JPS60181055A - フエニルアラニンと桂皮酸の分離方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 本発明はフェニルアラニンと桂皮ばの分離方法に係り、
更に詳しくは、フェニルアラニンと桂皮酸火含む親会浴
液ン、特定の条件下で合成吸着剤と接触させて、フェニ
ルアラニンと桂皮Ｖを分離する方法に係る。

フェニルアラニンは必須アミノ酸の一つであり、医薬品
、特に医療用アミノ鍍輸液等に使用さｎ１又最近はペプ
チド系甘味料であるα−アスパラテルフェニルアラニン
メチルエステルの構成アミノ酸として関心を集めている
。

従来フェニルアラニンは、化学会成法、タンパク質加水
分解法や発酵法等によって生産さｒていたが、生産効率
が低く、効率的な生産方法が種々検討されている。

これらの方法の一つに、桂皮酸を原料としてアンモニア
の存在下、Ｌ−フェニルアラニンアンモニアリアーゼを
用いて酵素反応により、Ｌ−フェニルアラニンを製造す
る方法があり、この方法はフェニルアラニンの生産性が
極めて高く、工業的な製造方法として注視されている。

しかし乍ら上ｄ己の方法に於ては、生成するＬ−フェニ
ルアラニンは桂皮酸やアンモニアと共存しており、Ｌ−
フェニルアラニンを単品として得るためには、こｎらの
混合物の中から、Ｌ−フェニルアラニンを分離採取する
必要があるが、特にフェニルアラニンと桂皮＃ｔｈ化学
構造が類似しており、相互に分離することが非常に困難
である。従って、工業的有利にＬ−フェニル了うニン′
％：１１！造するためには、共存する桂皮酸との分離を
効率良く行うことが重要である。

本発明者等をよこの様な状況を背景に、桂皮酸と共存す
るフェニルアラニンの効率的な分離、ｎｍ方法九ついて
鋭意検討した結果、多孔性の合成吸着剤を用匹て、特定
の条件下で処ｆｍヲ行うことにより、極めて効率良くフ
ェニルアラニンと桂皮酸の分離ができることを見出した
。

多孔性合成吸着剤は、種々の有機性の重合性七ツマ−を
重合、縮重合または共重合することによって得らｎた架
橋重合体、或は、種々の重合性モノマーを重合や縮重合
した後、架橋して得られた架橋重合体からなり、有為童
の表面積及び細孔容積を有し、各種の物質、特に医薬品
や食品等の分離精製に利用さｎてい心。そして、この様
な合成吸着剤としては、多くのものがあり、例えば、［
ダイヤイオンＪＨＰ１０．−〇、コ／、、？７．４ＩＯ
，！１０、「ダイヤイオン」ＨＰコＭＧ（三菱化成工業
■製：登録Ｈ１ｍ）やアンバーライトＸＡＤλ、ダ、り
、ざ（米国ローム＆ハース社製；商４］り等の面標で既
に製造、市販さｎている。

この様な合成吸着剤が、アばノ酸や有機酸な吸着するこ
とは既に知られ℃おり、例えば、アミノ酸でに等電点付
近で最も良く吸着さｎ、有機酸ではｐＨが低い、有機酸
の非解離状態で良く吸着されることも知られてｈる・ 本発明者らはこれらの知見な基に合成吸着剤を用いてフ
ェニルアラニンと桂皮ｔＩｌｙｋ含有する混合溶液から
、フェニルアラニンを分離Ｎ製する方法について検討し
赴結果、合成吸着によるフェニルアラニンと桂皮酸の吸
着性は共存する無機塩の濃度に依存し、篤（べきことに
、フェニルアラニンと桂皮酸の相対吸着性（吸着の選択
性）は共存する無機塩の濃度によって大巾に変化し、こ
れらの現象を巧みに利用することによって、フェニルア
ラニンと桂皮酸の分離が極めて効率的に行えることを見
出し、本発明に到達した。

即ち、本発明は桂皮酸と共存するフェニルアラニンの工
業的有利な分離精製方法を提供するものであり、その要
旨はフェニルアラニンと桂皮酸を含む親会溶液を合成吸
着剤を用い、溶液の無機塩濃度がＯコ規定以上の条件下
にクロマト展開させることを特徴とするフェニルアラニ
ンと桂皮酸の分離方法に存する＠ 以下、本発明を更に詳細に説明する。

本発明は、桂皮酸とフェニルアラニンを合成吸着剤によ
り分離するものであるが、桂皮酸とフェニルアラニンを
含有する混合溶液な合成吸着剤と接触させると、両者の
吸着剤に対する阪着量及び相対的な吸着性は、桂皮酸や
フェニルアラニンの撫度、共存する無機塩の濃度、溶液
のｐＨ等の溶液の状態、特に共存する無＆塩のｌ１ｉＩ
［に大きく依存して変化する。

例えば、第７図に試薬特級のフェニルアラニ　−ンと桂
皮酸が各ｊｔずつ溶解しており、かつ無機塩として所定
量の塩化アンモニウムを含み、アンモニアでｐＨ１ｌ！
１１整した溶液Ｉｔ中に、合成吸着剤ダイヤイオンＨＰ
λｏ’＠６ｓｏｍｔ添加した場会の桂皮酸とフェニルア
ラニンの吸着ｆｔヲ、又第２図に、Ｍ／ＩＷと同一条件
下における、フェニルアラニンと桂皮酸の相対吸着性を
フェニるフェニルアラニンの吸着蓋は溶液の塩化アンモ
ニウム濃度に依存するものの、吸着−の便化′Ｉｋは小
さく、一方桂皮酸の眩着量も浴液の無機塩濃度に依存し
、しかもその変化量はフェニルアラニンよりもはるかに
大きく、特に無機塩濃度が０１規定以上、好ましくはａ
５５規定上で桂皮酸がフェニルアラニンよりもよく吸着
されする桂ｋｊＬ酸の相対吸着性を変化させ相互に分離
することが可能となる。

本発明はこのような溶液中の無機塩濃度がａコ規定以上
で相対吸着性が変化するという新規な知見に基づき、桂
皮酸とフェニルアラニンの混合溶液から、フェニルアラ
ニンを分離精製する方法である。

本発明方法に従い、分離処理されるフェニルアラニンと
桂皮酸な含む溶液は特に制限さｎず、通常靜液中のフェ
ニルアラニンと桂皮酸の濃度は夫々ａｏｚ〜コＯ（重１
ｋ）／（容電）−程度である。又、雛故中の無機塩濃度
はａコ規定以上、好ましくｔａａｚｍ定以上である。し
かしながら、しＵえは合成吸着剤を充填したカラムにフ
ェニルアラニンと桂皮酸な含む混合溶液な一定電供給し
、別種の実質的にフェニルアラニンと桂皮＃Ｒを含まな
い溶液を溶離剤として流して溶離展開クロマトにより桂
皮酸とフェニルアラニンを分離する方法を採用する場合
には、桂皮酸とフェニルアラニンの混合溶液中の無機塩
濃度は必ずしもａコ規定以上である必要はなく、合成吸
着剤とフェニルアラニン及び桂皮酸が接触する間の、大
部分の時間の溶媒となる溶離剤中の無機塩濃度が０．１
規定以上であｎば良い。無機塩濃度がＱコ規定未満では
、フェニルアラニン及び桂皮酸の吸着剤に対する吸着性
に著しい差が認められず分離が開離となる。こｎらの溶
液中に存在するＳ機塩は特に制限はなく、塩化アンモニ
ウム、　４１１［アンモニウム、ジメチルアミン塩酸塩
、塩化ナトリウム、芒硝の様な塩酸、硝酸、リン酸及び
硫酸等のアンモニウム塩、アミン塩、アルカリ金属塩等
が使用さｎる。又、これらの溶液のｐｍも、特に制限は
ないがｓ　ｐＨが高ｉ程阪着性、特に桂皮酸の吸着性は
低下する傾向があるため、溶液のｐＨはダ〜ｌコ、好ま
しくは５〜ｌｌに保つのが良匹。

本発明に於て使用される合成吸着剤としては、４Ｍｉ々
の有機性の重合性モノマーを重合、共重合または！ｉｉ
Ｉ″Ｍ会することによって得らｎた架橋重合体或は種々
の重合性七ツマ−を重合や縮重合した俊架橋して得られ
た架槁重会体からなり、有為量の表ｖｎ積及び細孔容積
をもつものである。

合成吸着剤の吸着にはその表面積及び細孔容積にも大き
く影譬さｎ、少くともｉ　ｏ　ａ　ｍ”　／　を以上、
好ましくは３００．イ／？以上の表面積を有し、且つ少
くともθ／ｌｄ／Ｐ以上、好ましくは０、３　ｍｌ　／
　７以上の細孔容、ｔ＊ｖもつものが望ましい。一方合
成眩着剤の基体を構成する単位構造としては、吸漬谷址
の点からスチレンとジビニルベンゼンを主体とする芳香
族系の共重合体からなる基体構造をもつものが好ましい
。このような合成吸着剤としては、市販品として例えば
「ダイヤイオンＪＨＰＩＯ，−〇、λ／、３０゜ｑｏ％
３０（三菱化成工業■＃！：登録商標）、アンバーライ
トＸＡＤコ、４Ｉ（米国、ローム＆ハース社昶：商楯）
等が挙けられる。

本発明方法を実施する際の具体的なフェニルアラニンと
桂皮酸の分離操作方法としては、実質的に混合溶液中の
無機塩濃度がθコ規定以上の状態で合成吸着剤と接触さ
せる以外特に制限はないが、分＃ｌを効率的に行う為に
は、合成吸着剤をカラムに充填し、この充填層に桂皮酸
とフェニルアラニンを含む溶液を流して、クロマト分離
する方法が好ましい。

この際、無機塩の濃度が０．コ規定以上である、桂皮酸
とフェニルアラニンを含む混合溶液を合成吸着剤の充填
層に連続的に供給すると、吸着性の弱いフェニルアラニ
ンが先にカラムより流出し始め、遅れて桂皮酸が流出し
始めるため、カラム流出液の、フェニルアラニンが流出
し始めた点から、桂皮酸の流出し始める迄の分画を採取
する、いわゆる先端クロマト分離により、桂皮酸が分離
さｎたフェニルアラニンン得ることができる。尚この除
、原液中に共存する無機塩は桂皮酸やフェニルアラニン
の合成吸着剤への吸着性を向上させるが、そｎ自身は合
成吸着剤には殆んど吸着さｎず、フェニルアラニンの流
出に先立って流出し始めるため、必要に応じてこ扛らの
流出分画を採取することによって無機塩類も回収するこ
とが可能である。また、この原液の充填層への供給を継
続すると、合成吸着剤による吸着は飽和に達し、流入液
と流出液の組成は等しくなるが、通常は桂皮酸が流出し
始める前後の適轟な時点で通液は停止さｎ、その時点で
合成ｉ着剤にｇ＆着されている大部分の桂皮酸と、既に
流出した残りのフェニルアラニンは、過当な溶離剤、例
えばＱｌ−３規定、好ましくは０５〜コ規定のアンモニ
ア中水酸化ナトリウム水溶液を流すことによって溶離さ
れ、フェニルアラニン含量の減少した桂皮酸を得ること
ができる。他方、溶離剤で処理した・後の合成吸着剤は
、勿崗再びフェニルアラニンと桂皮酸の分離に繰返して
使用することができる・合成吸着剤の充ｍＷ’ｌ：用い
てクロマト分離する別の方法として、桂皮酸とフェニル
アラニンを含む溶′／ｆＬを一定址充填層に供給し、合
成吸着剤に吸着さｎた桂皮酸とフェニルアラニンを無機
塩濃度１２λ規定以上の溶液を溶離剤として流マ して、クロナト展開溶離して、桂皮酸とフェニルアラニ
ンを分Ｎ！することも可能である。この際、フェニルア
ラニンと桂皮酸を含む混合溶液の無機塩濃度は必ずしも
Ｑコ規定以上である必要はな（、分離工程時の合成吸着
剤の接触する溶液の大部分な占め、実質的に分＋＊Ｖ支
配する溶離液中の無機塩濃度がａコ規定以上であれば良
い。

これらの方法に於て、合成吸着剤の光横層高は装置や操
作上、許容さルる範囲内で高い方が好ましいが、通常Ｏ
，Ｓ〜ｊｍ程度が採用さｎる。

文通液の流速としてはＬＶ（空前線Ｍ反）で　□Ｑ／〜
／ａｍ程度が好ましい。クロマ）展開溶離により分離す
る場合、充填層への混合溶液の負荷証は、混合液の各成
分−腿や必要とされる分離の程度にもよるが、通常充填
層に、混合溶液を供給して、桂皮酸がカラムより流出し
始める迄の範囲で、合成吸着剤の光填量の０．０２〜１
００倍量程度の範囲が好ましい。

本発明の方法によｎば、合成吸着剤にはフェニルアラニ
ンより桂皮酸の方が強く吸着さｎるため、例えば先端ク
ロマト分離の手法を使用すれば、桂皮酸とフェニルアラ
ニンを含む躍液の中から桂皮ｆｄ’に吸着除去して、桂
ＢＬ酸の完全に除去されたフェニルアラニンを容易に得
ることができる。この際収得されるフェニルアラニンの
溶液中の濃度は、原液と比べて殆んど希釈されることは
なく、逆に一度、合成吸着剤に吸着されたフェニルアラ
ニンが、より吸着性の強い桂皮ばに置換さル、放出され
るため、原液ｇ反よりも上回って回収できる利点もある
。

一方、本発明の方法に従って溶離クロマトの手法を遍用
丁ｎば、ｓｉ機塩を含まない脱塩水等の俗猷で１＃離す
る場合に比して、桂皮酸がはるかに７！Ｊ！ｔｔて溶出
してくるため、桂皮酸とフェニルつ アラニンを尚収率かｌ高純度で分離することが可能であ
る。

以下本発明を実施例及び参考例に従って更に詳細に説明
するが、本発明はその要旨な越えない限り、本実施例に
限定されるもので位ない。

参考例１ 試薬特級のＬ−フェニルアラニンとｔｒａｎｓ−桂皮＃
！を各種濃度の塩化アンモニウム水溶液に各Ｓｉずつ溶
解し、アンモニア水で溶液のｐＨ５７又は１０として、
液＊ｗｉｔとした。こｎらの溶液に、夫々水中で５０−
ずつ秤取し、遠心分離機で水分を除去した合成吸着剤ダ
イヤイオンｕｐコ０な添加し、ＪＯ’Ｃ：、の恒温振盪
槽中で７０時間振盪した。その後溶液中に残留してｈる
フェニルアラニンと桂皮酸の濃度を測定し、原液との差
より、ダイヤイオンＨＰ２０への吸着量をめた。

これらの結果な溶液中の無機塩濃度とフェニルアラニン
、桂皮酸の吸着量、及び桂皮酸の相対吸着性（ダイヤイ
オンＨＰ−〇ＶＣ対する桂皮酸の吸着量のフェニルアラ
ニン吸着量に対する比）として夫々、第１図及び第一図
に示した・参考例コ 内径３０■φ、高さｌｊｍのアクリル樹脂製カラムに、
会成吸着剤ダイヤイオンＨＰコ□な１０４充横した。

ｔｒ−−−−桂皮酸とＬ−フェニルアラニンをアンモニ
ア水に溶解し、ｔｒａｎｓ−桂皮酸！ｆ？／Ｌ、Ｌ−フ
ェニルアラニン！ｔ／ｌ、及びアンモニアを含むｐＨ１
０Ｑの混合物溶液な、上記のカラムの上部よりａＬ／ｈ
ｒの流速でｉｏｏｗｔ通液し、続いて溶離液として脱塩
水（ｐＨムり１１：ｌｔ／ｈｒ　の流速で流した。その
際のカラム流出液量（横軸）と各成分濃度（縦軸）の関
係を第３図に示した。図中、（りは桂皮酸ヲ、（ｂ）　
Ｈフェニルアラニンを表わす。

実施例１ 参考例コに於て、溶離液として脱塩水の代りに、アンモ
ニアでｐＨを２！ｒに調整したθ亭規定の塩化アンモニ
ウム水蓄液を使用した以外は参考例−と全く同様に操作
し、溶離液ｗｅｔ通液した際の結果を第参図に示した。

参考例−と比較すると、フェニルアラニンと桂皮酸の流
出順序は逆転し、かつ両成分共に、溶出位置は遅くなり
、特に桂皮酸はフェニルアラニンの溶出が終了した、溶
離液をｔｒｔ通献した時点でも全く溶出せず、フェニル
アラニンは桂皮酸が全く混在しない形で回収できた。

参考例３ 実施例１に於て、溶離液ｔｔｔ’ｓ、（通液した後の／ カラムに、引続いてす規定アンモニア水なカラムの上部
よりコＬ　／　ｈ　ｒの流速で流した。その際のカラム
流出液Ｘ＜横軸）と流出物濃度（縦軸）の関係ｖ第５図
に示↓た・ この結果実施例１に於て溶出さｎなかりた桂皮酸が溶出
さｎ、フェニルアラニンを含まぬ桂皮酸として回収さｎ
た。

実施例ａ 内径／ｊｌｌｌφ、高さｌｓｍのアクリルＩ＃脂製カラ
ムに、曾成吸着剤ダイヤイオンＵＰλ／ｇコＳ０−充填
した。

−ｔｒａｎｓ−桂皮［１ｆ／ｌ、Ｌ−フェニルアラニン
ｓｈｙ／ｌと塩化アンモニウム１００ｆ／１（１９規定
）を含み、アンモニアでｐＨ１ｉ２ｊ＆ＣｉＪ［した溶
液を上記のカラムにｊ　００　ｄ／　ｈｒの流速でカラ
ム上部より注入し、カラム下部よりの流出液中の各成分
濃度を測定した結果を第６図に示した。流出液のｌλｊ
−〜ｔｏｏｗｔの間に桂皮酸、フェニルアラニンを含ま
ぬ塩化アンモニウム溶液が回収さｎ、続いてデ００−〜
．２３ＩＩＯ−の間に桂皮酸な含まぬフェニルアラニン
を９．２？回収できた。

【図面の簡単な説明】

ＨｔＩｚ１図は参考例１に従ってフェニルアラニンと桂
皮酸な含む種々の濃度の無機塩浴液を合成吸着剤ダイヤ
イオンＨＰ２０と接触させた除のフェニルアラニン及び
桂皮−の吸着量と溶液の無機塩濃度の関係を表わすもの
であり、横軸は溶液の無機塩一度を、縦軸は吸着１ｋｗ
示す。図中（峠と（ｂ）は夫々溶液のｐＨがりの時の桂
皮酸と、フェニルアラニンを示し、（Ｃ）と（ｄ）は夫
々溶液のｐＨがＩＯの時の桂皮酸とフェニルアラニンな
示す。 比コ図は参考例１における、フェニルアラニンの桂皮酸
に対する相対吸着性を、溶液中の無機塩濃度の関数とし
て表わしたものであり、縦軸は相対吸着性な、横軸は無
機塩濃度を示す。 図中（＆）線溶液のｐｎがｌ０１（ｂ）は溶液のｐＨが
７の時の結果を示す。　１ ｔｇｓｒｍｔａ参考例ＪＫ従りてフェニルアラニンと桂
皮酸の混合溶液な合成吸着剤ダイヤイオンＨＰＪＯのカ
ラムを用い、脱塩水で溶離展開した時の流出液中の各成
分濃度を縦軸に、流出液量な横軸に示したものである。 図中（−）は桂皮酸）ｋ　（ｂ）はフェニルアラニンな
表わす。 第参図は実施例１に従ってフェニルアラニンと桂皮酸の
混合溶液を合成吸着剤ダイヤイオンＨＰコＯのカラムで
ｐＨ２７のＱ４Ｉ規定塩化アンモニウム水溶液で溶離展
開した時の流出液の各成分濃度ＹＭ軸に、凱出献蓋を横
軸に示したものである。 第５図は参考例Ｊに従ってｌ規定アンモニア水を流した
時の流出液中の各成分濃度を縦軸に、流出液量を横軸に
示したものである。 第を図は実施Ｎコに従ってフェニルアラニンと桂皮酸の
温合溶液を合成吸着剤ダイヤイオンＨＰコｌのカラムで
先端クロマト分離した時のカラム流出液の各成分製置（
Ｃ）　ｙｋ原液濃度（ＣＯ）との比で表わしたものであ
る１図中（−）は桂ＩＬ［。 １ｂ）ｉｊｙエニルアラニン、（−）は塩化アンモニｆ
ｙｔ及びアンモニア漉匿な表わす。・ ｆｆ１Ｍ人　三菱化成工業株式会社 代理人　弁理士　長谷用　− （＃１か１名） 吸鬼量（敏−樹脂）・ 篇３図 ンｔ、ｉｌｌ、′Ｊｌ量（１） フエ二Ｊレアラニ〉濃度（シン） 桂皮酸１ｋｌ−（赦） 第１頁の続き

Claims (2)

【特許請求の範囲】
1. （１）　フェニルアラニンと桂皮酸ヲ含む混合溶液を、
   合成吸着剤を用い、溶液の無機塩濃度が０コ規定以上の
   条件下に、クロマト緩曲させるととｔ特赦とするフェニ
   ルアラニンと桂皮酸の分離方法。
2. （２）合成吸着剤な、少くともｉｏｏイ／？の表１ＭＩ
   績及び少くとも０．／ｍｌ／ｆの細孔容積を有すること
   を特徴とする特許請求の範囲第（１）項に記載の分離方
   法。 （３〕　混合浴液のフェニルアラニンと桂皮酸の濃ｊ建
   は夫々ａＯＳ〜コＯ（貞址）／（容址）斧であることｙ
   ａ′特徴とする特許請求の範囲第＋１）墳又は第（２）
   項に記載の分離方法。