TW202142694A - 含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法 - Google Patents

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Abstract

含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法，其包含以下步驟：a）在不含有維生素B12的細胞培養培養基中，培養包含編碼多肽的核酸之真核細胞；b）從培養物回收含有多肽的組成物。

Description

含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法
本發明提供含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法。
使用重組細胞培養物在體外（in vitro）製造多肽的方法係眾所周知，並被廣泛地使用於工業規模的製造。在將含有多肽例如抗體之組成物進行製劑化而提供作為醫藥製劑之情形，作為一品質特性，要求將製劑的顏色抑制在可容許的程度，例如，滿足用於產品行銷之規範要件的程度。
尤其，在以高濃度（例如，150mg／mL以上）含有抗體之製劑中，因伴隨濃縮而著色變強，故將製劑的顏色抑制在可容許的程度一事變得重要。
作為含有抗體之製劑的著色原因，已報導有維生素B12（以下，「VB12」）對於抗體的吸附（非專利文獻1～3、專利文獻1）。一分子的VB12中，配位一分子的鈷。已報導在VB12中雖存在氰基鈷胺素體與羥基鈷胺素體，但藉由羥基鈷胺素體與抗體結合，而同分子著色成粉紅色、紅色（非專利文獻1～3）。
又，作為以防止抗體的著色為目的之培養方法，已報導使用包含特定量的維生素B2、B6、B9、B12、胱胺酸的培養基之培養方法（專利文獻2）。又，已報導藉由防止培養基中的氰基鈷胺素體轉變成羥基鈷胺素及抗體的雙硫鍵的還原而防止著色之方法（專利文獻1）。
另一方面，已報導VB12為用於真核細胞的細胞培養培養基之必要成分（非專利文獻1）、VB12為用於培養哺乳類細胞之必要成分（專利文獻1）。 [先前技術文獻] [專利文獻]
[專利文獻1]WO2018／208743 [專利文獻2]日本特表2015－515281 [非專利文獻]
[非專利文獻1]MAbs. 2013 Nov 1; 5（6）: 974－981 [非專利文獻2]MAbs. 2014 May 1; 6（3）: 679－688 [非專利文獻3]Biotechnology and Bioengineering.2018;115:900－909
[發明所欲解決的課題]
本發明的課題在於提供一種方法，其針對容易著色的特性的多肽，藉由比較簡易的製造方法的變更，而將多肽的產量、物理性質維持在容許範圍內，且消除著色的問題。 [用於解決課題的手段]
為了達成上述課題而專心致志地研究的結果，本發明人等發現藉由使用不含有VB12的培養基，可維持多肽的產量且抑制著色，進而完成本發明。
因此，本發明可如以下（1）～（17）般表現。 （1）一種組成物之製造方法，其係含有抑制著色之抗體的組成物之製造方法，且包含以下步驟：（a）在不含有維生素B12的細胞培養培養基中，培養包含編碼多肽的核酸之真核細胞；（b）從培養物回收含有多肽的組成物。 （2）如（1）所記載之組成物之製造方法，其中，在前述組成物中，維生素B12與多肽的莫耳濃度比為小於0.26％。 （3）如（1）或（2）所記載之組成物之製造方法，其藉由不含有維生素B12的初代培養基（primary medium）及不含有維生素B12的饋料批式培養基進行饋料批式培養。 （4）如（3）所記載之組成物之製造方法，其中，在從饋料批式培養開始起第7日之細胞培養培養基中的VCD（活細胞密度）為80×105 cells／mL以上。 （5）如（1）～（4）中任一項所記載之組成物之製造方法，其中，前述真核細胞為CHO細胞。 （6）如（1）～（5）中任一項所記載之組成物之製造方法，其中，前述多肽為含有Fc的多肽。 （7）如（6）所記載之組成物之製造方法，其中，前述含有Fc的多肽為抗體。 （8）如（6）或（7）所記載之組成物之製造方法，其中，前述多肽包含選自Fc區域中之由EU編號（EU numbering）所定之214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及440位的胺基酸殘基之至少1個胺基酸殘基的改變。 （9）如（6）～（8）所記載之組成物之製造方法，其中，前述多肽包含選自Fc區域中之由EU編號所定之214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及440E之至少1個改變。 （10）如（6）～（9）所記載之組成物之製造方法，其中，前述多肽為包含以下區域的抗體：包含序列識別號：1的胺基酸序列之重鏈恆定區域；與包含序列識別號：2的胺基酸序列之輕鏈恆定區域。 （11）如（10）所記載之組成物之製造方法，其中，前述抗體為與潛在性肌肉生長抑制素（Myostatin）結合之IgG1人源化（humanized）抗體。 （12）一種含有抑制著色之抗體的組成物之製造方法，其包含以下步驟： a）確認目標抗體為包含選自在Fc區域中之由EU編號所定之214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及440位的胺基酸殘基之至少1個胺基酸殘基的改變之抗體的步驟； b）針對該包含胺基酸殘基的改變之抗體，選擇不含有維生素B12的細胞培養培養基的步驟； c）藉由步驟b）所選擇之細胞培養培養基，培養包含編碼抗體的核酸之真核細胞的步驟，其中，所述抗體包含該胺基酸殘基的改變；及 d）從培養物回收含有抗體的組成物的步驟。 （13）如（12）所記載之製造方法，其中，步驟b）為選擇不含有維生素B12的初代培養基及不含有維生素B12的饋料批式培養基之步驟。 （14）如（12）或（13）所記載之製造方法，其中，前述真核細胞為CHO細胞。 （15）一種含有抗體的製劑之製造方法，其包含以下步驟：（a）在不含有維生素B12的細胞培養培養基中，培養包含編碼抗體的核酸之真核細胞；（b）從培養物回收包含抗體之組成物；（c）將所得之組成物進行醫藥製劑化。 （16）一種抑制抗體的著色之方法，其在使用重組細胞培養物之抗體的製造中，包含以下步驟：（a）在不含有維生素B12的細胞培養培養基中，培養包含編碼抗體的核酸之真核細胞；（b）從培養物回收包含抗體之組成物。 （17）一種方法，其係如（7）所記載之組成物之製造方法、如（15）所記載之含有抗體的製劑之製造方法、或如（16）所記載之抑制抗體的著色之方法，其中，前述抗體為抗IL－8抗體、或抗肌肉生長抑制素抗體。 [發明效果]
藉由本發明，提供含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法。
以下，針對本發明的實施形態進行詳細地說明。
本發明係關係含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法。
VB12 VB12，狹義上係指氰基鈷胺素，廣義上係指作為維生素B12 類的總稱之鈷胺素（cobalamin）。作為培養基成分之VB12為氰基鈷胺素，若培養基成分成為水溶液，則成為氰基鈷胺素、羥基鈷胺素、水合鈷胺素（Aquacobalamin）、腺苷鈷胺素（adenosylcobalamin）、及甲基鈷胺素的平衡狀態。
VB12中，每一分子結合一分子的鈷分子。因此，在本案的實施例中，藉由定量鈷分子相對於抗體之相對濃度，而定量VB12相對於抗體之相對濃度。在本發明中，為了培養真核細胞，可使用不含有VB12之初代培養基及饋料批式培養基。所謂本發明中之「不含有VB12」之培養基，不僅指培養基中的VB12的濃度為0mg/L之情形，亦包含已混入作為培養基添加物之不滿足實質的含量之程度的VB12的培養基。具體而言，在使用該培養基，在與本發明的實施例1同樣的條件下進行培養，將所得之含有抗體的組成物（抗體濃度約30mg/mL）以ICP－MS進行測定之情形中，在VB12所含之鈷分子的濃度成為小於定量限界値的20ppb之情形中，符合「不含有VB12」。
真核細胞 所謂真核細胞，係指具有核膜所包覆的核之細胞。本發明中之「包含編碼多肽的核酸之真核細胞」，係指可適用作為用於製造所期望的多肽之產生系統的宿主細胞。此種細胞可為可產生所期望的多肽之天然細胞，亦可為已人為地導入編碼（或表現）所期望的多肽之核酸之細胞，但較佳為已導入編碼所期望的多肽之核酸之轉形細胞。此種轉形細胞的一例係多肽的產生株，其係將編碼所期望的多肽之外來DNA，使用基因重組技術導入真核細胞而得。因此，所謂「包含編碼多肽之核酸」一用語，亦可替換為「已人為地導入編碼多肽之核酸」或「已導入編碼多肽之外來核酸」。
本發明中之真核細胞的典型例係適合作為用於生產重組蛋白質的宿主之細胞，可選自源自昆蟲、魚、兩棲類、爬蟲類、或哺乳類的細胞。本發明中之真核細胞的較佳例為哺乳類細胞。哺乳類細胞係選自CHO細胞、NS0細胞、Sp2/0細胞、COS細胞、HEK細胞、BHK細胞、PER.C6（註冊商標） 細胞、及融合瘤細胞等，但更佳為CHO細胞。
細胞培養培養基 在本發明中，所謂細胞培養培養基，係指用於培養包含編碼多肽之核酸的細胞所使用之培養基，亦可簡稱為培養基。作為細胞培養培養基，能適當使用市售的培養基或公知的培養基。除了本發明所使用之不含有VB12的培養基，在通常的培養基中，含有VB12以作為細胞的轉錄活性及核酸合成所必要的必須成分。本發明的實施例中，使用維持既存的培養基的組成的同時僅使VB12的成分不包含、去除、或減少的培養基。
適合特定的細胞株之培養培養基的種類，只要為本發明所屬技術領域中具有通常知識者則可適當選擇。例如，作為動物細胞培養用的周知的培養基或市售的培養基，可使用IMDM（伊司考夫改良達爾伯克培養基，Iscove's Modified Dulbecco's Medium）、DMEM（達爾伯克改良伊格爾培養基，Dulbecco's Modified Eagle Medium）、Ham的F12培養基、D－MEM/F－12 1:1 Mixture （Dulbecco's Modified Eagle Medium : Nutrient Mixture F－12）、RPMI1640、CHO－S－SFM II （Invitrogen公司）、CHO－SF （Sigma－Aldrich公司）、EX－CELL 301 （JRH biosciences公司）、CD－CHO （Invitrogen公司）、IS CHO－V （Irvine Scientific公司）、PF－ACF－CHO （Sigma－Aldrich公司）等培養基，但本發明所屬技術領域中具有通常知識者理所當然地理解不限於此等。本發明所屬技術領域中具有通常知識者周知許多已最佳化細胞增殖及抗體或重組蛋白質生產的產率提升之培養基。
例如，作為實施例所使用之可使用於培養產生與潛在性肌肉生長抑制素結合的人源化抗體（IgG1抗體）之CHO細胞株的培養基的例子，可列舉IMDM、DMEM或Ham的F12培養基、或其組合。
細胞培養 一般而言，細胞培養法被分類成批次法（batch culture）、連續法（continuous culture）、饋料批式培養法（fed－batch culture）。
批次法係在培養基中添加少量的種培養液，在培養基中不新添加培養基或不排出培養液，而使細胞增殖之培養方法。
連續法係在培養中連續地添加培養基，並且，使其連續地排出之培養方法。此外，在連續法中，亦包含灌流培養。
饋料批式培養法因屬於批次法與連續法之中間，故亦被稱為半批次法（semi－batch culture），其係在培養中連續地或逐次地添加培養基，但不如連續法般連續地排出培養液之培養方法。饋料批式培養之際能添加之培養基（以下，稱為饋料批式培養基），不一定要與既已使用於培養之培養基（以下，稱為初代培養基）為相同的培養基，亦可添加不同的培養基，亦可僅添加特定的成分。或者，饋料批式培養基亦可為與初代培養基相同的組成之培養基。
在本發明中，可使用批次法、連續法、饋料批式培養法中之任一培養方法，但較佳為使用饋料批式培養法。
通常，在培養細胞而製造所期望的多肽時，係藉由將包含細胞的種培養基添加至一定量的初代培養基並培養細胞而進行。再者，為了使所期望的多肽的產量增加，而在培養中添加饋料批式培養基。
所謂種培養基，係指用於將產生所期望的多肽之細胞（生產細胞庫（Working cell banks））進行放大培養，最後獲得移至用於使所期望的多肽產生之培養基（初代培養基）所必要的細胞數之培養基。又，所謂初代培養基，通常係指用於培養細胞而使所期望的多肽產生之培養基，在該細胞的培養的最初階段所使用之培養基。所謂饋料批式培養基，通常係指添加於初始培養中的培養基之培養基。饋料批式培養基係有被分成多次添加之情形。又，饋料批式培養基亦有被持續性或斷續地添加之情形。
在本發明中，在種培養基中進行細胞的繼代培養，之後，將包含細胞的種培養基添加至一定量的初代培養基，為了使所期望的多肽產生而在初代培養基中進行培養。再者，依據情形，在培養中的培養基中添加1次以上的饋料批式培養基。
饋料批式培養法係依據進料的作法而被進一步分類。定速進料法係將一定量的饋料批式培養基持續地添加至初代培養基之培養方法。
多肽、包含多肽的組成物、包含多肽的組成物之回收 本發明所使用之多肽，較佳為包含相當於抗體的Fc之區域之含有Fc的多肽，再佳為抗體。
包含多肽的組成物（含有多肽的組成物），意指包含多肽與其他成分之組成物。在本發明的實施例中，可從藉由用於產生多肽的細胞培養步驟所得之培養物，回收包含多肽的組成物。於此，所謂「回收」，係指從藉由細胞培養步驟所得之培養物乃至培養液，回收包含多肽的上清液（培養上清液）或使用過濾器回收包含多肽的濾液。
如此進行所回收的溶液，經過由親和性管柱層析法等所致之精製、及濃縮的步驟，可調整成適當濃度之包含多肽的組成物。
多肽為含有Fc的多肽或抗體之情形，可將包含多肽的組成物（含有多肽的組成物）替換成含有Fc的包含多肽的組成物（含有Fc的含有多肽的組成物）或包含抗體的組成物（含有抗體的組成物）。
Fc區域（Fc） Fc區域（或僅稱為Fc）之用語，包含天然序列Fc區域及變異型Fc區域。免疫球蛋白重鏈的Fc區域的邊界雖能變化，但係指抗體分子中之樞紐區或者由其一部分、CH2、CH3區（domain）所構成之區域。Fc區域只要為抗體（IgA、IgD、IgE、IgG、IgM），尤其為IgG的Fc區域，則未被限定，但較佳為人類IgG（IgG1、IgG2、IgG3、IgG4）的Fc區域，再佳為人類IgG1的Fc區域。
著色的抑制 所謂本發明中之含有抑制著色之多肽的組成物，係指起因於VB12的吸附之著色，具體而言，係指已減低紅色或粉紅色之包含多肽的組成物。本發明的實施例中，針對已將多肽（抗體）的濃度調整成30mg/mL左右之含有多肽（抗體）的組成物，藉由視覺評價而進行無色的評價，確認抑制著色。又，已抑制著色之包含多肽（抗體）的組成物，其遵循實施例1的條件所定量之VB12與多肽之莫耳濃度比[%]係小於0.26，較佳為小於0.2，更佳為小於0.1，再佳為小於0.05。
抗體的確認、細胞培養培養基的選擇 在本發明的一實施態樣中，預先確認容易產生著色的抗體，針對此選擇與通常的培養步驟不同之適於抑制著色的培養步驟。在此實施態樣中，首先，具有以下步驟：確認作為目的之多肽係在選自Fc區域中之由EU編號所定之214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及440位的胺基酸殘基之至少1個胺基酸殘基中包含改變的多肽。所謂「確認」，不一定僅指藉由分析手法特定該多肽的具體的改變位置，還包含事先了解在作為目的之多肽中包含該改變。
接著，針對已確認包含該胺基酸殘基的改變之抗體，選擇與通常的培養步驟不同之步驟。亦即，在通常的培養步驟中，雖使用含有VB12作為必須成分之細胞培養培養基（通常細胞培養培養基），但在該抗體的培養步驟中，除了通常細胞培養培養基，更使用不含有VB12之細胞培養培養基。於此，不含有VB12之細胞培養培養基可使用在通常細胞培養培養基的組成中僅不含有VB12，其他組成為相同者。
藉由如此進行所選擇之細胞培養培養基，經過培養包含編碼該多肽之核酸的細胞之步驟，從培養物回收包含多肽的組成物之步驟，製造包含多肽的組成物。 [實施例]
以下，藉由實施例而具體地說明本發明。此外，此等實施例係用於說明本發明者，並不限定本發明的範圍。
實施例係使用下述抗體、細胞、培養基而進行。
抗體：
作為抗體A，使用抗肌肉生長抑制素抗體，其為包含含有序列識別號：1的胺基酸序列之重鏈恆定區域與含有序列識別號：2的胺基酸序列之輕鏈恆定區域的IgG1人源化抗體，且與潛在性肌肉生長抑制素結合。此抗體包含Fc區域中之由EU編號所定之214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及440E的改變。
作為抗體B，使用與WO/2016/125495或WO/2017/046994所記載之IL－8結合之抗IL－8抗體。
作為抗體C，使用與WO2019065795所記載之FIX（a）及FX之雙方結合之抗FIX（a）/FX雙重特異性抗體。
細胞： CHO細胞係使用源自CHO－DXB11的株。
培養基： 初代培養基、饋料批式培養基中，使用Thermo Fisher Scientific公司製、富士薄膜和光純藥公司製的培養基。本實施例中，準備將含有VB12之初代培養基（相對VB12濃度100％的初代培養基）、及完全去除VB12且VB12以外的組成相同之初代培養基（相對VB12濃度0％的初代培養基），這2個培養基以1：1進行混合而成之初代培養基（相對VB12濃度50％的初代培養基），作為初代培養基。又，準備含有VB12之饋料批式培養基（相對VB12濃度100％的饋料批式培養基）、及完全去除VB12且VB12以外的組成相同之饋料批式培養基（相對VB12濃度0％的饋料批式培養基）作為饋料批式培養基。
實施例1. VB12對於抗體的著色所造成之影響的探討
使用產生抗體A之細胞，針對將初代培養基與饋料批式培養基如同表1般進行組合之樣本1～9，分別使用1L～25L的培養裝置，藉由定速進料法，在同一條件下進行培養。在pH6.7～7.2的範圍、34℃～38℃的範圍進行14天的培養，饋料批式培養基係在培養開始後第3天進行添加。
從14天培養後的培養液回收包含抗體的組成物，以Protein A的親和性管柱層析法進行精製後，濃縮溶出液，在樣本1～8中，以抗體濃度成為約30mg／mL（26.7mg／mL～31.4mg／mL）之方式進行調整。樣本9進一步進行濃縮，成為200mg／mL以上的抗體濃度。
評價如此進行所得之含有抗體的組成物的著色與VB12的含量。著色係藉由視覺評價而進行。在樣本1、5、7中，觀察到些許著色（淡紅色）。又，在樣本9中，觀察到著色（紅色）。另一方面，關於樣本2～4、6～8，未觀察到著色（無色）。
含有抗體的組成物中的VB12，因每1分子的VB12結合1分子的鈷，故將含有抗體的組成物中所含之鈷的濃度以ICP－MS（Inductively Coupled Plasma－Mass spectrometry：誘導結合電漿質量分析計）進行測定，算出鈷與抗體之莫耳濃度比（鈷/抗體[%]），藉此估算VB12的含量（VB12與抗體之莫耳濃度比（VB12/抗體[%]））。將此等結果揭示於表1。
[表1]
樣本No. 1 2 3 4 5 6 7 8 9
相對VB12 濃度（％） 初代培養基 100% 0% 100% 50% 100% 0% 100% 50% 100%
饋料批式培養基 100% 0% 0% 0% 100% 0% 0% 0% 100%
著色的視覺評價 淡紅色 無色 無色 無色 淡紅色 無色 淡紅色 無色 紅色
精製・濃縮後的組成物中的抗體濃度[mg／mL] 31.4 30.3 28.1 26.7 30.1 30.9 31.4 31.3 237
鈷濃度 [ppb] 41 ＜20 ＜20 ＜20 38 ＜20 20 ＜20 247
鈷/抗體 [%] 0.33 － － － 0.7 － 0.3 － 0.26
VB12/抗體[%] 0.33 － － － 0.7 － 0.3 － 0.26
※ 樣本2～4、6、8的鈷濃度[ppb]、鈷/抗體[%]、及VB12/抗體[%]係小於定量極限
由實驗結果，驗證含有抗體的組成物所含之VB12為著色的原因。又，藉由抑制初代培養基及饋料批式培養基所含之VB12，確認可抑制培養後之含有抗體的組成物所含之VB12。
實施例2. 培養基中的VB12對於細胞培養之影響的探討
藉由在與實施例1相同的條件下進行細胞培養，而觀察培養基中有無存在VB12對於活細胞數、細胞存活率、累積細胞數造成的影響。其結果，由在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到各日的活細胞數、細胞存活率、累積細胞數幾乎同等。（圖1、2、3）
使用產生抗體B之細胞或產生抗體C之細胞，將初代培養基與饋料批式培養基以表1－1的樣本10（VB＋）及樣本11（VB－）的條件，分別使用1L的培養裝置，藉由定速進料法，在同一條件下進行培養。在pH6.7～7.2的範圍、34℃～38℃的範圍進行14天的培養，饋料批式培養基係在培養開始後第3天進行添加。
在此條件下之細胞培養中，觀察培養基中有無存在VB12對於活細胞數、細胞存活率、累積細胞數造成的影響。其結果，由在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到各日的活細胞數、細胞存活率、累積細胞數幾乎同等（圖5、6、9、10、13、14）
使用產生抗體B之細胞或產生抗體C之細胞，將初代培養基與饋料批式培養基以表1－1的樣本10（VB＋）及樣本12（VB－）的條件，分別使用1L的培養裝置，藉由定速進料法，在同一條件下進行培養。在pH6.7～7.2的範圍、34℃～38℃的範圍進行14天的培養，饋料批式培養基係在培養開始後第3天進行添加。
在此條件下之細胞培養中，觀察培養基中有無存在VB12對於活細胞數、細胞存活率、累積細胞數造成的影響。其結果，由在初代培養基中不含有VB12且在饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到各日的活細胞數、細胞存活率、累積細胞數幾乎同等（圖7、8、11、12、15、16）
[表1－1]
樣本No. 10 11 12
相對VB12濃度（%） 初代培養基 100% 0% 0%
饋料批式培養基 100% 0% 100%
實施例3. 培養基中的VB12對於抗體產量之影響的探討
藉由在與實施例1相同的條件下進行細胞培養，而觀察培養基中有無存在VB12對於抗體產量造成的影響。其結果，由在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到14天培養後的抗體的產量幾乎同等（表2：將VB＋作為控制組培養，將其抗體產量表示作為100%）。
針對產生抗體B之細胞，亦以表1－1的各條件進行培養，觀察培養基中有無存在VB12對於抗體的產量所造成之影響。其結果，由樣本11的條件，亦即在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）以及樣本12的條件，亦即在初代培養基中不含有VB12且在饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由樣本10的條件亦即在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到在14天培養後的抗體的產量幾乎同等（表2－1、2－2：將VB＋作為控制組培養，將其抗體產量表示作為100%）。
[表2]
  產量（％） 標準誤差（％）
VB＋ 100 1.36
VB－ 104.6 1.53
[表2－1] 抗體B VB＋為樣本No10，VB－為樣本No11的條件
　 產量（%）
VB＋ 100
VB－ 100.5
[表2－2] 抗體B VB＋為樣本No10，VB－為樣本No12的條件
產量（％） 標準誤差（%）
VB＋ 100 1.709
VB－ 100.7 1.861
針對產生抗體C之細胞，亦以表1－1的各條件進行培養，觀察培養基中有無存在VB12對於抗體的產量所造成之影響。其結果，由樣本11的條件亦即在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）及樣本12的條件亦即在初代培養基中不含有VB12且在饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB－）所致之培養，相較於由樣本10的條件亦即由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養，確認到14天培養後的抗體的產量幾乎同等（表2－3、2－4：將VB＋作為控制組培養，將其抗體產量表示作為100%）。
[表2－3] 抗體C VB＋為樣本No10，VB－為樣本No11的條件
產量（%） 標準誤差（%）
VB＋ 100 1.027
VB－ 106.2 1.558
[表2－4] 抗體C VB＋為樣本No10，VB－為樣本No12的條件
產量（%） 標準誤差（%）
VB＋ 100 1.027
VB－ 107.4 1.623
實施例4. 培養基中的VB12對於抗體物理性質之影響的探討
以與實施例1相同的條件進行細胞培養、親和性管柱層析法處理、及濃縮，將所得之組成物中的抗體進行分析，藉此觀察培養基中有無存在VB12對於抗體的物理性質所造成之影響。其結果，由在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基（VB－）所致之培養所得之抗體，相較於由在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基（VB＋）所致之培養所得之抗體，確認到糖鏈修飾（去岩藻醣、岩藻醣、半乳糖、高甘露糖、混合）、源自細胞的蛋白質（HCP）、源自細胞的DNA（DNA）、電荷異構物的比例（酸性、鹼性）、及聚合物的比例（HMWs）幾乎同等（表3：將VB＋作為控制組培養，將所得之抗體的各物理性質表示作為100%）。
[表3]
  去岩藻醣 岩藻醣 半乳糖 高甘露糖 混合 HCP DNA 酸性 鹼性 HMWs
VB＋（%） 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
VB－（%） 93.5 100.4 84.0 94.5 88.3 93.8 113.8 91.4 106.8 113.9
VB＋標準誤差（%） 8.2 0.3 3.1 2.3 14.6 4.9 31.4 1.6 2.5 21.8
VB－標準誤差（%） 5.4 0.2 1.7 2.3 6.6 8.9 26.2 1.0 1.3 14.0
實施例5. 培養基中的VB12對於細胞繼代之影響的探討
觀測從細胞繼代培養的培養基（Thermo Fisher Scientific公司製）去除VB12之情形的影響。其結果，由不含有VB12的培養基（VB－）所致之繼代培養，相對於由含有VB12的培養基（VB＋）所致之繼代培養，顯示幾乎同等的增殖行為。確認到能將產生抗體A之細胞的繼代培養實施100天（28次繼代）（圖4）、將產生抗體B之細胞的繼代培養實施136天（39次繼代）（圖17）、及將產生抗體C之細胞的繼代培養實施24天（7次繼代）（圖18）。
實施例6. 由陽離子交換層析法所致之VB12的去除可能性的探討
使用含有VB12之初代培養基及饋料批式培養基，以與實施例1相同的條件進行培養，進行親和性管柱層析法處理，針對所得之含有抗體的組成物，探討可否藉由Binding／Elute法亦即陽離子交換層析法步驟去除VB12。與實施例1同樣地，將鈷的濃度以ICP－MS進行測定，作為VB12的濃度的指標。
其結果，在通過CEX（陽離子交換）管柱前與從CEX溶出後，未見到鈷/抗體[%]的變化（表4）。由此確認到，含有抗體的組成物所含之VB12即使被供至追加的層析法步驟，亦無法被去除。
[表4]
鈷/抗體[%]
通過管柱前 0.29
溶出後 0.31
實施例7. VB12對於抗體的著色所造成之影響的追加探討
初代培養基及饋料批式培養基中使用含有VB12的培養基，以與實施例1相同的條件進行培養、親和性管柱層析法處理、再精製（polishing）步驟、濃縮，針對所得之含有抗體的組成物（抗體濃度30mg/ml左右，有著色（淡紅色）），進行VB12吸附於抗體之追加探討。
對於含有抗體的組成物，以成為0.1%之方式添加氰化鉀（作為控制組，亦實施未添加氰化鉀的條件），在37℃保溫45分鐘。將此等樣本通過5 KD分割過濾器，藉由逆相層析法分析已去除抗體的回收樣本。其結果，在未進行氰化鉀處理的樣本（KCN－）中，未檢測到VB12（氰基鈷胺素）的峰，相對於此，在進行氰化鉀處理的樣本（KCN＋）中，確認到表示VB12（氰基鈷胺素）的峰（圖19，抗體A）。由此結果，確認到藉由氰化鉀的處理，VB12從抗體遊離，並確認到VB12會影響抗體的著色。 [產業可利用性]
本發明可利用於含有多肽的醫藥品之製造。
無。
[圖1]表示在產生多肽（抗體A：抗肌肉生長抑制素抗體）之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數。 [圖2]表示在產生抗體A之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之細胞存活率。 [圖3]表示在產生抗體A之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，從由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數算出累積細胞數。 [圖4]表示在產生抗體A之細胞的培養中，將含有VB12的培養基設為VB＋，將不含有VB12的培養基設為VB－，以3天或4天周期實施繼代培養直至100天（28次繼代）為止，將各天的細胞增殖行為，以細胞倍增時間（Doubling time）作為指標進行作圖之結果。（由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製）進行測定，算出細胞倍增時間） [圖5]在產生與圖1不同的多肽（抗體B：抗IL－8抗體）之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數。 [圖6]在產生與圖1、圖5不同的多肽（抗體C：抗FIXa/FX雙重特異性抗體）之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數。 [圖7]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數。 [圖8]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數。 [圖9]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之細胞存活率。 [圖10]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之細胞存活率。 [圖11]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之細胞存活率。 [圖12]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之細胞存活率。 [圖13]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，從由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數算出累積細胞數。 [圖14]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將在初代培養基及饋料批式培養基中不含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，從由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數算出累積細胞數。 [圖15]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，從由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數算出累積細胞數。 [圖16]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將在初代培養基及饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB＋，將雖在初代培養基中不含有VB12但在饋料批式培養基中含有VB12的培養基設為VB－，針對培養14天的每一天，從由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製，型式Vi－CELL XR）所測定之活細胞數算出累積細胞數。 [圖17]表示在產生抗體B之細胞的培養中，將含有VB12的培養基設為VB＋，將不含有VB12的培養基設為VB－，以3天或4天周期實施繼代培養直至136天（39次繼代）為止，將各天的細胞增殖行為，以細胞倍增時間（Doubling time）作為指標進行作圖之結果。（由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製）進行測定，算出細胞倍增時間） [圖18]表示在產生抗體C之細胞的培養中，將含有VB12的培養基設為VB＋，將不含有VB12的培養基設為VB－，以3天或4天周期實施繼代培養直至24天（7次繼代）為止，將各天的細胞增殖行為，以細胞倍增時間（Doubling time）作為指標進行作圖之結果。（由細胞自動計測裝置Vi－CELL系統（Beckman Courter公司製）進行測定，算出細胞倍增時間） [圖19]表示分別針對已進行氰化鉀處理之含有抗體的組成物與未進行氰化鉀處理之含有抗體的組成物，以5KD分離過濾器（cutoff filter）去除抗體，以逆相層析法（Column：AcclaimTM Polar Advantage II LC）分析回收樣本之結果。以KCN－表示氰化鉀非處理樣本，以KCN＋表示氰化鉀處理樣本，以STD表示VB12的峰。
Figure 12_A0101_SEQ_0001
Figure 12_A0101_SEQ_0002
Figure 12_A0101_SEQ_0003

Claims (14)

  1. 一種含有抑制著色之多肽的組成物之製造方法，其包含以下步驟： a）在不含有維生素B12的細胞培養培養基中，培養包含編碼多肽的核酸之真核細胞； b）從培養物回收含有多肽的組成物。
  2. 如請求項1所述之組成物之製造方法，其中，在前述組成物中，維生素B12與多肽的莫耳濃度比為小於0.26％。
  3. 如請求項1或2所述之組成物之製造方法，其藉由不含有維生素B12的初代培養基（primary medium）及不含有維生素B12的饋料批式培養基進行饋料批式培養。
  4. 如請求項3所述之組成物之製造方法，其中，在從饋料批式培養開始起第7日之細胞培養培養基中的VCD（活細胞密度）為80×105 cells／mL以上。
  5. 如請求項1至4中任一項所述之組成物之製造方法，其中，前述真核細胞為CHO細胞。
  6. 如請求項1至5中任一項所述之組成物之製造方法，其中，前述多肽為含有Fc的多肽。
  7. 如請求項6所述之組成物之製造方法，其中，前述含有Fc的多肽為抗體。
  8. 如請求項6或7所述之組成物之製造方法，其中，前述多肽包含選自Fc區域中之由EU編號（EU numbering）所定之214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及440位的胺基酸殘基之至少1個胺基酸殘基的改變。
  9. 如請求項6至8中任一項所述之組成物之製造方法，其中，前述多肽包含選自Fc區域中之由EU編號所定之214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R及440E之至少1個改變。
  10. 如請求項6至9中任一項所述之組成物之製造方法，其中，前述多肽為包含以下區域的抗體：包含序列識別號：1的胺基酸序列之重鏈恆定區域；與包含序列識別號：2的胺基酸序列之輕鏈恆定區域。
  11. 如請求項10所述之組成物之製造方法，其中，前述抗體為與潛在性肌肉生長抑制素（Myostatin）結合之IgG1人源化（humanized）抗體。
  12. 一種製造方法，其係含有抑制著色之抗體的組成物之製造方法，且包含： a）確認目標抗體為包含選自在Fc區域中之由EU編號所定之214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位及440位的胺基酸殘基之至少1個胺基酸殘基的改變之抗體的步驟； b）針對該包含胺基酸殘基的改變之抗體，選擇不含有維生素B12的細胞培養培養基的步驟； c）藉由步驟b）所選擇之細胞培養培養基，培養包含編碼抗體的核酸之真核細胞的步驟，其中，前述抗體包含該胺基酸殘基的改變； d）從培養物回收含有抗體的組成物之步驟。
  13. 如請求項12所述之製造方法，其中，步驟b）為選擇不含有維生素B12的初代培養基及不含有維生素B12的饋料批式培養基之步驟。
  14. 如請求項12或13所述之製造方法，其中，前述真核細胞為CHO細胞。
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