CN117925507A - 牛奶外泌体及其提取纯化方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一牛奶外泌体及其提取纯化方法。该牛奶外泌体提取纯化方法包括以下步骤：处理牛奶，得过滤液；第一次浓缩：浓缩该过滤液，其中用500KD中空纤维柱对该过滤液进行浓缩，以得到首次浓缩液；分子筛层析：分子筛层析该首次浓缩液，以得到层析液；第二次浓缩：浓缩该层析液，其中再次利用500KD中空纤维柱对该层析液进行浓缩，并进一步使用100KD超滤柱浓缩，以得到再次浓缩液；除菌。
Description
技术领域
本发明涉及细胞外囊泡提取纯化方法，尤其涉及一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法。
背景技术
外泌体和其他小的细胞外囊泡是越来越被广泛认可的生物颗粒。外泌体可以用于科研、诊断，化妆品及医药等领域。
外泌体的提取主要包括以下几种方法：
一、超速离心法。超速离心法是外泌体提取最常用的方法。该方法得到的外泌体量多，但是纯度不足，电镜鉴定时发现外泌体聚集成块，由于微泡和外泌体没有非常统一的鉴定标准，也有一些研究认为此种方法得到的是微泡不是外泌体。
二、过滤离心法。过滤离心法操作简单、省时，不影响外泌体的生物活性，但同样存在纯度不足的问题。
三、密度梯度离心法。密度梯度离心法分离到的外泌体纯度高，但是前期准备工作繁杂，耗时，量少。
四、免疫磁珠法。免疫磁珠法可以保证外泌体形态的完整，特异性高、操作简单、不需要昂贵的仪器设备，但是非中性pH和非生理性盐浓度会影响外泌体生物活性，不便进行下一步的实验。
五、色谱法。色谱法分离到的外泌体在电镜下大小均一，但是需要特殊的设备，应用不广泛。
六、微流控分离法。微流控分离法通过负压及震荡等机械原理分离外泌体，产量纯度均具有较大幅度提高，但需要特定设备配合。
中国发明专利申请CN114790439A公开了一种牛奶外泌体的制备方法，其提出了柠檬酸、磷酸钠沉淀法、EDTA沉淀蛋白法去除酪蛋白，并且提出硫酸铵去除酪蛋白方法，去除酪蛋白之后后续应用切向流超滤法实现其他杂蛋白的去除，接着利用色谱柱进行精细纯化，以实现牛奶外泌体的生产。然而上述方法中，柠檬酸等溶剂酸性较强，并且只有初步纯化中使用一次切向流超滤法导致外泌体产品中杂蛋白依然较多而纯度不高。
发明内容
本发明的一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，以在分子筛层析前后通过两次中空纤维柱浓缩以得到高纯度外泌体。
本发明的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其通过EDTA溶液和醋酸钠缓冲液来处理牛奶以得到澄清液体，从而方便有效地去蛋白。
本发明的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其在分子筛层析后通过中空纤维柱和超滤柱浓缩以在保持较高浓度的外泌体同时去除杂蛋白提高外泌体纯度。
本发明的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其在超滤柱浓缩以后经过滤除菌步骤从而得到最终的牛奶外泌体产品。
本发明的另一个优势在于提供一种牛奶外泌体及其提取方法和纯化方法，其中所述提取方法和纯化方法稳定、可靠。
本发明的其它优势和特点通过下述的详细说明得以充分体现并可通过所附权利要求中特地指出的手段和装置的组合得实现。
依本发明的一个方面，能够实现前述目的和其他目的的优势的一种牛奶外泌体提取纯化方法，包括以下步骤：
A)处理牛奶，得过滤液；
B)第一次浓缩：浓缩所述过滤液，其中用中空纤维柱对所述过滤液进行浓缩，以得到首次浓缩液；
C)分子筛层析：分子筛层析所述首次浓缩液，以得到层析液；
D)第二次浓缩：浓缩所述层析液，其中再次利用中空纤维柱对所述层析液进行浓缩，以得到再次浓缩液；
E)除菌。
根据本发明的一个实施例，其中在步骤B)和步骤D)中通过500KD中空纤维柱浓缩。
根据本发明的一个实施例，在步骤D)中，在通过500KD中空纤维柱再次浓缩以后，进一步使用100KD超滤柱浓缩。
根据本发明的一个实施例，步骤E通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
根据本发明的一个实施例，步骤A包括以下步骤：
A2)去脂，得乳清；
A3)澄清：处理所述乳清，得“透明状”液体。
A4)去蛋白：对所述“透明状”液体进行去蛋白处理；
A5)膜过滤。
根据本发明的一个实施例，所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤A进一步包括一步骤A1：在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶，其中步骤A1在步骤A2前进行。
根据本发明的一个实施例，步骤A3包括以下步骤：
A31)加入试剂一至所述乳清中，其中所述乳清和所述试剂一被混匀，从而得到黄色澄清液体；和
A32)加入试剂二至所述乳清中，所得混合液被缓慢颠倒混匀，直至固液分离并且液体部分为“透明状”；
其中所述试剂一是指0.25MEDTA溶液，其中所述试剂二是指醋酸钠缓冲液。
根据本发明的一个实施例，所述试剂一的配置方法如下：称取36.53gEDTA粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gNaOH固体加入溶解，调节pH值至7.0，其中若pH值偏差太大，用HCl和NaOH溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25MEDTA溶液。
根据本发明的一个实施例，所述试剂二的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的pH值是4.0。
根据本发明的一个实施例，所述乳清与所述试剂一的体积比例为10:1，其中所述乳清与试剂二的体积比例≤10:1，其中10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”。
根据本发明的一个实施例，步骤C利用AKTA蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
根据本发明的一个实施例，步骤A1在25℃迅速解冻所述冻牛奶。
根据本发明的一个实施例，步骤A2的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心20min。
根据本发明的一个实施例，步骤A4的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心10min，取上清液，其中所述上清液用5MNaOH或NaHCO3调成中性。
根据本发明的一个实施例，步骤A5包括以下步骤：
A51)0.65μm膜抽滤；和
A52)0.22μm膜抽滤。
依本发明的另一个方面，本发明进一步提供一种牛奶外泌体，其粒径为150nm-160nm。
根据本发明的一个实施例，所述牛奶外泌体由以上牛奶外泌体提取纯化方法提取纯化得到。
根据本发明的一个优选实施例，所述牛奶外泌体的粒径为154。
附图说明
图1是根据本发明的第一个优选实施例的一种牛奶外泌体提取纯化方法的流程图。
图2A至图2C是根据本发明的上述第一个优选实施例的该牛奶外泌体提取纯化方法所得外泌体的TEM电镜检测结果图。
图3是根据本发明的上述第一个优选实施例的该牛奶外泌体提取纯化方法所得外泌体的NTA检测结果图。
图4是根据本发明的上述第一个优选实施例的该牛奶外泌体提取纯化方法所得外泌体的ZETA电位检测结果图。
图5是根据本发明的上述第一个优选实施例的该牛奶外泌体提取纯化方法各个步骤所得液体的电泳图。
图6是根据本发明的第二个实施例的一种牛奶外泌体提取纯化方法的流程图。
图7是根据本发明的上述第二个实施例的该牛奶外泌体提取纯化方法各个步骤所得液体的电泳图。
具体实施方式
以下描述用于揭露本发明以使本领域技术人员能够实现本发明。以下描述中的优选实施例只作为举例，本领域技术人员可以想到其他显而易见的变形。在以下描述中界定的本发明的基本原理可以应用于其他实施方案、变形方案、改进方案、等同方案以及没有背离本发明的精神和范围的其他技术方案。
本发明公开了一种牛奶外泌体的提取纯化方法，其中外泌体是指直径在20-300nm之间的细胞外囊泡。外泌体包含包围内部空间的膜，在一些方面，外泌体还包括支架部分。外泌体可源自生产细胞，并基于其大小、密度、生化参数或其组合从生产细胞中分离。在一些方面，外泌体由表达一种或多种转基因产物的细胞产生。外泌体可源自活的或死的生物体、外植的组织或器官、原核或真核细胞、和/或培养的细胞。本发明的的牛奶外泌体是指来源是牛奶的细胞外囊泡。
参考说明书附图之图1，根据本发明的第一个优选实施例的一种牛奶外泌体提取及纯化方法以冻牛奶为原料提取牛奶外泌体，包括如下步骤：
A)处理牛奶，以得到含有牛奶外泌体的过滤液；
B)浓缩所述过滤液，其中用500KD中空纤维柱对所述过滤液进行浓缩，以得到首次浓缩液；
C)分子筛层析所述首次浓缩液，以得到层析液；
D)浓缩所述层析液，其中再次利用500KD中空纤维柱对所述层析液进行浓缩，以得到再次浓缩液；
E)除菌。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤E通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
根据本发明的上述第一个优选实施例，所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤A包括以下步骤：
A1)解冻：解冻冻牛奶；
A2)去脂：去脂得乳清；
A3)澄清：处理所述乳清，得“透明状”液体。
A4)去蛋白：对所述“透明状”液体进行去蛋白处理；
A5)膜过滤。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤A1在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶。优选地，步骤A1在25℃迅速解冻所述冻牛奶。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤A3包括以下步骤：
A31)加入试剂一至所述乳清中，其中所述乳清和所述试剂一被混匀，从而得到黄色澄清液体；和
A32)加入试剂二至所述乳清中，所得混合液被缓慢颠倒混匀，直至固液分离并且液体部分为“透明状”。
根据本发明的上述第一个优选实施例，所述乳清与所述试剂一的体积比为10:1。
根据本发明的上述第一个优选实施例，所述乳清与试剂二的体积比≤10:1。具体地，体积比为10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤C利用AKTA蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤A2的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心20min。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤A4的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心10min，取上清液，其中所述上清液用5MNaOH调成中性。所述上清液也可以采用其它试剂来调节pH，如NaHCO3。
根据本发明的上述第一个优选实施例，步骤A5包括以下步骤：
A51)0.65μm膜抽滤；和
A52)0.22μm膜抽滤。
上述第步骤A3中试剂一是指0.25MEDTA溶液，其中0.25MEDTA溶液的配置方法如下：称取36.53gEDTA粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gNaOH固体加入溶解，调节pH值至7.0，其中若pH值偏差太大，用HCl和NaOH溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25MEDTA溶液。
步骤A3中试剂二是指醋酸钠缓冲液，其中所述醋酸钠缓冲液的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的pH值是4.0。
根据本发明的上述第一个优选实施例，在牛奶外泌体提取纯化的各个阶段产物进行了BCA浓度检测，BCA浓度检测结果见下表1。
表1牛奶外泌体提取纯化过程中的BCA浓度检测结果
注：BCA浓度检测，又称BCA蛋白浓度检测，是根据吸光值推算出蛋白浓度。碱性条件下，蛋白将Cu2+还原为Cu+，Cu+与BCA试剂形成紫颜色的络合物，两分子BCA螯合一个Cu+。将该水溶性复合物在562nm处的吸收值，与标准曲线对比，即可计算待测蛋白的浓度。
图2是本发明的上述第一个优选实施例所得外泌体的TEM电镜检测结果图。图2显示，纯化后得到的样品中含有外泌体，且形状符合正常的293F细胞上清液分离纯化的外泌体。
图3是本发明的上述第一个优选实施例所得外泌体的NTA检测结果图。图3表明，所得外泌体的粒径大小为150-155nm，更具体地，所得外泌体的粒径为154nm，浓度为2.3E+6/ml，占比为98.1％。更具体地，所得外泌体的粒径为154.1nm，浓度为2.3E+6/ml，占比为98.1％。
图4是上述第一个优选实施例所得外泌体的ZETA电位检测结果图。图4表明，样品中颗粒所带电荷均为负电荷，与外泌体本身带负电荷性质相符。
说明书附图之图5是根据本发明的上述第一个优选实施例的所述牛奶外泌体提取纯化工艺各个步骤中液体的电泳对比图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别显示以下步骤试样的条带图：去脂、去蛋白、0.22μm膜抽滤、500KD中空纤维柱浓缩、分子筛层析、500KD中空纤维柱浓缩、100KD中空纤维柱浓缩、0.22μm滤器除菌。由图5可知，经过500KD中空纤维柱浓缩步骤以后，从电泳结果看，杂带明显减少。500KD中空纤维柱的使用具有显著的提高外泌体纯度的效果。
参考说明书附图之图6，根据本发明的第二个实施例，其作为对比实施例的一种牛奶外泌体提取及纯化方法包括如下步骤：
a)解冻：取240ml冻牛奶，25℃迅速解冻；
b)去脂：4℃，11000rpm，20min，分离为三层，其中上层为凝固的脂类，其中最下层沉淀为蛋白质，取中间层，共收取216ml乳清；
c)澄清：对去脂后的乳清，做如下处理：①加入试剂一至所述乳清中，其中乳清与试剂一体积比为10:1，其中加入试剂一后上下缓慢颠倒混匀，乳清变成黄色澄清液体；②加入试剂二至所述乳清中，其中乳清与试剂二体积比为10:1，其中加入试剂二后上下缓慢颠倒混匀，出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则可继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”；
d)去蛋白：4℃，11000rpm，离心10min，取上清液，上清液用5MNaOH调成中性。
e)第一次浓缩：过滤液用500KD中空纤维柱进行浓缩(洗滤5次)。
f)分子筛层析：利用AKTA蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
g)第二次浓缩：用100KD超滤柱进行浓缩，其中转速为4000～5000rpm，其中离心时间为10～15min。
h)除菌：0.22μm膜滤器除菌。
步骤c中试剂一是指0.25MEDTA溶液，其中0.25MEDTA溶液的配置方法如下：称取36.53gEDTA粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gNaOH固体加入溶解，调节pH值至7.0，其中若pH值偏差太大，用HCl和NaOH溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25MEDTA溶液。
步骤c中试剂二是指醋酸钠缓冲液，醋酸钠缓冲液的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的pH值是4.0。
根据本发明的上述第二个优选优选实施例，在牛奶外泌体提取纯化的各个阶段产物进行了BCA浓度检测，BCA浓度检测结果见下表2。
表2牛奶外泌体提取纯化过程中的BCA浓度检测结果
| 阶段 | 浓度(ng/ul) |
| 去脂 | 5687.83 |
| 去蛋白 | 2788.81 |
| 0.65μm膜过滤 | 2625.34 |
| 0.22μm膜过滤 | 2470.15 |
| 500KD中空纤维柱浓缩(第一次浓缩) | 924.42 |
| 分子筛层析纯化 | 59.47 |
| 100KD超滤柱浓缩后除菌 | 3140.59 |
表3对上述第一个优选实施例和上述第二个实施例的实验数据进行了对比：
表3实验数据对照表
| 参数 | 第一个优选实施例 | 第二个实施例 |
| 初体积(ml)(去脂后) | 200 | 216 |
| 初浓度(ng/ul)(去脂后) | 6959.80 | 5687.83 |
| 初始蛋白总量(mg) | 1391.96 | 1228.57 |
| 终体积(ml) | 1.25 | 1 |
| 终浓度(ng/ul) | 130.82 | 3140.59 |
| 终蛋白总量(mg) | 0.164 | 3.14 |
| 得率(终蛋白量/初蛋白量) | 0.012％ | 0.256％ |
由表3可知，实施例二中，分子筛层析后，不用500KD中空纤维柱进行缩，得率和产物浓度较高。
说明书附图之图7是根据本发明的上述第二个实施例的所述牛奶外泌体提取纯化工艺各个步骤中液体的电泳对比图，其中泳道1、2、3、4、5、6、7、8分别显示以下步骤试样的条带图：去脂、蛋白、0.65μm膜抽滤、0.22μm膜抽滤、500KD中空纤维柱浓缩、分子筛层析、100KD中空纤维柱浓缩、0.22μm滤器除菌。由图7可知，分子筛后，500KD中空纤维柱浓缩步骤的减少，从电泳结果看，100KD超滤柱对纯度的影响基本没有，杂带较多。500KD中空纤维柱使用与否，纯度影响较大。
本领域的技术人员应理解，上述描述及附图中所示的本发明的实施例只作为举例而并不限制本发明。本发明的目的已经完整并有效地实现。本发明的功能及结构原理已在实施例中展示和说明，在没有背离所述原理下，本发明的实施方式可以有任何变形或修改。
Claims (17)
1.一种牛奶外泌体提取纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：
A)处理牛奶，得过滤液；
B)第一次浓缩：浓缩所述过滤液，其中用中空纤维柱对所述过滤液进行浓缩，以得到首次浓缩液；
C)分子筛层析：分子筛层析所述首次浓缩液，以得到层析液；以及
D)第二次浓缩：浓缩所述层析液，其中再次利用中空纤维柱对所述层析液进行浓缩，以得到再次浓缩液。
2.根据权利要求1所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤D)后，还包括步骤E：通过0.22μm膜滤器对所述再次浓缩液进行除菌。
3.根据权利要求2所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A包括以下步骤：
A2)去脂，得乳清；
A3)澄清：处理所述乳清，得“透明状”液体。
A4)去蛋白：对所述“透明状”液体进行去蛋白处理；
A5)膜过滤。
4.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述牛奶外泌体提取纯化方法以冻牛奶为原料，其中步骤A进一步包括一步骤A1：在20-30℃迅速解冻所述冻牛奶，其中步骤A1在步骤A2前进行。
5.根据权利要求3所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A3包括以下步骤：
A31)加入试剂一至所述乳清中，其中所述乳清和所述试剂一被混匀，从而得到黄色澄清液体；和
A32)加入试剂二至所述乳清中，所得混合液被缓慢颠倒混匀，直至固液分离并且液体部分为“透明状”；
其中所述试剂一是指0.25MEDTA溶液，其中所述试剂二是指醋酸钠缓冲液。
6.根据权利要求5所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂一的配置方法如下：称取36.53gEDTA粉末，溶于400ml超纯水中；再称取15gNaOH固体加入溶解，调节pH值至7.0，其中若pH值偏差太大，用HCl和NaOH溶液进行校准，最终定容至500ml，以得到500ml0.25MEDTA溶液。
7.根据权利要求6所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述试剂二的配置方法如下：取醋酸钠10.2g粉末，加冰醋酸40ml，加水稀释至500ml，充分混匀，得到500ml醋酸钠缓冲液，其中醋酸钠缓冲液的pH值是4.0。
8.根据权利要求7所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中所述乳清与所述试剂一的体积比例为10:1，其中所述乳清与试剂二的体积比例≤10:1，其中10:1的所述乳清和所述试剂二被混合后缓慢颠倒混匀，直至出现白色絮状沉淀，即固液分离现象，其中如果未发生固液分离现象或者液体部分仍有“乳白色”，则继续加入适当量的试剂二，直至液体部分为“透明状”。
9.根据权利要求1-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤B)和步骤D)中通过500KD中空纤维柱浓缩。
10.根据权利要求9所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中在步骤D)中，在通过500KD中空纤维柱再次浓缩以后，进一步使用100KD超滤柱浓缩。
11.根据权利要求1-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤C利用AKTA蛋白纯化仪，借助凝胶分子筛进行纯化，每次上样量≤50ml。
12.根据权利要求4所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A1在25℃迅速解冻所述冻牛奶。
13.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A2的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心20min。
14.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A4的操作条件是在4℃温度条件下以11000rpm的转速离心10min，取上清液，其中所述上清液用5MNaOH或NaHCO3调成中性。
15.根据权利要求3-8中任意一项所述的牛奶外泌体提取纯化方法，其中步骤A5包括以下步骤：
A51)0.65μm膜抽滤；和
A52)0.22μm膜抽滤。
16.一种牛奶外泌体，其特征在于，所述牛奶外泌体的粒径为150nm-160nm。
17.根据权利要求14所述的牛奶外泌体，其中所述牛奶外泌体由权利要求1-8中任意一项所述牛奶外泌体提取纯化方法提取纯化得到。
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