TW201414840A - 蛋白質產生促進劑 - Google Patents

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Abstract

本發明是關於在含有血清或血清代替物的動物細胞用培養基中添加多醣類，而可使增所希望之蛋白質的產生量大幅增加的蛋白質產生促進劑及使用含有該蛋白質產生促進劑的培養基的蛋白質的製造方法。

Description

蛋白質產生促進劑
本發明是關於細胞的培養，特別是關於適於動物細胞(例如CHO細胞)的蛋白質的高產生化的蛋白質產生促進劑及含有該促進劑的培養基。再者，本發明是關於使用該蛋白質產生促進劑及含有該促進劑的培養基的蛋白質的製造方法。
近年來，在生命科學的領域中，藉由大量培養能產生作為目的之有用蛋白質的動物細胞，而以工業規模產生有用蛋白質變得非常重要。藉由導入該動物細胞或編碼所希望之蛋白質的基因的動物細胞的培養，在製造天然或重組蛋白質等時，除了鹽類，糖類，胺基酸類，及維生素類等的基礎營養物之外，係為了該動物細胞的增殖而使用動物細胞增殖因子。動物細胞增殖因子通常係使用牛胎兒血清或小牛血清等的血清成分。一般而言，使用牛胎兒血清或小牛血清時，需要添加相對於基礎培養基的5至20容量%程度。
但是，牛胎兒血清或小牛血清等的血清之供應有限制，一般而言非常昂貴。此招致有用蛋白質的製造成本的上昇。
又，就哺乳動物來源的增殖因子或血清而言，除了狂牛症、牛海綿狀腦病、感染性海綿狀腦、還有關於庫賈氏症 (creutzfeldt-Jakob disease)等與普利昂(prion)有關的疾病的問題點之外，因哺乳動物來源的血清不能以高壓釜等滅菌，所以有被病毒或黴漿菌(mycoplasma)汚染的可能性，由安全性之考量點來看，係進行在無血清存在下培養動物細胞的無血清培養法之開發。在無血清培養法中，雖使用代替血清效果的物質(血清代替物)之胎球蛋白(fetuin)，胰島素，運鐵蛋白(transferrin)，增殖因子等的天然來源的經純化蛋白質或重組蛋白質等，但這些蛋白質一般而言比牛胎兒血清或小牛血清更為昂貴，其供應受到限制。
如此，因血清及血清代替物昂貴，其供應受到限制，因而希望能開發更有效率製造有用蛋白質之技術。
本發明以提供使用動物細胞而產生所希望之蛋白質的蛋白質產生促進劑為課題。再者，本發明以提供使用含有該蛋白質產生促進劑的培養基的蛋白質的製造方法為課題。
本發明者等為了達成如上述的課題而盡心研究，結果發現在含有血清或血清代替物的動物細胞用培養基中添加多醣類，則所希望之蛋白質產生量會大幅增加，進而完成本發明。
即，本發明是關於下述[1]至[15]的發明。
[1]一種含多醣類的動物細胞用培養基添加劑。
[2]如[1]所述的添加劑，係促進所培養之動物細胞產生所希望之蛋白質。
[3]如[2]所述的添加劑，係促進其前述動物細胞的每1個細胞 的蛋白質的產生。
[4]如[1]所述的添加劑，其中，前述多醣類具有陰離子性官能基。
[5]如[4]所述的添加劑，其中，前述多醣類的陰離子性官能基是選自由羧基，磺酸基及磷酸基所成群組之至少一者。
[6]如[5]所述的添加劑，其中，前述多醣類是選自由玻尿酸，結蘭膠(gellan gum)，脫醯基化結蘭膠，黃原膠，鹿角菜膠(carrageenan)，迪特膠(diutan gum)，海藻酸，褐藻糖膠(fucoidan)，果膠，果膠酸，果膠酯酸，硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)，肝素，類硫酸乙醯肝素(heparitin sulfate)，硫酸角質素(kerato sulfate)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)，硫酸皮膚素(dermatan sulfate)，硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)或其鹽所成群組之至少一者。
[7]如[6]所述的添加劑，其中，前述多醣類是脫醯基化結蘭膠或其鹽。
[8]一種含有如[1]至[7]中的任一項所述的添加劑所成的動物細胞用培養基。
[9]如[8]所述的培養基，其中，血清濃度在1%(w/v)以上，15%(w/v)以下。
[10]如[8]所述的培養基，其中，由血漿蛋白質，荷爾蒙類，增殖因子及鹽類所選的血清代替物的濃度在1%(w/v)以上，15%(w/v)以下。
[11]如[8]至[10]中的任一項所述的培養基，係再添加由胺基酸類，維生素類，能量源，滲透壓調整劑，鐵源，及pH緩衝液所成群組之至少一者。
[12]一種使用動物細胞培養的蛋白質的製造方法，其特徵為：在[1]至[7]中的任一項的所述的添加劑的存在下，或在[8]至[11]中的任一項所述的培養基中培養該動物細胞。
[13]如[12]所述的方法，其特徵為：至少在(a)或(b)的期間培養該動物細胞：(a)所培養的動物細胞能充分增殖的期間的一部分或全部；(b)該動物細胞所產生的所希望之蛋白質能充分產生的期間的一部分或全部。
[14]一種促進培養液中的動物細胞的蛋白質產生量的方法，其特徵為：在[1]至[7]中的任一項所述的添加劑的存在下，或在[8]至[11]中的任一項所述的培養基中，培養該動物細胞。
[15]如[14]所述的方法，其特徴為促進動物細胞的每1個細胞的蛋白質產生量。
本發明的動物細胞用培養基添加劑係將該添加劑添加於動物細胞培養用培養基，使用所得的培養基，培養可產生蛋白質的動物細胞，當由該培養基及/或該動物細胞收取所產生的蛋白質時，可增大所希望之蛋白質的產生量。特別是可增大每1個細胞的蛋白質產生量。
又，由於本發明的動物細胞用培養基添加劑只添加於培養基就能促進所希望之蛋白質的產生量，因而操作及處理上也是有利。
再者，由於可更有效率地製造所希望之蛋白質，因此由製造成本之點來看也是有利，例如，可大幅貢獻於抗體醫藥等的生物 醫藥品的大量供應。
第1圖顯示使用人類骨髓瘤來源之細胞株SC-01MFP，在脫醯基化結蘭膠的存在下(0.015%)及不存在下(對照)培養時的細胞數增加與λ鏈產生量的比較圖。
第2圖顯示在第1圖所述的使用SC-01MFP的試驗中，以梯形法算出在脫醯基化結蘭膠存在下(0.015%)及不存在下(對照組)，經比較的細胞數增加(左圖)及λ鏈產生量比較圖(右圖)二者的圖形下面積，並用所得細胞數增加之圖形下面積，校正λ鏈產生量之圖形下面積(λ鏈產生量之圖形下面積/細胞數增加之圖形下面積)，再與對照組為1時的脫醯基化結蘭膠0.015%存在時的比較圖。
第3圖顯示使用中國倉鼠(Chinese hamster)卵巢來源之細胞株(CHO-K1)插入人干擾素β(IFN-β)基因的CHO-K1，在脫醯基化結蘭膠的存在下(0.025%)及不存在下(對照)培養時的細胞數的增加與IFN-β產生量的比較圖。
第4圖顯示在第3圖所述的使用CHO-K1的試驗中，以梯形法算出在脫醯基化結蘭膠存在下(0.025%)及不存在下(對照組)，經比較的細胞數增加(左圖)與IFN-β產生量比較圖(右圖)二者的圖形下面積，並用細胞數增加之圖形下面積，校正λ鏈產生量之圖形下面積(IFN-β產生量之圖形下面積/細胞數增加之圖形下面積)，再與對照組為1時的脫醯基化結蘭膠0.025%存在時的比較圖。
第5圖顯示對凝膠進行超音波處理，並在培養培養基添加時 進行再懸浮的情況下，凝膠的細微化處理對細胞增殖的影響。
第6圖顯示對凝膠進行超音波處理，並在培養培養基添加時進行再懸浮的情況下，凝膠的細微化處理對IFN-β產生的影響。
第7圖顯示不同的轉瓶(roller bottle)器材對凝膠所具有的細胞增殖能力的影響。
第8圖顯示不同的轉瓶器材對凝膠所具有的IFN-β產生的影響。
1、培養基添加劑/蛋白質產生促進劑
本發明至少一部分是根據在使用動物細胞製造蛋白質時，至少在所培養的細胞能充分增殖的期間或所產生的所希望之蛋白質能充分產生的期間的一部分或全部中，藉由在培養液加多醣類，而可得到目的蛋白質的高產生的發現。因此，本發明是提供含有該多醣類而成的動物細胞用培養基添加劑、及藉由該動物細胞產生蛋白質的促進劑(以下，有時簡稱為「本發明的培養基添加劑/蛋白質產生促進劑」)。
在本發明所用的多醣類較佳為具有陰離子性官能基的多醣類。陰離子性的官能基可舉例為羧基，磺酸基，磷酸基及其鹽，較佳為羧基或其鹽。
在本發明所用的多醣類較佳為可舉例為有10個以上的單糖類(例如，三碳糖類，四碳糖類，五碳糖類，六碳糖類，七碳糖類等)所聚合的多醣類，更佳為可舉例為有陰離子性的官能基的酸性多醣類。這裏所稱的酸性多醣類只要在其構造中有陰離子性的官能基便無特別的限制，例如，具有糖醛酸(例如，葡萄糖醛酸，艾 杜糖醛酸(iduronic acid)，半乳糖醛酸，甘露糖醛酸)的多醣類，構造中的一部分具有硫酸或磷酸的多醣類，或具有該等二者的構造的多醣類，不只包括天然可得的多醣類，也包括由微生物醱酵產生的多醣類，以基因工程方法產生的多醣類，或使用酵素而人工合成的多醣類。更具體而言，可例示為選自由玻尿酸，結蘭膠，脫醯基化結蘭膠，鼠李聚糖膠，迪特膠，黃原膠，鹿角菜膠，黃原膠，己糖醛酸，褐藻糖膠，果膠，果膠酸，果膠酯酸，硫酸乙醯肝素，肝素，類硫酸乙醯肝素，硫酸軟骨素，硫酸皮膚素，硫酸鼠李聚糖及其鹽所成群組之1種或2種以上醣類所構成的多醣類。
這裏所稱的鹽可舉例如鋰，鈉，鉀等鹼金屬的鹽，鈣，鋇，鎂等鹼土類金屬的鹽或鋁，鋅，銅，鐵，銨，有機鹼基及胺基酸等的鹽。雖較佳為鈣，鎂，鋅，鐵，銅等的2價金屬鹽，但並不限定於此。
該等多醣類的重量平均分子量較佳為10,000至50,000,000，更佳為100,000至20,000,000，再更佳為1,000,000至10,000,000。本案發明中的該分子量是定義為經由凝膠滲透層析法(GPC)之普魯蘭多糖(pullulan)換算值。
在本發明所用的多醣類的更佳具體例，可舉脫醯基化結蘭膠，鹿角菜膠及黃原膠，最佳可舉脫醯基化結蘭膠。在本發明中的脫醯基化結蘭膠是以1-3鍵結的葡萄糖，1-4鍵結的葡萄糖醛酸，1-4鍵結的葡萄糖及1-4鍵結的鼠李糖的4分子的糖做為構成單元的直鏈狀的高分子多醣類，係在下面的一般式(I)中，R1，R2均為氫原子，n是2以上的整數所表示的多醣類。但，R1含甘 油基，R2含乙醯基也可以，而乙醯基及甘油基的含有量是，較佳為10%以下，更佳為1%以下。
在本發明中的多醣類是以化學合成法也可得，但該化合物是天然物時，係由含有該化合物的各種植物，各種動物，各種微生物使用慣用技術經萃取及分離精製而得為合適。在其萃取時，使用水或超臨界氣體可較有效率的萃取出該化合物。例如，結蘭膠的製造方法而言，以醱酵培養基培養產生結蘭膠之微生物，將在菌體外產生的黏膜物以通常的精製方法回收，經乾燥，粉碎等的製程後，製成粉末狀即可。又，脫醯基化結蘭膠的情況時，在回收前述黏膜物時施以鹼處理，將與1-3鍵結的葡萄糖殘基鍵結的甘油基及乙醯基脫醯基化後回收即可。精製方法而言，例如，藉由液-液萃取，示差沈澱(differential precipitation)，結晶化，各種的離子交換層析法，使用葡聚糖凝膠(sephadex LH-20)等的凝膠過濾層析法，經活性炭，氧化矽凝膠等的吸附層析法或薄層層析法的活性物質的吸脫附處理，或使用逆相管柱的高速液體層析法等，將上述者單獨或以任意的順序組合，或反覆使用，除去不純物而精製。產生結蘭膠的微生物的例並不是要限定為下述者，但可列舉鞘氨醇單胞菌(Sphingomonas elodea)及經改良該微生 物的基因的微生物。再者，脫醯基化結蘭膠的情況係可使用市售品，例如，三晶股份有限公司製「KELCOGEL(CP‧Kelco公司的登錄商標)CG-LA」，三營源F‧F‧I股份有限公司製「Kelco凝膠(CP‧Kelco公司的登錄商標)」等。
在本發明的培養基添加劑/蛋白質產生促進劑中，上述任一種的多醣類之外，可含有通常調配於培養基的各種成分，但也可以將該多醣類本身單獨做為本發明的培養基添加劑/蛋白質產生促進劑而使用。
本發明的培養基添加劑只要能發揮做為蛋白質產生促進劑的功能，即，只要將動物細胞產生的目的蛋白質的產生量比不添加該多醣類時可顯著增大，則在對該動物細胞培養沒有不良影響的範圍中可適宜添加於培養基。例如，在上述多醣類的培養基中的濃度是將本發明的培養基添加劑添加於培養基，使其濃度在0.001%至1.0%(重量/容量，有時亦簡述為w/v)，較佳為0.002%至0.4%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.2%(重量/容量)，再更佳為0.005%至0.05%(重量/容量)即可。例如，做為多醣類而使用脫醯基化結蘭膠時，在培養基中添加培養基添加劑而使脫醯基化結蘭膠濃度在0.001%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.001%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.1%(重量/容量)，最佳為0.01%至0.05%(重量/容量)即可。又，該濃度可由下述的式算出。
濃度(%)=特定化合物的重量(g)/培養基組成物的容量(ml)×100
2、培養基組成物
可使用本發明的培養基添加劑的培養基如是動物細胞用的培養基則無特別的限制，例如根據培養基組成的分類，可舉天然培 養基，半合成培養基及合成培養基，又，根據形狀的分類，可舉半固形培養基，液體培養基等。例如，可舉杜爾貝科改良伊格爾培養基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)，漢姆F12培養基(Ham’s Nutrient Mixture F12)，DMEM/F12培養基，媚恪5A培養基(Mccoy’s 5A medium)，伊格爾MEM培養基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)，α MEM培養基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；α MEM)，MEM培養基(Minimum Essential Medium)，RPMI1640培養基，伊斯科夫改良杜爾貝科培養基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)，MCDB131培養基，威廉培養基E(William’s medium E)，IPL41培養基，費歇爾培養基(Fischer’s medium)，E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)，UltraCHO(登錄商標)培養基(Lonza公司製)，EX-CELL(登錄商標)302培養基(Sigma Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標)325-PF培養基(Sigma-Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標)ACF CHO培養基(Sigma-Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標)CHO DHFR培養基(Sigma-Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標CD CHO培養基(Sigma-Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標)CD CHO-2培養基(Sigma-Aldrich公司製)，EX-CELL(登錄商標)CD CHO-3培養基(Sigma-Aldrich公司製)，CDOptiCHO(登錄商標)培養基(Life Technologies公司製)，CD CHO培養基(Life Technologies公司製)，CD CHO AGT(登錄商標)培養基(Life Technologies公司製)，CD FortiCHO(登錄商標)培養基(Life Technologies公司製)，CHO-S-SFMII培養基(Life Technologies公司製)，CD DG44培養基(Life Technologies公司製)，Hyclone CDM4CHO 培養基(Thermo Scientific公司製)，Hyclone SFM4CHO培養基(Thermo Scientific公司製)，CD-ACP-CHO(Sigma-Aldrich公司製)，Hyclone SFM4CHO-Utillity培養基(Thermo Scientific公司製)，KBM270培養基(Kohjin Bio股份有限公司製)，KBM240培養基(Kohjin Bio股份有限公司製)，KBM230培養基(Kohjin Bio股份有限公司製)，KBM306培養基(Kohjin Bio股份有限公司製)，BD Select CHO培養基(Becton,Dickinson公司製)，CHOMACS CD培養基(Miltenyi Biotec公司製)，ESF SFM培養基(Expression Systems公司製)，Daigo’s T培養基(日本製藥股份有限公司製)，IS CHO-V培養基(登錄商標)(Irvin Scientific公司)，IS CHO-V-GS培養基(登錄商標)(Irvin Scientific公司)，Opti-Pro(Invitrogen公司製)等，但不限定於該等者。
本業者在上述培養基中可添加各種胺基酸，各種維生素，能量源，滲透壓調整劑，鐵源，pH緩衝液，或抗生物質等的1種類或以上之組合。再者，本業者也可視目的添加1種類以上的其他的化學成分或活體成分的組合。
各種胺基酸而言，可使用L-丙胺酸，L-精胺酸，L-天冬醯胺酸，L-天冬胺酸，L-半胱胺酸，L-胱胺酸，L-麩醯胺酸，L-麩胺酸，甘胺酸，L-組胺酸，L-異白胺酸，L-白胺酸，L-離胺酸，L-甲硫胺酸，L-鳥胺酸，L-苯丙胺酸，L-脯胺酸，L-絲胺酸，L-蘇胺酸，L-色胺酸，L-酪胺酸，L-纈胺酸等，各種維生素而言，可使用生物素，葉酸，硫辛酸，菸鹼醯胺，菸鹼酸，對胺基安息香酸，泛酸鈣，鹽酸吡哆醛，鹽酸吡哆醇，核黃素，鹽酸抗神經素，維生素B12，抗壞血酸等，能量源而言，可使用葡萄糖，半 乳糖，甘露糖，果糖等，滲透壓調節劑而言，可使用氯化鈉，氯化鉀，硝酸鉀等，鐵源而言，可使用EDTA鐵，檸檬酸鐵，氯化亞鐵，氯化鐵，硫酸亞鐵，硫酸鐵，硝酸鐵等，pH緩衝劑而言，可使用碳酸氫鈉，氯化鈣，磷酸二氫鈉，HEPES，MOPS等。添加的濃度是本業者配合培養的細胞的種類等而可適宜調整。
添加於培養基的抗生素的例而言，可舉磺胺製劑，盤尼西林，苯氧乙基青黴素(phenethicillin)，甲氧西林(methicillin)，苯唑西林(oxacillin)，氯唑西林(cloxacillin)，二氯西林，氟氯西林(flucloxacillin)，奈夫西林(nafcillin)，安比西林(ampicillin)，盤尼西林，阿莫西林(amoxicillin)，環己西林(ciclacillin)，卡貝尼西林(carbenicillin)，替卡西林(ticarcillin)，哌拉西林(piperacillin)，阿洛西林(azlocillin)，美洛西林(mezlocillin)，美西林(mecillinam)，阿德諾西林(amdinocillin=mecillinam)，頭孢菌素(cephalosporin)及其衍生物，歐索林酸(oxolinic acid)，氨氟沙星(amifloxaicn)，替馬沙星(temafloxacin)，萘利啶酸(nalidixic acid)，吡咯米酸(piromidic acid)，環丙沙星(ciprofloxacin)，西諾沙星(cinoxacin)，諾氟沙星(norfloxacin)，培氟沙星(perfloxacin)，羅索沙星(rosaxacin)，氧氟沙星(ofloxacin)，依諾沙星(enoxacin)，吡哌酸(pipemidic acid)，沙巴克坦(sulbactam)，克拉維酸(clavulanic acid)，β-溴代青黴烷酸(bromopenicillanic acid)，β-氯代青黴烷酸，6-乙醯基亞甲基-青黴烷酸(acetylmethylene-penicillanic acid)，頭孢唑(cephoxazole)，舒他西林(sultamicillin)，美西林(adinocillin)，三唑巴坦(tazobactam)，氨曲南(aztreonam)，磺醯胺菌素(sulfazethin)，異磺醯胺菌素(isosulfazethin)，諾卡霉素(narcardicin)，m-羧基苯基，苯基乙醯胺 磺酸甲酯，氯四環素，氧四環素，四環素，地美環素(demeclocycline)，多環黴素(doxychycline)，美他環素(methacycline)，以及米諾環素(minocycline)，但不限定於該等者。添加的濃度是本業者配合培養細胞的種類等而可適宜調整。
將本發明的培養基添加劑添加於上述培養基時，在使用時先將培養基添加劑溶解於適當的溶媒，之後，將該添加劑溶液添加於培養基中，使多醣類在培養基中的濃度在上述的範圍內即可。於此，適當的的溶媒的例而言，可舉水，二甲基亞碸(DMSO)，甲醇，乙醇，丁醇，丙醇，甘油，丙二醇，丁二醇等的各種醇類等，但並不限定於該等者。
上述培養基添加劑溶液的調製法而言，先將培養基添加劑添加於上述溶媒，一邊於能溶解多醣類的溫度(例如，60℃，80℃，90℃以上)下加熱，一邊攪拌而溶解。溶解後，一邊攪拌一邊冷卻放，並進行滅菌(例如，在121℃ 20分鐘的高壓釜滅菌)，恢復到室溫後，在培養基添加前述滅菌後的溶解液，使之與將培養基混合均勻。例如，調製脫醯基化結蘭膠時，在離子交換水或超純水添加脫醯基化結蘭膠而使之成為0.1%至2.0%(重量/容量)，0.2%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.2%至0.5%(重量/容量)，更佳為0.2%至0.4%(重量/容量)。然後，如在能溶解前述脫醯基化結蘭膠的溫度則在任何溫度都可以，但一邊加熱到60℃以上，較佳為80℃以上，更佳為90℃以上，一邊攪拌而溶解直到成為透明的狀態為止。溶解後，一邊攪拌一邊冷卻放，並進行滅菌(例如121℃ 20分的高壓釜)，恢復到室溫後使之與培養基混合均勻。混合方法並無特別限制，例如可舉以移液吸管吸取釋放(pipetting)等 的手動的混合，使用電磁攪拌器或機械式攪拌機，均質混合機等的機器的混合。又，在混合後亦可將該培養基混合液以過濾器過濾。
如上述調製的脫醯基化結蘭膠係可將凝膠化的狀態細微化而使用於細胞培養。細微化的手段而言，可舉物理化學的方法。例如，可舉在後述的實施例所述，使用EDTA，草酸鉀等的化學手段，使用紫外光，超音波處理等的物理手段。由這些手段細微化的凝膠係可在添加於培養基時再懸浮而使用。
如上述調製的含有本發明的培養基添加劑/蛋白質產生促進劑而成的本發明的動物細胞用培養基組成物中的血清或血清代替物的濃度如下。
例如，血清的情況時，可舉無血清培養基，或血清濃度在1%至15%(重量/容量)，1%至10%(重量/容量)，5%至15%(重量/容量)，5%至10%(重量/容量)的血清培養基。血清代替物的情況時，可舉不含該代替物，或以代替前述濃度範圍內的血清的功能的濃度(例如，1%至15%(重量/容量)，1%至10%(重量/容量)，5%至15%(重量/容量)，5%至10%(重量/容量))而含有該代替物的培養基。
3、細胞培養方法
在本發明中，一邊而言，使用細胞培養方法的分批培養法(batch culture)，連續培養法(continuous culture)，分批補料式培養法(fed-batch culture)的任何一種培養方法都可以，但較佳為使用分批補料式培養法或連續培養法，特佳為使用分批補料式培養法。
分批培養法(batch culture)是在培養基添加少量的種菌培養液(seed culture medium)，在培養期間不重新添加培養基或 不排出培養液，而使細胞增殖的培養方法。在本發明中使用分批培養法時，可以使用含有本發明的培養基添加劑的培養液做為種菌培養液。
連續培養法(continuous culture)是在培養期間連續添加培養液並且連續排出的培養方法。又，連續法中也包括灌注培養法(perfusion culture)。
分批補料式培養法(fed-batch culture)是在分批培養法與連續培養法之間，所以也被稱為半分批培養法(semi-batch culture)，是在培養期間連續或逐次添加培養基，但是不進行如連續培養法般的連續排出培養液的培養方法。分批補料式培養時所添加的培養基(以下，稱為分批補料式培養基)是無須與已經在培養中使用的培養液(以下，稱為初期培養液)相同，而添加不同培養液也可以，只添加特定的成分也可以。
在本發明中的初期培養液就是，通常，係指在細胞培養的最初階段所使用的培養液。但，在分開添加多數次分批補料式培養液時，將各別的添加分批補料式培養液之前的培養液當做初期培養液也可以。在初期培養液中可使用含有上述本發明的培養基添加劑的培養液培養細胞。在初期培養液添加多醣類的濃度而言，只要能增加目的蛋白質的產生量的濃度就足夠。例如，將多醣類添加於培養液而成為0.001%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.002%至0.4%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.2%(重量/容量)，再更佳為0.005%至0.05%(重量/容量)就可以。
在本發明中，使用分批補料式培養法或連續培養法時，做為在培養途中添加的培養液，可使用含有上述本發明的培 養基添加劑的培養液。在分批補料式培養期間添加的培養液(分批補料式培養液)較佳為避免培養體積的增大而使用高濃度培養基為理想。具體而言，例如，分批補料式培養基的濃度可使用含0.001%至1.0%(重量/容量)，較佳為0.002%至0.4%(重量/容量)，更佳為0.005%至0.2%(重量/容量)，再更佳為0.005%至0.05%(重量/容量)的多醣類的培養基做為分批補料式培養液。
在本發明中，將前述分批補料式培養液添加於培養液時，可將初期培養液量的1%至150%，較佳為5%至50%，再更佳為8%至20%，做為在整個培養期間連續，或隔一定期間，或逐次添加的分批補料式培養液量而使用。
本發明的培養方法並無特別的限定而可使用於各種動物細胞的培養。例如，可培養人類癌化細胞，產生抗體的小鼠-人類，小鼠-小鼠，小鼠-大鼠等的融合瘤(hybridoma)所代表的融合細胞或藉由操作基因工程已插入編碼所希望之蛋白質的基因的COS細胞或CHO細胞。
例如，培養在後述的實施例所述的SC-01MFP(寄存於獨立行政法人產業技術綜合研究所的細胞株，FERM BP-10077)(國際公開第2005/083060號)，可得到該動物細胞天生產生的天然型蛋白質。又，此細胞株亦可利用於培養以含有編碼所希望之蛋白質的核酸的表現載體(expression vector)轉染(transfection)而得的該蛋白質高產生細胞株時。
在本發明中特佳的動物細胞是，導入有編碼所希望之蛋白質的基因的CHO細胞。CHO的例而言，可舉CHO K1細胞(ATCC CCL-61(商標))，CHO-S細胞，DG44細胞等，但並不限制 於該等者。所希望之蛋白質並無特別的限定，可為天然抗體，抗體片段，低分子化抗體，嵌合抗體(chimeric antibody)，人源化抗體(humanized antibody)，全人源抗體等的抗體(例如，抗IL-6受體抗體，抗蛋白多糖-3抗體(glypican-3)，抗CD3抗體，抗CD20抗體，抗GPIIb/IIIa抗體，抗TNF抗體，抗CD25抗體，抗EGFR抗體，Her2/neu抗體，抗RSV抗體，抗CD33抗體，抗CD52抗體，抗IgE抗體，抗CD11a抗體，抗VEGF抗體，抗VLA4抗體等)或生理活性蛋白質(個粒球群落刺激因子(granulocyte colony-stimulating factor(G-CSF))，個粒球巨噬细胞群落刺激因子(granulocyte/macrophage colony-stimulating factor(GM-CSF)，紅血球生成素(erythropoietin)，干擾素，IL-1或IL-6等的介白素(interleukin)，t-PA，尿激素(urokinase)，血清白蛋白，血液凝固因子，等)，包含細胞介素類的任何蛋白質，但特佳為做為醫藥品而可使用的抗體及胞含細胞介素類的免疫相關蛋白質，與細胞增殖分化有關的蛋白質，膜蛋白質等。
由於培養條件是隨使用的細胞的種類而不同，所以可適當決定合適的條件。例如，若是CHO細胞時，通常可於氣相的CO2濃度在0%至40%，較佳為2%至10%的環境下，培養液的pH設定為pH6.5至7.2，較佳為pH6.7至7.0，更佳為pH6.8至6.9的範圍，在30℃至39℃，較佳為37℃左右，培養1日至50日，再更佳為培養1日至14日。
又，動物細胞培養用的各種培養裝置而言，可使用例如醱酵槽型槽培養裝置，氣升型培養裝置，培養燒瓶型培養裝置，旋轉燒瓶型培養裝置，微載體(microcarrier)型培養裝置，流動 層型培養裝置，中空纖維型培養裝置，轉瓶型培養裝置，充填槽型培養裝置，生物反應器型培養裝置等而培養，但不限定於該等者。
使用本發明的培養方法培養細胞時，可使用在一般的細胞的培養所用的培養皿(schale)，燒瓶，塑膠袋，鐵弗龍(登錄商標)袋，盤，培養皿(petri dish)，組織培養用盤，多孔盤(multidish)，微孔板(microplate)，微孔板(microwell plate)，多孔板(multiplate)，多孔板(multiwell plate)，細胞培養玻片(chamber slide)，細胞培養燒瓶，旋轉燒瓶，試管，盤(tray)，培養袋，轉瓶等的培養器材培養。
這些培養器材的材質是，例如，可舉玻璃，聚氯乙烯，乙基纖維素或乙醯基纖維素等的纖維素系聚合物，聚苯乙烯，聚甲基丙烯酸甲酯，聚碳酸酯，聚碸，聚氨酯，聚酯，聚醯胺，聚苯乙烯，聚丙烯，聚乙烯，聚丁二烯，聚(乙烯-乙酸乙烯酯)共聚物，聚(丁二烯-苯乙烯)共聚物，聚(丁二烯-丙烯腈)共聚物，聚(乙烯-丙烯酸乙酯)共聚物，聚(乙烯-甲基丙烯酸酯)共聚物，聚氯丁二烯，苯乙烯樹脂，氯磺化聚乙烯(chlorosulfonated polyethylene)，乙烯乙酸乙烯酯，丙烯酸系崁段共聚物等的塑膠等。如後述的實施例所述，由於藉由轉瓶的器材，對本發明的凝膠所具有的細胞增殖等有影響，因而較佳為聚苯乙烯。
4、蛋白質的製造方法
藉由上述的細胞培養方法培養動物細胞，可以高產量產生蛋白質。
一般而言，動物細胞蛋白質的產生單純是僅將其培 養即可，或也存在需要特殊操作的情況，這些的操作或條件等是視培養的動物細胞而適宜決定即可。蛋白質的種類並無限定，例如在經由基因工程的操作轉染有含有編碼小鼠-人嵌合抗體的基因的載體的CHO細胞中，藉由在上述的條件下實施培養，在1日至50日，較佳為5日至21日，再更佳為7日至14日左右，可在培養基中得到所希望之蛋白質。將此蛋白質依照常法(例如，參照抗體工程入門，地人書館，(1994)，p.102-104；Affinity chromatography Principles and Methods，GE Health Care(股)，(2003)，p.56-60等)單離，精製，而可得到所希望之蛋白質。
藉由本發明，可以高產生量製造重組抗體(天然抗體，抗體片段，低分子化抗體，嵌合抗體，人源化抗體，全人源抗體，雙專一性抗體等)，基因重組蛋白質(個粒球群落刺激因子(G-CSF)，個粒球巨噬细胞群落刺激因子(GM-CSF)，紅血球生成素，干擾素，IL-1及IL-6等的介白素，t-PA，尿激素，血清白蛋白，血液凝固因子等)等。
以本發明的製造方法所產生的抗體而言，不僅是人類，小鼠，大鼠，倉鼠，兔，猴等的動物來源的單株抗體，也包含嵌合抗體，人源化抗體，全人源抗體，雙專一性抗體等經人為改良的基因重組型抗體。又，抗體的免疫球蛋白類組並無特別的限定，IgG1，IgG2，IgG3，IgG4等的IgG，IgA，IgD，IgE，IgM等任何類組(class)都可以，但做為醫藥而使用時較佳是IgG及IgM。再者做為本發明的抗體不只是整個抗體，也包含Fv，Fab，F(ab)2等的抗體片段，及以肽連接物(linker)等的連接物使抗體的可變領域鍵結的1價或2價以上的一條鏈Fv(scFv，sc(Fv)2等)的低 分子化抗體。
下面，依據實施例及參考例具體說明本發明。又，這些實施例等是用於說明本發明，並非限定本發明的範圍者。
實施例1 [樣本]
本實施例中所用的細胞株是具有抗體λ輕鏈蛋白質的特殊產生能力的人類骨髓瘤來源細胞株SC-01MFP(國際公開第2005/083060號)。
[經含有脫醯基化結蘭膠培養基的培養評估系統]
將脫醯基化結蘭膠粉末(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)溶解於超純水(milli-Q水)成為3g/L濃度。之後以熱水浴加熱，確認脫醯基化結蘭膠粉末溶解後，以高壓釜進行滅菌。將滅菌後的溶液靜置冷卻至室溫，製作混合培養基使脫醯基化結蘭膠濃度成為相對於含有10%牛胎兒血清E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)的0.015%(w/v，以下脫醯基化結蘭膠的濃度都一樣)。對照組是使用不含脫醯基化結蘭膠的含有10%牛胎兒血清E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)。其次將所製作的含有脫醯基化結蘭膠培養基以1×104個細胞/孔的方式在96孔免疫盤細胞每孔播種(seed)100μL。每隔24小時，添加10μL/孔的細胞計數套組(cell counting Kit8，股份有限公司同仁化學研究所)，培養1.5小時，將培養液100μL移到另一個96孔盤，測量在450至595nm的吸光度。結果如第1圖左所示，SC-01MFP細胞在培養開始後第2日以後，在添加脫醯基化結蘭膠0.015%的培養基培養與對照群的無添加脫醯基化結蘭膠比較，並未觀察到二者的細胞 數增加有顯著的差異。
[以酵素抗體法測定λ鏈產生量]
使用酵素抗體法(ELISA；enzyme-linked immunosorbent assay)測定上述的培養上清液中的λ鏈產生量。將山羊的抗人類λ鏈抗體(BIOSORCE)以磷酸緩衝鹽水(PBS)稀釋2000倍以100μL/孔分注於96孔免疫盤以塗佈之。在37℃下靜置1小時後，為防止非專一性反應，將在PBS中稀釋成為0.5%牛血清白蛋白(BSA；ICN)的溶液(0.5% BSA/PBS)以300μL/孔分注之，進行阻斷(blocking)。之後，在37℃下靜置1小時，將含有要定量的IFN-β抗體的培養上清液以0.5% BSA/PBS稀釋為1/10，1/100，以50μL/孔分注。又，同樣地將由1μg/mL至152ng/mL分成3段的梯度稀釋的標準溶液以50μl/well分注，在37℃下靜置1小時。之後，將辣根(Armoracia rusticana)來源過氧化酵素標記的人類λ鏈抗體(BIOSORCE)以0.5% BSA/PBS溶液稀釋為5,000倍，以100μL/孔分注，在37℃下靜置1小時。呈色液是將0.006% H2O2-0.2M檸檬酸緩衝液(pH4.0)，6mg/mL ABTS-(NH4)2(和光純藥)，超純水(milli-Q水)各分別以10：1：9比率混合的溶液並以100μL/well分注之，在30分鐘後測定在414nm波長的吸光度。各反應之間以PBS將聚乙烯(20)單月桂酸山梨糖醇酯(Tween20；和光純藥)稀釋為0.05%濃度的溶液清洗3次。第1圖右是顯示SC-01MFP細胞的λ鏈產生量的結果的圖形。培養開始後，相較於對照組實驗，在第3日以後的λ鏈的產生量，係添加0.015%的濃度的脫醯基化結蘭膠者之抗體產生量顯著地增加。第2圖是記載，以梯形法算出在第1圖左右圖所得的圖形的面積，比較以由細胞數的圖形所得面積 除由抗體產生量的圖形所得面積的值(由抗體產生量的圖形所得的面積/由細胞數的圖形所得的面積≒每1個細胞的抗體產生量相對量)的圖(將對照組做為1時，換算添加0.015%脫醯基化結蘭膠時的比率而表示之)。藉由添加脫醯基化結蘭膠，每1個細胞的λ鏈產生量增加約3倍。
實施例2 [樣本]
本實施例中所用的寄主細胞株是中國倉鼠卵巢來源細胞株CHO-K1(ATCC CCL-61(商標))。為了評估物質產生性，如以下所述將人類干擾素β(IFN-β)基因插入CHO-K1，製作在培養上清液中產生IFN-β的細胞株。
首先，自IFN-β生產細胞的人類皮膚來源的正常二倍體纖維芽細胞株TIG-108進行IFN-β基因之取得。將細胞數為5×106個細胞的TIG-108以400×g離心5分鐘，除去上清液後，添加核酸萃取試劑ISOGEN(NIPPON GENE公司)1mL，三氯甲烷(和光純藥)0.2mL，使DNA、蛋白質在有機層沈澱。以12000×g離心15分鐘後，取得水相(RNA層)，添加異丙醇(和光純藥)0.5M1於此，以12000×g離心15分鐘後，使RNA沈澱。將沈澱的RNA溶解於滅菌水後，添加First-Stand Reaction Mix Beads(Amersham Bioscience公司)及pd(N)6Randam Hexamer(Amersham Bioscience公司)1μL，在室溫下靜置1分鐘後，在37℃下進行60分鐘的反轉錄反應，合成cDNA。
繼而，嘗試IFN-β基因的PCR放大。首先，將滅菌水35.5μL，混合Taq緩衝液(Blend Taq buffer)5μLDntp混合物 4μl，引子F(5’-ATGACCAACAAGTGTCTCCT-3’；序列編號1)1μL(10pmoles)，引子R(5’-TcAGTTTcGGAGGTAAccTG-3’；序列編號2)1μL(10Pmoles)，Taq DNA聚合酶0.25μL(Takara Bio公司)，cDNA 3μL(50ng)在0.2mL試管中混合。將此試管放入程序溫度控制系統(Program Temp.Control System)(ASTEC公司)，進行PCR。將PCR產物以1%洋菜糖膠電泳法確認後，以Freeze’ NSqueese旋轉管柱(BIO RAD公司)精製。將精製後的PCR產物2μL，與pTARGET載體1μL(50ng)，與TaKaRa DNA連接套組(Takara Bio公司)3μL混合，在16℃下進行30分鐘的連結反應。繼而，將連結後的pTARGET載體以熱休克反應(heat shock)導入JM109細胞(Promega公司)，而播種於LB培養基盤。取得生長的群落，以LB培養基1mL，37℃下震盪培養一夜後，以QIAprep旋轉微製備套組(QIAprep Spin Miniprep Kit)(QIAGEN公司)萃取pTARGET載體。繼而，以在IFN-β基因序列上有辨識序列存在的限制酶Pst I(TOYOBO公司)切斷pTARGET載體，確認IFN-β基因在pTARGET載體上有被選殖(cloning)。
繼而，將CHO-K1細胞株以含有10%牛胎兒血清(Fetal bovine serum FBS，Trace公司)的E-RDF(10% FBS-E-RDF)培養基培養後，調製為5×106個細胞/mL，以PBS替換。其次，確認IFN-β基因在pTARGET載體有被選殖。
添加基因3μg，以0.75kV/cm，350μF的條件施加電壓。以10% FBS-E-RDF培養基進行恢復培養，在96孔培養盤(Beckton & Dickinson公司)以100μL/孔分注。培養24小時後，以添加有G-418(Geneticin，Invitrogen公司)最終濃度為500μg/mL的 10%FBS-E-RDF培養基選擇培養經導入基因的細胞。之後，對確認有增殖的細胞進行IFN-β基因的表現確認，而製作產生IFN-β的CHO-K1細胞。
[脫醯基化結蘭膠培養評估系統]
將脫醯基化結蘭膠粉末(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)溶解於超純水(milli-Q水)成為4g/L濃度。之後以熱水浴加熱，確認脫醯基化結蘭膠粉末溶解後，以高壓釜進行滅菌。將滅菌後的脫醯基化結蘭膠水溶液靜置冷卻至室溫，對含有胰島素(牛來源，最終濃度：5μg/mL)，運鐵蛋白(牛來源，最終濃度：20μg/mL)，乙醇胺(最終濃度：20μmol)，亞硒酸鈉(最終濃度：25nmol)的E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)，製作脫醯基化結蘭膠濃度為0.025%的混合培養基，做為無血清培養基。對照組是使用不含脫醯基化結蘭膠的上述無血清E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)。其次對所製作的培養基將細胞以1×104個細胞/孔在96孔免疫盤每孔播種100μL。每隔24小時，添加10μL/孔的細胞計數套組8(股份有限公司同仁化學研究所)，培養1.5小時，將培養液100μL移到另一個96孔盤，測量在450至595nm的吸光度。其結果，如第3圖左圖所示，可知相較於無添加的培養系，在無血清E-RDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)添加脫醯基化結蘭膠培養系對細胞增殖效果沒有影響。
[以酵素抗體法測定IFN-β產生量]
使用酵素抗體法(ELISA；enzyme-linked immunosorbent assay)測定培養上澄液中的IFN-β產生量。將山羊抗人類IFN-β抗體(R & D System INC.)以磷酸緩衝鹽水(PBS)稀釋成為1μg/mL，以100μL/孔分注在96孔免疫盤以塗佈之。在37℃下靜置1小時後，為了避免非專一性反應，將在PBS中稀釋為0.5%牛血清白蛋白(BSA；ICN)的溶液(0.5%BSA/PBS)以300μL/孔分注之，進行阻斷。之後，在37℃下靜置1小時，將含有要定量的IFN-β抗體的培養上清液以0.5% BSA/PBS稀釋為1/10，以50μL/孔分注。又，同樣地將0.33μg/mL的標準溶液以50μL/孔分注，在37℃下靜置1小時。之後，將小鼠抗人類IFN-β抗體(R & D System INc.)以0.5% BSA/PBS稀釋成為1μg/ml，以100μL/孔分注後，在37℃下靜置1小時。之後，將辣根來源過氧化酵素標記山羊抗小鼠IgG抗體以0.5% BSA/PBS溶液稀釋5,000倍，以100μL/孔分注而在37℃下靜置1小時。將呈色液的10% 3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺(tetramethylbenzidine,TMB)-二甲亞碸(DMSO)溶液/0.006% H2O2-0.2M檸檬酸緩衝液(pH4.0)溶液以100μL/孔分注，在30分鐘後以1N-H2SO4溶液停止反應後，測定在450nm波長的吸光度。各反應之間以PBS將聚乙烯(20)單月桂酸山梨糖醇酯(Tween20)(和光純藥)稀釋成為0.05%濃度的溶液清洗3次。第3圖左圖顯示細胞數的經時變化圖形，右圖顯示，CHO-K1細胞的IFN-β產生量的經時變化圖形。如第3圖右圖所示，可知在無血清培養中，藉由添加0.025%脫醯基化結蘭膠而比無添加時的IFN-β產生量增加。第4圖記載，以梯形法算出第3圖左右圖所得的圖形的面積，比較以由細胞數的圖形所得的圖形下面積除由IFN-β的圖形所得的圖形下面積的值(由IFN-β產生量的圖形所得的面積/由細胞數的圖形所得的面積≒每1細胞的IFN-β產生量相當量)的圖(將 對照組做為1時，換算添加0.025%脫醯基化結蘭膠時的比率表示之)。藉由添加脫醯基化結蘭膠，每1個細胞的IFN-β產生量增加約44%。
實施例3 [樣本]
本實施例中所使用的細胞株是將實施例2中所使用的人類干擾素β基因插入，並且在培養上清液中會產生人類干擾素β的CHO-K1細胞株。
[凝膠組織的細微化手段]
將脫醯基化結蘭膠粉末(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)溶解於超純水而成為1g/100mL的濃度。繼而，以高壓釜滅菌，溶解凝膠。
其次，將本凝膠進行EDTA，草酸鉀，紫外光，超音波的4種處理，謀求物理化學上的細微化，研究對細胞增殖及細胞生產物的產生量的影響。
首先，EDTA(股份有限公司同仁化學研究所製)的處理是，將EDTA 0.1g溶解於500mL的磷酸緩衝生理鹽水(PBS)，高壓釜滅菌後，將凝膠與EDTA溶液等量混合，在室溫下放置1日。之後，以4000×g離心10分鐘，將液體部分與凝膠部分分離，將凝膠部分添加於含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)成為5%(w/v)而培養。
草酸鉀的處理(和光純藥工業股份有限公司製)是，以超純水製作5%草酸鉀溶液，過濾滅菌後，將凝膠與草酸鉀溶液等量混合，在室溫下放置1日。之後，以4000×g離心10分鐘，將液體 部分與凝膠部分分離，將凝膠部分添加於含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)成為5%(w/v)而培養。
繼而，紫外光的處理是在自市售的15W紫外光燈55cm的距離處靜置凝膠溶液，將連續照射一夜的樣本添加於含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)成為5%(w/v)而培養。
最後，超音波的處理是以輸出20W，週波數28KHz照射凝膠溶液5分鐘，之後，添加於含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)成為5%(w/v)而培養。
又，對照組是使用不含凝膠的含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)。
又，最後，將經EDTA，草酸鉀，紫外光，超音波處理的各凝膠樣本添加於培養的培養基時，為了防止凝膠的再凝集之目的也實施以移液吸管(pipette)做激烈的吸取釋放操作與不做吸取釋放操作的2種處理方式。
細胞是於調製各處理後的凝膠培養基，以1×105個細胞/孔，每孔1mL播種於24孔培養盤。培養時的細胞數是以血球計算板測量細胞數。其結果，如第5圖所示，對凝膠進行超音波處理並在添加於培養的培養基時進行再懸浮，則可看到在培養第7日以後，對照組或其他的樣本的細胞增殖明顯高的增殖支持活性。
[以酵素抗體法測定IFN-β產生量]
測定方法是與實施例2相同。
如第6圖所示，將凝膠進行超音波處理，並在添加於培養的培養基時進行再懸浮時，則可知培養第6日以後，在對照組或其 他樣本的干擾素β產生量有顯著更多的生產。
實施例4 [樣本]
本實施例所使用的細胞株是將實施例2中所使用的人類干擾素β基因插入，並在培養上清液中產生人類干擾素β的CHO-K1細胞株。
脫醯基化結蘭膠培養評估系統]
將脫醯基化結蘭膠粉末(KELCOGEL CG-LA，三晶股份有限公司製)溶解於超純水成為1g/100mL濃度。之後，以高壓釜滅菌，使凝膠溶解。將此凝膠添加於含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)成為5%(w/v)濃度，在玻璃製轉瓶(WHEATON公司製)及聚苯乙烯製轉瓶(BD公司製)各分別分注200mL而培養。又，雙方的轉瓶培養器的表面積都是850cm2左右。
又，細胞的播種密度調整為1×105個細胞/孔。
又，將不含凝膠，只以含有5%牛胎兒血清ERDF培養基(極東製藥工業股份有限公司製)培養者做為對照組。
轉瓶的旋轉速度設定為1rpm。
開始轉瓶培養後，在第7日將各別的細胞以1600×g離心分離5分鐘而回收，以與培養開始時相同的培養基再懸浮而繼代，培養至第14日。細胞數是以血球計算板測量。第7圖顯示在培養第7日的繼代前與後的細胞數及生存率的變化。其結果為，雖然在繼代後細胞數都有增大，但生存率是在玻璃轉瓶中有少許降低。
[以酵素抗體法測定IFN-β產生量]
測定培養上清液中的IFN-β產生量的酵素抗體法是與在實 施例2所述者相同。
第8圖顯示經由不同素材(玻璃製或聚苯乙烯製)的轉瓶的干擾素β產生量。在培養後第7日的繼代前，雖然在玻璃製的轉瓶添加凝膠的實驗系統的IFN-β產生量少許低，但在其他系統中的IFN-β產生量並沒有大的差異。另一方面，在開始培養後第7日的繼代培養後，在聚苯乙烯製的轉瓶添加凝膠者的IFN-β產生量顯著提高，其效果達到沒有添加凝膠的系統的約1.5倍。
(產業上的利用可能性)
如以上的詳述，使用本發明的動物細胞用培養基添加劑時，可促進有用的蛋白質的產生量。
又，本發明的蛋白質的製造法由於能將所希望之蛋白質更為有效率的製造，由製造成本這點來看也有利，例如，在抗體醫藥等的生物醫藥品等的大量供應上可以有很大的貢獻。
本申請案是以在日本國申請的專利案，特願第2012-184508號(申請日：2012年8月23日)為基礎，其內容全部包含在本說明書中。
<110> 日產化學工業股份有限公司(NISSAN CHEMICAL INDUSTRIES,LTD.) 獨立行政法人國立高等專門學校機構(INSTITUTE OF NATIONAL COLLEGES OF TECHNOLOGY,JAPAN)
<120> 蛋白質產生促進劑(AGENT FOR ENHANCING PROTEIN PRODUCTION)
<130> 552577
<150> JP 2012/184508
<151> 2012-08-23
<160> 2
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
由於本案的圖式為呈現實施例之試驗的數據圖，並非本案的代表圖。故本案無指定代表圖。

Claims (15)

  1. 一種動物細胞用培養基添加劑，係含多醣類。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的動物細胞用培養基添加劑，係促進所培養之動物細胞產生所希望之蛋白質。
  3. 如申請專利範圍第2項所述的動物細胞用培養基添加劑，係促進前述動物細胞之每1個細胞的蛋白質的產生。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的動物細胞用培養基添加劑，其中，前述多醣類具有陰離子性官能基。
  5. 如申請專利範圍第4項所述的動物細胞用培養基添加劑，其中，前述多醣類的陰離子性官能基是選自由羧基，磺酸基及磷酸基所成群組之至少一者。
  6. 如申請專利範圍第5項所述的動物細胞用培養基添加劑，其中，前述多醣類是選自由玻尿酸，結蘭膠(gellan gum)，脫醯基化結蘭膠，黃原膠，鹿角菜膠，迪特膠(diutan gum)，海藻酸，褐藻糖膠(fucoidan)，果膠，果膠酸，果膠酯酸，硫酸乙醯肝素(heparan sulfate)，肝素，類硫酸乙醯肝素(heparitin sulfate)，硫酸角質素(keratosulfate)，硫酸軟骨素(chondroitin sulfate)，硫酸皮膚素(dermatan sulfate)，硫酸鼠李聚糖(rhamnan sulfate)或其鹽所組成群組之至少一者。
  7. 如申請專利範圍第6項所述的動物細胞用培養基添加劑，其中，前述多醣類是脫醯基化結蘭膠或其鹽。
  8. 一種動物細胞用培養基，係含有申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的動物細胞用培養基添加劑而成者。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的動物細胞用培養基，其中，血清 濃度在1%(w/v)以上，15%(w/v)以下。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的動物細胞用培養基，其中，由血漿蛋白質，荷爾蒙類，增殖因子及鹽類所選擇的血清代替物的濃度在1%(w/v)以上，15%(w/v)以下。
  11. 如申請專利範圍第8項至第10項中任一項所述的動物細胞用培養基，係再添加由胺基酸類，維生素類，能量源，滲透壓調整劑，鐵源，及pH緩衝液所成群組之至少一者。
  12. 一種使用動物細胞培養的蛋白質的製造方法，係在申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的動物細胞用培養基添加劑的存在下或在申請專利範圍第8項至第11項中任一項所述的動物細胞用培養基中培養該動物細胞。
  13. 如申請專利範圍第12項所述的製造方法，係至少在(a)或(b)期間培養該動物細胞：(a)所培養的動物細胞能充分增殖的期間的一部分或全部；(b)該動物細胞所產生的所希望之蛋白質能充分產生的期間的一部分或全部。
  14. 一種促進培養液中的動物細胞的蛋白質產生量的方法，係在申請專利範圍第1項至第7項中任一項所述的動物細胞用培養基的存在下或在申請專利範圍第8項至第11項中任一項所述的動物細胞用培養基中培養該動物細胞。
  15. 如申請專利範圍第14項所述的方法，係促進動物細胞的每1個細胞的蛋白質產生量。
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