18 1.8μm反向色谱柱进行LC分离，流速为0.24ml/min以及使用的等度条件如下：
 
时间(分钟) A％* B％*
0.00 87 13
0.20 87 13
5.50 50 50
6.50 30 70
11 30 70
11.3 87 13
15.00 87 13
*流动相A为0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵，流动相B为在50/50(体积/体积)甲醇/乙腈中的0.3％(体积/体积)的甲酸和10mM的甲酸铵。柱温为45℃。
以负电喷雾电离模式(-ESI)操作的用于LC/MS扫描模式试验的WatersPremier XE三重四极杆质谱仪的参数按以下设置：毛细管：3.0kV；锥管：25V；提取器：3V；RF透镜：0V；源温度：120℃；去溶剂化温度：350℃；去溶剂化气体：650L/h；锥管气体：47L/小时；低质量分辨率(Q1)：13.5；高质量分辨率(Q1)：13.5；离子能量(Q1)：0.5V；入口：30V；碰撞能量：3V；出口1：30；低质量分辨率(Q2)：15；高质量分辨率(Q2)：15；离子能量(Q2)：2.0；倍增器：650。为了对HMO-NBHA和2-氧基谷氨酸(oxoglutamic)-NBHA衍生物进行定性检测，采用的MS方法的质量扫描范围为120m/z到1000m/z。HMO-NBHA的定量基于2-氧基谷氨酸(oxoglutamic)-NBHA衍生物在波长为275nm处检测的摩尔响应。
实施例7、球形芽孢杆菌(B.sphaericus)D-丙氨酸转氨酶的表达和纯化
使用OvernightExpressTM System II(EMD Biosciences/Novagen；Madison，WI)培养细胞和诱导基因表达。所有其它的原料与HIS6-HEXaspC转氨酶的纯化中所使用的那些物质相同。
编码球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶的基因的克隆描述在美国专利公开No.2006/0252135的实施例20中，该专利通过引用加入本文。
在摇瓶中使用含有50μg/mL的卡那霉素的Ovemight ExpressTM SystemII(溶液1-6)制备具有氨基末端HIS6-纯化标记的球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶。该表达系统诱导IPTG-可诱导系统的表达而不需要监测细胞的生长。在接种200mL等份(在1L培养瓶中)的来自BL21(DE3)::球形芽孢杆菌dat
pET30a的液态培养物或其甘油储液的培养物后，在30℃下以转速为225rpm摇动过夜对培养物进行培育。当OD600大于6时，采用具有JS-16.25转头的Beckman(Fullerton，CA)J25II离心机在转速为10,000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞体用冷的缓冲液洗涤一次，然后将细胞再离心一次。收集洗涤后的细胞，并且立即使用或者在-80℃下保存直到用于纯化。为了制备含有球形芽孢杆菌HIS6-D-丙氨酸转氨酶(HIS6-BsphDAT)蛋白质的无细胞提取物，将细胞悬浮在3-4体积的50mM磷酸钾溶液(pH 7.8，含有50μM PLP)中，然后使用Microfluidics(Newton，MA)匀浆器(20,000psi，3次)破碎细胞，在此过程中，保持悬浮物的温度低于15℃。可供选择地，使用含有1μL/mL
Figure A200780027087D00521
 Nuclease(EMD Bioscience)，5μL/mL ProteaseInhibitor Cocktail Set II(EMD Bioscience)和0.33μL/mL rLysozymeTM(EMDBioscience)的Novagen BugBuster(无伯胺(primary amine free))ExtractionReagent(EMD Bioscience；Madison，WI)按照厂商推荐的方案制备细胞提取物。在二者情况下，通过具有JS-25转头的Beckman J25II离心机在转速为15,000rpm离心30分钟除去细胞碎片，获得无细胞提取物。HIS6-标记的蛋白质的随后的所有纯化步骤在4℃下进行。将来自600mL的OvernightExpress II培养物的无细胞提取物加入到GE Healthcare(Piscataway，NJ)Chelating SepharoseTM Fast Flow Resin(镍(II)形式)的2个40-45mL柱中，在此之前将该柱用含有200mM的氯化钠和50μM的PLP的100mM磷酸钾(pH 7.8)平衡。装载样品后，用3-5倍体积的平衡缓冲液、3-5倍体积的含有25mM的咪唑的平衡缓冲液、3-5倍体积的含有50-100mM的咪唑的平衡缓冲液和3-5倍体积的含有500mM的咪唑的平衡缓冲液连续地洗涤/洗脱所述柱。在最后一次洗涤中洗脱下HIS6-BsphDAT蛋白质。用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10kDa)将500mM的咪唑洗涤液浓缩。先用100mM的pH为7.8的磷酸钾(含有50μM PLP)溶液平衡一次性GE Healthcare PD10柱后，通过该柱除去咪唑和氯化钠。
使用Pierce BCATM分析试剂盒(Rockford，IL)测定脱盐溶液中的蛋白质浓度。使用Bio Rad(Hercules，CA)Experion Pro260微毛细管芯片系统或利用4-15％的SDS-PAGE梯度凝胶电泳来测定各级分的纯度和在无细胞提取物中的表达水平。通常，该方法产生约300mg的酶(从600mL的OvernightExpress II培养物中)，所述酶的纯度通过Experion软件估算为约90％。在使用前将等份(1-5mL)纯化的酶储存在-80℃下。
实施例8、醛缩酶的表达和纯化
原料
使用OvemightExpressTM System II(EMDBiosciences/Novagen；Madison，WI)培养细胞和诱导基因表达。所有其它的原料与HIS6-HEXaspC转氨酶的纯化中所使用的那些物质相同。
编码醛缩酶的基因的克隆描述在美国专利公开No.2006/0252135的实施例3中，该专利全文通过引用加入本文(本文中提到的醛缩酶相应于该文献中的SEQ ID NO：22)。
在摇瓶中使用含有50μg/mL的卡那霉素的Overnight ExpressTM SystemII(溶液1-6)制备具有氨基末端HIS6-纯化标记的醛缩酶。该表达系统诱导IPTG-可诱导系统的表达而不需要监测细胞的生长。在接种200mL等份(在1L培养瓶中)的来自构建体的液态培养物或其甘油储液的培养物后，在30℃下以转速为225rpm摇动过夜对培养物进行培育。当OD600大于6时，采用具有JS-16.25转头的Beckman(Fullerton，CA)J25II离心机在转速为10,000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞体用冷的缓冲液洗涤一次，然后将细胞再离心一次。收集洗涤后的细胞，并且立即使用或者在-80°C下保存直到用于纯化。使用含有1μL/mL  Nuclease(EMD Bioscience)、5μL/mL Protease Inhibitor Cocktail Set II(EMD Bioscience)和0.33μL/mLrLysozymeTM(EMD Bioscience)的Novagen BugBuster(无伯胺(primary aminefree))Extraction Reagent(EMD Bioscience；Madison，WI)按照厂商推荐的方案制备无细胞提取物。通过具有JS-25转头的Beckman J25II离心机在转速为15,000rpm离心30分钟除去细胞碎片，获得无细胞提取物。HIS6-标记的蛋白质的随后的所有纯化的步骤在4℃下进行。将来自800mL的Overnight Express II培养物的无细胞提取物加入到GE Healthcare(Piscataway，NJ)Chelating SepharoseTM Fast Flow Resin(镍(II)形式)的柱中，在此之前将该柱用含有200mM的氯化钠的100mM磷酸钾(pH 7.8)平衡。装载样品后，用3-5倍体积的平衡缓冲液、3-5倍体积的含有25mM的咪唑的平衡缓冲液、3-5倍体积的含有50-100mM的咪唑的平衡缓冲液和3-5倍体积的含有500mM的咪唑的平衡缓冲液连续地洗涤/洗脱所述柱。在最后一次洗涤中洗脱下HIS6-标记的蛋白质。用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10 kDa)将500mM的咪唑洗涤液浓缩。先用100mM的pH为7.8的磷酸钾(含有200mM氯化钠和4mM MgCl2)溶液平衡一次性GE Healthcare PD10柱后，通过该柱除去咪唑和氯化钠。使用Pierce BCATM分析试剂盒(Rockford，IL)测定脱盐溶液中的蛋白质浓度。使用Bio Rad(Hercules，CA)Experion Pro260微毛细管芯片系统或利用4-15％的SDS-PAGE梯度凝胶电泳来测定各级分的纯度和在无细胞提取物中的表达水平。通常，该纯化方法产生约18-20mg的酶(从800mL的Overnight Express II培养物中)，所述酶的纯度通过Experion软件估算为85-90％。在使用前将等份(1-5mL)纯化的酶储存在-80℃下。
实施例9、采用两步反应从D-色氨酸和丙酮酸小规模地生物催化制备R，R-莫那亭
原料
所有的试剂为分析纯或者为可商购的纯度最高的产品。用于催化形成R，R-莫那亭的球形芽孢杆菌HIS6-标记的D-丙氨酸转氨酶和HIS6-标记的醛缩酶按照实施例7和8所述的方法进行纯化。
方法和结果
建立了从D-色氨酸和丙酮酸小规模地生物催化制备R，R--莫那亭的方法。该方法除去了反应混合物中的氧气从而将氧气催化的中间产物吲哚-3-丙酮酸的降解降到最少。在10mL的具有塞子和铝封条的玻璃瓶中进行酶反应。
反应1：在100mL的血清瓶中制备含有200mM丙酮酸钠、4mMMgCl2、和50μM PLP的磷酸钾溶液(pH7.8)；将瓶塞住并密封好，然后用氮气吹扫液体几分钟。然后将等份的这种溶液在隔绝空气的情况下转移到含有固体D-色氨酸的10-mL血清瓶中。这些10-mL瓶在使用之前用塞子和铝封条密闭，并随后用氮气吹扫。加入酶溶液引发反应(终体积为7mL)，其中纯化的HIS6-醛缩酶的浓度为0.05g/L，对于HIS6-D-丙氨酸转氨酶的浓度为0.5g/L。磷酸钾的终浓度为25mM，所述的磷酸钾包括来自酶溶液中的磷酸钾。D-色氨酸的终浓度为100mM。反应瓶在室温下孵育并温和地混合，在加入酶后5小时和20小时取样。通过向一些反应混合物中加入0.1％和0.01％的洗涤剂检测洗涤剂吐温-80对于酶的稳定效应。通过检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫那亭、R-莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。采用柱后荧光衍生方法检测色氨酸、丙氨酸和莫那亭的浓度。所有的分析方法均描述在实施例6中。
采用Amicon Ultra-15离心过滤设备(MWCO 10 kDa)通过超滤将过夜孵育的蛋白质从反应混合物中移去。
反应2：将脱除蛋白质的溶液加入到含有固体D-色氨酸的10-mL血清瓶中。这些10-mL瓶在使用之前用塞子和铝封条密闭，并随后用氮气进行吹扫。加入酶HIS6-D-丙氨酸转氨酶(终浓度为0.5mg/mL)引发反应(终体积为5mL)。D-丙氨酸的终浓度为1500mM。反应瓶在室温下孵育并温和地混合，在加入酶后4小时和20小时取样。通过检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫那亭、R-莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。采用柱后荧光衍生方法检测色氨酸、丙氨酸和莫那亭的浓度。采用LC-RI方法确定丙酮酸的浓度并采用柱进行分离。所有的分析方法均描述在实施例6中。
表3：采用两步反应小规模地制备R，R-莫那亭以提高莫那亭的滴度
Figure A200780027087D00562
实施例10、球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶的固定化
按照实施例7所述的HIS6-标记蛋白纯化的方法纯化球形芽孢杆菌D-丙氨酸转氨酶。
按照Mateo等人(2002)的方法将酶固定到
Figure A200780027087D00563
 C250L树脂颗粒上。向48mg的纯化的酶(5.2mL，9.3mg/mL)中加入磷酸钾，使磷酸钾的终浓度为0.5M以及pH为7.8，磷酸吡哆醛(PLP)的终浓度为0.05mM。将得到的溶液与0.4g的购自Sigma-Alrich(St.Louis，MO)的
Figure A200780027087D00564
C 250L树脂混合。在环境温度下温和地搅拌酶-树脂悬浮液过夜。以4000×g离心5分钟将树脂颗粒与酶溶液分离。移去上清后，用3×5mL的含有0.05mM PLP的100mM磷酸钾(pH 7.8)洗涤树脂。在洗涤之间将混合物以4000×g离心5分钟。结合到树脂上的蛋白质的量通过待固定的蛋白质的最初量减去每次洗涤液中的蛋白质的总量确定。使用Pierce BCATM Protein分析试剂盒，并用牛血清白蛋白作为标准(Rockford，IL)检测蛋白质的浓度。最后将洗涤后的固定化酶颗粒悬浮在3mL的含有0.05mM PLP的100mM磷酸钾(pH 7.8)中。通过与1.4M甘氨酸在环境温度下温和地搅拌孵育，将固定化酶颗粒的未反应的环氧基封闭。在24小时后，用4×10mL的含有0.05mM PLP的50mM EPPS(pH 8.4)洗涤颗粒，以除去过多的甘氨酸，并最后重悬浮在5mL的含有0.05mM PLP的50mM EPPS(pH 8.4)中。固定化酶的终浓度为66mg蛋白质/树脂颗粒。
参考文献：Mateo，C.，Abain，O.，Fernandez-Lorente，G.，Pedroche，J.，Fernandez-Lafuente，R.，Guisan，J.M.，Tam，A.，and Daminati，M.，Biotechnology Progress 18(3)：629-634(2002).
实施例11、编码如SEQ ID NO：2的醛缩酶的SEQ ID NO：1的醛缩酶基因的克隆
将编码SEQ ID NO：2醛缩酶的基因(基因的DNA序列如SEQ ID NO：1)亚克隆到具有pET28b表达载体(EMDBiosciences/Novagen，Madison，WI)中，该载体具有用于纯化酶的N-末端His-标记。还将该基因克隆到pET30a(没有标记)。
用于克隆的引物如下：
5′-ATAAGACATATGCCTATCGTTGTTACGAAG-3′(Nde I限制位点)(SEQ ID NO：5)和
5′-ATAAGAGGATCCTTATT CCTCGGGCAGCCGCTC-3′(BamH I限制位点)(SEQ ID NO：6)。
含有SEQ ID NO：1的克隆从Diversa Corporation，San Diego，CA获得，并用作PCR的模板。不过本领域的普通技术人员可以通过其它方法重组得到SEQ ID NO：1。例如，可以采用合成PCR方法重新构建SEQ ID NO：1。通过PCR扩增SEQ ID NO：1，用限制酶NdeI和BI消化，然后用琼脂糖凝胶(
Figure A200780027087D00571
 Gel extraction Kit(Qiagen，Valencia，CA))纯化。将消化物连接到已经用Nde I和BamH I消化并用凝胶纯化的pET28b(EMDBiosciences/Novagen Madison，WI)和pET30a中。将连接物转化到TOP10大肠杆菌细胞(Invitrogen，Carlsbad，CA)中。使用琼脂糖凝胶电泳比较片断的大小分析来自克隆的质粒DNA中是否存在插入片断。对具有预定大小的插入物的分离物进行DNA序列分析(Agencourt，Beverly，MA)。
编码SEQ ID NO：2的醛缩酶的SEQ ID NO：1基因的DNA序列如下：
atgcctatcg ttgttacgaa gatcgaccga cccagcgcgg cggacgtcga aaggatcgcc gcctatggtg
tcgcgacctt gcatgaagcg caaggacgaa ccgggttgat ggcgtccaat atgcgcccaa tctatcgccc
tgcgcacatt gccgggcccg cggtgacctg ccttgtggcg cctggcgaca attggatgat ccatgtcgcc
gtcgaacagt gccagccggg agatgtcctg gtcgtggtac cgaccagccc ctgcgaagac ggctatttcg
gcgatctgct ggcgacctcg ctgcggtcgc gcggggtcaa aggtctgatc atcgaggccg gcgtacgcga
tatcgcgaca ttgaccgaga tgaaattccc ggtctggtcc aaggcggtgt tcgcgcaagg aacggtcaag
gagaccatcg ccagcgtcaa tgtgcccctc gtctgcgcgg gcgcccgcat cgtgccgggc gatctgatcg
ttgccgacga cgacggggtc gtcgtgattc caagacgttc cgttccggcg gtcctttcca gcgccgaggc
ccgcgaagag aaggaagccc gcaaccgcgc ccgcttcgaa gctggcgagc tgggcctcga cgtctacaac
atgcgccagc gcctggccga caagggcttg cgctatgtcg agcggctgcc cgaggaatag(SEQ IDNO：1).
SEQ ID NO：2的醛缩酶的蛋白质序列如下：
Met Pro Ile Val Val Thr Lys Ile Asp Arg Pro Ser Ala Ala Asp Val Glu Arg Ile Ala
Ala Tyr Gly Val Ala Thr Leu His Glu Ala Gln Gly Arg Thr Gly Leu Met Ala Ser
Asn Met Arg Pro Ile Tyr Arg Pro Ala His Ile Ala Gly Pro Ala Val Thr Cys Leu
Val Ala Pro Gly Asp Asn Trp Met Ile His Val Ala Val Glu Gln Cys Gln Pro Gly
Asp Val Leu Val Val Val Pro Thr Ser Pro Cys Glu Asp Gly Tyr Phe Gly Asp Leu
Leu Ala Thr Ser Leu Arg Ser Arg Gly Val Lys Gly Leu Ile Ile Glu Ala Gly Val
Arg Asp Ile Ala Thr Leu Thr Glu Met Lys Phe Pro Val TrpSer Lys Ala Val Phe
Ala Gln Gly Thr Val Lys Glu Thr Ile Ala Ser Val Asn Val Pro Leu Val Cys Ala
Gly Ala ArgIle Val Pro Gly Asp Leu Ile Val Ala Asp Asp Asp Gly Val Val Val
Ile Pro Arg Arg Ser Val Pro Ala Val Leu Ser Ser Ala Glu Ala ArgGlu Glu Lys
Glu Ala Arg Asn ArgAla Arg Phe Glu Ala Gly Glu Leu Gly Leu Asp Val Tyr
Asn Met Arg Gln Arg Leu Ala Asp Lys Gly Leu Arg Tyr Val Glu Arg Leu Pro
Glu Glu(SEQ ID NO：2).
实施例12、SEQ ID NO：2的醛缩酶的纯化
使用Overnight ExpressTM System II(EMD Biosciences/Novagen；Madison，WI)培养细胞和诱导基因表达。所有其它的原料与HIS6-HEXaspC转氨酶的纯化中所使用的那些物质相同。
编码SEQ ID NO：2的醛缩酶的基因的克隆描述在实施例11中。
在摇瓶中使用含有50μg/mL的卡那霉素的Overnight ExpressTM SystemII(溶液1-6)制备具有氨基末端HIS6-纯化标记的SEQ ID NO：2的醛缩酶。在接种200mL等份(在1L培养瓶中)的来自pET28b构建体的液态培养物或其甘油储液的培养物后，在30℃下以转速为225rpm摇动过夜对培养物进行培育。当OD600大于6时，采用具有JS-16.25转头的Beckman(Fullerton，CA)J25II离心机在转速为10,000rpm离心10分钟收集细胞。将细胞体用冷的缓冲液洗涤一次，然后将细胞再离心一次。收集洗涤后的细胞，并且立即使用或者在-80°C下保存直到用于纯化。使用含有1μL/mL 
Figure A200780027087D00591
Nuclease(EMD Bioscience)、5μL/mL Protease Inhibitor Cocktail Set II(EMDBioscience)和0.33μL/mL rLysozymeTM(EMD Bioscience)的NovagenBugBuster(无伯胺(primary amine free))Extraction Reagent(EMD Bioscience；Madison，WI)按照厂商推荐的方案制备含有HIS6-标记的SEQ ID NO：2醛缩酶的无细胞提取物。通过具有JS-25转头的Beckman J25II离心机在转速为15,000rpm离心30分钟除去细胞碎片，获得无细胞提取物。HIS6-标记的蛋白质的随后的所有纯化的步骤在4℃下进行。将来自2×200mL的Overnight Express II培养物的无细胞提取物加入到GE Healthcare(Piscataway，NJ)Chelating SepharoseTM Fast Flow Resin(镍(II)形式)的柱中，在此之前将该柱用含有200mM的氯化钠的100mM磷酸钾(pH 7.8)平衡。装载样品后，用3-5倍体积的含有25mM的咪唑的平衡缓冲液、3-5倍体积的含有50-100mM的咪唑的平衡缓冲液和3-5倍体积的含有500mM的咪唑的平衡缓冲液连续地洗涤/洗脱所述柱。在最后一次洗涤中洗脱下HIS6-标记的SEQ ID NO：2的醛缩酶。用Amicon(Billerica，MA)Centricon-70或Ultra-15离心过滤装置(MWCO 10kDa)将500mM的咪唑洗涤液浓缩。先用100mM的pH为7.8的磷酸钾溶液平衡一次性GE Healthcare PD10脱盐柱后，通过该柱除去咪唑和氯化钠。在脱盐步骤后，如果向洗脱缓冲液中加入4mM的MgCl2、200mM的NaCl、和/或0.01％的Tween-80，酶是微溶的(通过蛋白质的浑浊度判定)。使用Pierce BCA分析试剂盒(Rockford，IL)测定脱盐溶液中的蛋白质浓度。使用Bio Rad(Hercules，CA)Experion Pro260微毛细管芯片系统或利用4-15％的SDS-PAGE梯度凝胶电泳来测定各级分的纯度和在无细胞提取物中的表达水平。通常，该纯化方法产生约50-80mg的酶(从400mL的Overnight Express II培养物中)，所述酶的纯度通过Experion软件估酸为85-90％。在使用前将等份(1mL)纯化的酶储存在-80℃下。
实施例13、SEQ ID NO：2的醛缩酶的固定化
按照实施例12所述的HIS6-标记的蛋白质的纯化方法纯化SEQ IDNO：2的醛缩酶。
按照Mateo等人(2002)的方法将酶固定到
Figure A200780027087D00601
 C树脂颗粒上。向20.4mg的纯化的酶(14.1mL，浓度为1.45mg/mL)中加入磷酸钾，使磷酸钾的终浓度为0.5M以及pH为7.8，MgCl2的终浓度为1mM。将得到的溶液与0.2g的购自Sigma-Alrich(St.Louis，MO)的 C 250L树脂混合。在环境温度下温和地搅拌酶-树脂悬浮液过夜。以4000×g离心5分钟将树脂颗粒与酶溶液分离。移去上清后，用3×5mL的含有1mMMgCl2的100mM磷酸钾(pH7.8)洗涤树脂。在洗涤之间将混合物以4000×g离心5分钟。结合到树脂上的蛋白质的量按照实施例10中所述的来自球形芽孢杆菌中的转氨酶的固定的量的方法确定。最后将洗涤后的固定化酶颗粒悬浮在3mL的含有1mM MgCl2的100mM磷酸钾(pH 7.8)中。通过与1.4M甘氨酸在环境温度下温和地搅拌孵育，将固定化酶颗粒的未反应的环氧基封闭。在24小时后，用4×10mL的含有1mMMgCl2的50mMEPPS(pH 8.4)洗涤颗粒，以除去过多的甘氨酸，并最后重悬浮在5mL的含有l mmM MgCl2的50mM EPPS(pH 8.4)中。固定化酶的终浓度为90mg蛋白质/树脂颗粒。
实施例14、克隆的无纯化标签的SEQ ID NO：2的醛缩酶的表达
采用标准的分子生物学方法将SEQ ID NO：1的基因亚克隆到pET23d载体(Novagen，Madison，WI)的衍生物中，该载体含有大肠杆菌metE基因以及插入在NgoMIV限制位点和第二个psiI限制位点的启动子，所述的第二个psiI限制位点的加入是为了容易去除β内酰胺酶基因(bla)。含有肌醇加氧酶(myo-inositol oxygenase)的基因插入物的载体的构建描述在PCT WO2006/066072的实施例2和20中。通过DNA测序(Agencourt BioscienceCorporation；Beverly，MA)确定醛缩酶的插入物，并将具有正确插入序列的质粒转化到大肠杆菌表达宿主BW30384(DE3)ΔompTΔmetE中。这种表达宿主的构建和转化方法也描述在PCT WO 2006/066072(实施例21和22)中。在3L的发酵罐中用乳糖诱导醛缩酶基因的表达。诱导的方法描述在实施例1中。为了制备含醛缩酶的无细胞提取物，将细胞悬浮在3-4体积的100mM磷酸钾溶液(pH 7.8，含有1mM MgCl2)中，然后按照实施例2所述的方法破碎细胞。在4℃下以20,000-25,000×g离心30分钟除去细胞碎片。用B io-Rad Laboratories ExperionTM Automated Electrophoresis Station(Bio-Rad，Hercules，CA)分离无细胞提取物中的可溶蛋白质，并用Experion软件或者4-15％的梯度凝胶的SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析可溶蛋白质的表达百分比。
实施例15、在小发酵罐中采用两步反应从D-色氨酸和丙酮酸生物催化制备R，R-莫那亭
原料
所有的试剂为分析纯或者为可商购的纯度最高的产品。用于生物催化制备R，R-莫那亭的D-丙氨酸转氨酶购自Biocatalytics，Inc.(Pasadena，CA)(catalog # AT-103)；而在制备中使用的SEQ ID NO：2的醛缩酶按照实施例14所述的方法制备。
方法和结果
两步反应在0.7L INFORS(Bottmingen，Switzerland)生物反应器中以250mL进行。在顶部空间为氮气的条件下，pH为8.4和温度为25℃的条件下进行反应。
混合物1(第一反应混合物)：在发酵罐中制备含有25mMEPPS、1mMMgCl2，5mM磷酸钾和50μM磷酸吡哆醛(PLP)(pH 8.4)溶液。在以固体加入200mM丙酮酸钠和100mM D-色氨酸之前用氮气吹扫液体几分钟。在加入底物之后并在加入酶之前用氢氧化钠将pH调到8.4。将D-丙氨酸转氨酶以固体的形式加入至其终浓度为2mg/mL，而醛缩酶以无细胞提取物的形式加入至其终浓度为0.01mg/mL(在加入酶和底物后终体积为250mL)。将反应混合物在25℃下孵育，并以转速为250rpm摇动，且顶部空间为氮气。通过检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫那亭、R-莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。采用柱后荧光衍生化方法检测色氨酸和丙氨酸的浓度。采用LC/MS/MS方法对莫那亭进行定量。所有的分析方法均描述在实施例6中。超滤：过夜孵育后，采用Millipore 
Figure A200780027087D00621
 50cm2超滤膜组件(MWCO 10,000)(GE Healthcare，Piscataway，NJ)通过超滤将蛋白质从反应混合物中移去。在此过程中，保持第一发酵罐和接受渗透物的第二发酵罐中的氮气氛围，以排除氧气。
混合物2(第二反应混合物)：向脱除蛋白质的溶液(约230mL)中加入D-丙氨酸(终浓度为1M)和D-丙氨酸转氨酶(终浓度为2mg/mL)。将反应混合物在25℃下孵育，并以转速为250rpm摇动，且顶部空间为氮气。按照如上述的混合物1的方法进行反应过程追踪。
表4：在小的发酵罐中采用两步反应制备R，R-莫那亭以提高莫那亭的滴度
Figure A200780027087D00622
结果表明：当2-步方法以250mL的规模进行时，该方法能提高莫那亭的滴度超过2倍。
实施例16、采用两步反应和固定化酶从D-色氨酸和丙酮酸以小规模制备R，R-莫那亭
原料
用于催化制备R，R-莫那亭的球形芽孢杆菌HIS6-标记的D-丙氨酸转氨酶和HIS6-标记的SEQ ID NO：2的醛缩酶按照实施例10和13所述的方法固定。在Coy厌氧型室中进行反应，反应氛围为97-98％氮气和2-3％氢气以使得氧气催化的反应中间物的降解最小化
方法和结果
反应1：在Coy 30厌氧型室中使用脱气的H2O制备含有100mM丙酮酸钠、1mM MgCl2、和50μM PLP的50mM EPPS(pH 8.4)溶液。向该溶液中加入固态的D-色氨酸并使其终浓度为50mM。向该溶液中加入固定化酶溶液(终体积为4mL)，其中固定化的SEQ ID NO：2的醛缩酶的浓度为0.05g/L，固定化的转氨酶的浓度为2g/L。将反应混合物在室温下孵育，并温和地混合。通过检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫那亭、R-莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸的浓度追踪反应的进程。所有的分析方法均描述在实施例6中。对于莫那亭，采用LC/MS/MS方法，对于色氨酸和丙氨酸，采用柱后荧光衍生化方法。对于丙酮酸的分析，采用柱进行分离。
过夜孵育后，采用0.45微米的注射过滤器通过过滤从反应混合物中移去固定化酶。
反应2：向过滤的材料中加入固体D-丙氨酸(终浓度为1M)和固定化转氨酶(终浓度为2g/L)(终体积为5.1mL)。将反应混合物在室温下孵育，并温和地混合。通过HPLC和/或LC-MS分析、检测D-色氨酸、D-丙氨酸、R，R-莫那亭、R-莫那亭前体(2-羟基-2-(1H-吲哚-3-基甲基)-4-氧基-戊二酸)和丙酮酸追踪反应的进程。
表5：采用两步反应和固定化酶以小规模制备R，R-莫那亭
Figure A200780027087D00632
结果表明：当采用2-步反应方法时，莫那亭的滴度增加2倍。在第二步通过加入过量的D-丙氨酸并只存在D-转氨酶的情况下，约5.3mM莫那亭前体被转化为莫那亭，并且约28mM吲哚-3-丙酮酸被转化为色氨酸。
实施例17、超滤
原料
在得自Sartorius BBI Systems(Bethlehem，PA)的5L Biostat B发酵罐中在厌氧条件下制备3升反应混合物。标准的反应含有25mM的磷酸钾(pH7.8)、4mM的氯化镁、0.05mM的PLP、0.01％的吐温80、200mM的丙酮酸钠和100mM的L-色氨酸。向上述溶液中分别加入未纯化的HEXaspC转氨酶和纯化的睾丸酮丛毛单胞菌proA醛缩酶0.5g/L和0.05g/L。反应在氮气氛下进行，反应温度为30℃，转速为250rpm，溶液pH为7.8。在3-5小时后，再加入100mM丙酮酸钠和50mM L-色氨酸。在18-24小时后，终止反应，并在超滤前在4℃下厌氧保存。超滤在由GE Osmonics生产的SEPA CFII交叉流动平板膜部件(cross flow flat sheet membrane)上进行。试验的膜类型的一个实例为具有150cm2的表面积的Nadir C30 30 kDaMWCO的平板(Microdyn-Nadir Gmbh，Wiesbaden，Germany)。容器设被计为有利于氮气的吹扫和覆盖以将对于氧敏感的中间物质的分解降到最小。
方法和结果
在进行超滤操作前和后对莫那亭、丙氨酸、色氨酸、丙酮酸、I3P、MP进行分析。按照实施例6所述的LC-UV/Vis方法测定莫那亭和色氨酸的浓度。采用相同的LC-UV/Vis方法和标准曲线对MP进行半定量分析。按照实施例6所述的基于柱后荧光衍生化方法进行定量分析丙氨酸。与实施例6的色氨酸相比，基于吲哚-3-丙酮酸的峰面积，定性分析吲哚-3-丙酮酸。超滤操作的流速约为0.6gpm。不断地调节反流的背压使之保持为50-150psi。分析物的浓度列在表6中。用水重新稀释浓缩物流体以冲洗系统并获得更准确的分析。
表6：分析物的浓度
 
说明 罐中的体积 莫那亭(ppm) 色氨酸(ppm) 丙氨酸(ppm) 丙酮酸(ppm) MP(ppm) I3P(ppm)
进料、批次071306 3400 5742.6 10832.3 3235.0 2555.6 5461.5 874.1
超滤渗透物 2948.4 5115.0 9946.5 2903.9 2417.7 5006.9 585.4
超滤浓缩物 2580.2 1628.2 2517.4 451.1 629.4 1330.6 290.8
进料被浓缩8倍，所有成分的回收都非常好。渗透物的SDS-PAGE分析表明蛋白质成分被完全除去。
实施例18、阴离子交换
原料
使用来自Itochu Chemicals America，Inc.的43mL填充体积的乙酸盐型的ZGA313树脂进行阴离子交换纯化莫那亭。使用模拟溶液(mock solution)作为进料，该模拟溶液含有色氨酸、丙氨酸和莫那亭(其比例与用阳离子交换处理生物反应后的比例相似)。使用试剂级的乙酸钾(溶液浓度为3M)作为洗脱液。
方法和结果
加载溶液，然后在以相同速度进行洗脱前用去离子水以2.5mL/min的速度洗涤。将结果列在表7中。保守的单批负载容量计算为0.1g莫那亭/mL填充树脂。观察到莫那亭的高纯度和高回收率。在进行再次洗脱之前，少量没有结合的莫那亭被洗脱下来，而丙氨酸级分不能被完全地被冲洗下来。按照实施例17所述的方法测定分析物。
表7：结果
 
说明 体积 莫那亭(ppm) 色氨酸(ppm) 丙氨酸(ppm)
进料 2494 1897.1 5816.7 64717.3
洗涤 2739 192.8 5832.9 54250.4
洗脱液1，3M KOAc 1016 4285.1 0 42.8
实施例19、特殊膜(specialty membrane)纯化
原料
将3L不含蛋白质的超滤渗透物作为进料。用HCl将pH调解到7.36。超滤在由GE Osmonics生产的SEPA CFII交叉流动平板膜部件()上进行。试验的膜类型的一个实例为由ITT Aquios-PCI Membrane Systems，Inc.(Basingstoke，UK)生产的称为NP的膜。平板膜的表面积测定为150cm2。容器设被计为有利于氮气的吹扫和覆盖以将对于氧敏感的中间物质的分解降到最小。
方法和结果
在每一步的膜操作中使用实施例17所述的方法进行莫那亭、丙氨酸、色氨酸、丙酮酸、I3P和MP的分析。在初次浓缩后进行三次渗滤(diafiltration)。膜操作的流速约为0.4gpm。不断地调节反流的背压使之保持为100-400psi。分析物的浓度列在表8中。用水重新稀释浓缩物流体以冲洗系统并获得更准确的分析。
表8：分析物的浓度
 
说明 罐中的体积 莫那亭(g) 色氨酸(g) 丙氨酸(g) 丙酮酸(g) MP(g) I3P(g)
进料 3054.8 12.92 20.34 5.89 11.79 26.48 1.79
渗透物1 2051.6 0.94 8.68 2.46 8.92 5.67 1.04
浓缩物1 3024.1 10.67 9.93 2.38 4.40 17.36 1.24
渗透物2 2412.5 0.21 2.81 1.03 2.14 1.62 0.22
浓缩物2 3046.3 10.27 7.67 1.66 3.27 16.79 1.29
渗透物3 2542.9 0.26 2.82 0.77 1.82 1.71 0.20
浓缩物3 3074.8 10.13 5.67 1.04 2.23 16.10 1.20
渗透物4 2658.4 0.38 3.23 0.69 1.31 1.86 0.22
浓缩物4 918.1 9.90 4.53 0.52 1.53 14.81 0.91
NP膜表现出对莫那亭很强的截留并且能使更小的分子如丙氨酸和丙酮酸快速地通过。这使得该膜能显著地减少在下游纯化过程中的丙氨酸的负载量，因此是个很好的选择。此外，温和的条件对于回收各种成分并避免分解是很理想的。其它比较好的可以选择的膜包括NF270(FilmtecTM，theDow Chemical Company，Midland，Michigan)和NFB(ITT Aquios-PCIMembrane Systems，Inc.(Basingstoke，UK)。
实施例20、SDVB分离
原料
进料为含有莫那亭、色氨酸、丙氨酸和丙酮酸的模拟溶液，各种成分的浓度如表9所示。使用由Mitsubishi生产的合成的SDVB吸附树脂HP21将莫那亭从混合物中纯化。使用试剂极的乙醇和去离子水作为洗脱剂。柱的填充体积为98.7ml，柱的尺寸为：直径为1.5cm，高为55.9cm。
方法和结果
使用280nm处的吸光值追踪洗脱以及选择的级分。流速为2.5ml/min。树脂用pH为8.5的氢氧化钠水溶液平衡。收集4种级分进行分析，分析的结果列在表9中。用去离子水洗脱柱子以洗脱前三个级分。最后一种级分主要含有色氨酸，用10％乙醇水溶液进行洗脱。
表9：分析物的浓度
 
说明 体积 莫那亭(g) 色氨酸(g) 丙氨酸(g) 丙酮酸(g)
进料 49.5 0.43 0.53 0.42 0.47
洗脱 48.1 0.00 0.00 0.00 0.00
级分2 95.1 0.00 0.00 0.31 0.44
级分3 533.4 0.38 0.00 0.01 0.00
级分4，10％乙醇 603.4 0.01 0.32 0.00 0.00
在本方案种，主要的困难是将莫那亭与丙氨酸分离，尤其在给定的两步反应方案中采用了过量的丙氨酸以促进反应的进一步进行。适当的柱填料(sizing)对于这种分离是很关键的。很可能另一种类似的SDVB树脂会提供更大的容量并促进分离。这种可能的树脂包括由Mitsubishi提供的SP70或SP850，或者其它还未测试的树脂。使用10％乙醇加快了色氨酸的洗脱。可以将超滤渗透物直接加载到SDVB柱中，省去其它的纯化步骤，但这可能损失柱的相对容量。
相比较而言，使用SDVB树脂对阴离子树脂洗脱液进行脱盐可以获得相当高的加载速度，这可以从表10看出。
表10：脱盐的结果
 
说明 体积 莫那亭(g) 盐(g)
进料 200 1.95 81.18
级分1 410 0.00 69.80
级分2 256 0.04 0.05
级分3，约50％的乙醇 1040 1.82 0.00
为了用于脱盐，将由Mitsubishi提供的SP70树脂填充到103mL的柱中，该柱的尺寸为1.5cm×58.4cm。观察到了非常好的回收率和容量。最后的级分用50％的乙醇水溶液洗脱以降低峰托尾。莫那亭与盐的很好分离使得可以收集并回收很纯的莫那亭级分。
实施例21、电渗析
原料
使用实验室规模的电渗析设备进行该测试。所有的化学物质为试剂级。阳极电解液和阴极电解夜为1M的碳酸氢钠溶液。浓缩物溶液为0.1％氯化钠溶液。使用的膜为AMX和CMX。电极膜为Nafion膜。进料压力小于1psi。操作进行80分钟，并且在电压迅速上升时结束。在过程中两次降低电流以降低电势。将进料pH设定为7.4，并缓慢地升高至7.7，而将浓缩物的pH终止在7.2。用于进料的四种分析物的浓度列在表11中(按照实施例17所述的方法进行检测)。
方法和结果
物质平衡最终分析表明只有丙酮酸有显著的分子迁移，而其它三种分析物在操作时被吸附在膜上并在效率测试时被滤去。推测尽管采用具有最高扩散率的膜进行测试，但绝大多数的分子太大而不能通过膜，尤其是莫那亭。测试了几种其它的pH′s和膜，获得类似的结果。但是，能够选择性分离高浓度的丙酮酸使得这在设计下游处理方法中是令人关注的选择。由于丙氨酸与丙酮酸在大小上很相似，希望能够找到一种膜，该膜在适当的条件下可以使丙氨酸扩散出去。
表11
 
描述 体积(mL) 莫那亭(ppm) 色氨酸(ppm) 丙氨酸(ppm) 丙酮酸(ppm)
进料，t＝0，pH 7.4 235 4433.7 6337.1 564635.6 3740.5
浓缩物，t＝0 505 0 0 0.0 26.7
进料，t＝20 245 4208.9 6166.3 549417.3 2171.1
浓缩物，t＝20 495 0 0 0.0 749.9
进料，t＝50 255 4165.7 6431.5 573046.7 926.7
浓缩物，t＝50 475 119.3 0 0.0 1343.8
最后的进料 270 3017.5 4991.137 444710.3 536.2
最后的浓缩物 457 157.9 0 0.0 1649.5
来自效率测试的进料 490 20.5 26.1 2325.5 0.0
来自效率测试的浓缩物 510 51.5 13.8 1229.6 0.0
电解液 500 0 0 0.0 0.0
实施例22、阳离子交换
可以设想使用强阳离子交换树脂用一步将莫那亭从其它反应成分(包括其它的氨基酸)中纯化。优选的树脂为酸型的强酸阳离子交换树脂。加载除去蛋白质的反应混合物后，有机酸化合物被洗脱下来，只剩下结合在柱子上的氨基酸。根据等电点的不同采用分步梯度(step gradient)分别洗脱氨基酸。所述分级梯度可以包括各步为pH2.5、3、3.1和4的柠檬酸缓冲液或者磷酸盐缓冲液。由于莫那亭的pI为约3.9，而色氨酸和丙氨酸的pI接近6，莫那亭首先被洗脱下来。可以参见，例如MCI 
Figure A200780027087D00691
 TechnicalInformation 2004-2005，Mitsubishi Chemical Corporation，第7页。
实施例23、阳离子交换
原料：用950ml填充体积的质子型AG50Wx8阳离子交换树脂填充直径为7.5cm的柱子。AG50Wx8由Rohm and Haas(Philadelphia，PA)生产，但从Bio-Rad(Hercules，CA)获得。将1升的超滤生物反应混合物以流速为140mL/min加载到柱中。使用去离子水作为洗涤液。用1M氢氧化钾洗脱柱。
方法和结果：在加入1升的进料后，使用44.6升的水洗涤柱直到在280nm处的吸收显著降低。随后，用1M KOH洗脱柱子直到总的收集体积为14.7升，各种分析物的分析结果列在表12中。
表12
 
说明 体积 莫那亭(g) 色氨酸(g) 丙氨酸(g) HMG(g) 丙酮酸(g) 13P(g) MP(g) HMO(g)
进料 1000 5.70 12.00 3.74 2.02 1.20 0.85 14.28 8.71
洗涤1 22450 0.02 0.17 0.00 0.22 4.15 0.22 10.33 4.49
洗涤2 22150 0.00 0.00 0.00 0.18 0.00 0.00 2.79 0.00
洗脱物，1MKOH 14700 4.91 11.15 3.53 1.68 0.00 0.00 1.35 0.00
另外的步骤可以进一步纯化洗脱物的组分。
实施例24：阴离子交换
可以使用强阴离子交换树脂用一步将莫那亭从反应混合物(例如，实施例17所述的用于制备S，S-莫那亭的混合物)中纯化。优选的树脂为强阴离子交换树脂，例如，碳酸氢盐型的ZGA313(Itochu Chemicals America，Inc)。将除去蛋白质的反应物加载到适当尺寸的pH为7-8的柱中。不带电的氨基酸(例如丙氨酸和色氨酸)不能结合，从而被水冲洗下来。带负电荷的分子在pH为7-8时被截留在柱上。这些分子包括莫那亭、4-羟基-4-甲基谷氨酸、4-羟基-4-甲基-酮戊二酸、丙酮酸、吲哚-3-丙酮酸、和莫那亭前体。在pH为7-8，使用线性盐梯度(例如，0-2M的碳酸氢铵)，期望莫那亭在有机酸(例如，丙酮酸、4-羟基-4-甲基-酮戊二酸、莫那亭前体、和吲哚-3-丙酮酸)之前被洗脱下来。莫那亭的吲哚部分与树脂骨架之间的疏水反应妨碍了莫那亭的洗脱，从而使莫那亭与4-羟基-4-甲基-谷氨酸选择性地分离。可以使用实施例6中所述的方法对色谱级分进行分析。
对于本领域的技术人员来说，对所述的本发明进行其它的改变而不超出本发明的忠旨和范围是显而易见的。例如，尽管在所述方法中，超滤是优选的步骤，但是也可以使用其它的过滤方法将大分子量的酶从反应组成平衡中分离，例如可以采用凝胶过滤或者尺寸排阻色谱法。具体的酶和成分的选择可以在本文中所述的那些酶和成分中有所变化。反应物的具体量可以变化，以及循环的量以及循环的次数也可以变化以提高总的方法效率。

Claims (40)

1、一种方法，包括：
a)使含有一种或多种反应物和一种或多种第一促进剂的第一组合物进行反应，在多步骤平衡途径中形成一定量的莫那亭和一定量的一种或多种中间产物，其中，所述途径包括莫那亭生成反应和限制性反应，该限制性反应限制用于莫那亭生成反应的一种或多种中间产物中的至少一种的量；
b)在经过所需的时间后，将所述一种或多种促进剂除去、抑制、钝化或分解，形成第二组合物；和
c)生成额外量的莫那亭，通过：向所述第二组合物中加入第二促进剂，其中，第二组合物促进剂可以与所述第一促进剂中的至少一种相同；或者将参与莫那亭生成反应的第一促进剂中的一种或多种去抑制或再活化；或者使用它们的组合；并向所述第二组合物中加入使莫那亭生成反应进行的组分。
2、根据权利要求1所述的方法，其中，所述所需的时间为步骤a)达到平衡所需要的时间。
3、根据权利要求1所述的方法，其中，所述组分可以与步骤a)的一种或多种反应物中的至少一种相同，或者可以与步骤a)中生成的化合物相同。
4、根据权利要求1所述的方法，其中，进一步包括：从所述第二组合物中提纯所述莫那亭，并形成反应纯化混合物。
5、根据权利要求1所述的方法，其中，所述除去、抑制、钝化或分解包括除去全部的所述一种或多种促进剂。
6、根据权利要求1所述的方法，其中，所述除去选自过滤、色谱分离和萃取中的一种或多种。
7、根据权利要求6所述的方法，其中，所述过滤为超滤。
8、根据权利要求6所述的方法，其中，所述色谱分离选自尺寸排阻色谱法、离子交换色谱法和亲和色谱法。
9、根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种反应物中的至少一种为氨基酸，并且所述一种或多种反应物中的至少一种为氨基受体，并且所述一种或多种第一促进剂包括两种或更多种促进剂。
10、根据权利要求9所述的方法，其中，所述氨基酸为L-色氨酸、D-色氨酸、或它们的混合物。
11、根据权利要求9所述的方法，其中，所述两种或更多种促进剂中的一种为第二促进剂。
12、根据权利要求9所述的方法，其中，所述氨基受体为丙酮酸盐、草酰乙酸盐、α-酮戊二酸盐、或它们的混合物。
13、根据权利要求9所述的方法，其中，所述氨基受体反应生成选自丙氨酸、天冬氨酸盐和谷氨酸盐的氨基供体。
14、根据权利要求1所述的方法，其中，所述一种或多种第一促进剂选自酶、无机催化剂和RNA。
15、根据权利要求14所述的方法，其中，所述酶选自转氨酸、消旋酶和醛缩酶。
16、根据权利要求4所述的方法，其中，所述氨基受体为丙酮酸盐，该氨基受体反应生成丙氨酸，步骤c)中的所述组分也为丙氨酸，该方法还包括将反应纯化混合物中的丙氨酸循环返回到所述第二组合物中，和任选地返回到所述第一组合物中。
17、根据权利要求3所述的方法，其中，所述组分为丙氨酸。
18、根据权利要求4所述的方法，其中，进一步包括在所需的时间后，从所述第二组合物中分离至少一部分的丙氨酸，并将分离出的丙氨酸循环到所述第一组合物中。
19、根据权利要求1所述的方法，其中，步骤c)中的所述促进剂为转氨酶。
20、根据权利要求1所述的方法，其中，所述莫那亭为R，R莫那亭、S，S莫那亭、R，S莫那亭、S，R莫那亭，或它们的混合物。
21、根据权利要求20所述的方法，其中，所述莫那亭为R，R莫那亭。
22、一种用多步骤平衡途径制备莫那亭的方法，所述方法包括：
a)通过包括由酶促进的至少两个反应步骤的途径从反应物混合物中生成莫那亭，其中，所述至少两个步骤中的至少一个步骤为莫那亭生成步骤，并且所述至少两个步骤中的至少一个步骤为不利平衡反应；
b)折衷处理至少所述具有不利平衡的反应，形成折衷组合物；
c)将至少一种组分加入到所述折衷组合物中以使莫那亭生成步骤向生成莫那亭的方向进行。
23、根据权利要求22所述的方法，其中，所述途径包括至少三个反应步骤。
24、根据权利要求23所述的方法，其中，进一步包括通过从反应混合物中分离促进剂或促进剂的辅助因子或者它们的组合，折衷处理全部的所述至少三个步骤，其中，所述至少一种组分至少为第一组分和第二组分，所述第一组分为促进莫那亭生成步骤的酶，所述第二组分为参与莫那亭生成步骤的反应物，其中，促进莫那亭生成步骤的酶也促进在该途径中较不稳定的组分转化为在该途径中较稳定的组分。
25、根据权利要求24所述的方法，其中，所述较不稳定的组分为吲哚-3-丙酮酸盐，所述较稳定的组分为色氨酸。
26、根据权利要求25所述的方法，其中，进一步包括将分离的酶和色氨酸循环到反应混合物中。
27、根据权利要求24所述的方法，其中，进一步包括将副产物、联产物或它们的组合循环到所述第一组合物、折衷组合物或它们的组合中。
28、根据权利要求22所述的方法，其中，进一步包括在反应混合物中提供生成2-羟基-2-(吲哚-3-基甲基)-4-酮戊二酸(“MP”)的一组初始组分，其中，约90％的MP转化为莫那亭。
29、根据权利要求28所述的方法，其中，约95％的MP转化为莫那亭。
30、根据权利要求28所述的方法，其中，约100％的MP转化为莫那亭。
31、根据权利要求28所述的方法，其中，生成的莫那亭的浓度比在未干扰的平衡途径中生成的莫那亭的浓度高1.5倍。
32、根据权利要求28所述的方法，其中，生成的莫那亭的浓度比在未干扰的平衡途径中生成的莫那亭的浓度高1.7倍。
33、根据权利要求28所述的方法，其中，生成的莫那亭的浓度比在未干扰的平衡途径中生成的莫那亭的浓度高2.0倍。
34、根据权利要求4所述的方法，其中，使用阴离子交换色谱法、SDVB柱色谱法或阳离子交换色谱法纯化莫那亭。
35、一种用多步骤平衡途径制备产物的方法，所述方法包括：
a)使含有一组反应物与一组促进剂的第一组合物进行反应，在所述途径中形成含有所述产物和一种或多种中间产物的第二组合物；
b)除去、抑制、钝化或分解所述促进剂，以钝化或减慢所述多步骤途径；
c)使至少产物生成反应再活化或加速，同时使与产物生成步骤竞争的反应保持非活化或减慢的状态，任选地加入一定量的参与产物生成步骤的至少一种组分，所述一定量是足够使产物生成步骤向生成产物的方向进行的量；和
d)从所述第二组合物中提纯所述产物。
36、一种用多步骤平衡途径制备产物的系统，该系统包括：
a)第一容器，用于接受和保存含有一种或多种反应物和一种或多种促进剂的第一混合物的组分，这些组分可以反应生成所需产物和中间产物；
b)第一装置，与所述容器连接，用于将所述反应物、产物和中间产物与所述促进剂分离；
c)将所述促进剂循环返回到所述容器中的工具；
d)第二容器，与所述第一装置连接，以从该第一装置接受反应物、所需产物和中间产物，该第二容器也用于接受用于激活生成所需产物的反应的促进剂，所述生成所需产物的反应涉及反应物和中间产物中至少一种，和用于接受使产物生成反应进行以形成所需产物的组分；
e)与所述第二容器连接的用于提纯所需产物的工具；
f)用于从所述的提纯工具中将反应物和任选地将中间产物循环到所述第一容器中的工具；和，任选地
g)用于从所述的提纯工具中将组分循环到所述第二容器中的工具。
37、一种方法，该方法包括从原始反应混合物中提纯莫那亭得到新的混合物，选择性地将所述原始反应混合物中的至少一种组分循环到所述新的反应混合物中，由原始量的反应物生成比仅由平衡过程生成的莫那亭的量更多的量的莫那亭，其中，所述提纯包括至少一个超滤步骤和至少一个色谱步骤。
38、根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少一个色谱步骤包括阳离子交换色谱步骤和采用非极性吸附树脂的色谱步骤。
39、根据权利要求37所述的方法，其中，该方法还包括脱盐步骤，所述至少一种色谱步骤包括阳离子交换色谱步骤、阴离子交换色谱步骤和采用非极性吸附树脂的色谱步骤。
40、根据权利要求37所述的方法，其中，所述至少一种色谱步骤包括采用非极性合成吸附树脂的色谱步骤。
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