CN103386126A - 一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物，其含有灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原、灭活的脊髓灰质炎抗原。所述多价免疫原性组合物还可包含选自甲肝抗原、乙肝抗原、无细胞百日咳抗原、破伤风类毒素、白喉类毒素、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖、脑膜炎球菌多糖抗原和与细菌多糖抗原结合的生理可接受的载体。本发明还提供了所述多价免疫原性组合物的制备方法。本发明的多价免疫原性组合物可以同时预防多种病原体的侵染，并且这些抗原之间不存在相互干扰的现象，相应的免疫原性较单独抗原激发的免疫原性不会降低；且使用本发明所述多价免疫原性组合物可以明显简化疫苗接种程序，提高接种效率并降低成本。

Description

一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及一种含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物。

背景技术

（1）手足口病及手足口病原体

手足口病是一种常见的、轻微的，但多发的且传染性极高的疾病。手足口病一年四季均可发生，常见以夏秋季较多。大部分患者症状轻微，主要以发热，手、足和口腔等部位的皮疹和疱疹为主。少数病例(尤其是小于3岁者)可出现脑炎、脑脊髓炎、脑膜炎、肺水肿、循环衰竭等。个别重症患儿病程发展较快，易导致死亡。手足口病可由多种肠道病毒感染引起，其中肠道病毒71型（Enteroviruse EV71）和柯萨奇病毒A组16型（Coxsackievirus A16,CA16）为主要流行毒株。

人肠道病毒71型(EV71)属于小RNA病毒科,基因组为单股正链RNA,长度约为7400个核苷酸,仅含有一个开放读码框,编码的多聚蛋白约含2190个氨基酸。该病毒最早于1969～1970年间在美国加利福尼亚州发生中枢神经系统症状的婴儿粪便中分离得到。电镜观察发现该病毒的形态及理化特性都与当时已知的其他肠道病毒类似,但中和抗体试验和免疫扩散试验却未发现交互作用,因此认为是一种新型肠道病毒,命名为人肠道病毒71型。

柯萨奇病毒A组16型于1958年被分离出，CA16是单正链RNA病毒，病毒颗粒呈球形，为二十面体立体对称，无包膜。基因组长约7400bp,包括5′及3′端的非编码区和中间一个大的开放读码框(ORF),依次由VP4、VP2、VP3、VP1、2A、2B、2C、3A、3B、3C、3D11个基因组成,主要编码产生病毒结构蛋白。

在历次手足口病的流行中,EV71与CA16交替或共同出现,成为HFMD的主要病原体。1963年在日本东京首次发现手足口病，至1988年共发生6次全国性大流行，其中1982年大流行报告14万余病例；20世纪70年代中期，保加利亚发生EV71流行，有750人发病，其中149人发生瘫痪,死亡44人；1994年在英国发生由CA16引起的手足口病爆发；20世纪90年代后期，EV71开始在东亚地区流行；1997年马来西业发生EV71流行，2-8月共报告2628例,死亡29例；澳大利亚（1972-1973年1986年和1999年）、新加坡（1997-1998年）、马来西亚和新加坡（2000年）等地先后出EV71引起的爆发流行，发生病例数万至数十万例。

我国1981年上海首次报道手足口病，1983年在天津发生CA16流行、1986年在天津再次发生CA16流行；1987年我国香港地区发生EV71流行；1998年，我国台湾地区发生EV71手足口病流行；2000年上海市发生手足口病爆发；2006年全国共报告手足口病13637例，死亡6例；除西藏外，全国31个省自治区直辖市均有病例报告；2007年全国共报告手足口病83344例，死亡17例，仅山东省就报告病例39606例，死亡14例。2008年3月，我国安徽省阜阳市，爆发了由EV71引起的手足口病疫情，疫情迅速蔓延至河南、湖北、广东、江苏、北京等省市。2008年5月2日，卫生部将手足口病列入《中华人民共和国传染病防治法》规定的丙类传染病进行管理，各地加强对手足口病的监测和报告，并通过国家疾病监测管理直报系统及时上报疫情信息。

（2）脊髓灰质炎及脊髓灰质炎病原体

脊髓灰质炎是由病毒感染人引起的高传染性疾病。脊髓灰质炎病毒可以侵染人体神经系统，并可在数小时内导致病人肢体麻痹，造成终身残疾。脊髓灰质炎可在所有年龄段人群中发生，但好发于小于5岁的婴幼儿，因此该病又称为“小儿麻痹症”。

脊髓灰质炎病毒属于小核糖核酸病毒科的肠道病毒属。电子显微镜下观察病毒呈小的圆球形，直径为24-30nm，呈圆形颗粒状。脊髓灰质炎病毒含有单股正链RNA，被3个外壳蛋白包裹，分别为VP1-3，另外一个VP4蛋白为内壳蛋白。脊髓灰质炎病毒按照血清型分类可以分为I、II和III型，均可以致病。

被脊髓灰质炎病毒感染的绝大部分人（90%）不会出现临床症状或只有轻微症状，如发烧、疲倦头疼、呕吐和肢体疼痛等。在被感染人群中，只有大约0.5%的人会变成终身残疾，主要是因为病毒通过血液侵入神经系统，破坏控制人体肌肉的神经细胞，导致机体麻痹失调，临床上被称为急性弛缓性麻痹。在导致残疾的人群中，有大约5-10%的人会因为呼吸中枢神经系统遭到破坏而死亡。在幸存下来的人群中有大约40%在随后的15-40年中会再次出现肌肉麻痹和肢体疼痛等症状，被称为后小儿麻痹症综合症。被脊髓灰质炎病毒感染并诱发造成终身瘫痪的人往往存在如下体征：免疫力缺陷、怀孕、切除过扁导体、肌肉注射、剧烈运动或者受过伤等。

到目前为止医学界还没有治疗脊髓灰质炎的特效药，仅能通过缓解症状来治疗病人，比如通过物理疗法和服用止痉挛药来缓解肌肉麻痹和紧张。但是脊髓灰质炎可以通过注射疫苗来达到良好的预防效果。

灭活的脊髓灰质炎疫苗（IPV）最先由Salk博士在上世纪50年代开发成功。1954年在美国进行了大规模临床试验，次年临床试验结果证明疫苗具有良好的安全性和保护性，随后在美国开展了大规模接种活动。另外一种减毒口服的脊髓灰质炎疫苗（OPV）由Sabin博士在上世纪六十年代开发成功，并迅速在世界范围内使用，为防治脊髓灰质炎疫情贡献了坚实力量。我国也几乎与世界同步开始生产OPV疫苗并对儿童进行了大规模接种，累计已经供应了约50亿人份的三价OPV疫苗。

灭活脊髓灰质炎疫苗的生产工艺在两个时期经历了质的飞跃，首先是荷兰人Wezel博士通过选育猴肾细胞成功开发了微载体细胞和病毒培养技术以及病毒纯化技术；随后赛诺菲巴斯德的Montagnon博士通过引入Vero传代细胞培养病毒，使IPV疫苗的免疫原性得到了显著提高。

随着在世界范围内大规模接种OPV和IPV疫苗，脊髓灰质炎疫情得到了极大的控制。1988年世界卫生组织（WHO）启动了全球脊髓灰质炎消灭行动，首先鼓励发展中国家在计划免疫中使用多价或单价的OPV，从而彻底阻断自然界中野生脊髓灰质炎病毒在人群中的传染，随后使用灭活的脊髓灰质炎疫苗逐步代替OPV疫苗，从而避免因服用减毒活疫苗带来的疫苗衍生脊髓灰质炎病毒（VDPV）和脊髓灰质炎疫苗相关病例（VADP）。此种灭活的脊髓灰质炎疫苗可分为两类：由野毒株制备的灭活IPV疫苗和由减毒株制备的灭活疫苗（sabin-IPV）。前者已经在发达国家普遍使用多年，且效果良好，不过生产IPV使用野毒株极大的限制了在发展中国家的推广使用，尤其是在消灭脊髓灰质炎病毒后时代，WHO会更严格限制野毒株的使用，因此sabin-IPV疫苗就成为代替OPV疫苗在发展中国家推广使用的一种新产品。

（3）含多种抗原的联合疫苗

联合疫苗的运用可以使机体在获得多种病原体保护的同时减少免疫次数、降低给药成本和增加疫苗接种率和覆盖率，是一种非常理想的疫苗形式。但联合疫苗在研发的过程中有其特殊的技术壁垒。如联合疫苗中多种抗原组分在机体内的抗原竞争或干扰现象使研发技术复杂化。抗原干扰是指观察到施用多种抗原经常导致针对某些抗原的应答相对于这些抗原单独施用时的免疫应答减小。

已知联合疫苗可预防百日咳杆菌，破伤风杆菌、白喉杆菌，和可选的预防灭活的脊髓灰质炎病毒（IPV）和/或乙肝病毒和/或B型嗜血杆菌感染；可预防麻疹、风疹和腮腺炎的麻风腮三联疫苗。

和脊髓灰质炎疫苗相关的在研联苗有：脊髓灰质炎疫苗和B型嗜血杆菌联合疫苗，脊髓灰质炎疫苗（sIPV）和DTaP（百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌），脊髓灰质炎疫苗（sIPV）和DTaP（百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌）和HiB（B型嗜血杆菌），脊髓灰质炎疫苗（sIPV）和DTP（百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌）；六联苗：IPV和DTaP（百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌）、B型嗜血杆菌、乙肝。和脊髓灰质炎疫苗相关的已上市产品有五联苗：IPV和DTaP（百日咳杆菌、白喉杆菌、破伤风杆菌）、B型嗜血杆菌。

和手足口病疫苗相关的联苗有：甲肝和手足口病二联苗（发明专利201110129073.7），乙型脑膜炎和手足口联合疫苗（发明专利201110005142.3）。

脊髓灰质炎疫苗作为针对婴幼儿计划免疫的疫苗，有广泛的受种人群，且接种年龄群为婴幼儿至学龄前儿童。手足口病近10年来的发病率有逐年增加的趋势，且发病主要年龄段也为婴幼儿和学龄前儿童。在研手足口病疫苗和已上市脊髓灰质炎疫苗均为多剂免疫，受种人群需要多次接种，费时费力。

因此，研发一种同时包含手足口病疫苗和脊髓灰质炎疫苗或同时还含其它疫苗的联合疫苗，具有广阔的应用价值和市场前景。

发明内容

为解决上述问题，本发明的目的是提供一种包含肠道病毒抗原的多价免疫原性组合物。

本发明提供了一种多价免疫原性组合物，其含有：

（1）灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原

（2）灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。

所述多价免疫原性组合物中，灭活脊髓灰质炎病毒为三型，优选为灭活的sabin株，包含sabin I型、sabin II型和sabin III型。

所述多价免疫原性组合物含有300-1200U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有1000-8000U单位/人份的灭活CA16抗原；优选地，所述多价免疫原性组合物含有600-1000U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有2000-6000U单位/人份的灭活CA16抗原；最优选地，所述多价免疫原性组合物含有800-1000U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有4000-6000U单位/人份的灭活CA16抗原。

所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原1.5-20D单位/人份,sabin II型抗原2-40D单位/人份,sabin III型抗原5-70D单位/人份；优选地，所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原5-15D单位/人份,sabin II型抗原10-30D单位/人份,sabin III型抗原10-40D单位/人份；最优选地，所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原5-10D单位/人份,sabin II型抗原10-20D单位/人份,sabin III型抗原15-35D单位/人份。

其中，所述多价免疫原性组合物还含有甲肝抗原、乙肝抗原、百日咳类毒素、丝状血凝素、菌毛抗原、破伤风类毒素、白喉类毒素、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原、脑膜炎菌多糖抗原中的一种或多种。

所述多价免疫原性组合物还包含如下一种或多种抗原：50-1000U/人份的甲肝抗原、5-40ug/人份的乙肝抗原，5-40ug/人份的百日咳类毒素，5-40ug/人份的丝状血凝素，2.5-20ug/人份的菌毛抗原，2.5-30lf/人份的破伤风类毒素，10-50lf/人份的白喉类毒素，2.5-30ug/人份的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。

优选地，所述多价免疫原性组合物还包含如下一种或多种抗原：100-600U/人份的甲肝抗原、15-30ug/人份的乙肝抗原，20-35ug/人份的百日咳类毒素，20-35ug/人份的丝状血凝素，5-15ug/人份的菌毛抗原，8-20lf/人份的破伤风类毒素，20-40lf/人份的白喉类毒素，5-20ug/人份的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。

最优选地，所述多价免疫原性组合物还包含如下一种或多种抗原：250-600U/人份的甲肝抗原、20-30ug/人份的乙肝抗原，25-35ug/人份的百日咳类毒素，25-35ug/人份的丝状血凝素，8-15ug/人份的菌毛抗原，10-20lf/人份的破伤风类毒素，25-40lf/人份的白喉类毒素，10-20ug/人份的b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。

所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原，包括2.5-30ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的C群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，2.5-30ug/人份的Y群脑膜炎多糖抗原。

优选地，所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原，包括5-20ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的C群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，5-20ug/人份的Y群脑膜炎多糖抗原。

最优选地，所述多价免疫原性组合物还包含四种血清型的脑膜炎多糖抗原，包括10-20ug/人份的A群脑膜炎多糖抗原，10-20ug/人份的C群脑膜炎多糖抗原，10-20ug/人份的W群脑膜炎多糖抗原，10-20ug/人份的Y群脑膜炎多糖抗原。

所述多价免疫原性组合物还包含生理可接受的载体，优选为与细菌多糖抗原结合的生理可接受的载体。如：包含可与b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋白，如10-50ug/人份的破伤风类毒素载体，也可选自白喉类毒素、白喉CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。所述多价免疫原性组合物还包含可与脑膜炎多糖抗原缀合的生理可接受的载体蛋白，如30-200ug/人份的白喉类毒素载体，也可选自白喉类毒素，白喉CRM197蛋白和脑膜炎外膜蛋白或任何已知的其它载体。

细菌多糖与载体蛋白的偶联方法使用公知技术，包括使用1-氰基-4-二甲氨基吡啶四氟硼酸盐（CDAP）活化多糖抗原后与载体蛋白共价连接，也包括使用还原胺化法处理多糖和载体蛋白的偶联，或者使用溴化氰活化多糖后与载体蛋白偶联的方法。

所述多价免疫原性组合物还有含有一种佐剂，所述佐剂为铝盐；优选地，所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝；进一步优选地，所述佐剂为氢氧化铝。

所述多价免疫原性组合物的剂型为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。

本发明还提供了所述多价免疫原性组合物的制备方法，所述方法包括如下步骤：

（1）制备灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原原液；

（2）制备灭活的脊髓灰质炎病毒抗原原液；

（3）制备灭活的甲肝抗原原液，乙肝抗原原液，百日咳抗原原液，白喉抗原原液，破伤风抗原原液，hib多糖蛋白缀合物抗原原液和脑膜炎球菌A、C、W135、Y群抗原原液中的一种或多种；

（4）将灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原原液与脊髓灰质炎病毒抗原原液进行搅拌混合，作为一种抗原混合物I；将甲肝抗原原液、乙肝抗原原液、百日咳抗原原液、破伤风抗原原液、白喉抗原原液、hib多糖蛋白缀合物抗原原液和脑膜炎球菌A、C、W135、Y群抗原原液按照不同价次需求与抗原混合物I进行搅拌混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。

步骤（1）为肠道病毒抗原原液的制备，主要针对EV71病毒和/或者CA16病毒，通过对EV71或CA16病毒的培养、收获、灭活和纯化实现，其中病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；病毒抗原的灭活使用甲醛，方法参照灭活甲肝疫苗的相关要求。病毒抗原的纯化可包括糖密度梯度离心、浓缩、酶切和分子筛层析。

步骤（2）中，脊髓灰质炎病毒抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括三种血清型脊灰病毒的培养、收获、纯化和灭活，其中脊灰病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如2BS细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；脊灰抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩、分子筛层析和离子交换层析；脊灰抗原的灭活使用甲醛，方法符合WHO对灭活脊灰疫苗指导原则中对灭活步骤的要求。

步骤（3）中，百日咳抗原原液中含有百日咳类毒素、丝状血凝素和菌毛抗原；破伤风抗原原液中含有破伤风类毒素；白喉抗原原液中含有白喉类毒素；hib多糖蛋白缀合物抗原原液中含有b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原。

步骤（3）中，甲肝抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括甲肝病毒的培养、收获、纯化和灭活，其中甲肝病毒培养的细胞基质可以选择人二倍体细胞如SV-1细胞或者传代细胞如Vero细胞，培养方式可以选择细胞工厂或者生物反应器；甲肝抗原的纯化可包括多级澄清过滤、浓缩和分子筛层析；甲肝抗原的灭活使用甲醛，方法符合中国药典2010版相关要求和WHO对灭活甲肝疫苗的指导原则中对灭活步骤的要求。

步骤（3）中，乙肝抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，包括重组乙肝抗原的表达和纯化，其中重组乙肝表达载体可以是汉逊酵母或者啤酒酵母，通过细菌发酵罐培养并表达乙肝抗原；乙肝抗原的收获和纯化可包括研磨破菌、PEG沉淀、超滤浓缩、分子筛层析、离子交换层析和离心脱盐。制备方法符合中国药典2010版对乙肝抗原制备的相关要求。

步骤（3）中，百日咳抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对百日咳菌的培养、收获和多组分纯化获得，包括百日咳菌在发酵罐中的培养、针对百日咳类毒素、丝状红细胞凝集素、百日咳外膜蛋白、百日咳菌毛的纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对百日咳抗原制备的相关要求。

步骤（3）中，白喉抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对白喉菌的培养和纯化获得，包括白喉菌在发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处理和超滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对白喉抗原制备的相关要求。

步骤（3）中，破伤风抗原原液的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对破伤风菌的培养和纯化获得，包括破伤风菌在发酵罐中的培养、菌体经硫酸铵处理、三步层析、类毒素化处理和超滤步骤纯化。制备方法符合中国药典2010版和WHO对破伤风抗原制备的相关要求。

步骤（3）中，hib多糖蛋白缀合物的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过对hib菌的培养和纯化获得，包括hib菌在发酵罐中的培养，对菌体进行福尔马林处理、离心浓缩和一系列化学方法的处理获得纯化后的荚膜多糖，然后通过一种上述的生理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋白的偶联方法获得hib荚膜多糖结合物。制备方法符合中国药典2010版对hib抗原结合物制备的相关要求。

步骤（3）中，脑膜炎球菌A、C、W135和Y群抗原的制备方法是通过行业内成熟的工艺技术制造的，通过分别对A、C、W135和Y群的培养和纯化获得，包括脑膜炎球菌各血清型在发酵罐中的培养、收获和甲醛灭活，对菌体进行去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉淀收集多糖、超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素和沉淀收集多糖，然后通过一种上述的生理可接受载体蛋白，基于一种上述的多糖和载体蛋白的偶联方法获得多糖结合物。制备方法符合WHO对脑膜炎球菌抗原结合物制备的相关要求。

如果所述多价免疫原性组合物包含佐剂，则所述方法中步骤（4）为将各抗原原液分别与佐剂吸附后进行搅拌混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。

优选地，步骤（4）中，所述佐剂为0.5～1.2mg/ml的氢氧化铝溶液，将各抗原原液分别与铝佐剂等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，再将各抗原半成品混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。

本发明还提供了含有所述多价免疫原性组合物的用于预防或治疗肠道病毒或脊髓灰质炎病毒所致疾病的药物。

本发明还提供了免疫有效量的所述多价免疫原性组合物在制备用于预防或治疗肠道病毒或脊髓灰质炎病毒所致疾病的药物中的应用。

本发明的多价免疫原性组合物具有如下有益效果：

（1）本发明所述多价免疫原性组合物包含手足口病和脊髓灰质炎疫苗，能够很好的预防由EV71或CA16和脊髓灰质炎病毒引起的手足口病和小儿麻痹症的发生。本发明研究表明，上述两种抗原在免疫受种者后互相不干扰抗原性和免疫效果，具有很好的免疫原性和安全性。

（2）本发明将手足口病疫苗和脊髓灰质炎疫苗或同时还含其它疫苗结合起来，以二联苗或更多联合的形式免疫受种人群，在不降低二者或多者免疫效果的同时节省受种次数，节约时间和人力资源。且本发明所述脊髓灰质炎疫苗生产所用抗原为灭活的减毒株，和OPV相比能够避免毒株毒力返祖的风险，对受种者和环境均具有很好的安全性。所述多价免疫原性组合物可用于对宿主体内注射给药，通过对组合物中各成分的配置混合使各成分的免疫原性保持稳定。

（3）本发明提供的多价免疫原性组合物可以同时预防多种病原体的侵染，并且这些抗原之间不存在相互干扰的现象，相应的免疫原性较单独抗原激发的免疫原性不会降低。多价免疫原性组合物的使用可以明显简化疫苗接种程序，提高接种效率并降低成本，是未来技术发展的大趋势，也是未来市场需求所在。此外，将灭活的手足口病抗原，如EV71和CA16抗原和灭活脊灰抗原作为所述多价免疫原性组合物的重要组分，并与多种细菌类抗原混合配制后制备出多价联合疫苗将是对未来国家计划免疫的重要补充。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

若未特别指明，本发明实施例中所用的实验材料、试剂和仪器等均可市售获得，若未具体指明，实施例中所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。

MFM培养基、无血清M199培养基、EMEM培养基为本领域常规的培养基，均可市售获得。

汉逊酵母购自ATCC NO.26012。

实施例1EV71病毒的培养

将EV71病毒株（保藏号为CGMCC No.3544），在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%(v/v)小牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%(v/v)小牛血清，按照MOI为0.001接种EV71病毒，于33±1℃培养15天，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液，经澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。EV71病毒收获液可在6-8LgCCID50/ml范围内。

实施例2EV71病毒的灭活和纯化

将实施例1中描述的EV71病毒收获液中加入甲醛溶液（1:1000-1:10000）(v/v)，使游离甲醛终浓度为100-200μg/ml，置36.5℃±1℃灭活13天，制得病毒灭活液。将灭活液在30000rpm的蔗糖密度梯度离心6-12小时，收集病毒所在区带，经膜包超滤脱糖。随后经分子筛层析，用0.01M PBS（pH7.0）缓冲液进行平衡，然后继续用0.01M PBS（pH7.0）洗脱，收集病毒峰，最后经除菌过滤后获得EV71病毒抗原原液。

实施例3CA16病毒的培养

将CA16病毒株（保藏号为CGMCC No.5371），在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%小牛血清，置37±1℃培养箱中培养5-7天后换MEM培养基加2%小牛血清，按照MOI为0.001接种CA16病毒，并在37±1℃培养箱中继续培养，每天观察细胞病变，当细胞病变达50%以上时，收获病毒液，经澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。CA16病毒收获液可在6-8LgCCID50/ml范围内。

实施例4CA16抗原的灭活和纯化

从实施例3中获得的CA16病毒收获液加入1:1000-1:10000（v/v）的甲醛溶液，使游离甲醛终浓度为100～200μg/ml，置36.5℃±1℃灭活13天，制得病毒灭活液。将灭活液进行离心澄清处理后超滤浓缩10-50倍。浓缩后料液加入PEG并使其终浓度达到5-15%，pH值在5-7之间，混合后进行搅拌10-60分钟，然后于2-8℃沉淀8-24小时后再离心7500-10000rpm约20-60分钟。将沉淀物用PBS缓冲液重溶后获得溶液，再经蔗糖密度梯度离心并收集病毒区带后，再超滤脱糖获得病毒液，然后上分子筛层析获得病毒层析液，最后经除菌过滤后获得疫苗原液。

实施例5Sabin脊髓灰质炎病毒的培养

由美国ATCC提供的脊灰毒株sabin I型、sabin II型、sabin III型，分别在10层细胞工厂Vero细胞中适应生长并连续传代，使用MEM培养基加10%小牛血清，置37.5±1.0℃培养箱中培养3-5天后换无血清M199培养基，按照MOI为0.01分别接sabin株I型、II型和III型病毒，在32.5℃培养3-4天后收获病毒液，经澄清过滤后用CCID50法检测病毒滴度值。以上三型脊灰病毒收获液可在7-8LgCCID₅₀/ml范围内。病毒收获液同时通过D抗原ELISA双抗夹心检测法检测D抗原值。以上三型脊灰病毒收获液的D抗原含量在20-120DU/ml范围内。

实施例6Sabin脊髓灰质炎病毒的纯化和灭活

将实施例5中描述的脊灰病毒收获液进行三级澄清过滤，选用0.75um、0.45um和0.22um的过滤膜包；将澄清过滤后的料液进行两级超滤浓缩，第一级选用100KD聚醚砜类膜包浓缩30-50倍，第二级选用100KD聚醚砜类膜包再浓缩5-10倍；然后将浓缩后的料液通过分子筛层析柱，用0.08M PBS（pH7.0）缓冲液进行平衡，然后继续用0.08M PBS（pH7.0）洗脱，收集第1峰为病毒峰。将收集的病毒液加到用0.08M PBS（pH7.0）平衡好的装有DEAE的层析柱中，用0.08M PBS（pH7.0）洗脱，收集第1洗脱峰为病毒峰。该病毒收集液通过0.22μm过滤后用1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得抗原原液。

实施例7甲肝病毒的培养

甲肝病毒（TZ84株或者YN5株）来自北京科兴生物制品有限公司，在10层细胞工厂2BS细胞中适应生长并连续传代，使用EMEM培养基加10%新生牛血清，置37.5±1.0℃培养箱中培养5-7天后，按照MOI为0.05接种甲肝病毒，在37.5±1.0℃培养3-5天后收获病毒液，经澄清过滤后用ELISA法检测病毒滴度值。甲肝病毒收获液可在6-8LgCCID50/ml范围内。

实施例8甲肝抗原的纯化和灭活

将实施例7中描述的甲肝病毒收获液进行三级澄清过滤；将澄清过滤后的料液进行超滤浓缩；然后将浓缩后的料液通过分子筛层析柱，用0.1MPBS（pH7.2）缓冲液进行平衡，然后继续用0.1M PBS（pH7.2）洗脱，收集第1峰为病毒峰。将收集的病毒液通过0.22μm过滤后用1:4000甲醛37℃灭活12-13天，最后经除菌过滤后获得抗原原液。

实施例9乙肝抗原的制备

采用培养汉逊酵母，购自ATCC NO.26012制备重组乙肝抗原的方法，在摇瓶和细菌发酵罐中两级培养汉逊酵母后进行收获破菌，可采用玻璃珠研磨法进行两次研磨破碎，然后进行PEG沉淀和超滤浓缩，将浓缩液进行层析纯化，结合分子筛Sepharose CL-4B层析柱和离子交换DEAE层析柱进行，然后对纯化液进行氯化铯梯度离心处理和脱盐处理获得纯化后的乙肝抗原，最后经除菌过滤后获得抗原原液。

实施例10百日咳菌的培养和抗原的制备

按照公开专利200780036247.7中对百日咳菌培养和抗原制备方法的描述，包括对百日咳菌的培养，对培养液进行浓缩和离心分离，取上清液，再通过在上清液中加入缓冲液并进行两步层析收集百日咳毒素液（PT）。

该专利中对纤维状红细胞凝集素的制备方法，包括将百日咳菌体进行溶解，进行离心分离后获取上清液，再通过在上清液中加入乙酸钙溶液并过滤收集含丝状红细胞凝集素的液体（FHA），然后对滤液进行硫酸铵浓缩处理，并进行密度梯度离心，收集含有目标抗原的部分。

该专利中对外膜蛋白的制备方法，包括对从含纤维状红细胞凝集素的液体中重新分离的菌体进行溶解、离心、取上清、加入缓冲液过滤、层析纯化分离和过滤步骤处理。获得纯化后的外膜蛋白。

该专利中对菌毛的制备方法，包括将收集含外膜蛋白的液体加入盐和缓冲液，过滤后得到含菌毛的滤液，再通过硫酸铵浓缩后进行密度梯度离心获得纯化后的菌毛。

实施例11白喉菌的培养和类毒素的制备

按照公开专利200780036247.7中对白喉菌培养和类毒素制备方法的描述，包括对白喉菌的培养，对培养液进行硫酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的赖氨酸盐酸盐，福尔马林并加热，最后用超滤法去除多余的福尔马林和赖氨酸盐酸盐，获得类毒素液。

实施例12破伤风菌的培养和类毒素的制备

按照公开专利200780036247.7中对破伤风培养和类毒素制备方法的描述，包括对破伤风的培养，对培养液进行硫酸铵处理，取上清液进行过滤并进行三步层析纯化，包括苯基疏水层析、DEAE离子交换层析和凝胶过滤层次方法，收集层析液获得纯化毒素液，然后对毒素液进行类毒素化处理，包括加入定量的福尔马林等并加热处理，最后用超滤法去除多余的福尔马林，获得类毒素液。

实施例13流感嗜血杆菌的培养和多糖纯化

按照公开专利200810125160.3中对b型流感嗜血杆菌培养方法的描述，包括2次在固体培养基上的预培养和1次液体培养基的预培养，然后在发酵罐中培养并收获。按照该专利中对b型流感嗜血杆菌多糖纯化方法的描述，包括将收获液进行福尔马林处理、离心收集抗原上清液并浓缩，随后进行一系列化学方法的处理，获得纯化的b型流感嗜血杆菌多糖。

实施例14流感嗜血杆菌结合物的制备

按照公开专利200680023334.4中对b型流感嗜血杆菌和破伤风类毒素的共价结合方法的描述，包括加入溴化氢对多糖进行活化处理，以及一系列化学方法将多糖和破伤风类毒素进行偶联形成缀合物，再对缀合物进行层析纯化，获得流感嗜血杆菌结合物原液。

实施例15脑膜炎奈瑟菌的培养和多糖纯化

按照公开专利201110245718.3中对脑膜炎球菌A、C、W135和Y群培养方法的描述，包括细菌在传代培养、发酵罐培养、收获和甲醛灭活。脑膜炎球菌纯化方法包括该专利中公开的去菌体、沉淀、解离、去核酸、沉淀收集多糖、超滤膜过程去除杂蛋白和内毒素、沉淀收集多糖。

实施例16脑膜炎奈瑟菌结合物的制备

按照公开专利200310119414.8和A群和C群脑膜炎抗原多糖结合疫苗的WHO指导文件中对脑膜炎球菌结合物制备方法的描述，包括将A群、C群、W群和Y群血清型的脑膜炎多糖分别与溴化氰混合进行活化，加入已二酰肼，透析、加入等量白喉类毒素、加入碳二亚胺、超滤浓缩、层析纯化、除菌过滤等步骤，获得各型脑膜炎多糖蛋白缀合物。

实施例17EV71和/或CA16和脊灰抗原组合物的制备

将实施例2中制得的EV71疫苗原液和/或者实施例4中制得的CA16疫苗原液与实施例6中制得的脊灰疫苗原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例18含佐剂的EV71和/或CA16和脊灰抗原组合物的制备

将实施例2中所述的EV71疫苗原液、实施例4中所述的CA16疫苗原液和实施例6中所述的脊灰疫苗原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原和含佐剂的脊灰抗原和/或含佐剂的CA16抗原和含佐剂的脊灰抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71和脊灰的联合疫苗组合物（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表1所示，含CA16和脊灰的联合疫苗组合物（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表2所示。

表1含EV71和脊灰的联合疫苗组合物中各抗原含量

表2含CA16和脊灰的联合疫苗组合物中各抗原含量

实施例19EV71和/或CA16、脊灰、甲肝抗原组合物的制备

将实施例2中制得的EV71疫苗原液和/或者实施例4中制得的CA16疫苗原液与实施例6中制得的脊灰疫苗原液和实施例8中制得的甲肝疫苗原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例20含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、甲肝组合物的制备

将实施例2中所述的EV71疫苗原液、实施例4中所述的CA16疫苗原液、实施例6中所述的脊灰疫苗原液和实施例8中所述的甲肝疫苗原液分别与1.2mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原、含佐剂的脊灰抗原和含佐剂的甲肝抗原或者含佐剂的CA16抗原、含佐剂的脊灰抗原和含佐剂的甲肝抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、甲肝的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表3所示，含CA16、脊灰、甲肝的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表4所示。

表3含EV71、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量

表4含CA16、脊灰、甲肝的联合疫苗中各抗原含量

实施例21EV71和/或CA16、脊灰、乙肝组合物的制备

将实施例2中制得的EV71抗原原液或者实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液和实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合，获得联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例22含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、乙肝组合物的制备

将实施例2中所述的EV71抗原原液或实施例4中所述的CA16抗原原液与实施例6中所述的脊灰抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与1mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的疫苗半成品，然后将含佐剂的EV71抗原、含佐剂的脊灰抗原和含佐剂的乙肝抗原或者含佐剂的CA16抗原、含佐剂的脊灰抗原和含佐剂的乙肝抗原等体积混合搅拌，获得含铝佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、乙肝的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表5所示，含CA16、脊灰、乙肝的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表6所示。

表5含EV71、脊灰、乙肝的联合疫苗中各抗原含量

表6含CA16、脊灰、乙肝的联合疫苗中各抗原含量

实施例23EV71和/或CA16、脊灰、百白破组合物的制备

将实施例10中制得的无细胞百日咳抗原、实施例11中制得的白喉抗原和实施例12中制得的破伤风抗原混合制成百白破组分I（所述百白破组分I中包含丝状血细胞凝集素和菌毛抗原）；将实施例2中制得的EV71抗原原液或者实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例24含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、百白破组合物的制备

将实施例23中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的EV71抗原原液、实施例4中所述的CA16抗原原液和实施例6中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原和含佐剂的脊灰抗原或者含佐剂的CA16抗原和含佐剂的脊灰抗原的混合液与含佐剂的组分I等体积搅拌混合，获得含佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、百白破的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表7所示，含CA16、脊灰、百白破的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表8所示。

表7EV71、脊灰、百白破的联合疫苗中各抗原含量

表8CA16、脊灰、百白破的联合疫苗中各抗原含量

实施例25EV71和/或CA16、脊灰、hib组合物的制备

将实施例14中制得的b型流感嗜血杆菌结合物抗原作为组分I；将实施例2中制得的EV71抗原原液或者实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例26含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、hib组合物的制备

将实施例25中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的EV71抗原原液、实施例4中所述的CA16抗原原液和实施例6中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原和含佐剂的脊灰抗原或者含佐剂的CA16抗原和含佐剂的脊灰抗原的混合液与含佐剂的组分I等体积搅拌混合，获得含佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、hib结合物的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表9所示，含CA16、脊灰、hib结合物的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表10所示。

表9含EV71、脊灰、hib结合物的联合疫苗中各抗原含量

表10含CA16、脊灰、hib结合物的联合疫苗中各抗原含量

实施例27EV71和/或CA16、脊灰、四价脑膜炎组合物的制备

将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原（A、C、W135、Y）多糖蛋白缀合物混合作为组分I；将实施例2中制得的EV71抗原原液或者实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II，再将组分I和组分II混合成联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例28含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、四价脑膜炎组合物的制备

将实施例27中所述的组分I与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的EV71抗原原液、实施例4中所述的CA16抗原原液和实施例6中所述的脊灰抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原和含佐剂的脊灰抗原或者含佐剂的CA16抗原和含佐剂的脊灰抗原的混合液与含佐剂的组分I等体积搅拌混合，获得含佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、四价脑膜炎结合物的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表11所示，含CA16、脊灰、四价脑膜炎结合物的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表12所示。

表11含EV71、脊灰、四价脑膜炎的联合疫苗中各抗原含量

表12含CA16、脊灰、四价脑膜炎结合物的联合疫苗中各抗原含量

实施例29EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib组合物的制备

将实施例10中制得的无细胞百日咳抗原、实施例11中制得的白喉抗原和实施例12中制得的破伤风抗原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的EV71抗原原液或者实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液与实施例8中制得的甲肝抗原原液与实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合物原液作为组分III，再将组分I、组分II和组分III混合成联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例30含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib组合物的制备

将实施例29中所述的组分I和组分III分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的EV71抗原原液和/或实施例4中所述的CA16抗原原液和实施例6中所述的脊灰抗原原液和实施例8中所述的甲肝抗原原液和实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含铝佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原、脊灰抗原、甲肝抗原和乙肝抗原或者含佐剂的CA16抗原、脊灰抗原、甲肝抗原和乙肝抗原的混合液与含佐剂的组分I和含佐剂的组分III等体积搅拌混合，获得含佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表13所示，含CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表14所示。

表13含EV71、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物的联合疫苗中各抗原含量

表14含CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物的联合疫苗中各抗原含量

实施例31EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎组合物的制备

将实施例10中制得的无细胞百日咳抗原、实施例11中制得的白喉抗原和实施例12中制得的破伤风抗原混合制成百白破组分I；将实施例2中制得的EV71抗原原液和/或实施例4中制得的CA16抗原原液与实施例6中制得的脊灰抗原原液与实施例8中制得的甲肝抗原和实施例9中制得的乙肝抗原原液按一定浓度搅拌混合制成组分II；将实施例14中制得的hib多糖结合物原液作为组分III；将实施例16中制得的四价脑膜炎抗原多糖结合物原液作为组分IV，再将组分I、组分II、组分III和组分IV混合成联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

实施例32含佐剂的EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎组合物的制备

将实施例31中所述的组分I、组分III和组分IV分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含佐剂的抗原半成品；将实施例2中所述的EV71抗原原液和/或实施例4中所述的CA16抗原原液和实施例6中所述的脊灰抗原原液和实施例8中所述的甲肝抗原原液与实施例9中所述的乙肝抗原原液分别与0.5mg/ml的氢氧化铝溶液等体积均匀混合，室温搅拌吸附20±5分钟，制成含佐剂的抗原半成品，然后将含佐剂的EV71抗原、脊灰抗原、甲肝抗原和乙肝抗原或者含佐剂的CA16抗原、脊灰抗原、甲肝抗原和乙肝抗原的混合液与含佐剂的组分I、组分III、组分IV等体积搅拌混合，获得含佐剂的联合疫苗，确定pH值在6-7的范围内。

含EV71、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表15所示，含CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表16所示，含EV71、CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗（不含佐剂和含佐剂）中各抗原含量如表17所示。

表15含EV71、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗中各抗原含量

表16含CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗中各抗原含量

表17含EV71、CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、四价脑膜炎的联合疫苗中各抗原含量

实施例33EV71和/或CA16、脊灰组合物的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例17制备的含EV71和/或者CA16和脊灰抗原的抗原组合物或者实施例18制备的含EV71和/或CA16和脊灰抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物的免疫原性。

大鼠按照每组10只的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。选择灭活EV71疫苗和/或灭活CA16疫苗和灭活脊灰疫苗作为对照组，大鼠免疫后第3周加强一次，免疫后第2周进行采血，用病毒回滴实验检测中和抗体效价，采用ELISA法检测血清阳转率。中和用病毒选用EV71病毒或者CA16病毒、Sabin I、II和III型，各型的滴度为100CCID50。阳性对照细胞选择Vero细胞。中和试验在36℃进行7天，并观察细胞病变（所述中和试验按照中国药典2010版要求进行）。

如表18和19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒或者CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例17和实施例18制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示所述抗原混合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

实施例34EV71和/或CA16、脊灰、甲肝组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例19制备的含EV71和/或CA16、脊灰抗原和甲肝抗原的抗原组合物或者实施例20制备的含EV71和/或CA16、脊灰抗原和甲肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒、CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例19和实施例20制备的免疫原性组合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示所述免疫原性组合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性

通过对恒河猴免疫实施例19制备的含EV71和/或CA16抗原、脊灰抗原和甲肝抗原的抗原组合物或者实施例20制备的含EV71和/或CA16抗原、脊灰抗原和甲肝抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。

选用恒河猴进行效价实验，同时与灭活甲肝疫苗进行对比。选用体重在1.5～4.5kg的恒河猴按照每组7只的规格进行肌肉注射免疫，其中5组为实验组，2组为对照组，免疫后28天采血，采用ELISA法检测甲肝病毒抗体（此类效价实验按照中国药典2010版要求进行）。

如表18和表19所示，结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明实施例19和实施例20制备的免疫原性组合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗免疫原性组合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

实施例35EV71和/或CA16、脊灰、乙肝组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例21制备的含EV71和/或者CA16、脊灰抗原和乙肝抗原的组合物或者实施例22制备的含EV71和/或CA16、脊灰抗原和乙肝抗原混合物和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中EV71和脊灰和/或者CA16和脊灰的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒和/或者CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例21和实施例22制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示所述抗原混合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中乙肝的免疫原性

通过对BALB/c小鼠免疫实施例21制备的含EV71和/或者CA16、脊灰和乙肝抗原的抗原混合物或者实施例22制备的含EV71和/或者CA16、脊灰和乙肝抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中乙肝的免疫原性。

选择重组乙肝疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫，4-6周后采血，采用ELISA法测定乙肝抗体，计算半数有效剂量ED50（ED50实验按照中国药典2010版要求进行）。

如表18和表19所示，结果显示实施例21和实施例22制备的抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

实施例36EV71和/或CA16、脊灰、百白破组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例23制备的含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原的组合物或者实施例24制备的含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中EV71和/或CA16和脊灰抗原的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒、CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例23和实施例24制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例23制备的含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原的抗原混合物或者实施例24制备的含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。

选择百白破联合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。小鼠免疫后14-16天进行百日咳菌的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。如表18和表19所示，攻毒实验结果显示实施例23和实施例24制备的抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。

小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。如表18和表19所示，攻毒实验结果显示实施例23和实施例24制备的抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示所述抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

3、评估抗原混合物中白喉菌的免疫原性

通过对250g～350g的豚鼠免疫实施例23制备含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原的抗原混合物或者实施例24制备含EV71和/或CA16、脊灰和百白破抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。

选择百白破联合疫苗作为对照组，豚鼠按照10只每组的规格进行注射免疫。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成3组抗原混合物。豚鼠免疫4周后进行白喉毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。

如表18和表19所示，攻毒实验结果显示本发明制备的抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定。同时显示实施例23和实施例24制备的抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

实施例37EV71和/或CA16、脊灰、hib组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例25制备的含EV71和/或CA16、脊灰和hib结合物抗原的抗原混合物或者实施例26制备的含EV71和/或CA16、脊灰和hib结合物抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中EV71和/或CA16和脊灰的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒、CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例25和实施例26制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例25制备的含EV71和/或CA16、脊灰和hib抗原的抗原混合物或者实施例26制备的含EV71和/或CA16、脊灰和hib抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。

选择hib结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照每次2.5ug多糖的抗原混合物的注射量进行免疫。小鼠首先进行0.85%氯化钠溶液注射，于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定hib的IgG抗体。效价实验按照中国药典2010版要求进行。

如表18和表19所示，结果显示实施例25和实施例26制备的抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定，同时显示所述抗原混合物的免疫原性和对照组中的hib结合疫苗的免疫原性相当。

实施例38EV71和/或CA16、脊灰、脑膜炎抗原组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例27制备的含EV71和/或CA16、脊灰和脑膜炎结合物抗原的组合物或者实施例28制备的含EV71和/或CA16、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中EV71和/或CA16和脊灰的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71病毒、CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例27和实施例28制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例27制备的含EV71和/或CA16、脊灰和脑膜炎结合物抗原的抗原混合物或者实施例28制备的含EV71和/或CA16、脊灰和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性。

选择四价脑膜炎结合疫苗作为对照组，小鼠按照20只每组的规格进行注射免疫（含10只对照/每组）。抗原混合物按照人用剂量进行3倍倍比稀释，共配成5组抗原混合物。小鼠于第1、14天注射两次，与第21～28天经眼眶静脉采血，用ELISA法测定脑膜炎各血清型的IgG抗体，效价实验按照WHO相关要求进行。如表18和表19所示，结果显示实施例27和实施例28制备的抗原混合物符合WHO相关指导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫原性的相关规定。

此外，选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体，效价实验按照WHO相关要求进行。如表18和表19所示，结果显示实施例27和实施例28制备的抗原混合物中A群脑膜炎抗原据有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的四价脑膜炎结合疫苗相应血清型的免疫原性相当。

实施例39EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破和hib组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中EV71和/或CA16和脊灰的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71和/或CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例29和实施例30制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性

通过对恒河猴免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib组合物、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。

具体方法同实施例34中评估抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价和血清阳转，说明实施例29和实施例30制备的抗原混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

3、评估抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性

通过对BALB/c小鼠免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的抗原混合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性。

具体方法同实施例35中评估抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例29和实施例30制备的抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

4、评估抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。

通过对NIH小鼠免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。

具体方法同实施例36中评估抗原混合物中百日咳菌免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例29和实施例30制备的抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。

小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。如表18和表19所示，结果显示实施例29和实施例30制备的抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

5、评估抗原混合物中白喉菌的免疫原性

通过对250g～350g的豚鼠免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。

具体方法同实施例36中评估抗原混合物中白喉菌免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示实施例29和实施例30制备的抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

6、评估抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例29制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例30制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。

具体方法同实施例37中评估抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例29和实施例30制备的抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。

实施例40EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib、脑膜炎组合物的免疫原性

1、评估抗原混合物中EV71抗原和/或者CA16抗原和脊灰抗原的免疫原性

通过对SD大鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中EV71和/或CA16和脊灰的免疫原性。

具体实验方法同实施例33第二段描述。如表18和表19所示，结果显示各组大鼠血清均有对EV71和/或CA16病毒、sabin I、II和III型病毒的中和作用和血清阳转，说明实施例31和实施例32制备的抗原混合物在大鼠上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的EV71疫苗和/或CA16疫苗、脊灰疫苗的免疫原性相当。

2、评估抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性

通过对恒河猴免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物、脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib组合物、脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估该抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性。

具体方法同实施例34中评估抗原混合物中甲肝抗原的免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示各组恒河猴血清均有对甲肝病毒的抗体效价，说明实施例31和实施例32制备的抗原混合物在恒河猴上具有良好的免疫原性，同时显示该抗原混合物的免疫原性和灭活甲肝疫苗的免疫原性相当。

3、评估抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性

通过对BALB/c小鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的抗原混合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的抗原混合物来评估对抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性。

具体方法同实施例35中评估抗原混合物中乙肝抗原的免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对重组乙肝疫苗效价的相关规定，同时显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物的免疫原性和对照组中重组乙肝疫苗的免疫原性相当。

4、评估抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。

通过对NIH小鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中破伤风和百日咳菌的免疫原性。

具体方法同实施例36中评估抗原混合物中百日咳菌免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物符合中国药典上对百日咳菌效价的相关规定。

小鼠免疫后4周进行破伤风毒素的攻毒实验，攻毒实验按照中国药典2010版要求进行。如表18和表19所示，结果显示该抗原混合物符合中国药典上对破伤风疫苗效价的相关规定，同时显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中破伤风和百日咳抗原的免疫原性相当。

5、评估抗原混合物中白喉菌的免疫原性

通过对250g～350g的豚鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中白喉菌的免疫原性。

具体方法同实施例36中评估抗原混合物中白喉菌免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物符合中国药典上对白喉疫苗效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中的百白破联合疫苗中白喉抗原的免疫原性相当。

6、评估抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的免疫原性。

具体方法同实施例37中评估抗原混合物中b型流感嗜血杆菌的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物符合中国药典上对hib效价的相关规定，同时显示该抗原混合物的免疫原性和对照组中hib结合疫苗的免疫原性相当。

7、评估抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性

通过对NIH小鼠免疫实施例31制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原的联合疫苗组合物或者实施例32制备的含EV71和/或CA16、脊灰、甲肝、乙肝、百白破、hib结合物和脑膜炎结合物抗原和氢氧化铝佐剂的组合物来评估对抗原混合物中脑膜炎抗原的免疫原性。

具体方法同实施例38中评估抗原混合物中脑膜炎抗原免疫原性的方法。如表18和表19所示，结果显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物符合WHO相关指导文件对各血清型脑膜炎抗原临床前免疫原性的相关规定。此外，选择SD怀孕大鼠按照相同分组原则进行免疫，对乳鼠进行采血测定针对A群脑膜炎的IgG抗体，结果显示该抗原混合物中A群脑膜炎抗原据有良好的免疫原性，同时显示实施例31和实施例32制备的抗原混合物的免疫原性和对照组中四价脑膜炎结合疫苗的免疫原性相当。

表18含EV71、CA16、脊灰抗原的不同组合物的免疫原性实验结果（血清阳转率%）

注：百日咳和脑膜炎抗原的免疫原性中血清阳转率为各组分的平均值。

组合物1：EV71+脊灰（实施例17）

组合物2：CA16+脊灰+甲肝（实施例19）

组合物3：EV71+脊灰+乙肝（实施例21）

组合物4：CA16+脊灰+百白破+佐剂（实施例24）

组合物5：EV71+脊灰+Hib（实施例25）

组合物6：CA16+脊灰+脑膜炎+佐剂（实施例28）

组合物7：EV71+脊灰+甲肝+乙肝+百白破+Hib（实施例29）

组合物8：EV71+CA16+脊灰+甲肝+乙肝+百白破+Hib+脑膜炎（实施例31）

表19含EV71、CA16、脊灰抗原的不同组合物的免疫原性实验结果（血清阳转率%）

注：百日咳和脑膜炎抗原的免疫原性中血清阳转率为各组分的平均值。

组合物9：CA16+脊灰+佐剂（实施例18）

组合物10：EV71+脊灰+甲肝+佐剂（实施例20）

组合物11：CA16+脊灰+乙肝+佐剂（实施例22）

组合物12：EV71+脊灰+百白破（实施例23）

组合物13：CA16+脊灰+Hib+佐剂（实施例26）

组合物14：EV71+脊灰+脑膜炎（实施例27）

组合物15：CA16+脊灰+甲肝+乙肝+百白破+Hib+佐剂（实施例30）

组合物16：EV71+CA16+脊灰+甲肝+乙肝+百白破+Hib+脑膜炎+佐剂（实施例32）

本发明包含但不限于上述组合物，其它组合物免疫原性实验结果类似，不在此赘述。

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (10)

1.一种多价免疫原性组合物，其特征在于，其含有：

（1）灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原

（2）灭活的脊髓灰质炎病毒抗原。

2.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述灭活脊髓灰质炎病毒为三型，优选为灭活的sabin株，包含sabin I型、sabin II型和sabinIII型。

3.根据权利要求1所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物含有300-1200U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有1000-8000U单位/人份的灭活CA16抗原；优选地，所述多价免疫原性组合物含有600-1000U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有2000-6000U单位/人份的灭活CA16抗原；最优选地，所述多价免疫原性组合物含有800-1000U单位/人份的灭活EV71抗原和/或含有4000-6000U单位/人份的灭活CA16抗原。

4.根据权利要求2所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原1.5-20D单位/人份,sabin II型抗原2-40D单位/人份,sabin III型抗原5-70D单位/人份；优选地，所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原5-15D单位/人份,sabin II型抗原10-30D单位/人份,sabin III型抗原10-40D单位/人份；最优选地，所述多价免疫原性组合物含有sabin I型抗原5-10D单位/人份,sabin II型抗原10-20D单位/人份,sabin III型抗原15-35D单位/人份。

5.根据权利要求1-4任一项所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还含有甲肝抗原、乙肝抗原、百日咳类毒素、丝状血凝素、菌毛抗原、破伤风类毒素、白喉类毒素、b型流感嗜血杆菌荚膜多糖抗原、脑膜炎菌多糖抗原中的一种或多种。

6.根据权利要求5所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还包括生理可接受的载体，优选地，所述载体为与细菌多糖抗原结合的生理可接受的载体。

7.根据权利要求6所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物还含有一种佐剂，所述佐剂为铝盐；优选地，所述佐剂为氢氧化铝或磷酸铝；进一步优选地，所述佐剂为氢氧化铝。

8.根据权利要求1-7任一项所述的多价免疫原性组合物，其特征在于，所述多价免疫原性组合物的剂型为喷雾剂、注射剂、冻干剂、胶囊剂、片剂或丸剂。

9.权利要求1-8任一项所述多价免疫原性组合物的制备方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

（1）制备灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原原液；

（2）制备灭活的脊髓灰质炎病毒抗原原液；

（3）制备灭活的甲肝抗原原液，乙肝抗原原液，百日咳抗原原液，白喉抗原原液，破伤风抗原原液，hib多糖蛋白缀合物原液和脑膜炎球菌A、C、W135、Y群抗原原液中的一种或多种；

（4）将灭活的EV71抗原和/或灭活的CA16抗原原液与脊髓灰质炎病毒抗原原液进行搅拌混合，作为一种抗原混合物I；将甲肝抗原原液、乙肝抗原原液、百日咳抗原原液、破伤风抗原原液、白喉抗原原液、hib多糖蛋白缀合物抗原原液和脑膜炎抗原原液按照不同价次需求与抗原混合物I进行搅拌混合，并控制混合液的pH值在6-7之间。

10.权利要求1-8任一项所述多价免疫原性组合物在制备用于预防或治疗肠道病毒或脊髓灰质炎病毒所致疾病的药物中的应用。