CN115038793A - 含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法 - Google Patents

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Abstract

含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法，其包括：a)在不含维生素B12的细胞培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞；b)从培养物回收包含多肽的组合物的步骤。

Description

含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法
技术领域
本发明提供含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法。
背景技术
应用重组细胞培养物体外制备多肽的方法是公知的，在工业规模制备中广泛使用。在将含有多肽例如抗体的组合物制剂化、作为药物制剂提供的情形中，作为一个品质特性，需要将制剂的颜色抑制到可容许的水平、例如满足用于制品的市场化的规定要求的水平。
特别是在以高浓度(例如150mg/mL以上)含有抗体的制剂中，由于伴随浓缩着色增强，将制剂的颜色抑制到可容许的水平变得重要。
作为含有抗体的制剂的着色的原因，报告了维生素B12(以下称为“VB12”)对抗体的吸附(非专利文献1～3、专利文献1)。1分子的钴与1分子的VB12配位。VB12中存在氰钴胺素体和羟钴胺素体，据报告，通过羟钴胺素体与抗体结合，该分子着色为粉红色或红色(非专利文献1～3)。
此外，作为以防止抗体的着色为目的的培养方法，报告了使用含有特定量的维生素B2、B6、B9、B12、胱氨酸的培养基的培养方法(专利文献2)。此外，报告了通过防止培养基中的氰钴胺素体变换为羟钴胺素和抗体的二硫键的还原来防止着色的方法(专利文献1)。
另一方面，报告了VB12是用于真核细胞的细胞培养基的必需成分(非专利文献1)，VB12是用于哺乳类细胞的培养的必需成分(专利文献1)。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：WO2018/208743
专利文献2：特表2015-515281
非专利文献
非专利文献1：MAbs.2013Nov 1；5(6)：974-981
非专利文献2：MAbs.2014May 1；6(3)：679-688
非专利文献3：Biotechnology and Bioengineering.2018；115：900-909
发明概述
发明要解决的课题
本发明的课题是提供一种方法，其对于容易产生着色特性的多肽，通过比较简单的制备方法的变更，将多肽的产生量和物理性质维持在容许范围内，同时解决着色的问题。
用于解决课题的手段
本发明人为了实现上述课题深入研究，结果发现，通过应用不含VB12的培养基，可以维持多肽的产生量，同时抑制着色，从而完成本发明。
因此，本发明可以表现为如以下(1)～(17)。
(1)含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法，其包括：(a)在不含维生素B12的细胞培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞；(b)从培养物回收包含多肽的组合物的步骤。
(2)(1)中记载的组合物的制备方法，其中，在前述组合物中，维生素B12与多肽的摩尔浓度比低于0.26％。
(3)(1)或(2)中记载的组合物的制备方法，其中，通过不含维生素B12的初始培养基和不含维生素B12的补料分批培养基进行补料分批培养。
(4)(3)中记载的组合物的制备方法，其中，从补料分批培养开始第7天的细胞培养基中的VCD(存活细胞密度)是80×105个细胞/mL以上。
(5)(1)～(4)的任一项中记载的组合物的制备方法，其中，前述真核细胞是CHO细胞。
(6)(1)～(5)的任一项中记载的组合物的制备方法，其中，前述多肽是含有Fc的多肽。
(7)(6)中记载的组合物的制备方法，其中，前述含有Fc的多肽是抗体。
(8)(6)或(7)中记载的组合物的制备方法，其中，前述多肽包含选自Fc区中按EU编号214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位和440位氨基酸残基中至少一个氨基酸残基的改变。
(9)(6)～(8)中记载的组合物的制备方法，其中，前述多肽包含选自Fc区中按EU编号214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R和440E的至少一个改变。
(10)(6)～(9)中记载的组合物的制备方法，其中，前述多肽是包含含有序列编号：1的氨基酸序列的重链恒定区和含有序列编号：2的氨基酸序列的轻链恒定区的抗体。
(11)(10)中记载的组合物的制备方法，其中，前述抗体是与潜在型肌抑素(myostatin)结合的IgG1人源化抗体。
(12)含有抑制着色的抗体的组合物的制备方法，其包括：
a)确认作为目标的抗体是包含选自Fc区中按EU编号214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位和440位氨基酸残基中至少一个氨基酸残基的改变的抗体的步骤；
b)对于包含该氨基酸残基的改变的抗体选择不含维生素B12的细胞培养基的步骤；
c)通过步骤b)中选择的细胞培养基培养包含编码含有该氨基酸残基的改变的抗体的核酸的真核细胞的步骤；和
d)从培养物回收含有抗体的组合物的步骤。
(13)(12)中记载的制备方法，其中，步骤b)是选择不含维生素B12的初始培养基和不含维生素B12的补料分批培养基的步骤。
(14)(12)或(13)中记载的制备方法，其中，前述真核细胞是CHO细胞。
(15)含有抗体的制剂的制备方法，其包括：在不含维生素B12的细胞培养基中培养包含编码抗体的核酸的真核细胞；(b)从培养物回收包含抗体的组合物；(c)将得到的组合物制备为药物制剂的步骤。
(16)抑制抗体的着色的方法，其包括：在应用重组细胞培养物的抗体的制备中，(a)在不含维生素B12的细胞培养基中培养包含编码抗体的核酸的真核细胞；(b)从培养物回收包含抗体的组合物的步骤。
(17)(7)中记载的组合物的制备方法、(15)中记载的含有抗体的制剂的制备方法、或(16)中记载的抑制抗体的着色的方法，其中，前述抗体是抗IL-8抗体、或抗肌抑素抗体。
发明效果
根据本发明，提供含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法。
附图简述
[图1]显示在产生多肽(抗体A：抗肌抑素抗体)的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数。
[图2]显示在产生抗体A的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的细胞存活率。
[图3]显示在产生抗体A的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，根据由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数算出累计细胞数。
[图4]显示在产生抗体A的细胞的培养中，以包含VB12的培养基为VB+，以不含VB12的培养基为VB-，以3天期间或4天期间周期实施传代培养至100天期间(28次传代)，以细胞倍增时间(Doubling time)为指标绘制各天的细胞增殖行为的结果。(由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制)测定，算出细胞倍增时间)
[图5]显示在产生与图1不同的多肽(抗体B：抗IL-8抗体)的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数。
[图6]显示在产生与图1、图5不同的多肽(抗体C：抗FIXa/FX双特异性抗体)的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数。
[图7]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数。
[图8]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数。
[图9]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的细胞存活率。
[图10]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的细胞存活率。
[图11]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的细胞存活率。
[图12]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的细胞存活率。
[图13]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，根据由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数算出累计细胞数。
[图14]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，根据由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数算出累计细胞数。
[图15]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，根据由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数算出累计细胞数。
[图16]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以在初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB+，以在初始培养基中不含VB12但在补料分批培养基中包含VB12的培养基为VB-，对于培养14天期间的各天，根据由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(BeckmanCourter公司制、型号Vi-CELL XR)测定的活细胞数算出累计细胞数。
[图17]显示在产生抗体B的细胞的培养中，以包含VB12的培养基为VB+，以不含VB12的培养基为VB-，以3天期间或4天期间周期实施传代培养至136天期间(39次传代)，以细胞倍增时间(Doubling time)为指标绘制各天的细胞增殖行为的结果。(由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制)测定，算出细胞倍增时间)
[图18]显示在产生抗体C的细胞的培养中，以包含VB12的培养基为VB+，以不含VB12的培养基为VB-，以3天期间或4天期间周期实施传代培养至24天期间(7次传代)，以细胞倍增时间(Doubling time)为指标绘制各天的细胞增殖行为的结果。(由细胞自动计量装置Vi-CELL系统(Beckman Courter公司制)测定，算出细胞倍增时间)
[图19]显示对于进行了氰化钾处理的含有抗体的组合物和未进行氰化钾处理的含有抗体的组合物各自用5KD截止滤器除去抗体和用反相色谱(Column：AcclaimTMPolarAdvantage II LC)分析回收样品的结果。氰化钾非处理样品以KCN-表示，氰化钾处理样品以KCN+表示，VB12的峰以STD表示。
用于实施发明的方式
以下，对于本发明的实施方式进行详细说明。
本发明涉及含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法。
VB12
VB12狭义上指氰钴胺素，广义上指作为维生素B12类的总称的钴胺素(cobalamin)。作为培养基成分的VB12是氰钴胺素，培养基成分成为水溶液时，成为氰钴胺素、羟钴胺素、水钴胺素、腺苷钴胺素和甲基钴胺素的平衡状态。
VB12中，每1分子结合1分子的钴分子。因此，在本申请的实施例中，通过定量钴分子相对于抗体的相对浓度，定量VB12相对于抗体的相对浓度。在本发明中，为了真核细胞的培养，可以应用不含VB12的初始培养基和补料分批培养基。本发明中的“不含VB12”的培养基不仅包含培养基中的VB12的浓度是0mg/L的情形，也包含混入了低于作为培养基添加物的实质含有量程度的VB12的培养基。具体地，在使用该培养基在与本发明的实施例1同样的条件下进行培养，用ICP-MS测定得到的含有抗体的组合物(抗体浓度约30mg/mL)的情形中，在VB12中包含的钴分子的浓度低于定量界限值的20ppb的情形中，相当于“不含VB12”。
真核细胞
真核细胞指具有被核膜包围的核的细胞。本发明中的“包含编码多肽的核酸的真核细胞”是可以作为用于期望的多肽的制备的产生系统使用的宿主细胞。这样的细胞可为可以产生期望的多肽的天然的细胞，也可为将编码(或表达)期望的多肽的核酸人工导入的细胞，优选导入了编码期望的多肽的核酸的转化细胞。这样的转化细胞的一个实例是将编码期望的多肽的外源DNA应用基因重组技术导入真核细胞得到的多肽的产生株。因此，“包含编码多肽的核酸”的术语也可以替代地读作“人工导入了编码多肽的核酸”或“导入了编码多肽的外源核酸”。
本发明中的真核细胞的典型实例是适合作为用于重组蛋白的生产的宿主的细胞，可以选自来自昆虫、焦、两栖类、爬行类、或哺乳类的细胞。本发明中的真核细胞的优选实例是哺乳类细胞。哺乳类细胞选自CHO细胞、NS0细胞、Sp2/0细胞、COS细胞、HEK细胞、BHK细胞、PER.C6(注册商标)细胞、和杂交瘤细胞等，更优选CHO细胞。
细胞培养基
在本发明中，细胞培养基指用于培养包含编码多肽的核酸的细胞而使用的培养基，也可以简称为培养基。作为细胞培养基，可适当使用市售的培养基或公知的培养基。除了本发明中应用的不含VB12的培养基，通常的培养基包含VB12作为细胞的转录活性和核酸合成所必需的必需成分。在本发明的实施例中，应用维持现有的培养基的组成，同时使仅VB12的成分不包含、除去或减少的培养基。
本领域技术人员可以适当选择适合特定的细胞株的培养基的种类。例如，作为动物细胞培养用的公知的培养基或市售的培养基，可以使用IMDM(Iscove改良Dulbecco培养基、Iscove′s Modified Dulbecco′s Medium)、DMEM(Dulbecco改良Eagle培养基，Dulbecco′s Modified Eagle Medium)、Ham的F12培养基、D-MEM/F-121：1Mixture(Dulbecco′s Modified Eagle Medium：Nutrient Mixture F-12)、RPMI1640、CHO-S-SFMII(Invitrogen公司)、CHO-SF(Sigma-Aldrich公司)、EX-CELL 301(JRH biosciences公司)、CD-CHO(Invitrogen公司)、IS CHO-V(Irvine Scientific公司)、PF-ACF-CHO(Sigma-Aldrich公司)等培养基，但不限于这些，这是本领域技术人员当然理解的。对于细胞增殖和抗体及重组蛋白生产收率提高最优化的多数培养基是本领域技术人员公知的。
例如，作为可用于培养产生与实施例中使用的潜在型肌抑素结合的人源化抗体(IgG1抗体)的CHO细胞株的培养基的实例，列举IMDM、DMEM或Ham的F12培养基、或其组合。
细胞培养
通常，细胞培养法分类为分批法(batch culture)、连续法(continuousculture)、补料分批培养法(fed-batch culture)。
分批法是在培养基中加入少量种子培养液、不向培养基中新加入培养基或排出培养液而使细胞增殖的培养方法。
连续法是在培养中连续加入培养基、并且使其连续排出的培养方法。另外，连续法也包含灌注培养。
由于补料分批培养法介于分批法和连续法之间，也称为半分批法(semi-batchculture)，是在培养中连续或依次加入培养基、但不进行如连续法的连续培养液排出的培养方法。补料分批培养时加入的培养基(以下称为补料分批培养基)不必是与已经在培养中使用的培养基(以下称为初始培养基)相同的培养基，可以添加不同的培养基，也可以仅添加特定成分。或者，补料分批培养基也可以是与初始培养基组成相同的培养基。
在本发明中，可以应用分批法、连续法、补料分批培养法的任一培养方法，优选应用补料分批培养法。
通常，在培养细胞制备期望的多肽中，通过将包含细胞的种子培养基一定量地添加至初始培养基、培养细胞而进行。进一步，为了使期望的多肽的产生量增加，在培养中添加补料分批培养基。
种子培养基指用于扩增培养产生期望的多肽的细胞(工作细胞库)、得到最终向用于产生期望的多肽的培养基(初始培养基)转移所必需的细胞数的培养基。此外，初始培养基通常指用于培养细胞产生期望的多肽的培养基，即该细胞的培养的最初阶段中使用的培养基。补料分批培养基通常指向初始培养中的培养基添加的培养基。补料分批培养基有时分数次添加。此外，补料分批培养基有时连续或间歇地添加。
在本发明中，用种子培养基进行细胞的传代培养，其后，将包含细胞的种子培养基以一定量添加到初始培养基，为了产生期望的多肽在初始培养基中进行培养。进一步地，根据情形，向培养中的培养基加入补料分批培养基1次以上。
补料分批培养法根据补料分批的方式进一步分类。等速补料分批法是将一定量的补料分批培养基连续添加到初始培养基的培养方法。
多肽、包含多肽的组合物、包含多肽的组合物的回收
本发明中应用的多肽优选包含相当于抗体的Fc的区的含有Fc的多肽，更优选抗体。
包含多肽的组合物(含有多肽的组合物)意味着包含多肽与其它成分的组合物。在本发明的实施例中，可以从通过用于多肽产生的细胞培养步骤得到的培养物回收包含多肽的组合物。此处所述的“回收”指从通过细胞培养步骤得到的培养物或培养液回收包含多肽的上清液(培养上清液)或使用滤器回收包含多肽的滤液。
如此回收的溶液可以经过通过亲和柱色谱等纯化和浓缩的步骤调整为包含适当浓度的多肽的组合物。
在多肽是含有Fc的多肽或抗体的情形中，包含多肽的组合物(含有多肽的组合物)可以替代地读作包含含有Fc的多肽的组合物(包含含有Fc的多肽的组合物)或包含抗体的组合物(含有抗体的组合物)。
Fc区(Fc)
Fc区(或简称为Fc)的术语包含天然序列Fc区和变异型Fc区。免疫球蛋白重链的Fc区的边界可变化，指由抗体分子中的铰链部或其一部分、CH2、CH3结构域组成的区。Fc区只要是抗体(IgA、IgD、IgE、IgG、IgM)、特别是IgG的Fc区则没有限定，优选人IgG(IgG1、IgG2、IgG3、IgG4)的Fc区，进一步优选人IgG1的Fc区。
着色的抑制
本发明中的含有抑制着色的多肽的组合物指包含降低起因于VB12的吸附的着色、具体地红色或粉红色的多肽的组合物。在本发明的实施例中，对于将多肽(抗体)的浓度调整为30mg/mL左右的含有多肽(抗体)的组合物，通过目测评价进行无色的评价，确认着色被抑制。此外，对于含有抑制着色的多肽(抗体)的组合物，按照实施例1的条件定量的VB12与多肽的摩尔浓度比[％]低于0.26，优选低于0.2，更优选低于0.1，进一步优选低于0.05。
抗体的确认、细胞培养基的选择
在本发明的一个实施方式中，预先确认容易产生着色的抗体，对其选择与通常的培养步骤不同、适于着色的抑制的培养步骤。在该实施方式中，首先具有确认作为目标的多肽是在Fc区按EU编号选自214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位和440位氨基酸残基中至少一个氨基酸残基包含改变的多肽的步骤。“确认”不一定仅是通过分析的方法指定该多肽的具体改变位置，包括预先识别作为目标的多肽中含有该改变。
随后，对于确认包含该氨基酸残基的改变的抗体，选择与通常的培养步骤不同的步骤。即，在通常的培养步骤中，应用包含VB12作为必需成分的细胞培养基(通常细胞培养基)，但在该抗体的培养步骤中，替代通常细胞培养基应用不含VB12的细胞培养基。此处，不含VB12的细胞培养基可以应用从通常细胞培养基的组成使得仅不包含VB12、其它组成相同的那种。
经过通过如此选择的细胞培养基培养包含编码该多肽的核酸的细胞的步骤、从培养物回收包含多肽的组合物的步骤，制备包含多肽的组合物。
实施例
以下，通过实施例具体说明本发明。另外，这些实施例用于说明本发明，不限定本发明的范围。
实施例应用下列抗体、细胞、培养基进行。
抗体：
作为抗体A，应用包含含有序列编号：1的氨基酸序列的重链恒定区、和含有序列编号：2的氨基酸序列的轻链恒定区的IgG1人源化抗体，即与潜在型肌抑素结合的抗肌抑素抗体。该抗体包含在Fc区中的按EU编号214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R和440E的改变。
作为抗体B，应用WO/2016/125495或WO/2017/046994中记载的与IL-8结合的抗IL-8抗体。
作为抗体C，应用WO2019065795中记载的与FIX(a)和FX二者结合的抗FIX(a)/FX双特异性抗体。
细胞：
CHO细胞应用CHO-DXB11衍生株。
培养基：
初始培养基、补料分批培养基应用Thermo Fisher Scientific公司制、富士胶片和光纯药公司制的培养基。在本实施例中，作为初始培养基，准备包含VB12的初始培养基(相对VB12浓度100％的初始培养基)、VB12完全除去并且VB12以外的组成相同的初始培养基(相对VB12浓度0％的初始培养基)、将这两种的培养基以1：1混合的初始培养基(相对VB12浓度50％的初始培养基)。此外，作为补料分批培养基，准备包含VB12的补料分批培养基(相对VB12浓度100％的补料分批培养基)、和VB12完全除去并且VB12以外的组成相同的补料分批培养基(相对VB12浓度0％的补料分批培养基)。
实施例1.VB12对抗体的着色造成的影响的研究
应用产生抗体A的细胞，对于如表1组合初始培养基和补料分批培养基的样品1～9，分别应用1L～25L的培养装置通过等速补料分批法在相同条件下进行培养。在pH6.7～7.2的范围、34℃～38℃的范围进行14天期间的培养，补料分批培养基在培养开始后第3天添加。
从14天期间培养后的培养液回收包含抗体的组合物，用Protein A的亲和柱色谱纯化后，浓缩洗脱液，在样品1～8中，调整为抗体浓度成为约30mg/mL(26.7mg/mL～31.4mg/mL)。样品9进一步进行浓缩，成为200mg/mL以上的抗体浓度。
评价如此得到的含有抗体的组合物的着色与VB12的含有量。着色通过目测评价进行。在样品1、5、7中，观察到一些着色(淡红色)。此外，在样品9中观察到着色(红色)。另一方面，对于样品2～4、6～8，未观察到着色(无色)。
由于含有抗体的组合物中的VB12每1分子VB12结合1分子钴，通过用ICP-MS(Inductively Coupled Plasma-Mass spectrometry：电感耦合等离子体质谱仪)测定含有抗体的组合物中包含的钴的浓度算出钴与抗体的摩尔浓度比(钴/抗体[％])，估计VB12的含有量(VB12与抗体的摩尔浓度比(VB12/抗体[％]))。这些结果示于表1。
[表1]
Figure BDA0003772192760000131
※样品2-4、6、8的钴浓度[ppb]、钴/抗体[％]和VB12/抗体[％]低于定量界限
根据实验结果验证，含有抗体的组合物中包含的VB12是着色的原因。此外确认，通过抑制初始培养基和补料分批培养基中包含的VB12，可以抑制培养后的含有抗体的组合物中包含的VB12。
实施例2.培养基中的VB12对细胞培养的影响的研究
通过在与实施例1相同的条件进行细胞培养，观察培养基中的VB12的存在的有无对活细胞数、细胞存活率、累计细胞数造成的影响。其结果，确认通过初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)的培养与通过初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，各天的活细胞数、细胞存活率、累计细胞数几乎同等。(图1、2、3)
应用产生抗体B的细胞或产生抗体C的细胞，在使初始培养基和补料分批培养基为表1-1的样品10(VB+)以及样品11(VB-)的条件，分别应用1L的培养装置通过等速补料分批法在同一条件下进行培养。在pH6.7～7.2的范围、34℃～38℃的范围进行14天期间的培养，补料分批培养基在培养开始后第3天添加。
在该条件下的细胞培养中，观察培养基中的VB12的存在的有无对活细胞数、细胞存活率、累计细胞数造成的影响。其结果，确认通过初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)的培养与通过初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，各天的活细胞数、细胞存活率、累计细胞数几乎同等(图5、6、9、10、13、14)。
应用产生抗体B的细胞或产生抗体C的细胞，在使初始培养基和补料分批培养基为表1-1的样品10(VB+)以及样品12(VB-)的条件，分别应用1L的培养装置通过等速补料分批法在同一条件下进行培养。在pH6.7～7.2的范围、34℃～38℃的范围进行14天期间的培养，补料分批培养基在培养开始后第3天添加。
在该条件下的细胞培养中，观察培养基中的VB12的存在的有无对活细胞数、细胞存活率、累计细胞数造成的影响。其结果，确认通过初始培养基中不含VB12补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB-)的培养与通过初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，各天的活细胞数、细胞存活率、累计细胞数几乎同等(图7、8、11、12、15、16)
[表1-1]
Figure BDA0003772192760000141
实施例3.培养基中的VB12对抗体产生量的影响的研究
通过在与实施例1相同的条件进行细胞培养，观察培养基中的VB12的存在的有无对抗体的产生量造成的影响。其结果，确认通过初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)的培养与通过初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，14天期间培养后的抗体的产生量几乎相等(表2：以VB+为对照培养的抗体产生量表示为100％)。
对于产生抗体B的细胞也在表1-1的各条件培养，观察通过培养基中的VB12的存在的有无对抗体的产生量造成的影响。其结果，确认通过作为样品11的条件的初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)以及作为样品12的条件的初始培养基中不含VB12补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB-)的培养与通过作为样品10的条件的初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，14天期间培养后的抗体的产生量几乎相等)表2-1、2-2：以VB+为对照培养的抗体产生量表示为100％)。
[表2]
产生量(％) 标准误差(％)
VB+ 100 1.36
VB- 104.6 1.53
[表2-1]
抗体B
VB+是样品编号10、VB-是样品编号11的条件
产生量(％）
VB+ 100
VB- 100.5
[表2-2]
抗体B
VB+是样品编号10、VB-是样品编号12的条件
产生量(％) 标准误差(％）
VB+ 100 1.709
VB- 100.7 1.861
对于产生抗体C的细胞也在表1-1的各条件培养，观察通过培养基中的VB12的存在的有无对抗体的产生量造成的影响。其结果，确认通过作为样品11的条件的初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)以及作为样品12的条件的初始培养基中不含VB12补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB-)的培养与通过作为样品10的条件的初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养相比，14天期间培养后的抗体的产生量几乎相等(表2-3、2-4：以VB+为对照培养的抗体产生量表示为100％)。
[表2-3]
抗体C
VB+是样品编号10、VB-是样品编号11的条件
产生量(％) 标准误差(％)
VB+ 100 1.027
VB- 106.2 1.558
[表2-4]
抗体C
VB+是样品编号10、VB-是样品编号12的条件
产生量(％) 标准误差(％)
VB+ 100 1.027
VB- 107.4 1.623
实施例4.培养基中的VB12对抗体物理性质的影响的研究
在与实施例1相同的条件进行细胞培养、亲和柱色谱处理和浓缩，通过分析得到的组合物中的抗体，观察培养基中的VB12的存在的有无对抗体的物理性质造成的影响。其结果，确认通过初始培养基和补料分批培养基中不含VB12的培养基(VB-)的培养中得到的抗体与通过初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基(VB+)的培养中得到的抗体相比，糖链修饰(Afcosyl、岩藻糖基、半乳糖基、高甘露糖、杂合体)、来自细胞的蛋白(HCP)、来自细胞的DNA(DNA)、电荷变体的比例(酸性、碱性)、和聚合物的比例(HMWs)几乎相等(表3：以VB+为对照培养得到的抗体的各物理性质表示为100％)。
[表3]
Afucosyl 岩藻糖基 半乳糖基 高甘露糖 杂合体 HCP DNA 酸性 碱性 HMWs
VB+(％) 100 100 100 100 100 100 100 100 100 100
VB-(％) 93.5 100.4 84.0 94.5 88.3 93.8 113.8 91.4 106.8 113.9
VB+标准误差(％) 8.2 0.3 3.1 2.3 14.6 4.9 31.4 1.6 2.5 21.8
VB-标准误差(％) 5.4 0.2 1.7 2.3 6.6 8.9 26.2 1.0 1.3 14.0
实施例5.培养基中的VB12对细胞传代的影响的研究
观察从细胞传代培养的培养基(Thermo Fisher Scientific公司制)除去VB12的情形的影响。其结果，通过不含VB12的培养基(VB-)的传代培养与通过包含VB12的培养基(VB+)的传代培养相比，显示几乎相等的增殖行为。确认产生抗体A的细胞的传代培养可实施100天期间(28次传代)(图4)、产生抗体B的细胞的传代培养可实施136天期间(39次传代)(图17)、和产生抗体C的细胞的传代培养可实施24天期间(7次传代)(图18)。
实施例6.通过阳离子交换色谱的VB12的除去可能性的研究
使用包含VB12的初始培养基和补料分批培养基在与实施例1相同的条件培养，进行亲和柱色谱处理，对于得到的含有抗体的组合物，研究通过作为结合/洗脱法的阳离子交换色谱步骤是否可以除去VB12。与实施例1同样，用ICP-MS测定钴的浓度，作为VB12的浓度的指标。
其结果，在通过CEX(阳离子交换)柱前和从CEX洗脱后，钴/抗体[％]未见变化(表4)。由此确认，含有抗体的组合物中包含的VB12即使供给追加的色谱步骤也不能除去。
[表4]
钴/抗体[％]
通过柱前 0.29
洗脱后 0.31
实施例7.VB12对抗体的着色造成的影响的追加研究
应用初始培养基和补料分批培养基中包含VB12的培养基，对于进行在与实施例1相同的条件培养、亲和柱色谱处理、精制(polishing)步骤、浓缩而得到的含有抗体的组合物(抗体浓度30mg/ml左右、有着色(淡红色))，进行VB12与抗体吸附的追加研究。
向含有抗体的组合物添加氰化钾成为0.1％(作为对照也实施不添加氰化钾的条件)，在37℃保温45分分钟。将这些样品通过5KD截止滤器、通过反相色谱分析除去抗体的回收样品。其结果，在氰化钾非处理样品(KCN-)中未检测到VB12(氰钴胺素)的峰，与之相对，在氰化钾处理样品(KCN+)中见到显示VB12(氰钴胺素)的峰(图19、抗体A)。根据该结果，确认通过氰化钾的处理，VB12从抗体游离，确认VB12影响抗体的着色。
产业上的可利用性
本发明可以用于制备含有多肽的药物。
序列表
<110> 中外制药株式会社
<120> 含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法
<130> FA0001-20314
<150> JP 2020-014739
<151> 2020-01-31
<160> 2
<210> 1
<211> 328
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 1
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1 5 10 15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
50 55 60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65 70 75 80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
85 90 95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
100 105 110
Pro Ala Pro Glu Tyr Leu Gly Gly Asp Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
115 120 125
Lys Pro Lys Asp Val Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
130 135 140
Val Val Ile Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145 150 155 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
165 170 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Pro Val Leu
180 185 190
His Arg Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
195 200 205
Lys Ala Leu Pro Lys Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
210 215 220
Gln Arg Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225 230 235 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
245 250 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
260 265 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
275 280 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
290 295 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Leu His Glu Ala Leu His Ala His Thr Thr
305 310 315 320
Arg Lys Glu Leu Ser Leu Ser Pro
325
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列（Artificial sequence）
<220>
<223> 人工合成的序列
<400> 2
Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu
1 5 10 15
Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln
35 40 45
Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu
65 70 75 80
Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser
85 90 95
Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
100 105

Claims (14)

1.含有抑制着色的多肽的组合物的制备方法，其包括：
a)在不含维生素B12的细胞培养基中培养包含编码多肽的核酸的真核细胞，
b)从培养物回收包含多肽的组合物的步骤。
2.根据权利要求1所述的组合物的制备方法，其中，在所述组合物中，维生素B12与多肽的摩尔浓度比低于0.26％。
3.根据权利要求1或2所述的组合物的制备方法，其中，通过不含维生素B12的初始培养基和不含维生素B12的补料分批培养基进行补料分批培养。
4.根据权利要求3所述的组合物的制备方法，其中，从补料分批培养开始第7天的细胞培养基中的VCD(存活细胞密度)是80×105个细胞/mL以上。
5.根据权利要求1～4的任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述真核细胞是CHO细胞。
6.根据权利要求1～5的任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述多肽是含有Fc的多肽。
7.根据权利要求6所述的组合物的制备方法，其中，所述含有Fc的多肽是抗体。
8.根据权利要求6或7所述的组合物的制备方法，其中，所述多肽包含选自Fc区中按EU编号214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位和440位氨基酸残基中至少一个氨基酸残基的改变。
9.根据权利要求6～8所述的组合物的制备方法，其中，所述多肽包含选自Fc区中按EU编号214R、234Y、238D、250V、264I、307P、311R、330K、343R、428L、434A、436T、438R和440E的至少一个改变。
10.根据权利要求6～9所述的组合物的制备方法，其中，所述多肽是包含含有序列编号：1的氨基酸序列的重链恒定区和含有序列编号：2的氨基酸序列的轻链恒定区的抗体。
11.根据权利要求10所述的组合物的制备方法，其中，所述抗体是与潜在型肌抑素结合的IgG1人源化抗体。
12.含有抑制着色的抗体的组合物的制备方法，其包括：
a)确认作为目标的抗体是包含选自Fc区中按EU编号214位、234位、238位、250位、264位、307位、311位、330位、343位、428位、434位、436位、438位和440位氨基酸残基中至少一个氨基酸残基的改变的抗体的步骤，
b)对于包含所述氨基酸残基的改变的抗体，选择不含维生素B12的细胞培养基的步骤，
c)通过步骤b)中选择的细胞培养基培养包含核酸的真核细胞的步骤，所述核酸编码含有所述氨基酸残基的改变的抗体，
d)从培养物回收含有抗体的组合物的步骤。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其中，步骤b)是选择不含维生素B12的初始培养基和不含维生素B12的补料分批培养基的步骤。
14.根据权利要求12或13所述的制备方法，其中，所述真核细胞是CHO细胞。
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