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HINTERGRUND DER ERFINDUNG
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Bereich der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Herstellung von chiralen
organischen Verbindungen über
katalysierte Reaktionen. Noch spezieller bezieht sich die vorliegende
Erfindung auf ein katalytisches System, das sowohl ein metallisch
katalysiertes Wasserstoff-Übertragungssystem,
als auch ein enzymatisch oder mikrobiologisch katalysiertes Oxidationssystem
einschließt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich ebenso auf ein Verfahren
zur Verwendung dieses Systems für
die Herstellung von optisch aktiven Aminosäuren.
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KURZE BESCHREIBUNG DES
STANDES DER TECHNIK
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Die
traditionelle chemische Katalyse bezieht sich im Allgemeinen auf
Verfahren, in welchen chemische Reaktionen durch Säuren, Basen,
Metalle, Metallsalze oder organometallische Verbindungen katalysiert
werden, während
die Biokatalyse dazu verwendet wird, um Reaktionen zu beschreiben,
welche durch Proteine, Enzyme, andere Biomoleküle oder Mikroorganismen katalysiert
werden. Die traditionelle chemische Katalyse befand sich in der
chemischen Industrie lange in Verwendung für die Herstellung von Petrochemikalien,
Feinchemikalien und Spezialitätenchemikalien.
Obwohl die Fermentation schon lange für die Herstellung von gewissen
Bedarfschemikalien angewendet wurde, hat in jüngster Zeit die Biokatalyse sich
auf Herstellung von hochwertigen Feinchemikalien, insbesondere chiralen
chemischen Zwischenprodukten für
Pharmazeutika und andere biologisch aktive Mittel fokussiert.
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Jede
Art der Katalyse weist ihre Vorteile und Nachteile auf. Die traditionelle
chemische Katalyse bezieht hohe Temperatur, hohen Druck und niedrige
chemische Selektivität
ein, ist aber typischer Weise kosteneffektiv und effizient. Die
Biokatalyse arbeitet unter milden Reaktionsbedingungen und hoher
chemischer Selektivität
und Stereoselektivität,
ist aber gewöhnlich
mit hohen Kosten verbunden. Diese zwei Arten von Katalyse werden
gewöhnlicher
Weise in sehr unterschiedlichen Verfahren angewendet und sind nur
sehr selten miteinander verknüpft.
Katalytische Übertragungs-Hydrierungsreaktionen
zum Beispiel wurden breitgefächert
in der Reduktion einer Vielzahl von funktionellen Gruppen von organischen
Verbindungen angewendet, wie die Reduktion von Ketonen und Aldehyden
(Ram S.; Spicer, L. D.; Tetrahedron Lett. 1988, 29(31), 3741), Olefinen (Ranu,
B. C.; Sarkar, A.; Tetrahedron, Lett. 1994, 35(46), 8649), Aziden
(Gartiser, T.; Selve, C.; Delpuech, J.-J.; Tetrahedron Lett. 1983,
24(15), 1609), Epoxiden (Dragovich, P. S.; Prins, T. J.; Zhou, R.;
J. Org. Chem. 1995, 60, 4922), Nitraten (Barett, A. G. M.; Spilling,
C. D.; Tetrahedron Lett. 1988, 29, 5733) und aromatischen Ringen
(Balezewski, P.; Joule, J. A.; Syn. Commun., 1990, 20, 2851).
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Die
Veröffentlichung
WO 9814602-A offenbart ein Verfahren der Herstellung von D-Aminosäuren durch
Fermentation.
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Ein
katalytisches Übertragungs-Hydrierungssystem
bezieht typischer Weise einen metallischen oder Metallkomplexkatalysator
wie Palladium-Kohlenstoff und eine Wasserstoffquelle wie Ammoniumformat
oder Cyclohexen ein. Die Wasserstoffquelle gibt Wasserstoff oder
Hydrid frei, wenn die Reaktion fortschreitet. Ein Hauptvorteil gegenüber der
herkömmlichen
katalytischen Hydrierung, welche spezielle Geräte zur Handhabung von Wasserstoffgas
und Druck benötigt,
ist, dass die Reduktion gewöhnlicher
Weise unter atmosphärischem
Druck ohne einen großen Überschuss
von Wasserstoffgas durchgeführt
wird. Obwohl viele verschiedene Katalysatoren und Wasserstoffquellen
in katalytischen Übertragungs-Hydrierungssystemen
verwendet wurden, ist ein Ammoniumformat/Palladium auf Kohlenstoff
(Pd-C)-System das vielseitigste und praktischste katalytische Wasserstoff-Übertragungsmittel.
Es wurde für
die Reduktion verschiedener Funktionalitäten verwendet (Johnstone, R.
A. W.; Wilby, A. H.; Entwistle, I. D.; Chem. Rev., 1985, 85, 129).
Nach unserem besten Stand des Wissens wurde das System jedoch nie
in Kombination mit einem biokatalytischen System oder in der Gegenwart
von Biokatalysatoren wie Enzymen oder Mikroorganismen angewendet.
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Mit
Ausnahme von Glycerin besteht jede der herkömmlichen Aminosäuren als
eines von zwei optischen Isomeren, linksdrehend oder rechtsdrehend
genannt, abhängig
von der Richtung, in welcher sie eine Ebene von polarisiertem Licht
zum Drehen bringen. Durch Festlegung werden Aminosäuren ebenso
als D- oder L- bezeichnet, darauf beruhend, ob die Konfiguration
um den α-Kohlenstoff der Aminosäure dem
D- oder L-Stereoisomer (Enantiomer) von Glyceraldehyd, dem beliebigen
Standard, entspricht. Beruhend auf diesem Standard sind die meisten
natürlich
vorkommenden Aminosäuren
L-Aminosäuren,
trotz dem, dass einige von ihnen rechtsdrehend sind, wenn sie in
einer wässrigen
Lösung
bei neutralem pH-Wert platziert werden.
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Auf
der anderen Seite sind Aminosäureoxidasen
und Aminosäuredeaminasen
Klassen von Enzymen, welche die stereoselektive Oxidation einer
Aminosäure
katalysieren, um die entsprechende Ketosäure zu erzeugen. Gemäß ihrer
Stereoselektivität
werden jene Enzyme, die nur die L-Aminosäuren oxidieren, L-Aminosäureoxidasen
(oder Deaminasen) genannt, während
jene, welche nur auf die D-Aminosäuren wirken,
D-Aminosäureoxidasen
(oder Deaminasen) genannt werden.
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In
der Anwesenheit von sowohl L- als auch D-Aminosäuren werden die L-Aminosäureoxidasen
(und Deaminasen) nur die L-Aminosäuren oxidieren, während sie
die D-Aminosäuren
unberührt
lassen, wohingegen die D-Aminosäurenoxidasen
(Deaminasen) genau das Gegenteil tun werden. Beruhend auf dieser
hoch stereoselektiven Natur wurden die Enzyme in Kombination mit
anderen Enzymen oder chemischen Reagenzien für die stereospezifische Umwandlung
von Aminosäuren
von einem Enantiomer in das andere verwendet. L-Aminosäuredeaminasen
(und Oxidasen) wurden in Kombination mit D-Aminosäuretransaminasen
für die stereospezifische
Umwandlung von L-Aminosäure
zu D-Aminosäure angewendet.
Die L-Aminosäuredeaminase
katalysiert die Umwandlung von L-Aminosäuren zu den α-Ketosäuren, welche
als Substrate zu D-Aminosäuren
zugeführt
und auf diese Weise in D-Aminosäuren
umgewandelt werden.
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Eine
andere Anwendung bezieht die Verwendung von Aminosäureoxidaseenzymen
in Kombination mit Natriumborhydrid ein. In diesem Fall katalysiert
eine Aminosäureoxidase
die stereoselektive Dehydrierung der α-Aminogruppe in einer Aminosäure, um
ein Imin-Zwischenprodukt
zu erzeugen, welches augenblicklich zu dem racemischen Amin oder
der racemischen Aminosäure
durch Natriumborhydrid, welches in dem System vorhanden ist, zurück reduziert
wird. Weil das Enzym nur auf ein spezifisches Enantiomer der Aminosäure wirkt,
ohne das andere zu beeinflussen, wandelt dieses Enantiomer sich konstant
in das Racemat um, während
es dem anderen Enantiomer ermöglicht,
zu akkumulieren. Das Endergebnis dieser dynamischen Auflösung ist
die komplette Umwandlung der Aminosäure von einem Enantiomer in
das andere.
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Zum
Beispiel ist die Synthese von L-Prolin aus D-Prolin unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und
Natriumborhydrid bekannt, siehe Huh, et al., Journal of Fermentation
and Bioengineering, Vol. 74, Nr. 3, 189–190 (1992). In ähnlicher
Weise wurde die Synthese von L-Pipecolinsäure aus
D-Pipecolinsäure
unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase
und Natriumborhydrid ebenso beschrieben, siehe Huh, et al., BioSci.
Biotech. Biochem., 56(12), 2081–2082
(1992). Die Umwandlung von D-Alanin
zu L-Alanin unter Verwendung von D-Aminosäureoxidase und Natriumborhydrid
und die Umwandlung von L-Leucin zu D-Leucin unter Verwendung von
L-Aminosäureoxidase
und Natriumborhydrid sind ebenso bekannt, siehe Hafner et al., Proc.
Nat. Acad. Sci., Vol. 68, Nr. 5, 987–991 (1971).
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Die
Verwendung von Natriumborhydrid in Kombination mit Aminosäureoxidaseenzymen,
um Aminosäuren
von einem Enantiomer in das andere Enantiomer stereospezifisch umzuwandeln,
weist verschiedene Nachteile auf, die seine industrielle Anwendung
begrenzen. Natriumborhydrid und einige seiner Derivate sind gegenüber Wasser
empfindlich und zersetzen sich in Säure oder neutralem pH leicht,
bei welchem die Aminosäureoxidaseenzyme
seine maximale Aktivität
und Stabilität
besitzt. Damit die Reduktion effektiv fortschreitet, war das Hydridreagenz
häufig
langsam zuzugeben, in vielfachen Intervallen über eine lange Zeitspanne und in
großem
molaren Überschuss.
Der große Überschuss
von Borhydrid führt
häufig
zu einer schnellen Deaktivierung oder Zerstörung der Oxidaseenzyme, wie
auch zu einem signifikanten Anstieg der Kostenstruktur für ein potentielles
industrielles Verfahren. Zusätzlich
zu diesem Problem werden die Reaktionen unter Verwendung von gereinigten
Enzymen ausgeführt,
welche nur in sehr kleinen Mengen zu großen Kosten erhältlich sind.
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Daher
wäre es
in höchstem
Maße wünschenswert,
ein katalytisches Hydrierungssystem in Kombination mit einem Aminosäureoxidasesystem
zur Verfügung
zu stellen, um die stereospezifische Umwandlung von Aminosäure zu bewirken.
In dieser neuen Kombination würde
das Imin-Zwischenprodukt,
das von der Aminosäureoxidase
katalysierten Dehydrierung erzeugt wurde, durch katalytische Hydrierung
anstatt von Borhydridreduktion zu der Aminosäure zurück reduziert werden. Das katalytische
Hydrierungssystem würde
einen metallischen Katalysator und einen kostengünstigen Sauerstoffdonator umfassen,
welche zusammen eine effiziente Reduktionskraft erzeugen würden, ohne
die Aminosäureoxidasenzyme
zu schädigen
oder insbesondere bevorzugt die Mikroorganismuszellen, welche diese
Enzyme herstellen. Ein solches Katalysatorsystem würde die
stereospezifische Umwandlung von Aminosäuren zu ihren entsprechenden
Enantiomeren in einem industriellen Maßstab auf einer praktikablen
und kosteneffektiven Grundlage ermöglichen.
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ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
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Die
vorliegende Erfindung stellt ein katalytisches System nach Anspruch
1 zur Verfügung,
welches eine katalytische Übertragungs-Hydrierung
mit Aminosäureoxidase
(oder Aminosäuredeaminase)
katalysierten Oxidationsreaktionen kombiniert. Die vorliegende Erfindung.
stellt auch ein Verfahren zur stereoselektiven Umwandlung von Aminosäuren von
einem Enantiomer in das andere oder von racemischen Mischungen zu dem
optisch aktiven Isomer zur Verfügung.
Das Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung schließt bevorzugt
ein: (i) ein Metall, Metallsalz oder Metallkomplex-Katalysator;
(ii) eine Wasserstoffquelle; (iii) ein Enzym, welches dazu fähig ist,
die chemische Verbindung in dem chiralen Zentrum gemäß Anspruch
1 zu oxidieren, oder einen Mikroorganismus, welcher dazu fähig ist,
ein Enzym herzustellen, das dazu fähig ist, die chemische Verbindung
an den chiralen Zentrum gemäß Anspruch
1 zu oxidieren, und (iv) ein Oxidationsmittel wie Sauerstoff. Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung schließt den Schritt der Behandlung
einer Aminosäure
mit einem Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung ein.
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Die
vorliegende Erfindung kann zum Umwandeln von optisch aktiven Aminosäuren zu
ihren entgegengesetzten Stereoisomeren oder zum Übertragen von racemischen Aminosäuren zu
ihren optisch aktiven Stereoisomeren verwendet werden. Auf diese
Weise wird hierin ein Katalysatorsystem und ein Verfahren zur Herstellung
von Deaminosäuren
aus ihren entsprechenden L-Aminosäuren oder racemischen Mischungen
zur Verfügung
gestellt.
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In
der vorliegenden Erfindung wird eine D-Aminosäure durch Behandeln ihrer entsprechenden
L-Aminosäure
oder einer racemischen Mischung mit einem Aminosäuredeaminaseenzym in der Gegenwart
eines metallischen Katalysators, eines Oxidationsmittels, einer
Wasserstoffquelle und optional aber bevorzugt eines Puffers hergestellt.
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Diese
Erfindung stellt ebenso ein Verfahren zur Herstellung einer D-Aminosäure durch
Behandeln ihrer entsprechenden L-Aminosäure oder der Mischung von D-
und L-Aminosäuren
mit Mikroorganismuszellen zur Verfügung, welche ein Aminosäuredeaminaseenzym
herstellen, in der Gegenwart eines Metallkatalysators, eines Oxidationsmittels,
einer Wasserstoffquelle und optionell aber bevorzugt eines Puffers.
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DETAILLIERTE
BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
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Aminosäureoxidasen
sind eine Klasse von Oxidoreduktasen, die die α-Aminogruppe von Aminosäuren stereoselektiv
oxidieren, um die entsprechende Ketosäure herzustellen. Es wird angenommen,
dass die Oxidation die enzymatische Dehydrierung der α-Aminogruppe
der Aminosäure
einbezieht, um ein Imin-Zwischenprodukt zu bilden, welches eine
nicht katalysierte Hydrolyse durchläuft, um die Ketosäure zu ergeben. Die
enzymatische Oxidationsreaktion ist stereoselektiv. Daher kann nur
die L- oder die D-Aminosäure
durch ein vorgegebenes Aminosäureoxidaseenzym
oxidiert werden. Die gleiche Reaktion wird ebenso durch Aminosäuredeaminaseenzyme
katalysiert. In einem gewissen pH-Wert-Bereich ist es möglich, das
Imin-Zwischenprodukt einer Metall katalysierten Hydrierungsreaktion
auszusetzen, um die Aminosäure
in racemischer Form zu regenerieren.
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Es
wurde entdeckt, dass gewisse katalytische Übertragungs-Hydrierungssysteme
in Kombination mit Aminosäureoxidaseenzymen
und Aminosäuredeaminaseenzymen
verwendet werden können,
ohne deren enzymatische Aktivität
und Stabilität
zu beeinflussen. Überraschender
Weise wurde ebenso entdeckt, dass diese metallischen Katalysatorsystemen
mit Mikroorganismuszellen kompatibel sind, einschließlich mutierter
Stränge
von E. coli, welche dazu fähig
sind, solche Enzyme herzustellen. Daher ist es gemäß der vorliegenden
Erfindung möglich,
Aminosäuren
zu ihren entsprechenden Enantiomeren durch Behandlung mit einem
Katalysatorsystem umzuwandeln, welches ein katalytisches Übertragungs-Hydrierungssystem
und ein biokatalytisches Oxidationssystem umfasst, ohne den Biokatalysator
zu zerstören.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
der Erfindung ist Ammoniumformat in das Katalysatorsystem sowohl
als Puffersalz für
den Biokatalysator als auch als Wasserstoffdonator für die katalytische Übertragungs-Hydrierung eingeschlossen.
Die metallischen Katalysatoren in Kombination mit Ammoniumformat
bilden Wasserstoff-Übertragungssysteme,
welche mit den Enzymen oder Mikroorganismuszellen kompatibel sind.
Die Nützlichkeit
dieser Erfindung ist nicht auf die zuvor beschriebene stereospezifische
Aminosäure-Umwandlungsreaktion
begrenzt. Anstatt dessen ist die potentielle Anwendbarkeit dieser
Erfindung viel breiter. Weil metallisch katalysierte Wasserstoff-Übertragungs-Hydrierungen zum
Beispiel, welche einen geeigneten Wasserstoffdonator wie Ammoniumformat
verwenden, für
die Reaktion einer großen
Vielzahl von organischen und chemischen Gruppen wie Olefine, Ketone,
Aldehyde, Nitrile und aromatische Ringe bekannt sind, kann das Katalysatorsystem
dieser Erfindung mit Enzymen oder Mikroorganismuszellen gekoppelt
werden, welche die Verbindungen als Substrate verwenden, oder diese
als Produkte herstellen, um chemische und stereoselektive Reaktionen
einschließlich
einer großen
Anzahl von chemischen Verbindungen zur Verfügung zu stellen.
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Das
Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung wurde auf die Umwandlung
von L-Aminosäuren
zu D-Aminosäuren mit
guter Ausbeute und hoher optischer Reinheit angewendet. Der prozentuale
enantiomere Überschuss
(ee) einer D-Aminosäure,
die über
ihre entsprechende L-Aminosäure
gemäß der vorliegenden
Erfindung hergestellt wurde, kann durch Subtrahieren der vorliegenden
Menge von L-Aminosäure
von der vorliegenden Menge der D-Aminosäure, Dividieren des Ergebnisses
durch die gesamte Menge von D- und L-Aminosäure und Multiplizieren mit
100 bestimmt werden.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
wird eine L-Aminosäure oder
eine racemische Mischung einer Aminosäure zu D-Aminosäure durch
Behandeln der L-Aminosäure
oder der racemischen Aminosäure
mit Aminosäuredeaminase
und Ammoniumformat/Pd-C gemäß des Verfahrens
dieser Erfindung umgewandelt. Die sich ergebende D-Aminosäure wird
aus der Reaktion wiederhergestellt, um die D-Aminosäure zu ergeben. Die hergestellten
D-Aminosäuren
gemäß der vorliegenden
Erfindung können
unter Verwendung wohl bekannter Verfahren für einen Fachmann isoliert werden.
Zum Beispiel wird die Reaktionsmischung gefiltert oder zentrifugiert,
um sowohl den biologischen als auch den chemischen Katalysator zu
entfernen. Das Filtrat oder der Überstand
wird durch Vakuumdestillation auf ein kleines Volumen konzentriert.
Das Produkt wird durch die Einstellung des pH-Wertes ausgeschieden
und ferner durch Rekristallisation gereinigt. Andere herkömmliche
Isolationsverfahren für
Aminosäuren
können
angewendet werden, wie Extrahieren der Produktlösung mit einem geeigneten mit
Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittel einschließlich n-Butanol
oder durch Leiten der Produktlösung
durch eine Ionenaustauschkolonne.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
schließt
das Katalysatorsystem dieser Erfindung einen Puffer ein. Geeignete
Puffer zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung schließen ein
jene, sind aber darauf nicht begrenzt, welche in einem pH-Wert-Bereich
von etwa 5,0 bis etwa 8,0 wirkungsvoll sind, einschließlich Ammoniumformat,
Natrium- oder Kaliumphosphaten, Tris(hydroxymethyl)aminomethanhydrochloride
(TRIS Hcl) und Mischungen davon. Bevorzugt ist der Puffer Ammoniumformat.
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In
einer anderen bevorzugten Ausführungsform
schließt
das Katalysatorsystem der vorliegenden Erfindung einen Mikroorganismus
ein, welcher dazu fähig
ist, ein Enzym herzustellen, das dazu fähig ist, ein chirales Zentrum
einer chiralen chemischen Verbindung nach Anspruch 1 zu oxidieren.
In dieser Ausführungsform
wird ein katalytisches System ohne die Notwendigkeit zum Isolieren
des Oxidasenznyms zur Verfügung gestellt.
Bevorzugt sind der metallische Katalysator und die Mikroorganismuszellen
darin kompatibel, dass keiner von beiden einen bemerkenswerten schädlichen
Effekt auf die Aktivität
des anderen ausübt.
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Die
Enzyme, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen bevorzugt Aminosäureoxidaseenzyme,
Aminosäuredeaminaseenzyme,
welche allgemein kommerziell erhältlich
sind, un dMischungen davon ein. Zum Beispiel können sowohl D- als auch L-Aminosäureoxidasen
aus verschiedenen unterschiedlichen Ursprüngen von Sigma-Aldrich Fine
Chemicals bezogen werden. Die Auswahl von in dem Verfahren der Erfindungen
zu verwendenden Enzymen wird von der speziellen gewünschten
stereospezifischen Reaktion abhängen.
Wo es zum Beispiel gewünscht
ist, eine L-Aminosäure
zu einer D-Aminosäure
umzuwandeln, ist das bevorzugte Enzym eine L-Aminosäureoxidase
oder Deaminase.
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Mikroorganismuszellen,
welche in der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, schließen bevorzugt
jene ein, welche das Enzym nach Anspruch 1 herstellen, und mit den
metallischen Katalysatorsystem dieser Erfindung kompatibel sind.
Insbesondere bevorzugt sind die Mikroorganismuszellen E. coli Zellen, welche
das gewünschte
Enzym herstellen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform
sind die Zellen E. coli Zellen, welche ein L-Aminosäuredeaminaseenzym
herstellen. Ein Strang von E. coli, welcher ein L-Aminosäuredeaminaseenzym
herstellt, kann durch Einführen
in die Zellen eines Plasmids hergestellt werden, welches das Gen
trägt,
das für
die Synthese von L-Aminosäuredeaminase
kodiert ist. Ein Plasmid, welches ein solches Gen trägt, kann
wie in dem U.S. Patent Nr. 5,728,555 beschrieben hergestellt werden.
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Die
metallischen Katalysatoren, welche in der vorliegenden Erfindung
verwendet werden können, schließen bevorzugt
jene ein, welche mit den Enzymen und Mikroorganismuszellen der Erfindung
kompatibel sind. Exemplarische metallische Katalysatoren schließen Palladium
auf Kohlenstoff (Pd-C), Palladium auf Bariumsulfat, Palladium-Ruß und Mischungen
davon ein. Bevorzugt ist der metallische Katalysator Palladium auf Kohlenstoff.
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Die
Oxidationsmittel, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können,
schließen
atmosphärischen
Sauerstoff, Wasserstoffperoxid, NAD und Mischungen davon ein. Bevorzugt
ist das Oxidationsmittel atmosphärischer
Sauerstoff.
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Die
Wasserstoffquellen, welche in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden können,
schließen Ammoniumformat,
Natriumformat, Triethylammoniumformat, H2 und
Mischungen davon ein. Bevorzugt ist die Wasserstoffquelle Ammoniumformat.
Wenn Ammoniumformat als Wasserstoffquelle und als Puffer verwendet wird,
ist die bevorzugte Konzentration von Ammoniumformat etwa 0,1 M bis
etwa 3,0 M.
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Das
Verfahren der vorliegenden Erfindung kann bei Temperatur- und pH-Wertbereichen
ausgeführt werden,
in welchen der Katalysator und die Enzyme stabil sind. Der bevorzugten
Temperaturbereich ist etwa 15°C
bis etwa 40°C.
Insbesondere bevorzugt ist der Temperaturbereich von etwa 20°C bis etwa
37°C. Der
bevorzugte pH-Bereich ist etwa 5,0 bis etwa 8,0, insbesondere bevorzugt
etwa 6,0 bis etwa 7,0.
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Die
Konzentration des metallischen Katalysators, der eine katalytische
Menge des Katalysators in dem Verfahren dieser Erfindung zur Verfügung stellt,
wird von dem besonderen angewendeten metallischen Katalysator abhängen und
liegt bevorzugt in dem Bereich von 1,0 Mol-% bis etwa 100 Mol-%
beruhend auf dem Gewicht des Reaktanden. Der bevorzugte Konzentrationsbereich
für den
Katalysator Palladium auf Kohlenstoff ist etwa 10 Mol-% bis etwa
50 Mol-%.
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Ein
speziell bevorzugtes Katalysatorsystem weist ein Verhältnis des
Katalysators Palladium auf Kohlenstoff zu Substrat zwischen etwa
0,001 bis 1,0 und etwa 0,1 bis 1,0 auf.
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Die
Konzentration des Enzyms oder der Mikroorganismuszelle, welche eine
katalytische Menge eines gewünschten
Enzyms in dem Verfahren dieser Erfindung zur Verfügung stellt,
liegt bevorzugt in dem Bereich von etwa 0,001 Gew.-% bis etwa 10,0
Gew.-% beruhend auf dem Gewicht der gesamten Reaktionsmischung. Der
am meisten bevorzugte Konzentrationsbereich für das Enzym oder die Mikroorganismuszellen
ist etwa 0,01 Gew.-% bis etwa 1,0 Gew.-% beruhend auf dem Gewicht
der gesamten Reaktionsmischung.
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Die
Konzentration des Puffers, der in der vorliegenden Erfindung verwendet
werden kann, ist der, welcher den pH-Wert der Reaktion bei etwa
5,0 bis etwa 8,0 aufrecht erhalten wird. Bevorzugt wird der Puffer
in einer Menge vorhanden sein, welche zum Aufrechterhalten des pH-Werts
der Reaktion bei etwa 6,0 wirkungsvoll ist. Das kann zum Beispiel
unter Verwendung einer effektiven Menge von einem einmolaren Ammoniumformatpuffer
bewerkstelligt werden.
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Die
nun folgenden Beispiele sind als Illustration von gewissen bevorzugten
Ausführungsformen
der Erfindung gedacht, und es ist keine Begrenzung der Erfindung
erwünscht.
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BEISPIELE
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Beispiel 1
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Herstellung
des BioChem Katalysators
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Der
Mikroorganismusstrang Escherichia coli NS 3302, welcher Aminosäuredeaminaseenzyme
enthält,
wurde in unseren Labors konstruiert und aufrecht erhalten, wie in
dem U.S. Patent Nr. 5,728,555 beschrieben wurde. Die Produktion
und Fermentation des Strangs NS 3302 wurde so ausgeführt, dass
sie einem zweistufigen Standardprotokoll wie folgt folgte.
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Die
Kolonien des Strangs NS 3302 wurden von einer Petri-Schale in einen
280 ml Fernbachkolben eingeimpft, welcher einen Liter des folgenden
Wachstumsmediums enthielt:
Kaliumphosphat
(zweibasisch) | 13
g |
Kaliumphosphat
(einbasisch) | 2
g |
Ammoniumphosphat | 4
g |
Eisenammoniumcitrat | 0,24
g |
Hefeextrakt | 2
g |
Magnesiumsulfat | 1
g |
L-Isoleucin | 0,5
g |
L-Leucin | 0,5
g |
L-Valin | 0,5
g |
Wasser | 930
ml |
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Nach
der Sterilisierung wurden die folgenden Komponenten zugegeben:
Glucose
(50% w/v Brühe) | 70
ml |
Chloramphenicol | 0,01
g |
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Der
Kolben wurde in einen Rüttler-Brutschrank
bei 30°C
unter Bewegung ausgebrütet.
Der Strang wurde auf 1000 bis 1900 Klett-Einheiten angewachsen und
dazu verwendet, den Fermentierer einzuimpfen. Der Fermentierer war
ein Biolafitt 78–100
(St. Germain- en Laye, France) 20L. Der Fermentierer wurde unter den
folgenden Bedingungen betrieben:
Bewegung | 500
rpm |
Temperatur | 30°C |
Druck | 0,7
Bar |
pH
(Aufrechterhalten mit NH3) | 7,2 |
Belüftung | 1
vvm |
Eingesetztes
Volumen | 11
1 |
Einimpfung | 50
ml |
Betriebszeit | 19
Std. |
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Das
Fermentationsmedium wurde aus den folgenden Komponenten, pro Liter,
wenn nicht anderweitig angegeben, aufgebaut:
Magnesiumsulfat
(7·H20) | 5,35
g |
Eisenammoniumcitrat | 0,13
g |
Kaliumphosphat
(zweibasisch) | 4,6
g |
Mangansulfat | 0,023
g |
Kaliumiodid | 0,74
mg |
Nickelsulfat | 0,74
mg |
Antischaummittel
(Mazur Mazu DF204) | 0,4
ml |
Hefeextrakt | 10
g |
L-Isoleucin | 0,5
g |
L-Leucin | 0,5
g |
L-Valin | 0,5
g |
Cobaltsulfat | 0,054
mg |
Natriummolybdat
(2H2O) | 0,054
mg |
Kupfersulfat | 0,088
mg |
Zinkchlorid | 0,428
mg |
Leitungswasser | 11
l |
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Vor
der Animpfung wurde Glucose zugegeben, um eine Konzentration von
25 g pro Liter zu erreichen. Nachdem die anfängliche Glucose vollständig dezimiert
worden war, wurde Glucose mit einer variablen Rate zugeführt, um
für die
verbleibende Zeit weniger als 1 g/l zu erreichen, bis zu einer gesamten
Zugabe von 512 g. Das abschließende
Volumen in dem Behälter
war 11,4 1. Die Herstellung des Aminosäuredeaminaseenzyms war in den
abschließenden
drei Stunden der Fermentation Temperatur induziert. Die Induktionstemperatur
war 42°C
und begann, nachdem die Kultur 35 OD (Spectronic 20 Genesys von
Spectronic Instruments) erreicht hatte.
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Nach
den drei Stunden der Temperaturinduktion wurden die Zellen auf 15°C gekühlt und
durch Ultrafiltration unter Verwendung einer DC-10 Amicon Labscale
Ultrafiltrationseinheit und eines das Molekulargewicht abschneidenden
Technologiegrößen-Klassifizierers
AG 500 9-E geerntet. Die konzentrierten Zellen, welche etwa 125
g getrockneter Zellen pro Liter enthielten, wurden bei 4°C gelagert
und direkt als Katalysator für die
Biotransformationsreaktionen verwendet.
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Beispiel 2
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Umwandlung von L-Phenylalanin
zu D-Phenylalanin
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L-Phenylalanin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurde zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des nach Beispiel 1 hergestellten Katalysatorsystems
angeimpft. Die sich ergebende Reaktionsmischung wurde kontinuierlich
gerührt
und bei 30°C
für 16
Stunden gehalten, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und
der Überstand
auf den D-Phenylalanin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Tabelle
1 Umwandlung
von L-Aminosäuren
zu D-Aminosäuren
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Wie
Tabelle 1 zeigt, wurde das Katalysatorsystem dieser Erfindung dazu
verwendet, eine Anzahl von L-Aminosäure zu ihren
entsprechenden Enantiomeren umzuwandeln. Die Stereospezifität jeder
Reaktion wird durch den enantiomeren Überschuss angezeigt. Die Ergebnisse
zeigen, dass die Erfindung für
die Umwandlung von allen der in Tabelle 1 aufgeführten Aminosäuren mit
der Ausnahme von L-Valin (ee 65%) und L-Isoleucin (ee 50%) wirkungsvoll
war. Alle anderen L-Aminosäuren
wurden zu ihren entsprechenden D-Enantiomeren mit einem enantiomeren Überschuss
von mindestens 95% umgewandelt.
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Beispiel 3
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Umwandlung von L-Valin
zu D-Valin
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L-Valin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit
Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und
der Überstand
auf den D-Valin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 4
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Umwandlung von L-Tyrosin
zu D-Tyrosin
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L-Tyrosin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit
Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und
der Überstand
auf den D-Tyrosin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 5
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Umwandlung von L-Tryptophan
zu D-Tryptophan
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L-Tryptophan
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert
und der Überstand
auf den D- Tryptophan-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 6
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Umwandlung von L-Methionin
zu D-Methionin
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L-Methionin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert
und der Überstand
auf den D-Methionin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die
Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 7
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Umwandlung von L-Nor-Leucin
zu D-Nor-Leucin
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L-Nor-Leucin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert
und der Überstand
auf den D-Nor-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 8
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Umwandlung
von L-Nor-Valin zu D-Nor-Valin
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L-Nor-Valin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert
und der Überstand
auf den D-Nor-Valingehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert. Die
Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 9
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Umwandlung von L-Leucin
zu D-Leucin
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L-Leucin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche mit
Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert und
der Überstand
auf den D-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Beispiel 10
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Umwandlung von L-Iso-Leucin
zu D-Iso-Leucin
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L-Iso-Leucin
(20 mg) wurde in 2,0 ml einer einmolaren wässrigen Ammoniumformatlösung gelöst, welche
mit Ameisensäure
auf einen pH-Wert von 6,0 eingestellt worden war. 20 mg 5%iges Palladium
auf Kohlenstoff (feucht, 50% Wasser) wurden zugegeben und die Suspension
mit 0,1 ml des gemäß Beispiel
1 hergestellten Katalysatorsystems angeimpft. Die sich ergebende
Reaktionsmischung wurde kontinuierlich gerührt und bei 30°C für 16 Stunden
aufbewahrt, während
sie Luft ausgesetzt war. Das Reaktionsprodukt wurde zentrifugiert
und der Überstand
auf den D-Iso-Leucin-Gehalt durch chirale Dünnschichtchromatographie analysiert.
Die Ergebnisse der Analyse werden in Tabelle 1 dargelegt.
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Andere
Variationen und Modifikationen dieser Erfindung werden für einen
Fachmann offensichtlich sein. Diese Erfindung ist nicht begrenzt,
außer
durch den beigefügten
Anspruchsatz.