WO2021153723A1 - 着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法 - Google Patents

着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法 Download PDF

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cell
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松尾　隆弘
政雄 森
篤司 国宗
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Definitions

  • the present invention provides a method for producing a composition containing a polypeptide containing suppressed coloring.
  • compositions containing a polypeptide for example, an antibody
  • a pharmaceutical formulation one quality characteristic is that the color of the formulation is at an acceptable level, for example, a level that meets the regulatory requirements for product marketing. It is required to suppress it.
  • the coloring becomes stronger as the concentration increases, so it is important to suppress the color of the preparation to an acceptable level.
  • VB 12 Adsorption of vitamin B 12 (hereinafter, "VB 12") to the antibody has been reported as a cause of coloring of the preparation containing the antibody (Non-Patent Documents 1 to 3 and Patent Document 1).
  • One molecule of cobalt is coordinated to one molecule of VB12.
  • VB12 has a cyanocobalamin form and a hydroxycobalamin form, and it has been reported that the molecule is colored pink or red when the hydroxycobalamin form binds to an antibody (Non-Patent Documents 1 to 3). ..
  • Patent Document 2 a method of preventing coloration by preventing the conversion of cyanocobalamin into hydroxycobalamin in the medium and the reduction of the disulfide bond of the antibody has been reported.
  • Non-Patent Document 1 a cell culture medium for eukaryotic cells
  • Patent Document 1 a cell culture medium for eukaryotic cells
  • Patent Document 1 a cell culture medium for eukaryotic cells
  • the present invention provides a method for solving a coloring problem while maintaining the production amount and physical properties of a polypeptide within an allowable range by changing a relatively simple production method for a polypeptide having characteristics that easily cause coloring. That is the issue.
  • the present invention can be expressed as follows (1) to (17).
  • (1) A method for producing a composition containing a polypeptide containing suppressed coloration, wherein (a) eukaryotic cells containing a nucleic acid encoding the polypeptide are cultured in a cell culture medium containing no vitamin B12; b) A method for producing the composition, which comprises the step of recovering the composition containing the polypeptide from the culture.
  • (2) The method for producing a composition according to (1), wherein the molar concentration ratio of vitamin B12 to the polypeptide in the composition is less than 0.26%.
  • the polypeptide is located at the 214th, 234th, 238th, 250th, 264th, 307th, 311th, 330th, 343rd, 428th, 434th, and 436th positions according to the EU numbering in the Fc region.
  • the polypeptide comprises at least one modification selected from 214R, 234Y, 238D, 250V, 264I, 307P, 311R, 330K, 343R, 428L, 434A, 436T, 438R and 440E by EU numbering in the Fc region. , (6) to (8).
  • the polypeptide is an antibody containing a heavy chain constant region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain constant region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2 (6) to (9).
  • the method for producing the composition according to. (11) The method for producing a composition according to (10), wherein the antibody is an IgG1 humanized antibody that binds to latent myostatin.
  • a method for producing an antibody-containing composition in which coloration is suppressed which comprises the following steps: a) The target antibody is the 214th, 234th, 238th, 250th, 264th, 307th, 311th, 330th, 343th, 428th, 434th, 436th, by EU numbering in the Fc region.
  • Eukaryotic cells containing the nucleic acid encoding the antibody are cultured in a cell culture medium containing no vitamin B12; (b) the composition containing the antibody is recovered from the culture; (c) the obtained composition.
  • a method for producing an antibody-containing preparation which comprises a step of converting a product into a pharmaceutical preparation.
  • eukaryotic cells containing the nucleic acid encoding the antibody are cultured in a cell culture medium free of vitamin B12; (b) antibodies from the culture.
  • a method for suppressing the coloring of an antibody which comprises a step of recovering a composition containing.
  • the present invention provides a method for producing a composition containing a polypeptide containing suppressed coloring.
  • the medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium is designated as VB +, and the medium containing no VB12 in the initial medium and the feed medium is designated as VB-.
  • the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) for each day of 14 days is shown.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the cell viability measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the total number of cells is calculated and shown from the number of viable cells measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR).
  • subculture was performed for 100 days (28 subcultures) in a 3-day or 4-day cycle, using VB12-containing medium as VB + and VB12-free medium as VB-.
  • the initial medium and the flow medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium is defined as VB-, and the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (manufactured by Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day of 14 days of culture.
  • VB + was used as the initial medium and the medium containing VB12 in the feed medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium but not containing VB12
  • the culture medium was used for 14 days.
  • the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day.
  • VB + was used as the initial medium and the medium containing VB12 in the feed medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium but not containing VB12, and the culture medium was used for 14 days.
  • the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the cell viability measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the cell viability measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown.
  • VB + was used as the initial medium and the medium containing VB12 in the feed medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium but not containing VB12
  • the cell viability measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day.
  • VB + was used as the initial medium and the medium containing VB12 in the feed medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium but not containing VB12
  • the culture medium was used for 14 days.
  • the cell viability measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day.
  • Vi-CELL system Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR) is shown for each day.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the total number of cells is calculated and shown from the number of viable cells measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR).
  • Vi-CELL system Boeckman Courter, model Vi-CELL XR.
  • VB + was used as the initial medium and medium containing VB12 in the flow medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium.
  • the total number of cells is calculated and shown from the number of viable cells measured by the automatic measuring device Vi-CELL system (Beckman Courter, model Vi-CELL XR).
  • VB + was used as the initial medium and the medium containing VB12 in the feed medium
  • VB- was used as the medium containing VB12 in the initial medium but containing VB12
  • the cumulative number of cells is calculated and shown from the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (manufactured by Beckman Courter, model Vi-CELL XR) for each day.
  • Vi-CELL system manufactured by Beckman Courter, model Vi-CELL XR
  • the cumulative number of cells is calculated and shown from the number of viable cells measured by the automatic cell measuring device Vi-CELL system (manufactured by Beckman Courter, model Vi-CELL XR) for each day.
  • Vi-CELL system manufactured by Beckman Courter, model Vi-CELL XR
  • subculture was performed for 136 days (39 subcultures) in a 3-day or 4-day cycle, using VB12-containing medium as VB + and VB12-free medium as VB-.
  • the results of plotting the cell proliferation behavior of each day using the cell doubling time as an index are shown.
  • the present invention relates to a method for producing a composition containing a polypeptide containing suppressed coloring.
  • VB12 VB12 refers to cyanocobalamin in a narrow sense, and cobalamin as a general term for B vitamins 12 in a broad sense.
  • VB12 as a medium component is cyanocobalamin, and when the medium component becomes an aqueous solution, it becomes an equilibrium state of cyanocobalamin, hydroxycobalamin, aquacobalamin, adenosylcobalamin, and methylcobalamin.
  • VB12-free initial medium and fed-batch medium can be used for culturing eukaryotic cells.
  • the “VB12-free” medium in the present invention is not only when the concentration of VB12 in the medium is 0 mg / L, but also when the medium is mixed with VB12 to a extent less than the substantial content as a medium additive. Also includes.
  • Example 1 of the present invention when the medium was used for culturing under the same conditions as in Example 1 of the present invention, and the obtained antibody-containing composition (antibody concentration of about 30 mg / mL) was measured by ICP-MS. , When the concentration of cobalt molecule contained in VB12 is less than the quantification limit value of 20 ppb, it corresponds to "VB12 is not contained".
  • Eukaryotic cells ⁇ br /> Eukaryotic cells are cells that have a nucleus surrounded by a nuclear envelope.
  • the "eukaryotic cell containing a nucleic acid encoding a polypeptide" in the present invention is a host cell that can be used as a production system for the production of a desired polypeptide.
  • Such cells may be natural cells capable of producing the desired polypeptide, or cells into which a nucleic acid encoding (or expressing) the desired polypeptide has been artificially introduced, although desired. Transformed cells into which a nucleic acid encoding a polypeptide has been introduced are preferred.
  • a transformed cell is a polypeptide-producing strain obtained by introducing a foreign DNA encoding a desired polypeptide into a eukaryotic cell using a gene recombination technique. Therefore, the phrase "contains a nucleic acid encoding a polypeptide" can also be read as “artificially introduced a nucleic acid encoding a polypeptide” or "introduced a foreign nucleic acid encoding a polypeptide".
  • Typical examples of eukaryotic cells in the present invention are cells suitable as hosts for the production of recombinant proteins and can be selected from cells derived from insects, fish, amphibians, reptiles, or mammals.
  • a preferred example of a eukaryotic cell in the present invention is a mammalian cell.
  • Mammalian cells are selected from CHO cells, NS0 cells, Sp2 / 0 cells, COS cells, HEK cells, BHK cells, PER.C6 (registered trademark) cells, hybridoma cells and the like, but more preferably CHO cells.
  • the cell culture medium refers to a medium used for culturing cells containing a nucleic acid encoding a polypeptide, and may be simply referred to as a medium.
  • a medium used for culturing cells containing a nucleic acid encoding a polypeptide
  • a commercially available medium or a known medium can be appropriately used.
  • ordinary medium contains VB12 as an essential component necessary for cell transcription activity and nucleic acid synthesis.
  • a medium was used in which the composition of the existing medium was maintained, and only the VB12 component was removed, removed, or reduced.
  • IMDM Iscove's Modified Dulbecco's Medium
  • DMEM Dulbecco's Modified Eagle Medium
  • Ham's F12 medium D-MEM as well-known medium or commercially available medium for culturing animal cells.
  • F-12 1 1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium: Nutrient Mixture F-12), RPMI1640, CHO-S-SFMII (Invitrogen), CHO-SF (Sigma-Aldrich), EX-CELL301 (JRH) Biosciences), CD-CHO (Invitrogen), IS CHO-V (Irvine Scientific), PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich) and other media can be used, but are not limited to these. It is something that those skilled in the art naturally understand. Numerous media are well known to those of skill in the art, optimized for cell proliferation and increased yields of antibody and recombinant protein production.
  • an example of a medium that can be used for culturing a CHO cell line that produces a humanized antibody (IgG1 antibody) that binds to latent myostatin used in Examples is IMDM, DMEM, or Ham's F12 medium, or a medium thereof. Combinations can be mentioned.
  • Cell culture Generally, cell culture methods are classified into batch culture, continuous culture, and fed-batch culture.
  • the batch method is a culture method in which a small amount of seed culture medium is added to a medium, and cells are proliferated without adding a new medium to the medium or draining the culture medium.
  • the continuous method is a culturing method in which a medium is continuously added during culturing and the medium is continuously discharged.
  • the continuous method also includes perfusion culture.
  • the fed-batch culture method is between the batch method and the continuous method, it is also called the semi-batch culture, and the medium is added continuously or sequentially during the culture, but like the continuous method.
  • This is a culture method in which continuous drainage of the culture medium is not performed.
  • the medium added during fed-batch culture does not have to be the same medium as the medium already used for culture (hereinafter referred to as initial medium), and even if a different medium is added. Alternatively, only specific components may be added.
  • the fed-batch medium may be a medium having the same composition as the initial medium.
  • any of the batch method, the continuous method, and the fed-batch culture method may be used, but the fed-batch culture method is preferably used.
  • a certain amount of seed medium containing cells is added to the initial medium, and the cells are cultured.
  • fed-batch medium is added during culture to increase the production of the desired polypeptide.
  • the seed medium is the number of cells required to expand and culture cells producing a desired polypeptide (working cell bank) and finally transfer the cells to a medium for producing the desired polypeptide (initial medium). It refers to the medium for obtaining.
  • the initial medium is a medium for culturing cells to produce a desired polypeptide, and is a medium used in the first stage of culturing the cells.
  • the fed-batch medium usually refers to a medium added to the medium during the initial culture.
  • the fed-batch medium may be added in multiple portions. In addition, the fed-batch medium may be added continuously or intermittently.
  • cells are subcultured in a seed medium, and then a certain amount of seed medium containing cells is added to the initial medium and cultured in the initial medium to produce a desired polypeptide. .. Further, in some cases, the fed-batch medium is added to the medium being cultured at least once.
  • the fed-batch culture method is further classified according to the fed-batch method.
  • the constant-velocity fed-batch method is a culture method in which a constant amount of fed-batch medium is continuously added to the initial medium.
  • the polypeptide used in the present invention is preferably an Fc-containing polypeptide containing a region corresponding to Fc of an antibody. More preferably, it is an antibody.
  • a composition containing a polypeptide means a composition containing a polypeptide and other components.
  • the composition containing the polypeptide can be recovered from the culture obtained by the cell culture step for the production of the polypeptide.
  • the term "recovery” as used herein means to collect a supernatant containing a polypeptide (culture supernatant) from a culture or culture obtained by a cell culture step, or to include a polypeptide using a filter. It means to collect the filtrate.
  • the solution recovered in this manner can be prepared into a composition containing a polypeptide having an appropriate concentration through the steps of purification and concentration by affinity column chromatography and the like.
  • the composition containing the polypeptide (polypeptide-containing composition), the composition containing the Fc-containing polypeptide (Fc-containing polypeptide-containing composition) or the composition containing the antibody. It can be read as a substance (antibody-containing composition).
  • Fc region includes the native sequence Fc region and the mutant Fc region.
  • the boundary of the Fc region of the immunoglobulin heavy chain can change, but it refers to the region consisting of the hinge part or a part thereof, CH2 and CH3 domains in the antibody molecule.
  • the Fc region is not limited as long as it is an antibody (IgA, IgD, IgE, IgG, IgM), particularly an IgG Fc region, but is preferably an Fc region of human IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), and more preferably. Is the Fc region of human IgG1.
  • the composition containing a polypeptide in which coloration is suppressed in the present invention refers to a composition containing a polypeptide in which coloring due to adsorption of VB12, specifically red or pink, is reduced.
  • a composition containing a polypeptide (antibody) whose concentration of the polypeptide (antibody) was adjusted to about 30 mg / mL was evaluated as colorless by visual evaluation, and it was confirmed that coloring was suppressed. did.
  • composition containing the polypeptide (antibody) with suppressed coloring has a molar concentration ratio [%] of VB12 and the polypeptide quantified according to the conditions of Example 1 of less than 0.26, preferably less than 0.2, more preferably less than 0.2. It is less than 0.1, more preferably less than 0.05.
  • the polypeptide of interest is first determined by EU numbering in the Fc region at positions 214, 234, 238, 250, 264, 307, 311, 330, 343, 428, 434. It comprises a step of confirming that the polypeptide contains a modification in at least one amino acid residue selected from the amino acid residues at positions 436, 438 and 440. "Confirming" means not only identifying the specific modification position of the polypeptide by an analytical method, but also recognizing in advance that the target polypeptide contains the modification. include.
  • a step different from the normal culture step is selected. That is, in the normal culture step, a cell culture medium containing VB12 as an essential component (normal cell culture medium) is used, but in the antibody culture step, instead of the normal cell culture medium, cell culture containing no VB12 is used.
  • Use medium As the cell culture medium containing no VB12, only VB12 may be contained from the composition of the normal cell culture medium, and the same composition can be used for other cells.
  • a composition containing a polypeptide is produced through a step of culturing cells containing a nucleic acid encoding the polypeptide and a step of recovering the composition containing the polypeptide from the culture using the cell culture medium selected in this manner. Will be done.
  • the antibody A is an IgG1 humanized antibody containing a heavy chain constant region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 1 and a light chain constant region containing the amino acid sequence of SEQ ID NO: 2, and binds to latent myostatin.
  • An anti-myostatin antibody was used. This antibody comprises modification of 214R, 234Y, 238D, 250V, 264I, 307P, 311R, 330K, 343R, 428L, 434A, 436T, 438R and 440E by EU numbering in the Fc region.
  • As antibody B an anti-IL-8 antibody that binds to IL-8 described in WO / 2016/125495 or WO / 2017/046994 was used.
  • antibody C an anti-FIX (a) / FX bispecific antibody that binds to both FIX (a) and FX described in WO2019065795 was used.
  • CHO cell As CHO cells, a strain derived from CHO-DXB11 was used.
  • Culture medium As the initial medium and the fed-batch medium, a medium manufactured by Thermo Fisher Scientific Co., Ltd. and Fuji Film Wako Pure Chemical Industries, Ltd. was used.
  • the initial medium containing VB12 initial medium having a relative VB12 concentration of 100%
  • the initial medium in which VB12 is completely removed and the composition other than VB12 is the same
  • the initial medium (the initial medium having a relative VB12 concentration of 50%), which was a mixture of these two media at a ratio of 1: 1, was prepared as the initial medium.
  • a fed-batch medium containing VB12 (a fed-batch medium having a relative VB12 concentration of 100%) and a fed-batch medium in which VB12 is completely removed and the composition other than VB12 is the same (a fed-batch medium having a relative VB12 concentration of 0%). ) was prepared as a fed-batch medium.
  • Example 1 Examination of the effect of VB12 on antibody coloring ⁇ br /> Incubators of 1 L to 25 L for each of Samples 1 to 9 in which the initial medium and the fed-batch medium were combined as shown in Table 1 using cells producing antibody A.
  • the cells were cultured under the same conditions by a constant-velocity fed-batch method.
  • the cells were cultured in a pH range of 6.7 to 7.2 and a temperature range of 34 ° C to 38 ° C for 14 days, and the fed-batch medium was added on the 3rd day after the start of the culture.
  • the composition containing the antibody was recovered from the culture solution, purified by Protein A affinity column chromatography, and then the eluate was concentrated.
  • the antibody concentration was about 30 mg / mL (26.7 mg / mL). It was adjusted to be mL to 31.4 mg / mL).
  • Sample 9 was further concentrated to an antibody concentration of 200 mg / mL or higher.
  • the coloring and VB12 content of the antibody-containing composition thus obtained were evaluated. Coloring was performed by visual evaluation. Some coloring (weak red) was observed in Samples 1, 5 and 7. In addition, coloring (red) was observed in sample 9. On the other hand, no coloring was observed in samples 2 to 4 and 6 to 8 (colorless).
  • VB12 in the antibody-containing composition has one cobalt bond per molecule of VB12
  • the concentration of cobalt contained in the antibody-containing composition is inductively coupled to ICP-MS (Inductively Coupled Plasma-Mass spectrum:).
  • VB12 content (VB12 to antibody molar concentration ratio (VB12 / antibody [%])) by calculating the molar concentration ratio of cobalt to antibody (cobalt / antibody [%]) by measuring with a plasma mass spectrometer) ) was estimated.
  • VB12 contained in the antibody-containing composition was the cause of coloring.
  • VB12 contained in the antibody-containing composition after culturing can be suppressed by suppressing VB12 contained in the initial medium and the fed-batch medium.
  • Example 2 Examination of the effect of VB12 in the medium on cell culture ⁇ br /> By culturing the cells under the same conditions as in Example 1, the presence or absence of VB12 in the medium determines the number of viable cells, cell viability, and integrated cells. The effect on the number was observed. As a result, the number of viable cells and cells in the culture medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium (VB-) were higher than those in the culture medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium (VB +). It was confirmed that the survival rate and the cumulative number of cells were almost the same. (Figs. 1, 2, 3)
  • the cells that produce antibody B or the cells that produce antibody C use 1 L of the incubator for the initial medium and the fed-batch medium under the conditions of sample 10 (VB +) and sample 12 (VB-) in Table 1-1.
  • the cells were cultured under the same conditions by a constant-velocity fed-batch method.
  • the cells were cultured in a pH range of 6.7 to 7.2 and a temperature range of 34 ° C to 38 ° C for 14 days, and the fed-batch medium was added on the 3rd day after the start of the culture.
  • Example 3 Examination of the effect of VB12 on the antibody production amount in the medium ⁇ br /> By culturing the cells under the same conditions as in Example 1, the effect of the presence or absence of VB12 in the medium on the antibody production amount was observed. did. As a result, the culture in the medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium (VB-) was compared with the culture in the medium containing VB12 in the initial medium and the feed medium (VB +), and the antibody was produced after 14 days of culture. It was confirmed that the amounts were almost the same (Table 2: The amount of antibody produced using VB + as the control culture was displayed as 100%).
  • Example 4 Examination of the effect of VB12 on the antibody physical characteristics in the medium ⁇ br /> By performing cell culture, affinity column chromatography, and concentration under the same conditions as in Example 1, and analyzing the antibody in the obtained composition. , The effect of the presence or absence of VB12 in the medium on the physical characteristics of the antibody was observed. As a result, the antibody obtained by culturing in the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium (VB-) was the same as the antibody obtained by culturing in the medium containing VB12 in the initial medium and the flow medium (VB +).
  • Example 5 Examination of the effect of VB12 on cell passage in the medium ⁇ br /> The effect of removing VB12 from the medium for cell subculture (manufactured by Thermo Fisher Scientific) was observed. As a result, the subculture in the medium without VB12 (VB-) showed almost the same growth behavior as the subculture with the medium containing VB12 (VB +). Subculture of cells producing antibody A for 100 days (28 passages) (Fig. 4), subculture of cells producing antibody B for 136 days (39 passages) (Fig. 17), and antibody. It was confirmed that subculture of C-producing cells could be carried out for 24 days (7 subcultures) (Fig. 18).
  • Example 6 Examination of the possibility of removing VB12 by cation exchange chromatography Using the initial medium containing VB12 and the fed-batch medium, culture was performed under the same conditions as in Example 1, and affinity column chromatography treatment was performed. The obtained antibody-containing composition was subjected to cation exchange chromatography, which is a Binding / Elute method. It was examined whether VB12 could be removed by the process. Similar to Example 1, the cobalt concentration was measured by ICP-MS and used as an index of the VB12 concentration.
  • Example 7 Additional study of the effect of VB12 on antibody coloring ⁇ br /> Using a medium containing VB12 as the initial medium and the feed medium, culture, affinity column chromatography treatment, polishing step, and concentration were performed under the same conditions as in Example 1. An additional study was conducted on the antibody-containing composition obtained (antibody concentration of about 30 mg / ml, colored (weak red)) that VB12 was adsorbed on the antibody.
  • Potassium cyanide was added to the antibody-containing composition so as to be 0.1% (a condition without addition of potassium cyanide was also implemented as a control), and the mixture was kept warm at 37 ° C. for 45 minutes. These samples were passed through a 5 KD cutoff filter, and the recovered samples from which the antibody had been removed were analyzed by reverse phase chromatography. As a result, the peak of VB12 (cyanocobalamin) was not detected in the potassium cyanide-untreated sample (KCN-), whereas the peak showing VB12 (cyanocobalamin) was observed in the potassium cyanide-treated sample (KCN +) (Fig. 19, antibody). A). From this result, it was confirmed that VB12 was released from the antibody by the treatment with potassium cyanide, and it was confirmed that VB12 affected the coloring of the antibody.
  • the present invention can be used for producing a pharmaceutical product containing a polypeptide.

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Abstract

a)ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を、ビタミンB12を含まない細胞培養培地中で培養し；b)培養物からポリペプチドを含む組成物を回収する工程を含む、着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法。

Description

着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法
　本発明は、着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法を提供する。
　組換え細胞培養物を用いてインビトロでポリペプチドを製造する方法は周知であり、工業的規模の製造に広く使用されている。ポリペプチド、例えば抗体を含有する組成物を製剤化し、医薬製剤として提供する場合、一品質特性として、製剤の色を許容可能なレベル、例えば、製品のマーケティングのための規制要件を満足するレベルに抑えることが求められる。
　特に、抗体を高濃度（例えば、１５０ｍｇ／ｍＬ以上）で含有する製剤では、濃縮に伴い着色が強くなるため、製剤の色を許容可能なレベルに抑えることが重要となる。
　抗体を含有する製剤の着色の原因として、抗体へのビタミンＢ１２(以下、「VB12」)の吸着が報告されている（非特許文献１～３、特許文献１）。１分子のVB12には１分子のコバルトが配位する。VB12には、シアノコバラミン体とヒドロキシコバラミン体が存在するが、ヒドロキシコバラミン体が抗体に結合することにより、同分子がピンク色や赤色に着色することが報告されている（非特許文献１～３）。
　また、抗体の着色を防止することを目的とした培養方法として、特定の量のビタミンＢ２、Ｂ６、Ｂ９、Ｂ１２、シスチンを含む培地を使用した培養方法（特許文献２）が報告されている。また、培地中のシアノコバラミン体のヒドロキシコバラミンへの変換及び抗体のジスルフィド結合の還元を防ぐことにより、着色を防止する方法が報告されている（特許文献１）。
　他方、VB12が真核細胞のための細胞培養培地に必須の成分であること（非特許文献１）、VB12が哺乳類細胞の培養のための必須の成分であること（特許文献１）が報告されている。
ＷＯ２０１８／２０８７４３ 特表２０１５－５１５２８１
MAbs. 2013 Nov 1; 5(6): 974-981 MAbs. 2014 May 1; 6(3): 679-688 Biotechnology and Bioengineering.2018;115:900-909
　本発明は、着色を生じやすい特性のポリペプチドについて、比較的簡易な製造方法の変更により、ポリペプチドの産生量や物性を許容範囲内に維持しつつ、着色の問題を解消する方法を提供することを課題とする。
　上記課題を達成するために鋭意研究した結果、本発明者らは、VB12を含まない培地を用いることにより、ポリペプチドの産生量を維持しつつ、着色を抑制することができることを見出し、本発明を完成した。
　したがって、本発明は、以下の（１）～（１７）のように表現することができる。
（１）　着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法であって、（a)ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を、ビタミンB12を含まない細胞培養培地中で培養し；（b)培養物からポリペプチドを含む組成物を回収する工程を含む、前記組成物の製造方法。
（２）　前記組成物における、ビタミンB12とポリペプチドとのモル濃度比が0.26％未満である、（１）に記載の組成物の製造方法。
（３）　ビタミンB12を含まない初発培地及びビタミンＢ12を含まない流加培地により流加培養する、（１）または（２）に記載の組成物の製造方法。
（４）　流加培養開始から7日目における細胞培養培地中のVCD（生存細胞密度）が80×105cells/mL以上である、（３）に記載の組成物の製造方法。
（５）　前記真核細胞がCHO細胞である、（１）～（４）のいずれかに記載の組成物の製造方法。
（６）　前記ポリペプチドがＦｃ含有ポリペプチドである、（１）～（５）のいずれかに記載の組成物の製造方法。
（７）　前記Ｆｃ含有ポリペプチドが抗体である、（６）に記載の組成物の製造方法。
（８）　前記ポリペプチドが、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及び440位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む、（６）又は（７）に記載の組成物の製造方法。
（９）　前記ポリペプチドが、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214Ｒ、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及び440Eから選ばれる少なくとも１つの改変を含む、（６）～（８）に記載の組成物の製造方法。
（１０）　前記ポリペプチドが、配列番号：1のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号：2のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含む抗体である、（６）～（９）に記載の組成物の製造方法。
（１１）　前記抗体が、潜在型ミオスタチンに結合するIgG1ヒト化抗体である、（１０）に記載の組成物の製造方法。
（１２）　以下の工程を含む、着色を抑制した抗体含有組成物の製造方法：
　a)目的とする抗体が、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及び440位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む抗体であること
を確認する工程；
　b)当該アミノ酸残基の改変を含む抗体について、ビタミンB12を含まない細胞培養培地を選択する工程；
　c)工程b)で選択した細胞培養培地により、当該アミノ酸残基の改変を含む抗体をコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程；および
　d)培養物から抗体含有組成物を回収する工程。
（１３）　工程b）は、ビタミンB12を含まない初発培地及びビタミンB12を含まない流加培地を選択する工程である、（１２）に記載の製造方法。
（１４）　前記真核細胞はCHO細胞である、（１２）または（１３）に記載の製造方法。
（１５）　抗体をコードする核酸を含む真核細胞を、ビタミンB12を含まない細胞培養培地中で培養し；（b)培養物から抗体を含む組成物を回収し；(c)得られた組成物を医薬製剤化する工程を含む、抗体含有製剤の製造方法。
（１６）　組換え細胞培養物を用いる抗体の製造において、（a)抗体をコードする核酸を含む真核細胞を、ビタミンB12を含まない細胞培養培地中で培養し；（b)培養物から抗体を含む組成物を回収する工程を含む、抗体の着色を抑制する方法。
（１７）　（７）に記載の組成物の製造方法、（１５）に記載の抗体含有製剤の製造方法、または（１６）に記載の抗体の着色を抑制する方法であって、前記抗体が、抗IL-8抗体、または抗ミオスタチン抗体である、方法。
　本発明により、着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法が提供される。
ポリペプチド（抗体A:抗ミオスタチン抗体）を産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数を示す。 抗体Aを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した細胞生存率を示す。 抗体Aを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数から積算細胞数を算出し示す。 抗体Aを産生する細胞の培養において、VB12を含む培地をVB+、VB12を含まない培地をVB-として、継代培養を3日間もしくは4日間周期で100日間（28回継代）まで実施し、各日の細胞増殖挙動を、細胞倍加時間（Doubling time）を指標としてプロットした結果を示す。（細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製）で測定し、細胞倍加時間を算出） 図１とは異なるポリペプチド（抗体B:抗IL-8抗体）を産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数を示す。 図１、図５とは異なるポリペプチド（抗体C:抗FIXa/FX二重特異性抗体）を産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数を示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数を示す。 抗体Cを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数を示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した細胞生存率を示す。 抗体Cを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した細胞生存率を示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した細胞生存率を示す。 抗体Cを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した細胞生存率を示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数から積算細胞数を算出し示す。 抗体Cを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数から積算細胞数を算出し示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数から積算細胞数を算出し示す。 抗体Cを産生する細胞の培養において、初発培地および流加培地にVB12を含む培地をVB+、初発培地にはVB12を含まないが流加培地にはVB12を含む培地をVB-とし、培養14日間の各日について、細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製、型式Vi-CELL XR）で測定した生細胞数から積算細胞数を算出し示す。 抗体Bを産生する細胞の培養において、VB12を含む培地をVB+、VB12を含まない培地をVB-として、継代培養を3日間もしくは4日間周期で136日間（39回継代）まで実施し、各日の細胞増殖挙動を、細胞倍加時間（Doubling time）を指標としてプロットした結果を示す。（細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製）で測定し、細胞倍加時間を算出） 抗体Cを産生する細胞の培養において、VB12を含む培地をVB+、VB12を含まない培地をVB-として、継代培養を3日間もしくは4日間周期で24日間（7回継代）まで実施し、各日の細胞増殖挙動を、細胞倍加時間（Doubling time）を指標としてプロットした結果を示す。（細胞自動計測装置Vi-CELLシステム（Beckman Courter社製）で測定し、細胞倍加時間を算出） シアン化カリウム処理を行った抗体含有組成物と、シアン化カリウム処理を行わない抗体含有組成物のそれぞれについて、5 KDカットオフフィルターで抗体を除去し、回収サンプルを逆相クロマトグラフィー（Column:AcclaimTMPolar Advantage II LC）で分析した結果を示す。シアン化カリウム非処理サンプルをKCN-、シアン化カリウム処理サンプルをKCN+、VB12のピークをSTDで表す。
　以下、本発明の実施の形態について詳細に説明する。
　本発明は、着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法に関する。
　VB12
VB12は、狭義ではシアノコバラミンを指し、広義では、ビタミンＢ１２類の総称としてのコバラミン（cobalamin）を指す。培地成分としてのVB12はシアノコバラミンであり、培地成分が水溶液になるとシアノコバラミン、ヒドロキシコバラミン、アクアコバラミン、アデノシルコバラミン、およびメチルコバラミンの平衡状態となる。
　VB12には、1分子あたりコバルト分子が1分子結合している。このため、本願の実施例では、抗体に対するコバルト分子の相対濃度を定量することにより、抗体に対するVB12の相対濃度を定量した。本発明では、真核細胞の培養のために、VB12を含まない初発培地および流加培地を用いることができる。本発明における「VB12を含まない」培地とは、培地中のVB12の濃度が0mg/Lである場合だけでなく、培地添加物としての実質的な含有量に満たない程度のVB12が混入した培地をも含む。具体的には、当該培地を使って本発明の実施例1と同様の条件下で培養を行い、得られた抗体含有組成物（抗体濃度約30mg/mL）をICP-MSで測定した場合に、VB12に含まれるコバルト分子の濃度が、定量限界値の20ppb未満となる場合に、「VB12を含まない」に該当する。
　真核細胞
真核細胞とは、核膜に包まれた核を持つ細胞のことをいう。本発明における「ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞」は、所望のポリペプチドの製造のための産生系として使用することができる宿主細胞である。そのような細胞は、所望のポリペプチドを産生できる天然の細胞であっても、所望のポリペプチドをコード（または発現）する核酸を、人為的に導入した細胞であってもよいが、所望のポリペプチドをコードする核酸を導入した形質転換細胞が好ましい。そのような形質転換細胞の一例は、所望のポリペプチドをコードする外来のＤＮＡを遺伝子組み換え技術を用いて真核細胞に導入して得られた、ポリペプチドの産生株である。したがって、「ポリペプチドをコードする核酸を含む」という文言は、「ポリペプチドをコードする核酸を人為的に導入した」または「ポリペプチドをコードする外来の核酸を導入した」と読み替えることもできる。
　本発明における真核細胞の典型例は、組換えタンパク質の生産のための宿主として好適な細胞であり、昆虫、魚、両生類、爬虫類、または哺乳類由来の細胞から選択することができる。本発明における真核細胞の好ましい例は、哺乳類細胞である。哺乳類細胞はCHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（商標登録）細胞、およびハイブリドーマ細胞などから選択されるが、より好ましくはCHO細胞である。
　細胞培養培地
　本発明において、細胞培養培地とは、ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞の培養のために使用される培地をいい、単に培地と呼ぶこともできる。細胞培養培地としては、市販の培地または公知の培地を適宜使用可能である。本発明で用いたVB12を含まない培地を除き、通常の培地には、細胞の転写活性や核酸合成に必要な必須成分としてVB12が含まれる。本発明の実施例では、既存の培地の組成を維持しつつ、VB12の成分のみを含まないようにし、除去し、又は減少させた培地を用いた。
　特定の細胞株に適した培養培地の種類は、当業者であれば適宜選択することができる。例えば、動物細胞培養用の周知の培地または市販の培地として、IMDM（イスコフ改変ダルベッコ培地、Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、DMEM(ダルベッコ改変イーグル培地、Dulbecco's Modified Eagle Medium)、HamのF12培地、D-MEM/F-12 1:1 Mixture (Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFM II (Invitrogen社)、CHO-SF (Sigma-Aldrich社)、EX-CELL 301 (JRH biosciences社)、CD-CHO (Invitrogen社)、IS CHO-V (Irvine Scientific社)、PF-ACF-CHO (Sigma-Aldrich社)などの培地を使用することができるが、これらに限定されないことは当業者が当然に理解するものである。細胞増殖および抗体や組み換えタンパク質生産の収率向上に最適化された、多数の培地が当業者に周知である。
　例えば、実施例で使用した潜在型ミオスタチンに結合するヒト化抗体（IgG1抗体）を産生するCHO細胞株の培養のために使用できる培地の例としては、IMDM、DMEMもしくはHamのF12培地、またはその組み合わせが挙げられる。
　細胞培養
　一般に、細胞培養法は、回分法（batch culture）、連続法（continuous culture）、流加培養法（fed-batch culture）に分類される。
　回分法は、培地に少量の種培養液を加え、培地中に新たに培地を加えたり又は培養液を排出したりせずに、細胞を増殖させる培養方法である。
　連続法は、培養中に連続的に培地を加え、かつ、連続的に排出させる培養方法である。なお、連続法には、灌流培養も含まれる。
　流加培養法は回分法と連続法の中間にあるため、半回分法（semi-batch culture）とも呼ばれ、培養中に連続的に又は遂次的に培地が加えられるが、連続法のような連続的な培養液の排出が行われない培養方法である。流加培養の際に加えられる培地（以下、流加培地という）は、既に培養に使用されている培地（以下、初発培地という）と同じ培地である必要はなく、異なる培地を添加してもよいし、特定の成分のみを添加してもよい。あるいは、流加培地は初発培地と同じ組成の培地であってもよい。
　本発明においては、回分法、連続法、流加培養法の何れの培養方法を用いてもよいが、好ましくは流加培養法が用いられる。
　通常、細胞を培養して所望のポリペプチドを製造するには、細胞を含んだ種培地を一定量初発培地に添加して、細胞を培養することにより行われる。さらに、所望のポリペプチドの産生量を増加させるために、培養中に流加培地を添加する。
　種培地とは、所望のポリペプチドを産生する細胞（ワーキングセルバンク）を、拡大培養して、最終的に所望のポリペプチドを産生させるための培地（初発培地）へ移すのに必要な細胞数を得るための培地のことをいう。また、初発培地とは、通常、細胞を培養して所望のポリペプチドを産生させるための培地であって、当該細胞の培養の最初の段階で使用される培地のことをいう。流加培地とは、通常、初発培養中の培地に添加される培地のことをいう。流加培地は、複数回に分けて添加される場合もある。また、流加培地は継続的に或いは断続的に添加される場合もある。
　本発明においては、種培地で細胞の継代培養を行い、その後、細胞を含んだ種培地を一定量初発培地に添加して、所望のポリペプチドを産生させるために初発培地中で培養を行う。さらに場合により、1回以上、培養中の培地に流加培地を加える。
　流加培養法は、流加のやり方によりさらに分類される。定速流加法は、一定量の流加培地を継続的に初発培地へ添加し続ける培養方法である。
　ポリペプチド、ポリペプチドを含む組成物、ポリペプチドを含む組成物の回収
本発明で用いるポリペプチドは、好ましくは、抗体のＦｃに相当する領域を含む、Ｆｃ含有ポリペプチドであり、さらに好ましくは抗体である。
　ポリペプチドを含む組成物（ポリペプチド含有組成物）は、ポリペプチドと他の成分とを含む組成物を意味する。本発明の実施例においては、ポリペプチド産生のための細胞培養工程により得られた培養物から、ポリペプチドを含む組成物を回収することができる。ここでいう「回収する」とは、細胞培養工程により得られた培養物ないし培養液から、ポリペプチドを含む上清液（培養上清液）を回収することまたはフィルターを使用しポリペプチドを含む濾液を回収することをいう。
　このようにして回収した溶液は、アフィニティカラムクロマトグラフィー等による精製、および濃縮の工程を経て、適当な濃度のポリペプチドを含む組成物に調整することができる。
　ポリペプチドがＦｃ含有ポリペプチドまたは抗体である場合、ポリペプチドを含む組成物（ポリペプチド含有組成物）を、Ｆｃ含有ポリペプチドを含む組成物（Ｆｃ含有ポリペプチド含有組成物）または抗体を含む組成物（抗体含有組成物）と読み替えることができる。
　Ｆｃ領域（Ｆｃ）
　Ｆｃ領域（または単にＦｃと呼ぶ）の用語は、天然配列Ｆｃ領域及び変異型Ｆｃ領域を含む。免疫グロブリン重鎖のＦｃ領域の境界は変化し得るが、抗体分子中の、ヒンジ部若しくはその一部、CH2、CH3ドメインからなる領域のことをいう。Ｆｃ領域は、抗体（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM）、特にIgGのＦｃ領域であれば限定されないが、好ましくはヒトIgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）のＦｃ領域であり、さらに好ましくはヒトIgG1のＦｃ領域である。
　着色の抑制
　本発明における着色を抑制したポリペプチドを含む組成物とは、VB12の吸着に起因する着色、具体的には赤色もしくはピンク色を低減したポリペプチドを含む組成物をいう。本発明の実施例では、ポリペプチド（抗体）の濃度を30mg/mL程度に調整したポリペプチド（抗体）含有組成物について、視覚評価により無色の評価を行い、着色が抑制されていることを確認した。また、着色を抑制したポリペプチド（抗体）を含む組成物は、実施例1の条件に従って定量したVB12とポリペプチドとのモル濃度比[%]が、0.26未満、好ましくは0.2未満、より好ましくは0.1未満、さらに好ましくは0.05未満である。
　抗体の確認、細胞培養培地の選択
　本発明の一つの実施態様では、着色を生じやすい抗体を予め確認し、これに対して通常の培養工程とは異なる、着色の抑制に適した培養工程を選択する。この実施態様では、まず目的とするポリペプチドが、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及び440位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基に改変を含むポリペプチドであることを確認する工程を有する。「確認する」とは、必ずしも分析的手法によって当該ポリペプチドの具体的な改変位置を特定することだけでなく、予め目的とするポリペプチドに、当該改変が含まれることを認識していることを含む。
　次に、当該アミノ酸残基の改変を含むことが確認された抗体については、通常の培養工程とは異なる工程を選択する。すなわち、通常の培養工程では、VB12を必須成分として含む細胞培養培地（通常細胞培養培地）が用いられるが、当該抗体の培養工程においては、通常細胞培養培地にかえて、VB12を含まない細胞培養培地を用いる。ここで、VB12を含まない細胞培養培地は、通常細胞培養培地の組成からVB12のみを含まないようにし、他の組成は同一のものを用いることができる。
　このようにして選択した細胞培養培地により、当該ポリペプチドをコードする核酸を含む細胞を培養する工程、培養物からポリペプチドを含む組成物を回収する工程を経て、ポリペプチドを含む組成物が製造される。
　以下、本発明を実施例によって具体的に説明する。なお、これらの実施例は、本発明を説明するためのものであって、本発明の範囲を限定するものではない。
実施例は、次の抗体、細胞、培地を用いて行った。
　抗体：
抗体Ａとしては、配列番号：1のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号：2のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含むIgG1ヒト化抗体であり、潜在型ミオスタチンへ結合する、抗ミオスタチン抗体を用いた。この抗体は、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214Ｒ、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及び440Eの改変を含む。
抗体Bとしては、WO/2016/125495またはWO/2017/046994に記載のIL-8へ結合する、抗IL-8抗体を用いた。
抗体Cとしては、WO2019065795に記載のFIX(a)及びFXの双方に結合する、抗FIX(a)/FX二重特異性抗体を用いた。
　細胞：
CHO細胞は、CHO-DXB11由来株を用いた。
　培地：
初発培地、流加培地にはThermo Fisher Scientific社製、富士フィルム和光純薬社製の培地を用いた。本実施例では、VB12が含まれる初発培地（相対VB12濃度100％の初発培地）、VB12が完全に除かれ、かつVB12以外の組成は同一の初発培地（相対VB12濃度0％の初発培地）、これら2つの培地を1：1で混合した初発培地（相対VB12濃度50％の初発培地）を初発培地として準備した。また、VB12が含まれる流加培地（相対VB12濃度100％の流加培地）、およびVB12が完全に除かれ、かつVB12以外の組成は同一の流加培地（相対VB12濃度0％の流加培地）を流加培地として準備した。
　実施例１．VB12が抗体の着色に及ぼす影響の検討
抗体Aを産生する細胞を用いて、初発培地と流加培地を表1の通り組み合わせたサンプル1～9について、それぞれ1L～25Lの培養装置を用いて定速流加法により同一条件下で培養を行った。pH6.7～7.2の範囲、34℃～38℃の範囲で14日間の培養を行い、流加培地は培養開始後3日目に添加した。
　14日間培養後の培養液から抗体を含む組成物を回収し、Protein Aのアフィニティカラムクロマトグラフィーで精製した後、溶出液を濃縮し、サンプル1～8では抗体濃度約30mg/mL（26.7mg/mL～31.4mg/mL）となるよう調整した。サンプル9はさらに濃縮を進め、200mg/mL以上の抗体濃度とした。
　このようにして得られた抗体含有組成物の着色とVB12の含有量を評価した。着色は、視覚評価により行った。サンプル1、5、７では若干の着色（弱赤色）が観察された。また、サンプル9では着色（赤色）が観察された。一方、サンプル2～4、6～8については、着色は観察されなかった（無色）。
　抗体含有組成物中のVB12は、VB12、1分子あたりコバルトが1分子結合していることから、抗体含有組成物中に含まれるコバルトの濃度をICP-MS（Inductively Coupled Plasma-Mass spectrometry: 誘導結合プラズマ質量分析計）で測定してコバルトと抗体のモル濃度比（コバルト/抗体[%]）を算出することにより、VB12の含有量（VB12と抗体のモル濃度比（VB12/抗体[%]））を見積もった。これらの結果を表1に示す。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000001
　実験結果から、抗体含有組成物に含まれるVB12が着色の原因であることが検証された。また、初発培地および流加培地に含まれるVB12を抑制することにより、培養後の抗体含有組成物に含まれるVB12を抑制できることを確認した。
　実施例２．培地中のVB12の細胞培養への影響の検討
実施例1と同じ条件で細胞培養を行うことにより、培地中のVB12の存在の有無が、生細胞数、細胞生存率、積算細胞数に及ぼす影響を観察した。この結果、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）による培養は、初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、各日の生細胞数、細胞生存率、積算細胞数がほぼ同等であることを確認した。(図１、２、３)
　抗体Bを産生する細胞または抗体Cを産生する細胞を用いて、初発培地と流加培地を表1-1のサンプル10(VB+)ならびにサンプル11(VB-)の条件で、それぞれ1Lの培養装置を用いて定速流加法により同一条件下で培養を行った。pH6.7～7.2の範囲、34℃～38℃の範囲で14日間の培養を行い、流加培地は培養開始後3日目に添加した。
　この条件下での細胞培養で培地中のVB12の存在の有無が生細胞数、細胞生存率、積算細胞数に及ぼす影響を観察した。この結果、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）による培養は、初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、各日の生細胞数、細胞生存率、積算細胞数がほぼ同等であることを確認した（図５、６、９、１０、１３、１４）。
　抗体Bを産生する細胞または抗体Cを産生する細胞を用いて初発培地と流加培地を表1-1のサンプル10(VB+)ならびにサンプル12(VB-)の条件で、それぞれ1Lの培養装置を用いて定速流加法により同一条件下で培養を行った。pH6.7～7.2の範囲、34℃～38℃の範囲で14日間の培養を行い、流加培地は培養開始後3日目に添加した。
　この条件下での細胞培養で培地中のVB12の存在の有無が生細胞数、細胞生存率、積算細胞数に及ぼす影響を観察した。この結果、初発培地にはVB12を含まず流加培地にはVB12を含む培地（VB-）による培養は、初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、各日の生細胞数、細胞生存率、積算細胞数がほぼ同等であることを確認した（図７、８、１１、１２、１５、１６）
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000002
　実施例３．培地中のVB12の抗体産生量への影響の検討
実施例1と同じ条件で細胞培養を行うことにより、培地中のVB12の存在の有無が、抗体の産生量に及ぼす影響を観察した。この結果、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）による培養は、初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、14日間培養後の抗体の産生量がほぼ同等であることを確認した（表2：VB+をコントロール培養とした抗体産生量を100%として表示）。
　抗体Bを産生する細胞についても表1-1の各条件で培養し、培地中のVB12の存在の有無による抗体の産生量に及ぼす影響を観察した。この結果、サンプル11の条件である初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）並びにサンプル12の条件である初発培地にはVB12を含まず流加培地にはVB12を含む培地（VB-）による培養は、サンプル10の条件である初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、14日間培養後の抗体の産生量がほぼ同等であることを確認した（表2-1、2-2：VB+をコントロール培養とした抗体産生量を100%として表示）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000003
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000004
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000005
　抗体Cを産生する細胞についても表1-1の各条件で培養し、培地中のVB12の存在の有無による抗体の産生量に及ぼす影響を観察した。この結果、サンプル11の条件である初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）並びにサンプル12の条件である初発培地にはVB12を含まず流加培地にはVB12を含む培地（VB-）による培養は、サンプル10の条件である初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養と比べ、14日間培養後の抗体の産生量がほぼ同等であることを確認した（表2-3、2-4：VB+をコントロール培養とした抗体産生量を100%として表示）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000006
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000007
　実施例４．培地中のVB12の抗体物性への影響の検討
実施例1と同じ条件で細胞培養、アフィニティカラムクロマトグラフィー処理、および濃縮を行い、得られた組成物中の抗体を分析することにより、培地中のVB12の存在の有無が、抗体の物性に及ぼす影響を観察した。この結果、初発培地および流加培地にVB12を含まない培地（VB-）による培養で得られた抗体は、初発培地および流加培地にVB12を含む培地（VB+）による培養で得られた抗体と比べ、糖鎖修飾（Afcosyl, Fucosyl, Galactosyl, High mannose, Hybrid）、細胞由来タンパク質（HCP）、細胞由来DNA（DNA）、チャージバリアント体の割合（Acidic, Basic）、および重合体の割合（HMWs）がほぼ同等であることを確認した（表3：VB+をコントロール培養として得られた抗体の各物性を100%として表示）。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000008
　実施例５．培地中のVB12の細胞継代への影響の検討
細胞継代培養の培地（Thermo Fisher Scientific社製）からVB12を除いた場合の影響を観測した。この結果、VB12を含まない培地（VB-）による継代培養は、VB12を含む培地（VB+）による継代培養と比較し、ほぼ同等な増殖挙動を示した。抗体Aを産生する細胞の継代培養を100日間（28回継代）（図４）、抗体Bを産生する細胞の継代培養を136日間（39回継代）（図１７）、および抗体Cを産生する細胞の継代培養を24日間（7回継代）（図１８）実施可能であることを確認した。
　実施例６．陽イオン交換クロマトグラフィーによるVB12の除去可能性の検討
VB12を含む初発培地及び流加培地を使用して実施例1と同じ条件で培養、アフィニティカラムクロマトグラフィー処理を行い、得られた抗体含有組成物について、Binding/Elute法である陽イオン交換クロマトグラフィー工程によりVB12を除去することができるか検討した。実施例1と同様に、コバルトの濃度をICP-MSで測定して、VB12の濃度の指標とした。
　この結果、CEX（陽イオン交換）カラムを通す前と、CEXから溶出した後で、コバルト/抗体[%]に変化は見られなかった（表4）。このことから、抗体含有組成物に含まれるVB12は、追加のクロマトグラフィー工程に供したとしても、除去できないことが確認された。
Figure JPOXMLDOC01-appb-T000009
　実施例７．VB12が抗体の着色に及ぼす影響の追加検討
初発培地および流加培地にVB12を含む培地を用い、実施例1と同じ条件で培養、アフィニティカラムクロマトグラフィー処理、ポリッシング工程、濃縮を行って得られた抗体含有組成物（抗体濃度30mg/ml程度、有着色（弱赤色））について、VB12が抗体に吸着していることの追加検討を行った。
　抗体含有組成物へシアン化カリウムを0.1%となるように添加し（コントロールとしてシアン化カリウム添加なし条件も実施）、37℃、45分間保温した。これらのサンプルを5 KDカットオフフィルターに通し、抗体を除去した回収サンプルを逆相クロマトグラフィーにより分析した。この結果、シアン化カリウム非処理サンプル（KCN-）ではVB12（シアノコバラミン）のピークが検出されなかったのに対し、シアン化カリウム処理サンプル(KCN+)ではVB12（シアノコバラミン）を示すピークが認められた（図1９、抗体A）。この結果から、シアン化カリウムの処理により、VB12が抗体から遊離されたことが確認され、VB12が抗体の着色に影響していることが確認された。
　本発明は、ポリペプチドを含有する医薬品の製造に利用することができる。

Claims (14)

  1. 　a)ポリペプチドをコードする核酸を含む真核細胞を、ビタミンB12を含まない細胞培養培地中で培養し、
    　b)培養物からポリペプチドを含む組成物を回収する工程を含む、着色を抑制したポリペプチドを含む組成物の製造方法。
  2. 　前記組成物における、ビタミンB12とポリペプチドとのモル濃度比が0.26％未満である、請求項1に記載の組成物の製造方法。
  3. 　ビタミンB12を含まない初発培地及びビタミンＢ12を含まない流加培地により流加培養する、請求項１または２に記載の組成物の製造方法。
  4. 　流加培養開始から7日目における細胞培養培地中のVCD（生存細胞密度）が80×105cells/mL以上である、請求項３に記載の組成物の製造方法。
  5. 　前記真核細胞がCHO細胞である、請求項１～４のいずれかに記載の組成物の製造方法。
  6. 　前記ポリペプチドがＦｃ含有ポリペプチドである、請求項１～５のいずれかに記載の組成物の製造方法。
  7. 　前記Ｆｃ含有ポリペプチドが抗体である、請求項６に記載の組成物の製造方法。
  8. 　前記ポリペプチドが、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及び440位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む、請求項６又は７に記載の組成物の製造方法。
  9. 　前記ポリペプチドが、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及び440Eから選ばれる少なくとも１つの改変を含む、請求項６～８に記載の組成物の製造方法。
  10. 　前記ポリペプチドが、配列番号：1のアミノ酸配列を含む重鎖定常領域と、配列番号：2のアミノ酸配列を含む軽鎖定常領域とを含む抗体である、請求項６～９に記載の組成物の製造方法。
  11. 　前記抗体が、潜在型ミオスタチンに結合するIgG1ヒト化抗体である、請求項１０に記載の組成物の製造方法。
  12. 　着色を抑制した抗体含有組成物の製造方法であって、
    　a)目的とする抗体が、Ｆｃ領域におけるＥＵナンバリングによる214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及び440位のアミノ酸残基から選ばれる少なくとも１つのアミノ酸残基の改変を含む抗体であることを確認する工程、
    　b)当該アミノ酸残基の改変を含む抗体について、ビタミンB12を含まない細胞培養培地を選択する工程、
    　c)工程b)で選択した細胞培養培地により、当該アミノ酸残基の改変を含む抗体をコードする核酸を含む真核細胞を培養する工程、
    　d)培養物から抗体含有組成物を回収する工程を含む、製造方法。
  13. 　工程b）は、ビタミンB12を含まない初発培地及びビタミンB12を含まない流加培地を選択する工程である、請求項１２に記載の製造方法。
  14. 　前記真核細胞はCHO細胞である、請求項１２または１３に記載の製造方法。
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