RU2678142C2 - Способ культивирования клеток млекопитающих и получение полипептидов с использованием композиции клеточной культуры - Google Patents
Способ культивирования клеток млекопитающих и получение полипептидов с использованием композиции клеточной культуры Download PDFInfo
- Publication number
- RU2678142C2 RU2678142C2 RU2014147018A RU2014147018A RU2678142C2 RU 2678142 C2 RU2678142 C2 RU 2678142C2 RU 2014147018 A RU2014147018 A RU 2014147018A RU 2014147018 A RU2014147018 A RU 2014147018A RU 2678142 C2 RU2678142 C2 RU 2678142C2
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- vitamin
- cell culture
- culture medium
- polypeptide
- medium
- Prior art date
Links
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 title claims abstract description 365
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 title claims abstract description 365
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 title claims abstract description 365
- 238000000034 method Methods 0.000 title claims abstract description 199
- 239000000203 mixture Substances 0.000 title claims abstract description 179
- 238000012258 culturing Methods 0.000 title claims abstract description 47
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 title claims abstract description 15
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 title claims description 81
- 239000006143 cell culture medium Substances 0.000 claims abstract description 266
- LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N pyridoxine Chemical compound CC1=NC=C(CO)C(CO)=C1O LXNHXLLTXMVWPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 240
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 claims abstract description 226
- RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Natural products CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O RADKZDMFGJYCBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 129
- 229940011671 vitamin b6 Drugs 0.000 claims abstract description 124
- 235000019164 vitamin B2 Nutrition 0.000 claims abstract description 106
- 239000011716 vitamin B2 Substances 0.000 claims abstract description 106
- 235000019158 vitamin B6 Nutrition 0.000 claims abstract description 104
- 239000011726 vitamin B6 Substances 0.000 claims abstract description 104
- AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N Riboflavin Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-SCRDCRAPSA-N 0.000 claims abstract description 98
- 229960003067 cystine Drugs 0.000 claims abstract description 98
- AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N D-Lyxoflavin Natural products OCC(O)C(O)C(O)CN1C=2C=C(C)C(C)=CC=2N=C2C1=NC(=O)NC2=O AUNGANRZJHBGPY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims abstract description 97
- 229960002477 riboflavin Drugs 0.000 claims abstract description 97
- 229930003471 Vitamin B2 Natural products 0.000 claims abstract description 96
- 235000019163 vitamin B12 Nutrition 0.000 claims abstract description 91
- 239000011715 vitamin B12 Substances 0.000 claims abstract description 91
- 235000019159 vitamin B9 Nutrition 0.000 claims abstract description 90
- 239000011727 vitamin B9 Substances 0.000 claims abstract description 90
- OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N folic acid Chemical compound C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-LBPRGKRZSA-N 0.000 claims abstract description 84
- 229930003779 Vitamin B12 Natural products 0.000 claims abstract description 82
- 229930003761 Vitamin B9 Natural products 0.000 claims abstract description 81
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims abstract description 76
- NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K iron(III) citrate Chemical compound [Fe+3].[O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O NPFOYSMITVOQOS-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims abstract description 72
- 239000007640 basal medium Substances 0.000 claims abstract description 25
- LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N D-cystine Chemical compound OC(=O)[C@H](N)CSSC[C@@H](N)C(O)=O LEVWYRKDKASIDU-QWWZWVQMSA-N 0.000 claims abstract 5
- FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L cobalt(3+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+3].N#[C-].N([C@@H]([C@]1(C)[N-]\C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C(\C)/C1=N/C([C@H]([C@@]1(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=C\C1=N\C([C@H](C1(C)C)CCC(N)=O)=C/1C)[C@@H]2CC(N)=O)=C\1[C@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP([O-])(=O)O[C@H]1[C@@H](O)[C@@H](N2C3=CC(C)=C(C)C=C3N=C2)O[C@@H]1CO FDJOLVPMNUYSCM-WZHZPDAFSA-L 0.000 claims abstract 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 claims description 173
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical compound [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 134
- JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N hydrocortisone Chemical compound O=C1CC[C@]2(C)[C@H]3[C@@H](O)C[C@](C)([C@@](CC4)(O)C(=O)CO)[C@@H]4[C@@H]3CCC2=C1 JYGXADMDTFJGBT-VWUMJDOOSA-N 0.000 claims description 114
- 235000018417 cysteine Nutrition 0.000 claims description 86
- XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N cysteine Natural products SCC(N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 84
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 claims description 67
- 229960000890 hydrocortisone Drugs 0.000 claims description 57
- YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N (+)-Biotin Chemical compound N1C(=O)N[C@@H]2[C@H](CCCCC(=O)O)SC[C@@H]21 YBJHBAHKTGYVGT-ZKWXMUAHSA-N 0.000 claims description 32
- FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L calcium D-pantothenic acid Chemical compound [Ca+2].OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O.OCC(C)(C)[C@@H](O)C(=O)NCCC([O-])=O FAPWYRCQGJNNSJ-UBKPKTQASA-L 0.000 claims description 32
- DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N nicotinic acid amide Natural products NC(=O)C1=CC=CN=C1 DFPAKSUCGFBDDF-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 32
- DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M thiamine hydrochloride Chemical compound Cl.[Cl-].CC1=C(CCO)SC=[N+]1CC1=CN=C(C)N=C1N DPJRMOMPQZCRJU-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N Chick antidermatitis factor Natural products OCC(C)(C)C(O)C(=O)NCCC(O)=O GHOKWGTUZJEAQD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N Niacin Chemical compound OC(=O)C1=CC=CN=C1 PVNIIMVLHYAWGP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229930003451 Vitamin B1 Natural products 0.000 claims description 31
- 229930003537 Vitamin B3 Natural products 0.000 claims description 31
- 229930003571 Vitamin B5 Natural products 0.000 claims description 31
- 229960002079 calcium pantothenate Drugs 0.000 claims description 31
- 229960003512 nicotinic acid Drugs 0.000 claims description 31
- 229960003495 thiamine Drugs 0.000 claims description 31
- 235000010374 vitamin B1 Nutrition 0.000 claims description 31
- 239000011691 vitamin B1 Substances 0.000 claims description 31
- 235000019160 vitamin B3 Nutrition 0.000 claims description 31
- 239000011708 vitamin B3 Substances 0.000 claims description 31
- 235000009492 vitamin B5 Nutrition 0.000 claims description 31
- 239000011675 vitamin B5 Substances 0.000 claims description 31
- 229930003756 Vitamin B7 Natural products 0.000 claims description 30
- 235000011912 vitamin B7 Nutrition 0.000 claims description 30
- 239000011735 vitamin B7 Substances 0.000 claims description 30
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 24
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 24
- 210000000270 basal cell Anatomy 0.000 claims description 17
- 230000010261 cell growth Effects 0.000 claims description 17
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 9
- 102000005789 Vascular Endothelial Growth Factors Human genes 0.000 claims description 8
- 108010019530 Vascular Endothelial Growth Factors Proteins 0.000 claims description 8
- 101001098868 Homo sapiens Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Proteins 0.000 claims 1
- 102000003735 Mesothelin Human genes 0.000 claims 1
- 108090000015 Mesothelin Proteins 0.000 claims 1
- 102100038955 Proprotein convertase subtilisin/kexin type 9 Human genes 0.000 claims 1
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 abstract description 91
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 87
- 229960002413 ferric citrate Drugs 0.000 abstract description 41
- 239000000825 pharmaceutical preparation Substances 0.000 abstract description 31
- 229940127557 pharmaceutical product Drugs 0.000 abstract description 31
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 abstract description 31
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 15
- 238000010254 subcutaneous injection Methods 0.000 abstract description 9
- 239000007929 subcutaneous injection Substances 0.000 abstract description 9
- 230000014616 translation Effects 0.000 abstract description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000306 component Substances 0.000 description 123
- LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N L-cystine Chemical compound [O-]C(=O)[C@@H]([NH3+])CSSC[C@H]([NH3+])C([O-])=O LEVWYRKDKASIDU-IMJSIDKUSA-N 0.000 description 93
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 85
- AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M cobalt(2+);[(2r,3s,4r,5s)-5-(5,6-dimethylbenzimidazol-1-yl)-4-hydroxy-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] [(2r)-1-[3-[(1r,2r,3r,4z,7s,9z,12s,13s,14z,17s,18s,19r)-2,13,18-tris(2-amino-2-oxoethyl)-7,12,17-tris(3-amino-3-oxopropyl)-3,5,8,8,13,15,18,19-octamethyl-2 Chemical compound [Co+2].N#[C-].[N-]([C@@H]1[C@H](CC(N)=O)[C@@]2(C)CCC(=O)NC[C@@H](C)OP(O)(=O)O[C@H]3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)\C2=C(C)/C([C@H](C\2(C)C)CCC(N)=O)=N/C/2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O AGVAZMGAQJOSFJ-WZHZPDAFSA-M 0.000 description 77
- XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N L-Cysteine Chemical compound SC[C@H](N)C(O)=O XUJNEKJLAYXESH-REOHCLBHSA-N 0.000 description 73
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 71
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 67
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 49
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 49
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 49
- BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L iron(2+) sulfate (anhydrous) Chemical compound [Fe+2].[O-]S([O-])(=O)=O BAUYGSIQEAFULO-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 46
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 45
- 230000002378 acidificating effect Effects 0.000 description 40
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 34
- 230000015556 catabolic process Effects 0.000 description 33
- 235000008160 pyridoxine Nutrition 0.000 description 28
- 239000011677 pyridoxine Substances 0.000 description 28
- 229910000358 iron sulfate Inorganic materials 0.000 description 24
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 22
- 239000011790 ferrous sulphate Substances 0.000 description 22
- 235000003891 ferrous sulphate Nutrition 0.000 description 22
- 229910000359 iron(II) sulfate Inorganic materials 0.000 description 22
- -1 color Substances 0.000 description 21
- 239000012533 medium component Substances 0.000 description 19
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 18
- 235000001014 amino acid Nutrition 0.000 description 18
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 18
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 18
- 229960003581 pyridoxal Drugs 0.000 description 17
- 235000008164 pyridoxal Nutrition 0.000 description 17
- 239000011674 pyridoxal Substances 0.000 description 17
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 16
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 15
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 15
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 14
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 14
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 14
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 14
- 230000008569 process Effects 0.000 description 13
- 102100029268 Neurotrophin-3 Human genes 0.000 description 12
- 108090000099 Neurotrophin-4 Proteins 0.000 description 12
- 230000003698 anagen phase Effects 0.000 description 11
- 239000003102 growth factor Substances 0.000 description 11
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 10
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 10
- 102000005962 receptors Human genes 0.000 description 10
- 108020003175 receptors Proteins 0.000 description 10
- 108090000723 Insulin-Like Growth Factor I Proteins 0.000 description 9
- 102000004218 Insulin-Like Growth Factor I Human genes 0.000 description 9
- 108010025020 Nerve Growth Factor Proteins 0.000 description 9
- 125000002181 pyridoxine group Chemical group 0.000 description 9
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 description 8
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 description 8
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 8
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 8
- 239000001888 Peptone Substances 0.000 description 8
- 108010080698 Peptones Proteins 0.000 description 8
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 8
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 8
- 239000012092 media component Substances 0.000 description 8
- 235000019319 peptone Nutrition 0.000 description 8
- 108010063738 Interleukins Proteins 0.000 description 7
- 102000015696 Interleukins Human genes 0.000 description 7
- 108010073929 Vascular Endothelial Growth Factor A Proteins 0.000 description 7
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 7
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 7
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 7
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 7
- 230000001965 increasing effect Effects 0.000 description 7
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 7
- 241000894007 species Species 0.000 description 7
- 230000001502 supplementing effect Effects 0.000 description 7
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 7
- 229940088594 vitamin Drugs 0.000 description 7
- 229930003231 vitamin Natural products 0.000 description 7
- 235000013343 vitamin Nutrition 0.000 description 7
- 239000011782 vitamin Substances 0.000 description 7
- 239000002028 Biomass Substances 0.000 description 6
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 6
- 102000007350 Bone Morphogenetic Proteins Human genes 0.000 description 6
- 108010007726 Bone Morphogenetic Proteins Proteins 0.000 description 6
- 102000007644 Colony-Stimulating Factors Human genes 0.000 description 6
- 108010071942 Colony-Stimulating Factors Proteins 0.000 description 6
- 108010051696 Growth Hormone Proteins 0.000 description 6
- 108090001117 Insulin-Like Growth Factor II Proteins 0.000 description 6
- 102000048143 Insulin-Like Growth Factor II Human genes 0.000 description 6
- 102100025390 Integrin beta-2 Human genes 0.000 description 6
- 108090000742 Neurotrophin 3 Proteins 0.000 description 6
- 102000003683 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 6
- 102100033857 Neurotrophin-4 Human genes 0.000 description 6
- 102100038803 Somatotropin Human genes 0.000 description 6
- 108010000499 Thromboplastin Proteins 0.000 description 6
- 102000002262 Thromboplastin Human genes 0.000 description 6
- 102000003978 Tissue Plasminogen Activator Human genes 0.000 description 6
- 108090000373 Tissue Plasminogen Activator Proteins 0.000 description 6
- 108010009583 Transforming Growth Factors Proteins 0.000 description 6
- 102000009618 Transforming Growth Factors Human genes 0.000 description 6
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 6
- 229940112869 bone morphogenetic protein Drugs 0.000 description 6
- 229940047120 colony stimulating factors Drugs 0.000 description 6
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 6
- 239000000122 growth hormone Substances 0.000 description 6
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 6
- 102000028416 insulin-like growth factor binding Human genes 0.000 description 6
- 108091022911 insulin-like growth factor binding Proteins 0.000 description 6
- 229940047122 interleukins Drugs 0.000 description 6
- 239000003900 neurotrophic factor Substances 0.000 description 6
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 6
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 6
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 6
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 5
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 5
- 101000935040 Homo sapiens Integrin beta-2 Proteins 0.000 description 5
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 5
- 108091007491 NSP3 Papain-like protease domains Proteins 0.000 description 5
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 5
- 239000012930 cell culture fluid Substances 0.000 description 5
- 230000000875 corresponding effect Effects 0.000 description 5
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 5
- 229940072221 immunoglobulins Drugs 0.000 description 5
- 210000003292 kidney cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000012423 maintenance Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 5
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 5
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 5
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 5
- 229960000187 tissue plasminogen activator Drugs 0.000 description 5
- VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N uroanthelone Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)CC)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CS)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(O)=O)C(C)C)[C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1NC=NC=1)NC(=O)[C@H](CCSC)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CS)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CS)NC(=O)CNC(=O)[C@H]1N(CCC1)C(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O)C(C)C)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 VBEQCZHXXJYVRD-GACYYNSASA-N 0.000 description 5
- CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N Ascorbic acid Chemical compound OC[C@H](O)[C@H]1OC(=O)C(O)=C1O CIWBSHSKHKDKBQ-JLAZNSOCSA-N 0.000 description 4
- 102100024222 B-lymphocyte antigen CD19 Human genes 0.000 description 4
- 102000017420 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Human genes 0.000 description 4
- 108050005493 CD3 protein, epsilon/gamma/delta subunit Proteins 0.000 description 4
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 108090000204 Dipeptidase 1 Proteins 0.000 description 4
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 description 4
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 4
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101000980825 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD19 Proteins 0.000 description 4
- 101000716102 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD4 Proteins 0.000 description 4
- 101000946843 Homo sapiens T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Proteins 0.000 description 4
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 4
- 102000006992 Interferon-alpha Human genes 0.000 description 4
- 108010047761 Interferon-alpha Proteins 0.000 description 4
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 4
- 101800004937 Protein C Proteins 0.000 description 4
- 102400000827 Saposin-D Human genes 0.000 description 4
- 101800001700 Saposin-D Proteins 0.000 description 4
- 102000007562 Serum Albumin Human genes 0.000 description 4
- 108010071390 Serum Albumin Proteins 0.000 description 4
- 102100036011 T-cell surface glycoprotein CD4 Human genes 0.000 description 4
- 102100034922 T-cell surface glycoprotein CD8 alpha chain Human genes 0.000 description 4
- 210000001744 T-lymphocyte Anatomy 0.000 description 4
- IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N Thymidine Chemical compound O=C1NC(=O)C(C)=CN1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-XLPZGREQSA-N 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N adenosine Chemical compound C1=NC=2C(N)=NC=NC=2N1[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H]1O OIRDTQYFTABQOQ-KQYNXXCUSA-N 0.000 description 4
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 4
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 4
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 4
- 102000006635 beta-lactamase Human genes 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 4
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 4
- 238000005534 hematocrit Methods 0.000 description 4
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 4
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 description 4
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 4
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 4
- 229960000856 protein c Drugs 0.000 description 4
- 239000003642 reactive oxygen metabolite Substances 0.000 description 4
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 4
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 4
- 239000011573 trace mineral Substances 0.000 description 4
- 235000013619 trace mineral Nutrition 0.000 description 4
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 4
- 108010059616 Activins Proteins 0.000 description 3
- 102000005606 Activins Human genes 0.000 description 3
- 101800001288 Atrial natriuretic factor Proteins 0.000 description 3
- 102400001282 Atrial natriuretic peptide Human genes 0.000 description 3
- 101800001890 Atrial natriuretic peptide Proteins 0.000 description 3
- 102100022005 B-lymphocyte antigen CD20 Human genes 0.000 description 3
- WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N Benzyl alcohol Chemical compound OCC1=CC=CC=C1 WVDDGKGOMKODPV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 102000013585 Bombesin Human genes 0.000 description 3
- 108010051479 Bombesin Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010021064 CTLA-4 Antigen Proteins 0.000 description 3
- 229940045513 CTLA4 antagonist Drugs 0.000 description 3
- 102000055006 Calcitonin Human genes 0.000 description 3
- 108060001064 Calcitonin Proteins 0.000 description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108050007758 Caldesmon Proteins 0.000 description 3
- 102000014914 Carrier Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010078791 Carrier Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000016938 Catalase Human genes 0.000 description 3
- 108010053835 Catalase Proteins 0.000 description 3
- 241000282693 Cercopithecidae Species 0.000 description 3
- 102000001327 Chemokine CCL5 Human genes 0.000 description 3
- 108010055166 Chemokine CCL5 Proteins 0.000 description 3
- 102000019034 Chemokines Human genes 0.000 description 3
- 108010012236 Chemokines Proteins 0.000 description 3
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 description 3
- 102100039498 Cytotoxic T-lymphocyte protein 4 Human genes 0.000 description 3
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 3
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 3
- 102000003951 Erythropoietin Human genes 0.000 description 3
- 108090000394 Erythropoietin Proteins 0.000 description 3
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 description 3
- 108010054218 Factor VIII Proteins 0.000 description 3
- 102000001690 Factor VIII Human genes 0.000 description 3
- 102000018233 Fibroblast Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108050007372 Fibroblast Growth Factor Proteins 0.000 description 3
- 108090000386 Fibroblast Growth Factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 102100031706 Fibroblast growth factor 1 Human genes 0.000 description 3
- 102100024785 Fibroblast growth factor 2 Human genes 0.000 description 3
- 108090000379 Fibroblast growth factor 2 Proteins 0.000 description 3
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 3
- 102400000321 Glucagon Human genes 0.000 description 3
- 108060003199 Glucagon Proteins 0.000 description 3
- 102000006771 Gonadotropins Human genes 0.000 description 3
- 108010086677 Gonadotropins Proteins 0.000 description 3
- 108010017080 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000004269 Granulocyte Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102100039620 Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Human genes 0.000 description 3
- 239000000095 Growth Hormone-Releasing Hormone Substances 0.000 description 3
- 101000897405 Homo sapiens B-lymphocyte antigen CD20 Proteins 0.000 description 3
- 101001046686 Homo sapiens Integrin alpha-M Proteins 0.000 description 3
- 101001012157 Homo sapiens Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Proteins 0.000 description 3
- 102000002265 Human Growth Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010000521 Human Growth Hormone Proteins 0.000 description 3
- 239000000854 Human Growth Hormone Substances 0.000 description 3
- 102000008100 Human Serum Albumin Human genes 0.000 description 3
- 108091006905 Human Serum Albumin Proteins 0.000 description 3
- 241000725303 Human immunodeficiency virus Species 0.000 description 3
- 102100022338 Integrin alpha-M Human genes 0.000 description 3
- 108010008212 Integrin alpha4beta1 Proteins 0.000 description 3
- 102000003996 Interferon-beta Human genes 0.000 description 3
- 108090000467 Interferon-beta Proteins 0.000 description 3
- 102000008070 Interferon-gamma Human genes 0.000 description 3
- 108010074328 Interferon-gamma Proteins 0.000 description 3
- 102000014150 Interferons Human genes 0.000 description 3
- 108010050904 Interferons Proteins 0.000 description 3
- 108010002386 Interleukin-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100039064 Interleukin-3 Human genes 0.000 description 3
- 108090001030 Lipoproteins Proteins 0.000 description 3
- 102000004895 Lipoproteins Human genes 0.000 description 3
- 102000009151 Luteinizing Hormone Human genes 0.000 description 3
- 108010073521 Luteinizing Hormone Proteins 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- 108010046938 Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000007651 Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 3
- 102000009571 Macrophage Inflammatory Proteins Human genes 0.000 description 3
- 108010009474 Macrophage Inflammatory Proteins Proteins 0.000 description 3
- FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N Magnesium Chemical compound [Mg] FYYHWMGAXLPEAU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010052285 Membrane Proteins Proteins 0.000 description 3
- 101710151805 Mitochondrial intermediate peptidase 1 Proteins 0.000 description 3
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 3
- 108090000028 Neprilysin Proteins 0.000 description 3
- 102000003729 Neprilysin Human genes 0.000 description 3
- 102000015336 Nerve Growth Factor Human genes 0.000 description 3
- 108090000095 Neurotrophin-6 Proteins 0.000 description 3
- 102000003982 Parathyroid hormone Human genes 0.000 description 3
- 108090000445 Parathyroid hormone Proteins 0.000 description 3
- 108010076181 Proinsulin Proteins 0.000 description 3
- 102100030086 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-2 Human genes 0.000 description 3
- 102100029986 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Human genes 0.000 description 3
- 101710100969 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-3 Proteins 0.000 description 3
- 102100029981 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Human genes 0.000 description 3
- 101710100963 Receptor tyrosine-protein kinase erbB-4 Proteins 0.000 description 3
- 102400000834 Relaxin A chain Human genes 0.000 description 3
- 101800000074 Relaxin A chain Proteins 0.000 description 3
- 102400000610 Relaxin B chain Human genes 0.000 description 3
- 101710109558 Relaxin B chain Proteins 0.000 description 3
- 108090000783 Renin Proteins 0.000 description 3
- 102100028255 Renin Human genes 0.000 description 3
- 102100022831 Somatoliberin Human genes 0.000 description 3
- 101710142969 Somatoliberin Proteins 0.000 description 3
- 102000019197 Superoxide Dismutase Human genes 0.000 description 3
- 108010012715 Superoxide dismutase Proteins 0.000 description 3
- 108091008874 T cell receptors Proteins 0.000 description 3
- 102000016266 T-Cell Antigen Receptors Human genes 0.000 description 3
- 108090000190 Thrombin Proteins 0.000 description 3
- 102000011923 Thyrotropin Human genes 0.000 description 3
- 108010061174 Thyrotropin Proteins 0.000 description 3
- 102000004887 Transforming Growth Factor beta Human genes 0.000 description 3
- 108090001012 Transforming Growth Factor beta Proteins 0.000 description 3
- 102000046299 Transforming Growth Factor beta1 Human genes 0.000 description 3
- 102000011117 Transforming Growth Factor beta2 Human genes 0.000 description 3
- 102400001320 Transforming growth factor alpha Human genes 0.000 description 3
- 101800004564 Transforming growth factor alpha Proteins 0.000 description 3
- 101800002279 Transforming growth factor beta-1 Proteins 0.000 description 3
- 101800000304 Transforming growth factor beta-2 Proteins 0.000 description 3
- 108090000097 Transforming growth factor beta-3 Proteins 0.000 description 3
- 102000056172 Transforming growth factor beta-3 Human genes 0.000 description 3
- 108060008682 Tumor Necrosis Factor Proteins 0.000 description 3
- 102000003990 Urokinase-type plasminogen activator Human genes 0.000 description 3
- 108090000435 Urokinase-type plasminogen activator Proteins 0.000 description 3
- 238000010521 absorption reaction Methods 0.000 description 3
- 230000001133 acceleration Effects 0.000 description 3
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 3
- 239000000488 activin Substances 0.000 description 3
- 102000015395 alpha 1-Antitrypsin Human genes 0.000 description 3
- 108010050122 alpha 1-Antitrypsin Proteins 0.000 description 3
- 229940024142 alpha 1-antitrypsin Drugs 0.000 description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000002585 base Substances 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 239000011230 binding agent Substances 0.000 description 3
- DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N bombesin Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CC=1NC2=CC=CC=C2C=1)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H]1NC(=O)CC1)C(C)C)C1=CN=CN1 DNDCVAGJPBKION-DOPDSADYSA-N 0.000 description 3
- 210000000988 bone and bone Anatomy 0.000 description 3
- 229960004015 calcitonin Drugs 0.000 description 3
- BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N calcitonin Chemical compound N([C@H](C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(N)=O)C(C)C)C(=O)[C@@H]1CSSC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N1 BBBFJLBPOGFECG-VJVYQDLKSA-N 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 3
- NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N carperitide Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(NCC(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CSSC[C@@H](C(=O)N1)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CO)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)C(O)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=CC=C1 NSQLIUXCMFBZME-MPVJKSABSA-N 0.000 description 3
- 230000002490 cerebral effect Effects 0.000 description 3
- 239000003086 colorant Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- 108700001680 des-(1-3)- insulin-like growth factor 1 Proteins 0.000 description 3
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 3
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 3
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 3
- 239000013583 drug formulation Substances 0.000 description 3
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 3
- 229940105423 erythropoietin Drugs 0.000 description 3
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 description 3
- 229940126864 fibroblast growth factor Drugs 0.000 description 3
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000006870 function Effects 0.000 description 3
- 229940044627 gamma-interferon Drugs 0.000 description 3
- 102000034356 gene-regulatory proteins Human genes 0.000 description 3
- 108091006104 gene-regulatory proteins Proteins 0.000 description 3
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 3
- MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N glucagon Chemical compound C([C@@H](C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC=1C2=CC=CC=C2NC=1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(O)=O)C(C)C)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CC=1C=CC(O)=CC=1)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC=1C=CC=CC=1)NC(=O)[C@@H](NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@@H](N)CC=1NC=NC=1)[C@@H](C)O)[C@@H](C)O)C1=CC=CC=C1 MASNOZXLGMXCHN-ZLPAWPGGSA-N 0.000 description 3
- 229960004666 glucagon Drugs 0.000 description 3
- 230000013595 glycosylation Effects 0.000 description 3
- 238000006206 glycosylation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000002622 gonadotropin Substances 0.000 description 3
- 230000036541 health Effects 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 239000002596 immunotoxin Substances 0.000 description 3
- 230000002637 immunotoxin Effects 0.000 description 3
- 229940051026 immunotoxin Drugs 0.000 description 3
- 231100000608 immunotoxin Toxicity 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 239000000893 inhibin Substances 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 3
- 102000006495 integrins Human genes 0.000 description 3
- 108010044426 integrins Proteins 0.000 description 3
- 229940079322 interferon Drugs 0.000 description 3
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 3
- MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N iron(2+);dinitrate Chemical compound [Fe+2].[O-][N+]([O-])=O.[O-][N+]([O-])=O MVFCKEFYUDZOCX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 3
- 210000004072 lung Anatomy 0.000 description 3
- 229940040129 luteinizing hormone Drugs 0.000 description 3
- 239000011777 magnesium Substances 0.000 description 3
- 229910052749 magnesium Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000463 material Substances 0.000 description 3
- 230000000813 microbial effect Effects 0.000 description 3
- 229940053128 nerve growth factor Drugs 0.000 description 3
- 229940032018 neurotrophin 3 Drugs 0.000 description 3
- 239000002777 nucleoside Substances 0.000 description 3
- 125000003835 nucleoside group Chemical group 0.000 description 3
- 230000010494 opalescence Effects 0.000 description 3
- 230000002138 osteoinductive effect Effects 0.000 description 3
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 3
- 239000000199 parathyroid hormone Substances 0.000 description 3
- 229960001319 parathyroid hormone Drugs 0.000 description 3
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 3
- OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N potassium;[2-butyl-5-chloro-3-[[4-[2-(1,2,4-triaza-3-azanidacyclopenta-1,4-dien-5-yl)phenyl]phenyl]methyl]imidazol-4-yl]methanol Chemical compound [K+].CCCCC1=NC(Cl)=C(CO)N1CC1=CC=C(C=2C(=CC=CC=2)C2=N[N-]N=N2)C=C1 OXCMYAYHXIHQOA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010087851 prorelaxin Proteins 0.000 description 3
- 239000011253 protective coating Substances 0.000 description 3
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 3
- ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N tgfbeta Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](C(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H]([C@@H](C)O)NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)CNC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCC(N)=O)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@@H](NC(=O)[C@H](CC(C)C)NC(=O)[C@@H](N)CCSC)C(C)C)[C@@H](C)CC)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](C(C)C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC=1C=CC=CC=1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CO)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O)C1=CC=C(O)C=C1 ZRKFYGHZFMAOKI-QMGMOQQFSA-N 0.000 description 3
- 229960004072 thrombin Drugs 0.000 description 3
- 108010042974 transforming growth factor beta4 Proteins 0.000 description 3
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 3
- 229960005356 urokinase Drugs 0.000 description 3
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 3
- 235000019156 vitamin B Nutrition 0.000 description 3
- 239000011720 vitamin B Substances 0.000 description 3
- 150000003722 vitamin derivatives Chemical class 0.000 description 3
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 2-[4-(2-hydroxyethyl)piperazin-1-yl]ethanesulfonic acid Chemical compound OCC[NH+]1CCN(CCS([O-])(=O)=O)CC1 JKMHFZQWWAIEOD-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000004475 Arginine Substances 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N Asparagine Natural products OC(=O)C(N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N Beta-D-1-Arabinofuranosylthymine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1C(O)C(O)C(CO)O1 DWRXFEITVBNRMK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000002126 C01EB10 - Adenosine Substances 0.000 description 2
- 101150013553 CD40 gene Proteins 0.000 description 2
- 241000699802 Cricetulus griseus Species 0.000 description 2
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 102000001301 EGF receptor Human genes 0.000 description 2
- 108060006698 EGF receptor Proteins 0.000 description 2
- 102400001368 Epidermal growth factor Human genes 0.000 description 2
- 101800003838 Epidermal growth factor Proteins 0.000 description 2
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 2
- 239000007995 HEPES buffer Substances 0.000 description 2
- 102100031547 HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Human genes 0.000 description 2
- 101000866278 Homo sapiens HLA class II histocompatibility antigen, DO alpha chain Proteins 0.000 description 2
- 241000701044 Human gammaherpesvirus 4 Species 0.000 description 2
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010054477 Immunoglobulin Fab Fragments Proteins 0.000 description 2
- 102000001706 Immunoglobulin Fab Fragments Human genes 0.000 description 2
- 238000012404 In vitro experiment Methods 0.000 description 2
- 102100022297 Integrin alpha-X Human genes 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P L-argininium(2+) Chemical compound NC(=[NH2+])NCCC[C@H]([NH3+])C(O)=O ODKSFYDXXFIFQN-BYPYZUCNSA-P 0.000 description 2
- DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N L-asparagine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC(N)=O DCXYFEDJOCDNAF-REOHCLBHSA-N 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N L-glutamine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-VKHMYHEASA-N 0.000 description 2
- 101100335081 Mus musculus Flt3 gene Proteins 0.000 description 2
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 description 2
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Natural products OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 2
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 2
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 102000004338 Transferrin Human genes 0.000 description 2
- 108090000901 Transferrin Proteins 0.000 description 2
- 102100040245 Tumor necrosis factor receptor superfamily member 5 Human genes 0.000 description 2
- 241000251539 Vertebrata <Metazoa> Species 0.000 description 2
- 229930003270 Vitamin B Natural products 0.000 description 2
- 238000000862 absorption spectrum Methods 0.000 description 2
- 239000012190 activator Substances 0.000 description 2
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 2
- 229960005305 adenosine Drugs 0.000 description 2
- 230000009435 amidation Effects 0.000 description 2
- 238000007112 amidation reaction Methods 0.000 description 2
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 2
- 235000021120 animal protein Nutrition 0.000 description 2
- ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N arginine Natural products OC(=O)C(N)CCCNC(N)=N ODKSFYDXXFIFQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 235000010323 ascorbic acid Nutrition 0.000 description 2
- 229960005070 ascorbic acid Drugs 0.000 description 2
- 239000011668 ascorbic acid Substances 0.000 description 2
- 229960001230 asparagine Drugs 0.000 description 2
- 235000009582 asparagine Nutrition 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 2
- IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N beta-L-thymidine Natural products O=C1NC(=O)C(C)=CN1C1OC(CO)C(O)C1 IQFYYKKMVGJFEH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000013368 capillary electrophoresis sodium dodecyl sulfate analysis Methods 0.000 description 2
- YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N catechol Chemical compound OC1=CC=CC=C1O YCIMNLLNPGFGHC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000003729 cation exchange resin Substances 0.000 description 2
- 230000003833 cell viability Effects 0.000 description 2
- 230000008859 change Effects 0.000 description 2
- 230000021615 conjugation Effects 0.000 description 2
- RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M cyanocobalamin Chemical compound N#C[Co+]N([C@]1([H])[C@H](CC(N)=O)[C@]\2(CCC(=O)NC[C@H](C)OP(O)(=O)OC3[C@H]([C@H](O[C@@H]3CO)N3C4=CC(C)=C(C)C=C4N=C3)O)C)C/2=C(C)\C([C@H](C/2(C)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C\C([C@H]([C@@]/2(CC(N)=O)C)CCC(N)=O)=N\C\2=C(C)/C2=N[C@]1(C)[C@@](C)(CC(N)=O)[C@@H]2CCC(N)=O RMRCNWBMXRMIRW-BYFNXCQMSA-M 0.000 description 2
- 125000000151 cysteine group Chemical group N[C@@H](CS)C(=O)* 0.000 description 2
- 150000001945 cysteines Chemical class 0.000 description 2
- 210000001151 cytotoxic T lymphocyte Anatomy 0.000 description 2
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 2
- 208000035475 disorder Diseases 0.000 description 2
- 230000007613 environmental effect Effects 0.000 description 2
- 239000003344 environmental pollutant Substances 0.000 description 2
- 229940116977 epidermal growth factor Drugs 0.000 description 2
- 235000013305 food Nutrition 0.000 description 2
- ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N glutamine Natural products OC(=O)C(N)CCC(N)=O ZDXPYRJPNDTMRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N histidine Natural products OC(=O)C(N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004191 hydrophobic interaction chromatography Methods 0.000 description 2
- 230000000977 initiatory effect Effects 0.000 description 2
- 150000002484 inorganic compounds Chemical class 0.000 description 2
- 229910010272 inorganic material Inorganic materials 0.000 description 2
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 2
- 210000005229 liver cell Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 2
- LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N methylparaben Chemical compound COC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 LXCFILQKKLGQFO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 description 2
- 230000010412 perfusion Effects 0.000 description 2
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 2
- 231100000719 pollutant Toxicity 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 2
- QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N propylparaben Chemical compound CCCOC(=O)C1=CC=C(O)C=C1 QELSKZZBTMNZEB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N pyridoxal hydrochloride Chemical compound Cl.CC1=NC=C(CO)C(C=O)=C1O FCHXJFJNDJXENQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000004451 qualitative analysis Methods 0.000 description 2
- GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N resorcinol Chemical compound OC1=CC=CC(O)=C1 GHMLBKRAJCXXBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229920002477 rna polymer Polymers 0.000 description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 2
- 229940104230 thymidine Drugs 0.000 description 2
- 239000012581 transferrin Substances 0.000 description 2
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 2
- 102000003390 tumor necrosis factor Human genes 0.000 description 2
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 2
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 2
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 2
- 238000011179 visual inspection Methods 0.000 description 2
- 239000011701 zinc Substances 0.000 description 2
- HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N α-D-glucopyranosyl-α-D-glucopyranoside Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OC1C(O)C(O)C(O)C(CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 1,4-bis(2-ethylhexyl) sulfosuccinate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)CC(S(O)(=O)=O)C(=O)OCC(CC)CCCC HNSDLXPSAYFUHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 2-diethylaminoethanol Chemical compound CCN(CC)CCO BFSVOASYOCHEOV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SAERAINFZWAKGQ-UHFFFAOYSA-N 2-methylbenzenesulfonyl fluoride Chemical compound CC1=CC=CC=C1S(F)(=O)=O SAERAINFZWAKGQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 3-[3-[3,5-dihydroxy-6-methyl-4-(3,4,5-trihydroxy-6-methyloxan-2-yl)oxyoxan-2-yl]oxydecanoyloxy]decanoic acid;hydrate Chemical compound O.OC1C(OC(CC(=O)OC(CCCCCCC)CC(O)=O)CCCCCCC)OC(C)C(O)C1OC1C(O)C(O)C(O)C(C)O1 HVCOBJNICQPDBP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 1
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 1
- ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N Boron Chemical compound [B] ZOXJGFHDIHLPTG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010006187 Breast cancer Diseases 0.000 description 1
- 208000026310 Breast neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 101100289995 Caenorhabditis elegans mac-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282836 Camelus dromedarius Species 0.000 description 1
- 241000282465 Canis Species 0.000 description 1
- 108010067225 Cell Adhesion Molecules Proteins 0.000 description 1
- 102000016289 Cell Adhesion Molecules Human genes 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 241000282552 Chlorocebus aethiops Species 0.000 description 1
- 241000251730 Chondrichthyes Species 0.000 description 1
- 102000011413 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Human genes 0.000 description 1
- 108010023736 Chondroitinases and Chondroitin Lyases Proteins 0.000 description 1
- 108010047041 Complementarity Determining Regions Proteins 0.000 description 1
- RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N Copper Chemical compound [Cu] RYGMFSIKBFXOCR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000699800 Cricetinae Species 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N D-Glucitol Natural products OC[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-FSIIMWSLSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N D-Mannitol Chemical compound OC[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-KVTDHHQDSA-N 0.000 description 1
- FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N D-glucitol Chemical compound OC[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O)CO FBPFZTCFMRRESA-JGWLITMVSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N D-mannopyranose Chemical compound OC[C@H]1OC(O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-QTVWNMPRSA-N 0.000 description 1
- 238000012270 DNA recombination Methods 0.000 description 1
- 102000004163 DNA-directed RNA polymerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000626 DNA-directed RNA polymerases Proteins 0.000 description 1
- 239000004375 Dextrin Substances 0.000 description 1
- 229920001353 Dextrin Polymers 0.000 description 1
- BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N Dihydrogen disulfide Chemical compound SS BWGNESOTFCXPMA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 101001065501 Escherichia phage MS2 Lysis protein Proteins 0.000 description 1
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 1
- 229930186217 Glycolipid Natural products 0.000 description 1
- 102100031573 Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Human genes 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- 101000777663 Homo sapiens Hematopoietic progenitor cell antigen CD34 Proteins 0.000 description 1
- 101001041117 Homo sapiens Hyaluronidase PH-20 Proteins 0.000 description 1
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 1
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010003272 Hyaluronate lyase Proteins 0.000 description 1
- 102000001974 Hyaluronidases Human genes 0.000 description 1
- 108010067060 Immunoglobulin Variable Region Proteins 0.000 description 1
- 102000017727 Immunoglobulin Variable Region Human genes 0.000 description 1
- 102100032818 Integrin alpha-4 Human genes 0.000 description 1
- 102100022337 Integrin alpha-V Human genes 0.000 description 1
- 108010041012 Integrin alpha4 Proteins 0.000 description 1
- 108010040765 Integrin alphaV Proteins 0.000 description 1
- 102100033016 Integrin beta-7 Human genes 0.000 description 1
- 102000008607 Integrin beta3 Human genes 0.000 description 1
- 108010020950 Integrin beta3 Proteins 0.000 description 1
- 108010064593 Intercellular Adhesion Molecule-1 Proteins 0.000 description 1
- 102100037877 Intercellular adhesion molecule 1 Human genes 0.000 description 1
- 108010002352 Interleukin-1 Proteins 0.000 description 1
- 108090001007 Interleukin-8 Proteins 0.000 description 1
- QIJRTFXNRTXDIP-JIZZDEOASA-N L-cysteine hydrochloride hydrate Chemical compound O.Cl.SC[C@H](N)C(O)=O QIJRTFXNRTXDIP-JIZZDEOASA-N 0.000 description 1
- HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N L-histidine Chemical compound OC(=O)[C@@H](N)CC1=CN=CN1 HNDVDQJCIGZPNO-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N L-lysine Chemical compound NCCCC[C@H](N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N L-methionine Chemical compound CSCC[C@H](N)C(O)=O FFEARJCKVFRZRR-BYPYZUCNSA-N 0.000 description 1
- 108010064548 Lymphocyte Function-Associated Antigen-1 Proteins 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 229930195725 Mannitol Natural products 0.000 description 1
- 108010085220 Multiprotein Complexes Proteins 0.000 description 1
- 102000007474 Multiprotein Complexes Human genes 0.000 description 1
- 101000822667 Mus musculus Something about silencing protein 10 Proteins 0.000 description 1
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 1
- OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N N-Pteroyl-L-glutaminsaeure Natural products C=1N=C2NC(N)=NC(=O)C2=NC=1CNC1=CC=C(C(=O)NC(CCC(O)=O)C(O)=O)C=C1 OVBPIULPVIDEAO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000005348 Neuraminidase Human genes 0.000 description 1
- 108010006232 Neuraminidase Proteins 0.000 description 1
- 208000008589 Obesity Diseases 0.000 description 1
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 1
- 206010033101 Otorrhoea Diseases 0.000 description 1
- 206010033128 Ovarian cancer Diseases 0.000 description 1
- 206010061535 Ovarian neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 108090000526 Papain Proteins 0.000 description 1
- 108090000284 Pepsin A Proteins 0.000 description 1
- 102000057297 Pepsin A Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- 241000276498 Pollachius virens Species 0.000 description 1
- 239000004365 Protease Substances 0.000 description 1
- 229940124158 Protease/peptidase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000012980 RPMI-1640 medium Substances 0.000 description 1
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108091028664 Ribonucleotide Proteins 0.000 description 1
- 241000283984 Rodentia Species 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 1
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 1
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N Trehalose Natural products O[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-WSWWMNSNSA-N 0.000 description 1
- 102000000852 Tumor Necrosis Factor-alpha Human genes 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 244000000188 Vaccinium ovalifolium Species 0.000 description 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 1
- 239000005862 Whey Substances 0.000 description 1
- 102000007544 Whey Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 1
- HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N Zinc Chemical compound [Zn] HCHKCACWOHOZIP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000008351 acetate buffer Substances 0.000 description 1
- 230000021736 acetylation Effects 0.000 description 1
- 238000006640 acetylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 description 1
- HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N alpha,alpha-trehalose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 HDTRYLNUVZCQOY-LIZSDCNHSA-N 0.000 description 1
- 238000012870 ammonium sulfate precipitation Methods 0.000 description 1
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 235000006708 antioxidants Nutrition 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 229960000686 benzalkonium chloride Drugs 0.000 description 1
- 229960001950 benzethonium chloride Drugs 0.000 description 1
- UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M benzethonium chloride Chemical compound [Cl-].C1=CC(C(C)(C)CC(C)(C)C)=CC=C1OCCOCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 UREZNYTWGJKWBI-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 235000019445 benzyl alcohol Nutrition 0.000 description 1
- CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N benzyl(dimethyl)azanium;chloride Chemical compound [Cl-].C[NH+](C)CC1=CC=CC=C1 CADWTSSKOVRVJC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N beta-N-Acetyl-D-neuraminic acid Natural products CC(=O)NC1C(O)CC(O)(C(O)=O)OC1C(O)C(O)CO SQVRNKJHWKZAKO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 229960002685 biotin Drugs 0.000 description 1
- 235000020958 biotin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011616 biotin Substances 0.000 description 1
- HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H bis[(2-oxo-1,3,2$l^{5},4$l^{2}-dioxaphosphaplumbetan-2-yl)oxy]lead Chemical compound [Pb+2].[Pb+2].[Pb+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O HUTDDBSSHVOYJR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 1
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 1
- 229910052796 boron Inorganic materials 0.000 description 1
- LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N butyl alcohol Substances CCCCO LRHPLDYGYMQRHN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000484 butyl group Chemical group [H]C([*])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])[H] 0.000 description 1
- 239000001506 calcium phosphate Substances 0.000 description 1
- 229910000389 calcium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011010 calcium phosphates Nutrition 0.000 description 1
- 238000004364 calculation method Methods 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 125000003178 carboxy group Chemical group [H]OC(*)=O 0.000 description 1
- 150000007942 carboxylates Chemical group 0.000 description 1
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000012534 cell culture medium component Substances 0.000 description 1
- 230000022131 cell cycle Effects 0.000 description 1
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 239000002738 chelating agent Substances 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 1
- 238000011098 chromatofocusing Methods 0.000 description 1
- 239000012568 clinical material Substances 0.000 description 1
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 229910052802 copper Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000010949 copper Substances 0.000 description 1
- 210000004748 cultured cell Anatomy 0.000 description 1
- 235000000639 cyanocobalamin Nutrition 0.000 description 1
- 239000011666 cyanocobalamin Substances 0.000 description 1
- 229960002104 cyanocobalamin Drugs 0.000 description 1
- HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N cyclohexanol Chemical compound OC1CCCCC1 HPXRVTGHNJAIIH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000433 cytotoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006240 deamidation Effects 0.000 description 1
- 239000005547 deoxyribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002637 deoxyribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 230000018109 developmental process Effects 0.000 description 1
- 235000019425 dextrin Nutrition 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 150000002016 disaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 1
- 230000002900 effect on cell Effects 0.000 description 1
- 230000001516 effect on protein Effects 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 238000005538 encapsulation Methods 0.000 description 1
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 1
- 229940088598 enzyme Drugs 0.000 description 1
- 239000003797 essential amino acid Substances 0.000 description 1
- 235000020776 essential amino acid Nutrition 0.000 description 1
- 238000012869 ethanol precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000005284 excitation Effects 0.000 description 1
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 description 1
- 238000002270 exclusion chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 1
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 1
- 230000002349 favourable effect Effects 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000000945 filler Substances 0.000 description 1
- 239000013020 final formulation Substances 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 235000019152 folic acid Nutrition 0.000 description 1
- 239000011724 folic acid Substances 0.000 description 1
- 229960000304 folic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000005194 fractionation Methods 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 125000000524 functional group Chemical group 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 1
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 1
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 1
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 1
- 238000002523 gelfiltration Methods 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 230000036252 glycation Effects 0.000 description 1
- 229940093915 gynecological organic acid Drugs 0.000 description 1
- 238000003306 harvesting Methods 0.000 description 1
- 206010073071 hepatocellular carcinoma Diseases 0.000 description 1
- VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N hexamethylenetetramine Chemical compound C1N(C2)CN3CN1CN2C3 VKYKSIONXSXAKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002773 hyaluronidase Drugs 0.000 description 1
- 210000004754 hybrid cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 229920001477 hydrophilic polymer Polymers 0.000 description 1
- 229940044700 hylenex Drugs 0.000 description 1
- 210000002865 immune cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000012642 immune effector Substances 0.000 description 1
- 229940121354 immunomodulator Drugs 0.000 description 1
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000036512 infertility Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 239000002054 inoculum Substances 0.000 description 1
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 1
- 108010021315 integrin beta7 Proteins 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000001361 intraarterial administration Methods 0.000 description 1
- 238000007918 intramuscular administration Methods 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H iron(3+) sulfate Chemical compound [Fe+3].[Fe+3].[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O.[O-]S([O-])(=O)=O RUTXIHLAWFEWGM-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 229910000360 iron(III) sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 1
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000005265 lung cell Anatomy 0.000 description 1
- 210000001165 lymph node Anatomy 0.000 description 1
- 210000004698 lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 239000000594 mannitol Substances 0.000 description 1
- 235000010355 mannitol Nutrition 0.000 description 1
- 238000013507 mapping Methods 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000002184 metal Substances 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 229930182817 methionine Natural products 0.000 description 1
- 235000010270 methyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004292 methyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960002216 methylparaben Drugs 0.000 description 1
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 239000011785 micronutrient Substances 0.000 description 1
- 235000013369 micronutrients Nutrition 0.000 description 1
- 150000002772 monosaccharides Chemical class 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 210000003739 neck Anatomy 0.000 description 1
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000005152 nicotinamide Nutrition 0.000 description 1
- 229960003966 nicotinamide Drugs 0.000 description 1
- 239000011570 nicotinamide Substances 0.000 description 1
- 239000002736 nonionic surfactant Substances 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010606 normalization Methods 0.000 description 1
- 238000010899 nucleation Methods 0.000 description 1
- 235000020824 obesity Nutrition 0.000 description 1
- 150000007524 organic acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000005985 organic acids Nutrition 0.000 description 1
- 230000003204 osmotic effect Effects 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 229940055729 papain Drugs 0.000 description 1
- 235000019834 papain Nutrition 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 229940111202 pepsin Drugs 0.000 description 1
- 239000000137 peptide hydrolase inhibitor Substances 0.000 description 1
- 230000000737 periodic effect Effects 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 230000026731 phosphorylation Effects 0.000 description 1
- 238000006366 phosphorylation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 1
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 1
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 1
- 239000001267 polyvinylpyrrolidone Substances 0.000 description 1
- 229920000036 polyvinylpyrrolidone Polymers 0.000 description 1
- 235000013855 polyvinylpyrrolidone Nutrition 0.000 description 1
- 239000003755 preservative agent Substances 0.000 description 1
- 235000010232 propyl p-hydroxybenzoate Nutrition 0.000 description 1
- 239000004405 propyl p-hydroxybenzoate Substances 0.000 description 1
- 229960003415 propylparaben Drugs 0.000 description 1
- 230000017854 proteolysis Effects 0.000 description 1
- 235000019171 pyridoxine hydrochloride Nutrition 0.000 description 1
- 239000011764 pyridoxine hydrochloride Substances 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000005855 radiation Effects 0.000 description 1
- 230000002285 radioactive effect Effects 0.000 description 1
- 238000004007 reversed phase HPLC Methods 0.000 description 1
- 235000019192 riboflavin Nutrition 0.000 description 1
- 239000002151 riboflavin Substances 0.000 description 1
- 239000002336 ribonucleotide Substances 0.000 description 1
- 125000002652 ribonucleotide group Chemical group 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000000717 sertoli cell Anatomy 0.000 description 1
- SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N sialic acid Chemical compound CC(=O)N[C@@H]1[C@@H](O)C[C@@](O)(C(O)=O)OC1[C@H](O)[C@H](O)CO SQVRNKJHWKZAKO-OQPLDHBCSA-N 0.000 description 1
- 230000009450 sialylation Effects 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- BWAUQTFFVCLSOS-UHFFFAOYSA-N sodiosodium hydrate Chemical class O.[Na].[Na] BWAUQTFFVCLSOS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000600 sorbitol Substances 0.000 description 1
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 1
- 210000004989 spleen cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 description 1
- SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M stearalkonium chloride Chemical compound [Cl-].CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)CC1=CC=CC=C1 SFVFIFLLYFPGHH-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- JDVPQXZIJDEHAN-UHFFFAOYSA-N succinamic acid Chemical compound NC(=O)CCC(O)=O JDVPQXZIJDEHAN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 125000003396 thiol group Chemical group [H]S* 0.000 description 1
- 230000000699 topical effect Effects 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 229910052723 transition metal Inorganic materials 0.000 description 1
- 150000003624 transition metals Chemical class 0.000 description 1
- QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H tricalcium bis(phosphate) Chemical compound [Ca+2].[Ca+2].[Ca+2].[O-]P([O-])([O-])=O.[O-]P([O-])([O-])=O QORWJWZARLRLPR-UHFFFAOYSA-H 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 238000013060 ultrafiltration and diafiltration Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 239000012608 weak cation exchange resin Substances 0.000 description 1
- 235000021119 whey protein Nutrition 0.000 description 1
- 229910052725 zinc Inorganic materials 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
- C12N5/0018—Culture media for cell or tissue culture
- C12N5/005—Protein-free medium
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
- C12P21/00—Preparation of peptides or proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/05—Inorganic components
- C12N2500/10—Metals; Metal chelators
- C12N2500/20—Transition metals
- C12N2500/24—Iron; Fe chelators; Transferrin
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/32—Amino acids
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2500/00—Specific components of cell culture medium
- C12N2500/30—Organic components
- C12N2500/38—Vitamins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2501/00—Active agents used in cell culture processes, e.g. differentation
- C12N2501/30—Hormones
- C12N2501/38—Hormones with nuclear receptors
- C12N2501/39—Steroid hormones
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Immunology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Abstract
Группа изобретений относится к биотехнологии, а именно к способам использования композиции сред клеточной культуры для выращивания клеток и/или белкового производства. Предложены способ культивирования клеток млекопитающего и способ получения полипептида, включающие стадию контактирования клеток с базальной средой, включающей от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа. Предлагаемые изобретения обеспечивают получаемым фармацевтическим продуктам на основе белка пониженную интенсивность окраски, поддерживая при этом желаемую концентрацию фармацевтического продукта на основе белка, например, ≥100 мг/мл или ≥150 мг/мл, и могут найти применение, например, для производства антител для подкожных инъекций. 2 н. и 34 з.п. ф-лы, 15 ил., 11 табл., 7 пр.
Description
ПЕРЕКРЕСТНАЯ ССЫЛКА НА СВЯЗАННЫЕ ПАТЕНТНЫЕ ЗАЯВКИ
[0001] Настоящая заявка испрашивает приоритет американской предварительной патентной заявки № 61/637778, поданной 24 апреля 2012 г., американской предварительной патентной заявки № 61/637780, поданной 24 апреля 2012 г., и американской патентной заявки № 13/841864, поданной 15 марта 2013 г., содержание каждой из которых, тем самым, включено в настоящий документ посредством ссылки во всей его полноте.
УРОВЕНЬ ТЕХНИКИ
[0002] Способы производства белков in vitro с использованием рекомбинантных клеточных культур являются хорошо известными и используются в промышленных масштабах для производства фармацевтических продуктов на основе белка. Однако все еще остаются значительные проблемы для эффективного приготовления белков из рекомбинантных клеточных культур. Например, фармацевтический продукт на основе белка имеет определенные качественные признаки, такие как распределение частиц по размерам, целостность последовательности и цвет продукта, на которые может влиять процесс производства белка.
[0003] Одним качественным признаком, вызывающим особое беспокойство, является цвет белкового фармацевтического продукта. Также должны быть соблюдены нормативные требования в части приемлемых цветовых уровней для фармацевтических продуктов на основе белка. Таким образом, производство белкового продукта, имеющего приемлемый цвет (например, для того, чтобы удовлетворить нормативные требования для маркетинга товаров) является важным аспектом производства лекарственного средства. Установление качественной сравнимости продукта с более ранним клиническим материалом также может быть важным.
[0004] Новые направления подкожного введения моноклональных антител сопровождались увеличением концентрации лекарственного средства в рецептуре (например, до концентрации ≥150 мг/мл). При таких концентрациях цвет фармацевтического продукта может быть более интенсивным, делая затруднительным производство фармацевтического продукта на основе белка, имеющего приемлемый цвет. Характеристики клеточной культуры могут воздействовать на признаки качества фармацевтических продуктов на основе белка. Среды, в которых культивируются клетки, могут оказывать значительное влияние на производство белков.
[0005] Методики рекомбинирования ДНК для производства белков in vitro исторически использовали клеточные линии, культивируемые в средах с переменными и химически неопределенными компонентами сред, такими как сыворотка животных и пептон. Химически неопределенные питательные вещества могут привести к изменениям от партии к партии, а продукты животного происхождения могут загрязнить среды нежелательными компонентами. Для того чтобы решить эти проблемы, были разработаны химически определенные среды для культивирования клеток («CDM»), которые имеют известный состав, неизменный от партии к партии. Благодаря различным преимуществам, связанным с использованием CDM для белкового производства, в промышленности проявляется широкая тенденция отхода от процессов, использующих сыворотку и пептон, в пользу таких процессов, которые используют CDM. Различные CDM были описаны в патентной литературе, такой как американские патенты №4767704; №5691202; №6048728; №6900056 и №7601535, и американские патентные заявки №20030087372 и №20110039330. Тем не менее, среды неопределенного химического состава продолжают находить использование в белковом производстве.
[0006] Существует постоянная необходимость в создании более совершенных и экономически эффективных методов производства in vitro белков (например, антител), имеющих приемлемые качественные признаки продукта. Желательными являются среды клеточной культуры, которые модулируют один или более качественных признаков продукта. Среды клеточной культуры, независимо от того, являются ли они химически неопределенными или химически определенными, имеющие компоненты, которые последовательно обеспечивают белковые продукты с низкой интенсивностью цвета при поддержании желаемой концентрации белков (например, ≥150 мг/мл), нашли бы свое использование в развитии белковых продуктов, таких как антитела, например, для подкожных инъекций.
КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0007] Описываются композиции сред клеточной культуры, которые обеспечивают фармацевтическому продукту приемлемый цвет, а также способы использования этих сред для выращивания клеток (то есть, клеточной культуры) и/или белкового производства. Также предлагаются среды, которые обеспечивают фармацевтическим продуктам на основе белка приемлемый цвет, поддерживая при этом желаемую концентрацию фармацевтического продукта на основе белка (например, ≥100 мг/мл или ≥150 мг/мл), которые могут найти использование в способах производства белка, например для производства антител для подкожных инъекций. Среды клеточной культуры, описываемые в настоящем документе, могут быть химически неопределенными или химически определенными. Также рассматриваются композиции, включающие в себя предлагаемую в настоящем документе среду и полипептид (например, полипептид, выделяемый клеткой-хозяином в среду), и/или клетка, включающая в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Предлагаются полипептиды, приготовленные с помощью способов, описываемых в настоящем документе, а также составы, включающие в себя полипептиды и среду (например, фармацевтически приемлемую среду). Полипептидные рецептуры в одном аспекте имеют приемлемый цвет и поддерживают концентрацию фармацевтического продукта на основе белка по меньшей мере 100 мг/мл или 150 мг/мл.
[0008] Среды клеточной культуры, подробно описываемые в настоящем документе, в большинстве случаев включают в себя один или больше следующих компонентов в таком количестве, которое влияет на качественный признак белкового продукта, такой как цвет: (a) цистин или цистеин; (b) витамин В2, (c) витамин B6 (пиридоксин и/или пиридоксаль, которые могут быть обеспечены в виде соли с HCl), (d) витамин B9, (e) витамин B12, (f) источник железа, такой как нитрат железа, лимоннокислое железо или сернокислое железо и (g) гидрокортизон. В одной вариации среда для культивирования клеток включает в себя 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или каждый из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g). Понятно, что среда клеточной культуры, предлагаемая в настоящем документе, может содержать любую комбинацию компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g) точно так же, как если бы каждая комбинация была перечислена конкретно и индивидуально. В одном аспекте среды для культивирования клеток являются CDM-средами. В другом аспекте среды для культивирования клеток являются химически неопределенными. В одной конкретной вариации среда клеточной культуры, подробно описанная в настоящем документе, включает в себя: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, причем среда для культивирования клеток (a) может в одной вариации быть химически определенной средой и/или (b) может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ), и (2) гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ). В другой вариации среда клеточной культуры, подробно описанная в настоящем документе, включает в себя: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и (c) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона, причем среда для культивирования клеток (1) может в одной вариации быть химически определенной средой (CDM) и/или (2) может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (A) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л); (B) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л); (C) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л); и (D) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л). Для любой среды, предлагаемой в настоящем документе, в одной вариации среда уменьшает присутствие вариантов, отличающихся зарядами (которые в одном аспекте являются кислыми вариантами, отличающимися зарядами), при использовании в способе производства полипептидов по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами (которые в одном аспекте являются кислыми вариантами, отличающиеся зарядами), получаемыми, когда полипептид производится в другой среде для культивирования клеток (например, в среде, которая не включает в себя те же самые компоненты среды или содержит те же самые компоненты среды, но в другом количестве). В одной вариации композиций и способов, предлагаемых в настоящем документе, варианты, отличающиеся зарядами (которые в одном аспекте являются кислыми вариантами, отличающимися зарядами) составляют не больше, чем 25% или 20% или 18% или 15% или 10% полипептидного продукта. В другой вариации композиций и способов, предлагаемых в настоящем документе, по меньшей мере 75% или 80% или 85% или 90% или 95% или больше полипептидного продукта является основным видом белка. В некоторых вариациях основной вид белка представляет собой количественно преобладающий белок, идентифицируемый последовательностью аминокислот, вторичной структурой, и/или третичной структурой белка. В некоторых вариациях основной вид белка представляет собой количественно преобладающий белок, который идентифицируется одной или более посттрансляционными модификациями. В некоторых вариациях посттрансляционная модификация представляет собой гликозилирование. Понятно, что процент полипептидного продукта, описываемый в настоящем документе, может быть определен перед очисткой полипептидного продукта, после очистки полипептидного продукта, или на любой стадии во время процесса очистки полипептида.
[0009] Кислые варианты могут быть оценены с помощью множества способов, но предпочтительно такие способы включают один, два, три, четыре, или пять из: ионообменной хроматографии (IEC), в которой композиция обрабатывается сиалидазой до, после и/или во время IEC (например, для того, чтобы оценить сиалилированный вариант), способа восстановленного CE-SDS (например, для того, чтобы оценить восстановленный дисульфидный вариант), способа невосстановленного CE-SDS (например, для того, чтобы оценить невосстановимый вариант), боронатной хроматографии (например, для того, чтобы оценить гликированный вариант), и картирования белка (например, для того, чтобы оценить дезамидированный вариант). В одной вариации все кислые варианты оцениваются с помощью ионообменной хроматографии, например, с использованием слабой катионообменной смолы и/или катионообменной смолы с карбоксилатной функциональной группой (например, с использованием хроматографической колонки DIONEX PROPAC™ WCX-10).
[0010] В другом аспекте настоящего изобретения среды клеточной культуры, подробно описанные в настоящем документе, обычно включают в себя один или больше следующих компонентов в количестве, влияющем на качественный признак белкового продукта, такой как цвет: (a) цистин; (b) витамин B1; (c) витамин В2; (d) витамин B3; (e) витамин B5; (f) витамин B6 (пиридоксин и/или пиридоксаль, которые могут быть обеспечены в виде соли с HCl); (g) витамин B7; (h) витамин B9; (i) витамин B12; и (j) источник железа, такой как нитрат железа, лимоннокислое железо или сернокислое железо. В одной вариации среда для культивирования клетоквключает в себя 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 или 9 или каждый из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), и (j). Понятно, что среда клеточной культуры, предлагаемая в настоящем документе, может содержать любую комбинацию компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), и (j) точно так же, как если бы каждая комбинация была перечислена конкретно и индивидуально. В одном аспекте среды для культивирования клетокявляются химически определенными средами. В другом аспекте среды для культивирования клетокявляются химически неопределенными. В одной конкретной вариации среда клеточной культуры, подробно описанная в настоящем документе, включает в себя: (a) от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых вариантах осуществления, 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; (b) от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; (c) от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6; (c) от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и (d) от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, причем среда для культивирования клеток (a) может в одной вариации быть химически определенной средой и/или (b) может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ), (2) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (3) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (4) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (5) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0011] Использование сред клеточной культуры, подробно описанных в настоящем документе, может увеличить стабильность (например, физическую стабильность и/или химическую стабильность) белкового продукта, например, путем уменьшения окисления основного вида белка, по сравнению с белковыми продуктами, произведенными в среде клеточной культуры, которая имеет отличающуюся композицию (например, среда, которая не включает в себя компоненты среды, описываемые в настоящем документе, и/или содержит другое количество компонентов). Использование сред клеточной культуры, подробно описанных в настоящем документе, может также уменьшить содержание окрашенных форм полипептидного продукта по сравнению с полипептидными продуктами, произведенными в среде, которая имеет отличающуюся композицию (например, в среде, которая не включает в себя компоненты среды, описываемые в настоящем документе, и/или содержит другое количество компонентов). Использование сред клеточной культуры, подробно описанных в настоящем документе, также может уменьшить связывание полипептидного продукта с другими веществами в сосуде с клеточной культурой (например, аддуктами) по сравнению с полипептидными продуктами, произведенными в среде, которая имеет отличающуюся композицию (например, в среде, которая не включает в себя компоненты среды, описываемые в настоящем документе, и/или содержит другое количество компонентов). Рассматривается способ увеличения стабильности полипептидной композиции, а также способы сокращения присутствия и/или количества цветной формы полипептидного продукта и сокращения связывания полипептидного продукта с другими веществами в сосуде с клеточной культурой, такими как аддукты.
[0012] Также предлагаются способы приготовления рецептуры, включающей в себя полипептид (например, антитело), включающие в себя стадии производства полипептида в соответствии с любым способом, подробно описанным в настоящем документе, и комбинирования полипептида с одним или более компонентами рецептуры, такими как фармацевтически приемлемая среда или инертный наполнитель.
[0013] Также предлагается рецептура, включающая в себя полипептид (например, антитело), полученный любым способом, подробно описанным в настоящем документе. Рецептура может включать в себя полипептид и фармацевтически приемлемую среду или инертный наполнитель. Полипептидная рецептура, которая может быть подходящей для назначения человеку, может включать в себя выделенное и/или очищенное антитело и иметь один или более желаемых качественных признаков продукта, таких как приемлемый цвет. В одном аспекте рецептура, включающая в себя полипептидный продукт, полученный любым из способов, подробно описанных в настоящем документе, включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл. Рецептуры, включающие в себя по меньшей мере на 100 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл полипептидного продукта (например, антитела, такого как антитело IgG1) также могут иметь приемлемый цвет. Такие рецептуры могут быть подходящими для инъекции, такой как подкожная инъекция индивиду, который в одном аспекте является человеком. В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт, подходящий для инъекции, имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9 при измерении в соответствии с пробой COC. Понятно, что значение интенсивности цвета в соответствии с пробой COC может быть любым из, не ограничиваясь этим, коричневого (B), коричневато-желтого (BY), желтого (Y), зеленовато-желтого (GY) или красного (R), причем более высокие значения указывают на более светлую интенсивность цвета. В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт, подходящий для инъекции, имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета меньше чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). Рецептуры, предлагаемые в настоящем документе, могут включать в себя полипептидный продукт, в котором не более 25% или 20% или 18% или 15% или 10% полипептидного продукта является полипептидным вариантом, отличающимся зарядом (который в одном аспекте является кислым вариантом, отличающимся зарядом). Рецептуры, подробно описываемые в настоящем документе, также могут включать в себя полипептидный продукт, в котором по меньшей мере 75% или 80% или 85% или 90% или 95% или больше полипептидного продукта представляют собой основной вид белка. В конкретной вариации предлагается рецептура, включающая в себя полипептидный продукт (например, антитело), причем рецептура включает в себя полипептидный продукт в концентрации больше, чем 100 мг/мл или больше, чем 125 мг/мл или больше, чем 150 мг/мл и причем рецептуры имеют приемлемый цвет, и причем не больше, чем 25% или 20% или 18% или 15% или 10% полипептидного продукта является полипептидным вариантом, отличающимся зарядом (который в одном аспекте является кислым вариантом, отличающимся зарядом).
[0014] Также предлагаются композиции, включающие в себя среду для культивирования клетоки один или более других компонентов, таких как клетка и/или желаемый полипептид (например, антитело). Композиции охватывают любые и все фазы клеточной культуры, такие как посев, выращивание клеток и производство/поддержание клеток. В одной вариации предлагается композиция, включающая в себя: (a) клетку, включающую в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид; и (b) среду клеточной культуры, предложенную в настоящем документе. В другой вариации предлагается композиция, включающая в себя: (a) полипептид; и (b) среду клеточной культуры, предложенную в настоящем документе, где в одном аспекте полипептид выделяется в среду клеткой, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, или выпускается в среду при распаде клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Клетка композиции может быть любой клеткой, подробно описанной в настоящем документе (например, клеткой CHO), а среда для культивирования клетоккомпозиции может быть любой средой, подробно описанной в настоящем документе, точно так же, как если бы каждая комбинация клетки и среды была перечислена конкретно и индивидуально. Аналогичным образом, полипептид композиции может быть любым полипептидом, подробно описанным в настоящем документе, а среда композиции может быть любой средой, подробно описанной в настоящем документе, точно так же, как если бы каждая комбинация полипептида и среды была перечислена конкретно и индивидуально.
[0015] Предлагаются способы выращивания клеток (то есть, культивируемых клеток) путем контактирования клеток со средой клеточной культуры, как подробно описано в настоящем документе. В конкретной вариации способа выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) среда для культивирования клетокявляется химически определенной средой. В одной вариации способ выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) включает в себя стадию контактирования клетки со средой клеточной культуры, включающей в себя: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 и (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, причем среда для культивирования клетокможет дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ) и (2) гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ). В другой вариации предлагается способ выращивания клетки (то есть, культивирования клетки), который включает в себя стадию контактирования клетки со средой клеточной культуры, включающей в себя: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и (c) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона, причем среда для культивирования клетокможет дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л); (2) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л); (3) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л); и (4) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л). В любом способе выращивания клеток (то есть, культивирования клеток), предлагаемом в настоящем документе, клетки могут контактировать со средой для культивирования клеток во время фазы роста клеток и/или во время фазы производства. Контактирование клеток со средой, подробно описанной в настоящем документе, возможно в любой фазе клеточной культуры, например, во время роста клеток, производства и поддержки. Как будет понятно специалисту в данной области техники, клетки контактируют со средой, подробно описанной в настоящем документе, при условиях (например, температура, pH, осмотическое давление и т.д.), которые способствуют поддержанию клетки и/или ее росту, включая производство полипептида.
[0016] В другой вариации настоящего изобретения способ выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) включает в себя стадию контактирования клетки со средой клеточной культуры, включающей в себя: (a) от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых вариантах осуществления 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; (b) от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; (c) от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6; (c) от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и (d) от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, причем среда для культивирования клетокможет дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ), (2) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (3) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (4) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (5) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0017] В еще одной вариации настоящего изобретения способ выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) включает в себя стадию контактирования клетки со средой клеточной культуры, включающей в себя от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона; от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6; от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, причем среда для культивирования клеток может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ) и (4) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0018] Также предлагаются способы производства полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клеток, включающих в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в которых: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) среда для культивирования клеток включает в себя: (1) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (2) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (3) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (4) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и (5) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, причем среда для культивирования клеток может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (A) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ) и (B) гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ). В другой вариации предлагается способ производства полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клеток, включающих в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) среда для культивирования клеток включает в себя: (1) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (2) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и (3) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона, причем среда для культивирования клеток может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (A) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л); (B) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л); (C) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л); и (D) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л).
[0019] В другой вариации настоящего изобретения также предлагается способ производства полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клеток, включающих в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) среда для культивирования клетоквключает в себя: (a) от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых вариантах осуществления 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; (b) от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; (c) от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6; (c) от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и (d) от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, причем среда для культивирования клеток может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ), (2) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (3) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (4) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ) и (5) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0020] В еще одной вариации настоящего изобретения также предлагается способ производства полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клеток, включающих в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) среда для культивирования клеток включает в себя: от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона; от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6; от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, причем среда для культивирования клеток может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (4) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0021] Полипептид, полученный способом, описанным в настоящем документе, или присутствующий в композиции, описанной в настоящем документе, может быть в одной вариации антителом, таким как антитело IgG1. В одном аспекте полипептид, полученный способом, описанным в настоящем документе, или присутствующий в композиции, описанной в настоящем документе, является антителом анти-VEGF, анти-мезотелин, анти-PCSK9 или анти-Бета7. Полипептиды, полученные способом, описанным в настоящем документе, или присутствующие в композиции, описанной в настоящем документе, могут быть выделены из среды для культивирования клеток и могут быть дополнительно очищены. Полипептиды (такие как антитела) также могут быть сконцентрированы для достижения желаемой концентрации. Способы концентрирования полипептидов являются известными в данной области техники, например, концентрация полипептида или белка может быть увеличена путем использования ультрафильтрации. В конкретной вариации полипептид выделяется в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл или 150 мг/мл и/или выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость. В конкретной вариации композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл и/или выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость. В другой вариации композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл и/или выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость. В другой вариации композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл и/или выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость. В другой вариации композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл и до приблизительно 125 мг/мл или до приблизительно 150 мг/мл и/или выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость. Также описывается композиция, включающая в себя полипептид, полученный способом, подробно описанным в настоящем документе, и фармацевтически приемлемая среда.
[0022] Также описывается набор для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов, включающий в себя: (a) цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина в среде клеточной культуры; (b) витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2 в среде клеточной культуры; (c) витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 в среде клеточной культуры; (d) витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 в среде клеточной культуры; и (e) витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12 в среде клеточной культуры, причем набор может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить источник железа в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ) и (2) гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить гидрокортизон в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ). В другой вариации описывается набор для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов, включающий в себя: (a) цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина в среде клеточной культуры; (b) лимоннокислое железо в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию лимоннокислого железа в среде для культивирования клеток от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ; и (c) гидрокортизон в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию гидрокортизона в среде выращивания клеток (то есть, в клеточной культуре) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ, причем набор может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2 в среде клеточной культуры); (2) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 в среде клеточной культуры); (3) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 в среде клеточной культуры); и (4) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12 в среде клеточной культуры). Также в настоящем документе предлагается набор для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов, который включает в себя: (a) цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых вариантах осуществления 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина в среде клеточной культуры; (b) витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2 в среде клеточной культуры; (c) витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6 в среде клеточной культуры; (d) витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9 в среде для культивирования клеток и (e) витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12 в среде клеточной культуры, причем набор может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ в среде клеточной культуры), (2) витамин B1 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ в среде клеточной культуры), (3) витамин B3 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ в среде клеточной культуры), (4) витамин B5 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ в среде клеточной культуры), и (5) витамин B7 (который в одном аспекте присутствует в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ в среде клеточной культуры). Наборы также могут включать в себя инструкции по их использованию, такие как инструкции по приготовлению среды (например, химически определенной среды) и/или по производству полипептидов (включая антитела) из системы клеточной культуры.
КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ
[0023] Фиг.1 представляет собой изображение, демонстрирующее пробу COC для образцов антитела, выделенных из линий клеток, культивированных при различных условиях клеточной культуры. Слева направо пробирки содержат рецептуры с антителами, выделенными из клеток, культивированных в: I) средах неопределенного химического состава; II) базальных средах 1 и питательных средах 2; III) базальных средах 1 и питательных средах 2; IV) базальных средах 5 и питательных средах 4; V) базальных средах 5 и питательных средах 2; VI) модифицированных базальных средах 3, содержащих цистеин вместо цистина, и питательных средах 4; VII) базальных средах 3 и питательных средах 4; и VIII) модифицированных базальных средах 3, содержащих цистеин вместо цистина, и питательных средах 4. Значения COC изображены над пробирками. Все пробирки содержат приблизительно 150 г/л белка. Рецептуры III, IV и VI имели значение интенсивности цвета 1,59, 1,47 и 0,71, соответственно, измеренное пробой NIFTY. Рецептуры III, IV и VI имели значение интенсивности цвета 2,62, 2,04 и 1,00, соответственно, измеренное Полной цветовой пробой.
[0024] Фиг.2 представляет собой серию графиков, показывающую небольшое сокращение количества клеток и производства антитела в клеточных культурах, выращенных на базальных средах 3 и питательных средах 4 по сравнению с базальными средами 1 и питательными средами 2. A и C) количество клеток в культуре в течение выращивания, измеренное как гематокритное число (PCV) и выраженное как процент полного объема культуры. B и D) производство антитела в клеточной культуре в течение выращивания, измеренное высокоэффективной жидкостной хроматографией и выраженное как титр антитела.
[0025] Фиг.3 представляет собой серию графиков, демонстрирующих влияние на производительную биомассу клеток и производство антитела клеточных культур, выращенных в химически определенных средах (CDM), содержащих различные уровни витамина В2, витамина B6 и витамина B9 вместе с витамином B12. A) производительная биомасса в культуре, измеренная как гематокритное число (PCV) и выраженная как процент полного объема культуры. B) производство антитела из клеток, измеренное высокоэффективной жидкостной хроматографией и выраженное как титр антитела. Для витамина В2 величина -1 означает концентрацию 0,25 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 1,41 мг/л в базальных средах и 10 мг/л в питательных средах; для витамина B6 величина -1 означает концентрацию 5,35 мг/л в базальных средах (пиридоксин) и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию пиридоксина 15,42 мг/л в базальных средах и 7 мг/л в питательных средах в комбинации с концентрацией пиридоксаля 0 мг/л в базальных средах и 60 мг/л в питательных средах; для витамина B9 величина -1 означает концентрацию 8,61 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 9,93 мг/л в базальных средах и 197 мг/л в питательных средах; для витамина B12 величина -1 означает концентрацию 1,76 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 3,05 мг/л в базальных средах и 48 мг/л в питательных средах. Средняя линия показывает ожидаемое значение, вычисленное по линейной модели, которая получается из данных. Верхние и нижние линии указывают 95%-ый доверительный интервал прогноза.
[0026] Фиг.4 представляет собой серию графиков, показывающую интенсивность цвета антител, выделенных из клеточных культур, выращенных в химически определенных средах, содержащих различные уровни витамина В2, витамина B6 и витамина B9 вместе с витамином B12. Интенсивность цвета определялась с помощью цветовой пробы, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. Для витамина В2 величина -1 означает концентрацию 0,25 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 1,41 мг/л в базальных средах и 10 мг/л в питательных средах; для витамина B6 величина -1 означает концентрацию 5,35 мг/л в базальных средах (пиридоксин) и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию пиридоксина 15,42 мг/л в базальных средах и 7 мг/л в питательных средах в комбинации с концентрацией пиридоксаля 0 мг/л в базальных средах и 60 мг/л в питательных средах; для витамина B9 величина -1 означает концентрацию 8,61 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 9,93 мг/л в базальных средах и 197 мг/л в питательных средах; для витамина B12 величина -1 означает концентрацию 1,76 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 3,05 мг/л в базальных средах и 48 мг/л в питательных средах.
[0027] Фиг.5 A-C) представляет собой серию графиков, показывающую производительную биомассу клеток, производство антитела и интенсивность цвета антител, выделенных из клеточных культур, выращенных в химически определенных средах, содержащих увеличивающиеся концентрации сернокислого железа. A) производительная биомасса в культуре, измеренная как гематокритное число в течение времени (IVPCV). B) производство антитела из клеток, измеренное высокоэффективной жидкостной хроматографией. C) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. Вертикальные отрезки указывают разброс данных и среднее значение. D) представляет собой график, показывающий интенсивность цвета антител, культивированных в средах, содержащих увеличивающиеся концентрации сернокислого железа в эксперименте in vitro.
[0028] Фиг.6 представляет собой серию графиков, показывающую производительную биомассу клетки, производство антитела, а также интенсивность цвета антител, выделенных из клеточных культур, выращенных в химически определенных средах, содержащих увеличивающиеся концентрации железа, с различными источниками железа. A) производительная биомасса в культуре, измеренная как гематокритное число в течение времени (IVPCV). B) производство антитела из клеток, измеренное высокоэффективной жидкостной хроматографией. C) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. Вертикальные отрезки указывают разброс данных и среднее значение. D-E) показывают производство антитела и интенсивность цвета антител, выделенных из клеточных культур, выращенных в химически определенных средах (CDM), содержащих различные концентрации различных источников железа и пониженные уровни витамина В. Значки «+» означают низкое содержание витамина, а значки «ᴑ» указывают высокое содержание витамина. D) производство антитела из клеток, измеренное высокоэффективной жидкостной хроматографией. E) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная пробой NIFTY, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета.
[0029] Фиг.7 представляет собой серию графиков, показывающую интенсивность цвета антител, культивированных в химически определенных средах (CDM), содержащих различные концентрации сернокислого железа или витамина В2 в отсутствие или при наличии каталазы в эксперименте in vitro. A) интенсивность цвета антител в отсутствие каталазы. B) интенсивность цвета антител в присутствии каталазы. Интенсивность цвета измерялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. Для сернокислого железа величина -1 означает концентрацию 18 мкМ в базальных средах и 0 мкМ в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 75 мкМ в базальных средах и 0 мкМ в питательных средах; для витамина В2 величина -1 означает концентрацию 0,25 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 1,41 мг/л в базальных средах и 10 мг/л в питательных средах. Средняя линия указывает ожидаемое значение, вычисленное по линейной модели, которая получается из данных. Верхняя и нижняя линии указывают 95%-ый доверительный интервал прогноза.
[0030] Фиг.8 представляет собой A) график, показывающий корреляцию между уменьшенной интенсивностью цвета и уменьшенным присутствием кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в модифицированных базальных средах 3 и питательных средах 4 (значок «+») по сравнению с модифицированными базальными средами 1 и питательными средами 2 (значок «ᴑ»). Модифицированные среды 1 содержали 10 мкМ, 18 мкМ или 75 мкМ сернокислого железа. Модифицированные среды 3 содержали 10 мкМ или 18 мкМ лимоннокислого железа. B) график, показывающий корреляцию между уменьшенной интенсивностью цвета и уменьшенным присутствием кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в средах, содержащих 18 мкМ сернокислого железа (значок «о») по сравнению со средами, содержащими 75 мкМ сернокислого железа (значок «+»). C) график, показывающий отсутствие корреляции между уменьшенной интенсивностью цвета и уменьшенным присутствием кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в средах, содержащих различные уровни витаминов В2, B6, B9 и B12. Уровни витаминов В одновременно изменялись до низкой концентрации (значок «о»), средней концентрации (значок «+»), или высокой концентрации (значок «◊»). Интенсивность цвета измерялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. Процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела определялся с помощью ионообменной хроматографии.
[0031] Фиг.9 представляет собой серию графиков, показывающую корреляцию между уменьшенной интенсивностью цвета и уменьшенным присутствием кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в средах, содержащих уменьшенные концентрации витамина В2 и витамина B6. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии. Для витамина В2 величина -1 означает концентрацию 0,25 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 1,41 мг/л в базальных средах и 10 мг/л в питательных средах; для витамина B6 величина -1 означает концентрацию 5,35 мг/л в базальных средах (пиридоксин) и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию пиридоксина 15,42 мг/л в базальных средах и 7 мг/л в питательных средах в комбинации с концентрацией пиридоксаля 0 мг/л в базальных средах и 60 мг/л в питательных средах.
[0032] Фиг.10 представляет собой серию графиков, показывающую уменьшенную интенсивность цвета и уменьшенное присутствие кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в базальных средах, содержащих лимоннокислое железо в сравнении с сернокислым железом с изменяющимися концентрациями пиридоксаля. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии. Для пиридоксаля величина -1 означает концентрацию 0 мг/л в базальных средах и 0 мг/л в питательных средах, а величина 1 означает концентрацию 0 мг/л в базальных средах и 60 мг/л в питательных средах. Лимоннокислое железо или сернокислое железо присутствовало в базальных средах в количестве 18 мкМ.
[0033] Фиг.11 представляет собой серию графиков, показывающую уменьшенную интенсивность цвета и уровни кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в базальных средах, содержащих лимоннокислое железо, в сравнении с сернокислым железом, с изменяющимися концентрациями витаминов В2, B6, B9 и B12 в питательных средах. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии. Уровень 1 означает питательные среды, не содержащие витаминов В2, B6, B9 и B12. Уровень 2 означает питательные среды, содержащие витамин В2 в концентрации 10 мг/л, пиридоксин в концентрации 7 мг/л, пиридоксаль в концентрации 60 мг/л, витамин B9 в концентрации 197 мг/л, и витамин B12 в концентрации 48 мг/л. Уровень 3 означает питательные среды, содержащие витамин В2 в концентрации 5 мг/л, пиридоксин в концентрации 3,5 мг/л, пиридоксаль в концентрации 30 мг/л, витамин B9 в концентрации 98,5 мг/л, и витамин B12 в концентрации 24 мг/л. Лимоннокислое железо или сернокислое железо присутствовало в базальных средах в количестве 18 мкМ.
[0034] Фиг.12 представляет собой серию графиков, показывающую уменьшенную интенсивность цвета и уменьшенные уровни кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в базальных средах, содержащих уменьшенную концентрацию железа и предпочтительно с лимоннокислым железом вместо сернокислого железа в качестве источника железа. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии.
[0035] Фиг.13 представляет собой серию графиков, показывающую уменьшенную интенсивность цвета и уменьшенные уровни кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в базальных средах, содержащих уменьшенные концентрации лимоннокислого железа. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии. Значок «*» означает модифицированные базальные среды 1, содержащие лимоннокислое железо в указанных концентрациях. Значок «‡» означает модифицированные базальные среды 3, содержащие лимоннокислое железо в указанных концентрациях. Значок «○» означает растворы антитела, выделенные из клеток, выращенных при температуре 33°C. Значок «+» означает растворы антитела, выделенные из клеток, выращенных при температуре 37°C.
[0036] Фиг.14 представляет собой серию графиков, показывающую уменьшенную интенсивность цвета и уменьшенные уровни кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, полученных из клеточных культур, выращенных в базальных средах, содержащих уменьшенные концентрации витаминов В2, B6, B9 и B12, с добавлением цистина вместо цистеина и в присутствии гидрокортизона. A) интенсивность цвета антител, выделенных из клеток, измеренная цветовой пробой, в которой более высокие численные значения соответствуют более высокой интенсивности цвета, а более низкие численные значения соответствуют более низкой интенсивности цвета. B) процент кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворах антитела, определенный при помощи ионообменной хроматографии. Значок «*» означает базальные среды, содержащие витамин В2 в концентрации 1,41 мг/л, пиридоксин в концентрации 15,42 мг/л, пиридоксаль в концентрации 0 мг/л, витамин B9 в концентрации 9,93 мг/л, и витамин B12 в концентрации 3,05 мг/л. Значок «‡» означает базальные среды, содержащие витамин В2 в концентрации 0,7 мг/л, пиридоксин в концентрации 7,7 мг/л, пиридоксаль в концентрации 0 мг/л, витамин B9 в концентрации 4,9 мг/л, и витамин B12 в концентрации 1,5 мг/л. Значок «○» означает цистин в концентрации 480 мг/л. Значок «Δ» означает цистеин в концентрации 525 мг/л. Гидрокортизон присутствует в указанных растворах в количестве 150 нМоль.
[0037] Фиг.15 представляет собой серию графиков, показывающую корреляцию между измерениями Полной цветовой пробы и пробы NIFTY в сравнении с измерениями пробы COC для интенсивности цвета. A) значения полного цвета и значения NIFTY были изображены символами, представляющими значения COC. B) измерения цвета пробой NIFTY в пуле протеина А и в соответствующей рецептуре лекарственного средства были изображены символами, представляющими значения COC. C) измерения цвета Полной цветовой пробой в пуле протеина А и в соответствующей рецептуре лекарственного средства были изображены символами, представляющими значения COC. Значок «○» соответствует значению COC ≤B3; значок «◊» соответствует значению COC ≤B4 или BY4; значок «+» соответствует значению COC ≤B5 или BY5; DS NIFTY и DS Total Color означают соответствующие значения пробы в конечной рецептуре лекарственного средства; и ProA NIFTY и ProA Total Color означают соответствующие значения пробы в пуле протеина А.
ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ
[0038] Описываются среды для культивирования клеток и способы использования этих сред для выращивания клеток (то есть, клеточной культуры) и получения полипептидов. Также предлагаются полипептиды, включая антитела, полученные с помощью описанных способов. Также предлагаются наборы для приготовления сред и композиций, включающих в себя среды, а также композиции, включающие в себя клетку и/или полипептид, полученный с помощью описанных способов. Описываются фармацевтические композиции, включающие в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл и имеющие значение интенсивности цвета, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9, измеренное пробой цвета, опалесценции и окраски (пробой COC). Также описываются фармацевтические композиции, включающие в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл и имеющие значение интенсивности цвета, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9, измеренное пробой COC. Понятно, что исходные эталоны для пробы COC могут быть любыми из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY или R, причем более высокие значения указывают более светлую интенсивность цвета. Также предлагаются фармацевтические композиции, включающие в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеющий значение интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). Также в настоящем документе предлагаются фармацевтические композиции, включающие в себя полипептид в концентрации, больше чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл, и имеющий значение интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). Также предлагаются способы оценки цвета в содержащем полипептид растворе (например, в растворе, содержащем антитела). В конкретных вариациях среды, способ, наборы и композиции включают в себя химически определенные среды.
[0039] Было найдено, что определенные среды для культивирования клеток (например, химически определенные среды (CDM)), используемые в получении полипептидов, обеспечивают полипептидному фармацевтическому продукту приемлемые качественные признаки. Например, было найдено, что определенные CDM модулируют интенсивность цвета полипептидного фармацевтического продукта, обеспечивая полипептидам, полученным в химически определенных средах, приемлемый цвет (например, для использования в качестве фармацевтического продукта для инъекций), сохраняя при этом выгоды, связанные с использованием химически определенных сред. Было найдено, что эти химически определенные среды при их использовании в способе получения полипептидов уменьшают интенсивность цвета полипептидного фармацевтического продукта по сравнению с полипептидом, произведенным в другой среде (например, в среде, которая не включает в себя компоненты среды, подробно описанные в настоящем документе, и/или не содержит количество компонентов, подробно описанное в настоящем документе). Среды для культивирования клеток могут быть химически определенными или химически неопределенными.
[0040] Не привязываясь к какой-либо теории, считается, что использование конкретных компонентов среды (таких как цистин и/или цистеин, некоторые витамины B, гидрокортизон и/или источник железа) в некоторых концентрациях позволяет произвести полипептидный фармацевтический продукт с приемлемыми качественными признаками, в частности с приемлемым цветом. Хотя считается, что использование этих компонентов среды в базальных средах, используемых для выращивания клеток, особенно влияет на качественные признаки полипептидного фармацевтического продукта, предполагается, что предлагаемые в настоящем документе среды могут быть использованы на любой стадии процесса выращивания клеток, поддержания и фазы производства полипептида, включая базальную и питательную среды. Предлагаемые в настоящем документе среды могут использоваться в способах выращивания клеток (то есть, культивирования клеток) и в получении полипептидов, и могут найти применение в фазе выращивания, поддержания и/или производства клеток, включающих в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую желаемый полипептид. Описанные в настоящем документе среды могут быть использованы для того, чтобы улучшить одно или более свойств полипептидного фармацевтического продукта (например, цвет, состав, чистоту и т.д.) или один или более аспектов способа получения полипептида (например, воспроизводимость от партии к партии, легкость получения, стоимость получения и т.д.). Описываются полипептиды (например, антитело), полученные процессом клеточной культуры, использующим предложенные в настоящем документе среды. В одном аспекте полипептид имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл и значение интенсивности цвета больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9 в соответствии с пробой COC. В другом аспекте полипептид имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл и значение интенсивности цвета больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8, или B9 в соответствии с пробой COC. В некоторых аспектах значение интенсивности цвета, определенное пробой COC, может быть любым из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY или R, причем более высокие значения указывают на более светлую интенсивность цвета. Также описываются способы назначения полипептидных продуктов, подробно описанных в настоящем документе, а также промышленные изделия, включающие в себя полипептидные продукты, полученные в соответствии с настоящим документом.
Определения
[0041] Если ясно не указано иное, используемые в настоящем документе формы единственного числа относятся как к единственному, так и к множественному числу.
[0042] Ссылка на «приблизительное» значение или параметр в настоящем документе включает в себя (и описывает) варианты осуществления, которые направлены по существу на это значение или параметр. Например, описание, ссылающееся на «приблизительно X», включает в себя описание «X». Числовые диапазоны являются включительными относительно чисел, определяющих диапазон.
[0043] «Вариант, отличающийся зарядом» является вариантом основного вида белка (например, антителом), который имеет заряд, отличающийся от заряда основного вида белка.
[0044] «Кислый вариант, отличающийся зарядом» является вариантом основного вида белка (например, антителом), который является более кислотным, чем основной вид белка (например, антитела). Кислый вариант получает отрицательный заряд или теряет положительный заряд относительно основного вида белка (например, антитела). Такие кислые варианты, отличающиеся зарядами, могут быть разделены путем использования методологии разделения, такой как ионообменная хроматография, которая разделяет белки в соответствии с их зарядом.
[0045] Термин «основной вид белка» в настоящем документе относится к структуре последовательности аминокислот белка (например, антитела) в композиции, который является количественно преобладающей молекулой белка (например, антитела) в композиции.
[0046] Термин «культивирование» клетки относится к контактированию клетки со средой для культивирования клетокпри условиях, подходящих для выживания и/или роста клетки.
[0047] Термин «пакетная культура» относится к культуре, в которой все компоненты для культивирования клеток (включая клетки и все питательные вещества для культуры) подаются в сосуд для культивирования в начале процесса культивирования.
[0048] Фраза «питаемая пакетная клеточная культура», использующаяся в настоящем документе, относится к пакетной культуре, в которой клетки и среды для культуры первоначально подаются в сосуд для культивирования, и дополнительные питательные вещества подаются в культуру, непрерывно или дискретными порциями, во время процесса культивирования, с или без периодического сбора клеток и/или продукта до прекращения использования культуры.
[0049] «Перфузионная культура» является культурой, с помощью которой клетки ограничиваются в культуре, например, путем фильтрации, инкапсуляции, фиксирования на микроносителях и т.д., и культуральные среды непрерывно или периодически вводятся в сосуд для культивирования и удаляются из сосуда для культивирования.
[0050] Термин «сосуд для культивирования» относится к емкости, используемой для культивирования клеток. Сосуд для культивирования может иметь любой размер, если это полезно для культивирования клеток.
[0051] «Титр»: использующийся в настоящем документе термин «титр» относится к общему количеству рекомбинантно экспрессированного полипептида, полученного клеточной культурой, деленному на данное количество объема среды. Титр обычно выражается в миллиграммах полипептида на миллилитр среды.
[0052] Термины «среда» и «среда клеточной культуры» относятся к источнику питания, используемому для выращивания или поддержания клеток. Как будет понятно специалисту в данной области техники, источник питания может содержать компоненты, требуемые клетке для ее роста и/или выживания, или может содержать компоненты, которые помогают росту клеток и/или их выживанию. Витамины, основные или неосновные аминокислоты, а также микроэлементы являются примерами компонентов среды.
[0053] «Химически определенная среда клеточной культуры» или «химически определенные среды» (CDM) является средой с заданным составом, который не содержит продуктов животного происхождения, таких как сыворотка животных и пептон. Эти термины также охватывают среды с заданным составом, которые не содержат неопределенных или частично определенных компонентов, например, таких компонентов, как сыворотка животных, животный пептон и растительный пептон. Как будет понятно специалисту в данной области техники, химически определенные среды могут использоваться в процессе получения полипептидов, посредством чего клетка контактирует с CDM и выделяет полипептид в CDM. Таким образом, понятно, что композиция может содержать химически определенные среды и полипептидный продукт, и что наличие полипептидного продукта не делает химически определенные среды химически неопределенными.
[0054] «Химически неопределенная среда клеточной культуры» относится к среде, химический состав которой не может быть определен, и которая может содержать один или более продуктов животного происхождения, таких как сыворотка животных и пептон. Как будет понятно специалисту в данной области техники, химически неопределенная среда для культивирования клеток может содержать продукт животного происхождения в качестве источника питания. Этот термин может также охватывать среды клеточной культуры, включающие в себя неопределенные или частично неопределенные компоненты, например, такие компоненты, как сыворотка животных, животный пептон и растительный пептон.
[0055] Термины «полипептид» и «белок» используются взаимозаменяемо в настоящем документе и относятся к полимерам аминокислот любой длины. Полимер может быть линейным или разветвленным, он может включать в себя модифицированные аминокислоты, и он может прерываться неаминокислотами. Эти термины также охватывают полимер аминокислоты, который был модифицирован естественным образом или посредством вмешательства; например, путем формирования дисульфидного мостика, гликозилирования, липидизации, ацетилирования, фосфориляции или любой другой манипуляции или модификации, такой как сопряжение с маркирующим компонентом. Также в это определение входят, например, полипептиды, содержащие один или более аналогов аминокислоты (включая, например, ненатуральные аминокислоты и т.д.), а также другие модификации, известные в данной области техники. Примеры полипептидов, охватываемых данным определением, включают в себя белки млекопитающих, такие как, например, ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; гормон, стимулирующий деятельность щитовидной железы; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, фактор ткани, и фактор фон Виллебрандса; препятствующие свертыванию крови факторы, такие как Протеин C; предсердный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество легкого; активатор плазмогена, такой как урокиназа или человеческая моча или тканевой активатор плазмогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа- и бета-факторы некроза опухоли; энкефалиназу; хемокин, выделяемый T-клетками при активации (RANTES); человеческий макрофагальный воспалительный белок (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующее вещество Мюллера; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; связанный с гонадотропином белок мыши; микробный белок, такой как бета-лактамазу; дезоксирибонуклеазу; IgE; антиген, связанный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; сосудистый фактор эндотелиального роста (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; протеин A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как получаемый из костей нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), инсулиноподобные связывающие белки фактора роста (IGFBP); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD19 и CD20; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как альфа-, бета- и гамма-интерферон; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлeйкины (IL), например, от IL-1 до IL-10; супероксид-дисмутазу; рецепторы Т-клеток; поверхностные мембранные белки; фактор ускорения затухания; вирусный антиген, такой как, например, часть защитного покрытия вируса СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регулирующие белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как CA125 (антиген рака яичников) или рецептор HER2, HER3 или HER4; иммуноадгезины; а также фрагменты и/или разновидности любого из вышеперечисленных белков, а также антител, включая фрагменты антител, связанные с белком, включая, например, любой из вышеперечисленных белков.
[0056] «Выделенный полипептид» означает полипептид, который был получен из клетки или клеточной культуры, в которой он был экспрессирован.
[0057] Используемый в настоящем документе термин «нуклеиновая кислота» относится к полимерам нуклеотидов любой длины, и включает в себя дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) и рибонуклеиновую кислоту (РНК). Нуклеотиды могут быть дезоксирибонуклеотидами, рибонуклеотидами, модифицированными нуклеотидами или основаниями, и/или их аналогами, или любым субстратом, который может быть включен в полимер с помощью полимеразы ДНК или РНК или путем реакции синтеза. Полинуклеотид может включать в себя модифицированные нуклеотиды, такие как метилированные нуклеотиды и их аналоги. Если они присутствуют, модификации структуры нуклеотида могут быть произведены до или после сборки полимера.
[0058] «Выделенная нуклеиновая кислота» означает и охватывает не встречающуюся в природе, рекомбинантную или встречающуюся в природе последовательность за пределами или отделенную от ее обычного контекста.
[0059] «Очищенный» полипептид означает, что чистота полипептида была увеличена, так что он существует в форме, которая является более чистой, чем та форма, в которой он существует в своей естественной среде, и/или чем та форма, в которой он был первоначально произведен и/или синтезирован и/или амплифицирован в лабораторных условиях. Чистота является относительным понятием и не обязательно означает абсолютную чистоту.
[0060] Термин «антитело» используется в самом широком смысле слова и в частности покрывает моноклональные антитела (включая моноклональные антитела полной длины), поликлональные антитела, мультиспецифичные антитела (например, биспецифичные антитела), а также фрагменты антитела.
[0061] «Фрагменты антитела» включают в себя часть антитела полной длины, обычно его антигенсвязывающие или переменные области. Примеры фрагментов антитела включают в себя фрагменты Fab, Fab’, F(ab’)2, и Fv; одноцепочечные молекулы антитела; диатела; линейные антитела; а также мультиспецифичные антитела, сформированные из фрагментов антитела.
[0062] Использующийся в настоящем документе термин «моноклональное антитело» относится к антителу, полученному из популяции по существу гомогенных антител, то есть, отдельные антитела, представляющие собой популяцию, идентичны за исключением возможных естественных мутаций, которые могут присутствовать в незначительном количестве. Моноклональные антитела являются высокоспецифичными и направлены против единственного антигенного участка. Кроме того, в отличие от препаратов обычных (поликлональных) антител, которые обычно включают в себя различные антитела, направленные против различных детерминантов (эпитопов), каждое моноклональное антитело направлено против единственного детерминанта на антигене. Прилагательное «моноклональное» указывает на ту особенность антитела, что оно получено из, по существу, гомогенной популяции антител, и не должно рассматриваться как требование производства антитела каким-либо конкретным способом. Например, моноклональные антитела, которые будут использоваться в соответствии с настоящим раскрытием, могут быть изготовлены способом гибридома, впервые описанным в публикации Kohler et al., Nature 256:495 (1975), или могут быть изготовлены с помощью способов рекомбинантной ДНК (см., например, патент США №4816567). «Моноклональные антитела» также могут быть выделены из библиотек антител бактериофагов с использованием методик, описанных, например, в публикациях Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) и Marks et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991).
[0063] «Гуманизированные» антитела являются формами нечеловеских антител (например, антител грызунов), которые являются химерными антителами, которые содержат минимальную последовательность, полученную из нечеловеческого антитела. По большей части гуманизированные антитела являются человеческими иммуноглобулинами (антителами реципиента), в которых остатки от гипервариабельного участка реципиента замещаются остатками от гипервариабельного участка нечеловеческой разновидности (донорское антитело), такими как антитела мышей, крыс, кроликов или обезьян-приматов, имеющие желаемую специфичность, сродство и способность антитела. В некоторых случаях каркасная область (FR) остатков человеческого иммуноглобулина замещается соответствующими нечеловеческими остатками. Кроме того, гуманизированные антитела могут включать в себя остатки, которые не находятся в антителе реципиента или в донорском антителе. Эти модификации делаются для того, чтобы дополнительно усовершенствовать работу антитела. В большинстве случаев гуманизированное антитело будет включать в себя по существу все из по меньшей мере одного, и обычно двух переменных доменов, в которых все или по существу все гиперпеременные петли соответствуют петлям нечеловеческого иммуноглобулина, и все или по существу все каркасные области являются каркасными областями последовательности человеческого иммуноглобулина. Гуманизированное антитело опционально также будет включать в себя по меньшей мере часть постоянной области (Fc) иммуноглобулина, обычно человеческого иммуноглобулина. Для получения дальнейшей информации см. публикации Jones et al., Nature 321:522-525 (1986); Riechmann et al., Nature 332:323-329 (1988); и Presta, Curr. Op. Struct. Biol. 2:593-596 (1992).
[0064] «Зависимое от вида антитело» является антителом, которое имеет более сильное связывающее сродство к антигену от первого вида млекопитающих, чем к гомологу этого антигена от второго вида млекопитающих. Обычно, зависимое от вида антитело «специфично связывается» с человеческим антигеном (то есть,, имеет значение связывающего сродства (Kd) не больше, чем приблизительно 1×10-7 Моль, не больше, чем приблизительно 1×10-8 Моль или не больше, чем приблизительно 1×10-9 Моль), но имеет связывающее сродство к гомологу антигена от второго вида млекопитающих (не человека), которое по меньшей мере приблизительно в 50 раз, или по меньшей мере приблизительно в 500 раз, или по меньшей мере приблизительно в 1000 раз меньше, чем его связывающее сродство к человеческому антигену. Зависимое от вида антитело может иметь любые из различных типов антител, как определено выше, но предпочтительно является гуманизированным или человеческим антителом.
[0065] Термин «загрязнители» относится к материалам, которые отличаются от желаемого полипептидного продукта. Загрязнитель включает в себя, без ограничения: материалы клетки-хозяина, такие как CHOP; выщелоченный протеин A; нуклеиновую кислоту; вариант, фрагмент, агрегат или производное желаемого полипептида; другой полипептид; эндотоксин; вирусный загрязнитель; компонент среды для культивирования клеток и т.д.
[0066] Термин «фармацевтическая рецептура» относится к препарату, который находится в такой форме, которая позволяет биологической активности активного ингредиента быть эффективной, и которая не содержит дополнительных компонентов, которые являются неприемлемо токсичными для субъекта, которому рецептура будет назначаться. Такие рецептуры являются стерильными.
[0067] «Стерильная» рецептура является асептической или не содержащей или по существу не содержащей никаких живых микроорганизмов и их спор.
[0068] «Бесцветная или слегка окрашенная» жидкость относится к жидкой композиции, включающей в себя полипептид, которая измеряется количественным и/или качественным анализом. Качественный анализ включает визуальный осмотр, такой как сравнение композиции, включающей в себя полипептид, с исходным эталоном.
[0069] Понятно, что везде в настоящем документе, где варианты осуществления описаны с использованием термина «включающий в себя», также предлагаются и аналогичные варианты осуществления, описанные с использованием термина «состоящий из» и/или «состоящий по существу из».
[0070] Там, где аспекты или варианты осуществления настоящего изобретения описываются в терминах группы Маркуша или другой группировки альтернатив, настоящее изобретение охватывает не только всю группу, перечисленную в целом, но и каждый элемент группы индивидуально и все возможные подгруппы главной группы, а также главную группу с исключенными одним или более членами группы. Настоящее изобретение также предусматривает явное исключение одного или более любых из членов группы в заявленном изобретении.
Среда клеточной культуры
[0071] Среды клеточной культуры, предлагаемые в настоящем документе, могут найти использование в способах (например, выращивания клеток (то есть, культивирования клеток) и производства полипептидов) и в композициях, подробно описанных в настоящем документе. Компоненты сред были идентифицированы как способные обеспечивать полипептидный фармацевтический продукт с приемлемыми качественными признаками, такими как приемлемый цвет (например, для использования в качестве фармацевтического продукта для инъекций). Некоторые компоненты сред уменьшают интенсивность цвета полипептидного фармацевтического продукта по сравнению с полипептидом, произведенным в других средах, что может быть особенно важным для полипептидных продуктов, которые содержатся в концентрациях больших, чем любая из 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл. В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета, измеренное пробой COC, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета, измеренное пробой COC, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах значение интенсивности цвета, измеренное пробой COC, может быть любым из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY или R, причем более высокие значения указывают на более светлую интенсивность цвета. В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). В некоторых аспектах полипептидный фармацевтический продукт имеет концентрацию больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл, и имеет значение интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). Подходящие среды для культивирования клеток подробно описываются во всем тексте настоящего документа, включая раздел «КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ». Любая среда, подробно описанная в настоящем документе, может использоваться на любой стадии выращивания клеток, их поддержания и получения полипептида, и может использоваться в базальных средах и/или в питательных средах. Среды, описанные в настоящем документе, в одной вариации приводят к приемлемой жизнеспособности клетки и приемлемым уровням титра антитела и интенсивности цвета полипептида (например, антитела), выделенного из клеточной культуры, выращенной в этих средах.
[0072] Предлагается среда клеточной культуры, включающая в себя один или больше из следующих компонентов: (a) цистин и/или цистеин; (b) витамин В2, (c) витамин B6 (пиридоксин и/или пиридоксаль), (d) витамин B9, (e) витамин B12, (f) источник железа, такой как лимоннокислое железо и (g) гидрокортизон. В одной вариации среда для культивирования клеток включает в себя 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или каждый из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g). Понятно, что предлагаемая в настоящем документе среда для культивирования клеток может содержать любую комбинацию компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g) точно так же, как если бы каждая комбинация была перечислена конкретно и индивидуально. Например, понятно, что среда клеточной культуры, включающая в себя четыре из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g), может включать в себя любую комбинацию компонентов, если присутствуют по меньшей мере четыре из компонентов. В одном аспекте среда для культивирования клеток является химически определенной средой. В другом аспекте среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры.
[0073] Компоненты сред могут быть добавлены к композиции в формах, которые известны в данной области техники. Например, витамин В2 может быть обеспечен в виде порошка рибофлавина, витамин B6 может быть обеспечен в виде пиридоксин HCl или в виде пиридоксаль HCl, витамин B9 может быть обеспечен в виде порошка фолиевой кислоты, витамин B12 может быть обеспечен в виде порошка цианокобаламина, цистеин может быть обеспечен в виде порошка моногидрата моногидрохлорида L-цистеина, цистин может быть обеспечен в виде порошка моногидрата двунатриевой соли. В некоторых вариантах осуществления витамин B6 не обеспечивается в виде пиридоксаль HCl. В дополнительном неограничивающем примере витамин B1 может быть обеспечен в виде моногидрохлорида тиамина, витамин B3 может быть обеспечен в виде ниацинамида, витамин B5 может быть обеспечен в виде D-кальцийпантотената, и витамин B7 может быть обеспечен в виде биотина. В качестве другого неограничивающего примера, железо может быть добавлено в различных формах железа или источников железа. В некоторых вариантах осуществления источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо. Описанные в настоящем документе компоненты сред могут быть обеспечены в форме соли, гидрата, гидрата соли, или в виде раствора, экстракта или твердой формы.
[0074] В одной вариации среда включает в себя цистин и каждый из витаминов B2, B6, B9 и B12. В одной вариации среда включает в себя цистин, витамины B2, B6, B9, B12 и источник железа, такой как лимоннокислое железо. В другой вариации среда включает в себя цистин, витамины B2, B6, B9, B12, источник железа, такой как лимоннокислое железо, и гидрокортизон. В дополнительной вариации среда включает в себя цистин, гидрокортизон и источник железа, такой как лимоннокислое железо. В другой вариации среда включает в себя цистин, гидрокортизон, источник железа, такой как лимоннокислое железо, и по меньшей мере один из витаминов B2, B6, B9 и B12. В другой вариации среда включает в себя цистин, гидрокортизон, источник железа, такой как лимоннокислое железо, и по меньшей мере два из витаминов B2, B6, B9 и B12. В еще одной вариации среда включает в себя цистин, гидрокортизон, источник железа, такой как лимоннокислое железо, и по меньшей мере три из витаминов B2, B6, B9 и B12. В любой описанной в настоящем документе среде в одном аспекте среда является химически определенной средой. В одном аспекте среда клеточной культуры включает в себя цистеин. В другой вариации среда для культивирования клеток включает в себя цистин и не содержит цистеина. В другой вариации среда для культивирования клеток включает в себя и цистин, и цистеин.
[0075] В одной вариации среда является средой клеточной культуры, включающей в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12. В одной вариации витамин В2 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,50 мг/л. В другой вариации витамин В2 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,40 мг/л. В другой вариации витамин В2 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,30 мг/л. В одной вариации витамин B6 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л. В другой вариации витамин B6 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л. В другой вариации витамин B6 имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В одной вариации среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя источник железа. В одной вариации источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо. В одной вариации среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ. В любой из вариаций в настоящем документе среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон. В одной вариации гидрокортизон имеет концентрацию от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
[0076] В другой вариации среда для культивирования клеток включает в себя одно или более из следующего: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина и/или цистеина (и который в одном аспекте является цистином); (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; (f) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как нитрат, цитрат или сульфат железа (который в одном аспекте является лимоннокислым железом и/или сернокислым железом); и (g) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона. В другой вариации среда для культивирования клеток включает в себя одно или более из следующего: (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 600 мг/л цистина и/или цистеина (и который в одном аспекте является цистином); (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,5 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 2,0 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); (d) от приблизительно 4,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мг/л витамина B12; (f) от приблизительно 5 мкМ до приблизительно 25 мкМ источника железа, такого как нитрат, цитрат или сульфат железа (который в одном аспекте является лимоннокислым железом и/или сернокислым железом); и (g) от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ гидрокортизона. В еще одной вариации среда для культивирования клеток включает в себя одно или более из следующего: (a) от приблизительно 400 мг/л до приблизительно 500 мг/л цистина и/или цистеина (и который в одном аспекте является цистином); (b) от приблизительно 0,1 мг/л до приблизительно 0,3 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 4,0 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); (d) от приблизительно 7,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,0 мг/л витамина B12; (f) от приблизительно 12 мкМ до приблизительно 20 мкМ источника железа, такого как нитрат, цитрат или сульфат железа (который в одном аспекте является лимоннокислым железом и/или сернокислым железом); и (g) от приблизительно 0,125 мкМ до приблизительно 0,175 мкМ гидрокортизона. В одной вариации среда для культивирования клеток включает в себя 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или каждый из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g) в концентрациях, упомянутых в настоящем документе. Понятно, что среда для культивирования клеток может содержать любую комбинацию компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f) и (g) в предложенных в настоящем документе диапазонах концентрации точно так же, как если бы каждая комбинация была перечислена конкретно и индивидуально. Например, понятно, что среда в одной вариации включает в себя компоненты (a), (b), (c), (d) и (e) и может опционально включать в себя компоненты (f) и/или (g). Также понятно, что в другой вариации среда включает в себя компоненты (a), (f) и (g) и может опционально включать в себя любой один или больше компонентов (b), (c), (d) и (e). В любой вариации, в которой среда включает в себя цистин или цистеин, в одном аспекте среда включает в себя цистин (и в дополнительной вариации не содержит цистеина). В любой вариации, в которой среда включает в себя витамин B6, в одном аспекте среда включает в себя пиридоксин. В любой вариации, в которой среда включает в себя источник железа, в одном аспекте источник железа представляет собой лимоннокислое железо. Таким образом, понятно, что в некоторых вариациях среда включает в себя цистин, пиридоксин и лимоннокислое железо. В одном аспекте среда для культивирования клеток является химически определенной средой.
[0077] В одной вариации среда включает в себя (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12. В одной вариации среда включает в себя (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и (f) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо. В другой вариации среда включает в себя каждый из (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; (f) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо; и (g) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона. В дополнительной вариации среда включает в себя: от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо; и от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона. В еще одной вариации среда включает в себя: от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона, и по меньшей мере один или два или три из: от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12. В любой описанной в настоящем документе среде в одном аспекте среда является химически определенной средой. В любой описанной в настоящем документе среде в одном аспекте среда является химически неопределенной средой клеточной культуры.
[0078] В некоторых дополнительных вариациях среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя цистеин в количестве, приведенном в Таблице 1. Например, понятно, что среда клеточной культуры, включающая в себя (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12 может дополнительно включать в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина. В одной вариации среда клеточной культуры, включающая в себя (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и (f) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо, может дополнительно включать в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина. В некоторых вариациях среда клеточной культуры, включающая в себя (a) от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; (b) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; (c) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; (d) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; (e) от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; (f) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо; и (g) от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона, может дополнительно включать в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина. В еще одной вариации среда клеточной культуры, включающая в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ источника железа, такого как лимоннокислое железо или сернокислое железо; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ гидрокортизона, и по меньшей мере один или два или три из: от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, может дополнительно включать в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина.
[0079] Отдельные компоненты сред могут присутствовать в таком количестве, которое приводит к одному или более выгодным свойствам (таким как один или более приемлемых качественных признаков продукта). В одной вариации среда клеточной культуры, предложенная в настоящем документе, содержит компоненты сред в количестве, показанном в Таблице 1. Понятно, что среда может включать в себя любой один или более компонентов среды, показанных в Таблице 1 (например, любой один или более из компонентов (a)-(g), например, среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d) и (e), или среда, включающая в себя компоненты (a), (f) и (g), или среда, включающая в себя каждый из компонентов (a)-(g)) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1, точно так же, как если бы каждая комбинация компонентов и их количества была бы перечислена конкретно и индивидуально. В конкретной вариации среда является химически определенной средой. В другой конкретной вариации среда является химически неопределенной средой клеточной культуры. Предложенная в настоящем документе среда (например, химически определенная среда) в одной вариации включает в себя пиридоксин и не содержит пиридоксаля. Среда без пиридоксаля может использоваться в базальных средах и/или в питательных средах. В одной вариации базальная среда не содержит пиридоксаля и включает в себя пиридоксин.
Таблица 1 Примерные количества компонентов среды |
|
Компонент сред | Количество компонента в среде |
(a) Цистин и/или цистеин (который в одной вариации является цистином) | от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 100 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1400 мг/л; от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1300 мг/л; от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1100 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1000 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 900 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 800 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 700 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 600 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 500 мг/л; от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 400 мг/л; от приблизительно 400 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 500 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 600 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 700 мг/л до приблизительно 1500 мг/л; от приблизительно 400 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 500 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 600 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 700 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 800 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 900 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 1000 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 1100 мг/л до приблизительно 1200 мг/л; от приблизительно 350 мг/л до приблизительно 850 мг/л; от приблизительно 400 мг/л до приблизительно 800 мг/л; от приблизительно 450 мг/л до приблизительно 550 мг/л; от приблизительно 450 мг/л до приблизительно 500 мг/л; приблизительно любое значение из 80 или 81 или 82 или 83 или 84 или 85 или 86 или 87 или 88 или 90 или 100 или 120 или 140 или 160 или 180 или 200 или 210 или 220 или 230 или 240 или 250 или 260 или 270 или 280 или 290 или 300 или 350 или 375 или 400 или 425 или 450 или 475 или 500 или 525 или 550 или 575 или 600 или 625 или 650 или 675 или 700 или 725 или 750 или 765 или 775 или 785 или 795 или 800 или 825 или 850 или 875 или 900 или 925 или 950 или 975 или 1000 или 1050 или 1100 или 1150 или 1200 или 1250 или 1300 или 1350 или 1400 или 1450 или 1500 мг/л; по меньшей мере приблизительно любое значение из 80 или 81 или 82 или 83 или 84 или 85 или 86 или 87 или 88 или 90 или 100 или 120 или 140 или 160 или 180 или 200 или 210 или 220 или 230 или 240 или 250 или 260 или 270 или 280 или 290 или 300 или 350 или 375 или 400 или 425 или 450 или 475 или 500 или 525 или 550 или 575 или 600 или 625 или 650 или 675 или 700 или 725 или 750 или 765 или 775 или 785 или 795 или 800 или 825 или 850 или 875 или 900 или 925 или 950 или 975 или 1000 или 1050 или 1100 или 1150 или 1200 или 1250 или 1300 или 1350 или 1400 или 1450 или 1500 мг/л. |
(b) витамин B2 | от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,9 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,8 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,7 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,6 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,4 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,3 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,2 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,1 мг/л; от приблизительно 0,1 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,2 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,3 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,4 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,5 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,6 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,7 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,8 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,9 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,1 мг/л до приблизительно 0,6 мг/л; от приблизительно 0,2 мг/л до приблизительно 0,4 мг/л; от приблизительно 0,2 мг/л до приблизительно 0,3 мг/л; приблизительно любое значение из 0,05 или 0,1 или 0,15 или 0,2 или 0,25 или 0,3 или 0,35 или 0,4 или 0,45 или 0,5 или 0,55 или 0,6 или 0,65 или 0,7 или 0,75 или 0,8 или 0,85 или 0,9 или 0,95 или 1,0 мг/л; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,05 или 0,1 или 0,15 или 0,2 или 0,25 или 0,3 или 0,35 или 0,4 или 0,45 мг/л и не более чем 0,7 или 0,6 мг/л. |
(c) витамин B6 (который в одном аспекте является пиридоксином) | от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 9,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 9,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 5,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 5,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 4,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 4,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 3,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 3,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 1,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 1,5 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 2,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 2,5 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 3,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 3,5 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 4,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 4,5 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 5,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 5,5 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 6,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 7,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 8,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 2,5 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л; от приблизительно 3,0 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л; от приблизительно 4,5 мг/л до приблизительно 6,5 мг/л; приблизительно любое значение из 1,0 или 2,0 или 3,0 или 3,5 или 4,0 или 4,5 или 5,0 или 5,5 или 6,0 или 6,5 или 7,0 или 8 мг/л; по меньшей мере приблизительно любое значение из 2,0 или 3,0 или 4,0 или 5,0 мг/л и не более чем 7,0 или 8,0 мг/л. |
(d) витамин B9 | от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 11,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 9,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 9,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 5,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 5,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 4,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 4,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 3,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 3,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,5 мг/л; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 1,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 1,5 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 2,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 2,5 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 3,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 3,5 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 4,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 4,5 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 5,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 5,5 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 6,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 7,0 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л; от приблизительно 8,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 3,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; от приблизительно 4,0 мг/л до приблизительно 9,0 мг/л; от приблизительно 7,0 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л; приблизительно любое значение из 1,0 или 2,0 или 3,0 или 4,0 или 4,5 или 5,0 или 5,5 или 6,0 или 6,5 или 7,0 или 7,5 или 8 или 8,5 или 9,0 или 9,5 или 10 мг/л; по меньшей мере приблизительно любое значение из 2,0 или 3,0 или 4,0 или 5,0 или 6,0 или 7,0 или 8,0 мг/л и не более чем 12,0 или 10,0 или 9,0 мг/л. |
(e) витамин B12 | от приблизительно 0,05 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 2,25 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,75 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,5 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,25 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 1,0 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,75 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,5 мг/л; от приблизительно 0,05 до приблизительно 0,25 мг/л; от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 0,75 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 1,25 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 1,75 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 2,0 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 2,25 до приблизительно 2,5 мг/л; от приблизительно 0,5 до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 1,25 до приблизительно 2,0 мг/л; от приблизительно 1,5 до приблизительно 2,25 мг/л; от приблизительно 0,75 до приблизительно 2,0 мг/л; приблизительно любое значение из 0,5 или 1,0 или 1,25 или 1,5 или 1,75 или 2,0 или 2,25 до приблизительно 2,5 мг/л; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,5 или 1,0 или 1,25 или 1,5 и не более чем 2,25 или 2,0 или 1,75 мг/л. |
(f) источник железа, такой как лимоннокислое железо | от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 15 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 20 мкМ; приблизительно любое значение из 5 или 10 или 15 или 20 или 25 или 30 или 35 или 40 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 2 или 5 или 10 или 12,5 или 15 или 17,5 и не более чем приблизительно 30 или 25 или 20 мкМ. |
(g) гидрокортизон | от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,15 мкМ; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,1 мкМ; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,075 мкМ; от приблизительно 0,075 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ; от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ; от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ; от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ; от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ; от приблизительно 0,125 мкМ до приблизительно 0,225 мкМ; от приблизительно 0,125 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ; от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,175 мкМ; приблизительно любое значение из 0,05 или 0,1 или 0,125 или 0,15 или 0,175 или 0,2 или 0,22 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,05 или 0,1 или 0,125 и не более чем 0,2 или 0,175 мкМ. |
[0080] В некоторых аспектах настоящее изобретение предлагает среду клеточной культуры, включающую в себя один или больше из следующих компонентов, выбранных из группы, состоящей из: (a) витамина B1; (b) витамина В2; (c) витамина B3; (d) витамина B5; (e) витамина B6; (f) витамина B7; (g) витамина B9; (h) витамина B12; (i) источника железа, такого как лимоннокислое железо; и (j) цистина. В некоторых вариантах осуществления среда для культивирования клеток включает в себя 2 или 3 или 4 или 5 или 6 или 7 или 8 или 9 или каждый из компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), и (j). Понятно, что предложенная в настоящем документе среда для культивирования клеток может содержать любую комбинацию компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), (i), и (j) точно так же, как если бы каждая комбинация была перечислена конкретно и индивидуально. Например, понятно, что среда клеточной культуры, включающая в себя восемь компонентов (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g) и (h), может включать в себя любую комбинацию компонентов, если присутствуют по меньшей мере восемь из этих компонентов. В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе клеточная культура включает в себя компоненты (b), (e), (g), (h) и (j). В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе клеточная культура, включающая в себя компоненты (b), (e), (g), (h) и (j), дополнительно включает в себя компоненты (a), (c), (d), и (f). В некоторых вариантах осуществления предложенная в настоящем документе клеточная культура, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) и (j), дополнительно включает в себя компонент (i).
[0081] В некоторых аспектах предложенная в настоящем документе среда для культивирования клеток содержит один или более компонентов среды, выбранных из группы, состоящей из (a) витамина B1; (b) витамина В2; (c) витамина B3; (d) витамина B5; (e) витамина B6; (f) витамина B7; (g) витамина B9; (h) витамина B12; (i) источника железа, такого как лимоннокислое железо; и (j) цистина, в количестве, показанном в Таблице 1A. Понятно, что среда может включать в себя любой один или больше компонентов среды, показанных в Таблице 1A (например, любой один или больше из компонентов (a)-(j), например, среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h) и (i), или среда, включающая в себя компоненты (b), (e), (g), (h) и (j), или среда, включающая в себя только один из компонентов (a)-(j)) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1A, точно так же, как если бы каждая комбинация компонентов и количества была перечислена конкретно и индивидуально. В некоторых аспектах среда для культивирования клеток включает в себя компоненты (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), и (i), причем (a) представляет собой от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 14 мкМ витамина B1, (b) представляет собой от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2, (c) представляет собой от приблизительно 11 мкМ до приблизительно 72 мкМ витамина B3, (d) представляет собой от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44 мкМ витамина B5, (e) представляет собой от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ витамина B6, (f) представляет собой от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7, (g) представляет собой от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22 мкМ витамина B9, (h) представляет собой от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, (i) представляет собой от приблизительно 11 мкМ до приблизительно 36 мкМ лимоннокислого железа, и (j) представляет собой от приблизительно 0,9 мМ до приблизительно 1,5 мМ цистина.
[0082] В некоторых дополнительных аспектах среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя цистеин в количестве, показанном в Таблице 1A. Например, понятно, что среда клеточной культуры, включающая в себя (a) от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 14 мкМ витамина B1, (b) от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2, (c) от приблизительно 11 мкМ до приблизительно 72 мкМ витамина B3, (d) от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44 мкМ витамина B5, (e) от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ витамина B6, (f) от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7, (g) от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22 мкМ витамина B9, (h) от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, (i) от приблизительно 11 мкМ до приблизительно 36 мкМ лимоннокислого железа, и (j) от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистина, может дополнительно включать в себя (k) от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина.
Таблица 1A Примерные количества компонентов среды |
|
Компонент | Количество компонента в среде |
(a) Витамин B1 | от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 16 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 14 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 12 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 8 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 6 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 4 мкМ; от приблизительно 1 мкМ до приблизительно 2 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 4 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 6 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 8 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 12 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 14 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 16 мкМ до приблизительно 18 мкМ; от приблизительно 1,5 мкМ до приблизительно 16 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 14 мкМ; от приблизительно 2,5 мкМ до приблизительно 12 мкМ; от приблизительно 3 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 3,5 мкМ до приблизительно 8 мкМ; от приблизительно 4 мкМ до приблизительно 6 мкМ; приблизительно любое значение из 1 или 2 или 4 или 6 или 8 или 10 или 12 или 14 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 1 или 2 или 4 или 6 мкМ и не более чем приблизительно 14 или 12 или 10 мкМ. |
(b) Витамин B2 | от приблизительно 0,09 мкМ до приблизительно 0,8 мкМ; от приблизительно 0,09 мкМ до приблизительно 0,6 мкМ; от приблизительно 0,09 мкМ до приблизительно 0,4 мкМ; от приблизительно 0,09 мкМ до приблизительно 0,2 мкМ; от приблизительно 0,09 мкМ до приблизительно 0,1 мкМ; от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,8 мкМ; от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 0,8 мкМ; от приблизительно 0,4 мкМ до приблизительно 0,8 мкМ; от приблизительно 0,6 мкМ до приблизительно 0,8 мкМ; от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,7 мкМ; от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 0,6 мкМ; от приблизительно 0,3 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ; от приблизительно 0,1 мкМ до приблизительно 0,76 мкМ; от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ; от приблизительно 0,12 мкМ до приблизительно 0,68 мкМ; от приблизительно 0,13 мкМ до приблизительно 0,64 мкМ; от приблизительно 0,14 мкМ до приблизительно 0,6 мкМ; приблизительно любое значение из 0,1 или 0,2 или 0,3 или 0,4 или 0,5 или 0,6 или 0,7 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,1 или 0,2 или 0,3 мкМ и не более чем приблизительно 0,8 или 0,7 или 0,6 мкМ. |
(c) Витамин B3 | от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 80 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 70 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 60 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 8,5 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 60 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 70 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 80 мкМ до приблизительно 86 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 80 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 70 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 60 мкМ; от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 9,5 мкМ до приблизительно 80 мкМ; от приблизительно 11 мкМ до приблизительно 72 мкМ; от приблизительно 12,5 мкМ до приблизительно 64 мкМ; от приблизительно 14 мкМ до приблизительно 56 мкМ; приблизительно любое значение из 10 или 11 или 15 или 20 или 30 или 40 или 50 или 60 или 70 или 72 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 9 или 10 или 11 или 12 или 13 мкМ и не более чем приблизительно 80 или 75 или 72 или 65 мкМ. |
(d) Витамин B5 | от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 5,4 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 50 мкМ до приблизительно 54 мкМ; от приблизительно 6 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 7 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 8 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 9 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 6,1 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 6,2 мкМ до приблизительно 49 мкМ; от приблизительно 6,3 мкМ до приблизительно 48 мкМ; от приблизительно 6,4 мкМ до приблизительно 47 мкМ; от приблизительно 6,5 мкМ до приблизительно 46 мкМ; от приблизительно 6,6 мкМ до приблизительно 45 мкМ; от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44 мкМ; приблизительно любое значение из 6 или 6,8 или 10 или 20 или 30 или 40 или 44 или 50 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 6 или 6,8 или 7 или 8 или 9 или 10 мкМ и не более чем приблизительно 50 или 44 или 40 или 35 мкМ. |
(e) Витамин B6 (который в одном аспекте является пиридоксином) | от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 15 мкМ; от приблизительно 4,0 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 32 мкМ; от приблизительно 5,0 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 5,0 мкМ до приблизительно 28 мкМ; от приблизительно 5,5 мкМ до приблизительно 26 мкМ; приблизительно любое значение из 4,0 или 4,5 или 5,0 или 10 или 15 или 20 или 30 или 32 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 4,0 или 4,5 или 5,0 или 6,0 мкМ и не более чем приблизительно 32 или 30 или 28 мкМ. |
(f) Витамин B7 | от приблизительно 0,016 мкМ до приблизительно 0,18 мкМ; от приблизительно 0,016 мкМ до приблизительно 0,15 мкМ; от приблизительно 0,016 мкМ до приблизительно 0,10 мкМ; от приблизительно 0,016 мкМ до приблизительно 0,05 мкМ; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,18 мкМ; от приблизительно 0,10 мкМ до приблизительно 0,18 мкМ; от приблизительно 0,15 мкМ до приблизительно 0,18 мкМ; от приблизительно 0,018 мкМ до приблизительно 0,16 мкМ; от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ; от приблизительно 0,022 мкМ до приблизительно 0,12 мкМ; от приблизительно 0,024 мкМ до приблизительно 0,10 мкМ; от приблизительно 0,026 мкМ до приблизительно 0,08 мкМ; от приблизительно 0,028 мкМ до приблизительно 0,06 мкМ; от приблизительно 0,030 мкМ до приблизительно 0,04 мкМ; приблизительно любое значение из 0,016 или 0,018 или 0,02 или 0,05 или 0,10 или 0,12 или 0,14 или 0,16 или 0,18 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,016 или 0,018 или 0,02 или 0,025 мкМ и не более чем приблизительно 0,18 или 0,16 или 0,14 или 0,12 мкМ. |
(g) Витамин B9 | от приблизительно 3,0 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 3,0 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 3,0 мкМ до приблизительно 15 мкМ; от приблизительно 3,0 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 3,0 мкМ до приблизительно 5,0 мкМ; от приблизительно 5,0 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 5,0 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 15 мкМ; от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22 мкМ; от приблизительно 3,8 мкМ до приблизительно 19 мкМ; от приблизительно 4,2 мкМ до приблизительно 16 мкМ; приблизительно любое значение из 3,0 или 3,4 или 4,0 или 5,0 или 10 или 15 или 20 или 22 или 25 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 3 или 3,4 или 4,0 или 5,0 мкМ и не более чем приблизительно 25 или 22 или 22 мкМ. |
(h) Витамин B12 | от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 1,75 мкМ; от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ; от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 1,25 мкМ; от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 1,0 мкМ; от приблизительно 0,18 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ; от приблизительно 0,25 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 0,75 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 1,0 до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 1,25 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 1,5 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 1,75 мкМ до приблизительно 2,0 мкМ; от приблизительно 0,25 мкМ до приблизительно 1,75 мкМ; от приблизительно 0,5 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ; от приблизительно 0,75 мкМ до приблизительно 1,25 мкМ; от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ; от приблизительно 0,4 мкМ до приблизительно 1,0 мкМ; приблизительно любое значение из 0,18 или 0,2 или 0,5 или 1,0 или 1,5 или 2,0 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,18 или 0,2 или 0,4 мкМ и не более чем приблизительно 2,0 или 1,75 или 1,5 или 1,25 мкМ. |
(i) источник железа, такой как лимоннокислое железо | от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 20 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 15 мкМ; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 10 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 20 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 25 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 30 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 40 мкМ до приблизительно 50 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 40 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 30 мкМ; от приблизительно 10 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 25 мкМ; от приблизительно 15 мкМ до приблизительно 20 мкМ; приблизительно любое значение из 5 или 10 или 15 или 20 или 25 или 30 или 35 или 40 мкМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 2 или 5 или 10 или 12,5 или 15 или 17,5 и не более чем приблизительно 30 или 25 или 20 мкМ. |
(j) цистин | от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,25 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 1,75 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 1,5 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 1,25 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 1,0 мМ; от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 1,6 мМ; от приблизительно 1,2 мМ до приблизительно 1,4 мМ; от приблизительно 1,25 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 1,75 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 2,0 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 2,25 мМ до приблизительно 2,5 мМ; от приблизительно 0,9 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 1,75 мМ; от приблизительно 0,9 мМ до приблизительно 1,5 мМ; от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 1,25 мМ; приблизительно любое значение из 0,7 или 0,8 или 0,9 или 1,0 или 1,1 или 1,2 или 1,3 или 1,4 или 1,5 или 1,6 мМ; любое значение из 0,7 мМ, 0,75 мМ, 0,8 мМ, 0,85 мМ, 0,9 мМ, 0,95 мМ, 1,0 мМ, 1,05 мМ, 1,1 мМ, 1,15 мМ, 1,2 мМ, 1,25 мМ, 1,3 мМ, 1,35 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,55 мМ, 1,6 мМ, 1,65 мМ, 1,7 мМ, 1,75 мМ, 1,8 мМ, 1,85 мМ, 1,9 мМ или 1,95 мМ или 2,0 мМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,7 или 0,8 или 0,9 или 1,0 или 1,1 мМ и не более чем приблизительно 2,0 или 1,75 или 1,6 или 1,5 или 1,4 мМ. |
(k) цистеин | от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 1,75 мМ; от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 1,5 мМ; от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 1,25 мМ; от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 1,0 мМ; от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 0,75 мМ; от приблизительно 0,6 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 1,0 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 1,25 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 1,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ; от приблизительно 1,75 мМ до приблизительно 2,0 мМ; приблизительно любое значение из 0,5 или 0,6 или 0,7 или 0,8 или 0,9 или 1,0 или 1,1 или 1,2 или 1,3 или 1,4 или 1,5 или 1,6 или 1,7 или 1,8 или 1,9 или 2,0 мМ; любое значение из 0,5 мМ, 0,55 мМ, 0,6 мМ, 0,65 мМ, 0,7 мМ, 0,75 мМ, 0,8 мМ, 0,85 мМ, 0,9 мМ, 0,95 мМ, 1,0 мМ, 1,05 мМ, 1,1 мМ, 1,15 мМ, 1,2 мМ, 1,25 мМ, 1,3 мМ, 1,35 мМ, 1,4 мМ, 1,5 мМ, 1,55 мМ, 1,6 мМ, 1,65 мМ, 1,7 мМ, 1,75 мМ, 1,8 мМ, 1,85 мМ, 1,9 мМ, 1,95 мМ, или 2,0 мМ; по меньшей мере приблизительно любое значение из 0,5 или 0,6 или 0,7 или 0,8 или 0,9 или 1,0 или 1,1 мМ и не более чем приблизительно 2,0 или 1,8 или 1,75 или 1,6 или 1,5 или 1,4 мМ. |
[0083] Предлагаемая в настоящем документе среда (например, химически определенная среда или среда неопределенного химического состава) в одной вариации включает в себя цистин и не содержит цистеина. Среда без цистеина может использоваться в базальных средах или в питательных средах. В одной вариации базальная среда является не содержащей цистеина и включает в себя цистин. В одной вариации базальная среда, включающая в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, которая в одном аспекте может дополнительно включать в себя любой один или больше из: (1) витамина B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамина B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамина B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ) и (4) витамина B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ), является не содержащей цистеин. В другой вариации базальная среда, включающая в себя от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых вариантах осуществления 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22 мкМ витамина B9; и от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, которая в одном аспекте может дополнительно включать в себя любой один или больше из: (1) витамина B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамина B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамина B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ) и (4) витамина B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ), не содержит цистеина. В любой вариации в настоящем документе базальная среда может дополнительно включать в себя источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ). В любой вариации в настоящем документе базальные среды могут дополнительно включать в себя гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ).
[0084] Предлагаемая в настоящем документе среда (например, химически определенная среда или среда неопределенного химического состава) в одной вариации включает в себя цистеин и не содержит цистина. Среда без цистина может использоваться в базальных средах или в питательных средах. В одной вариации питательная среда не содержит цистина и включает в себя цистеин. В одной вариации питательная среда включает в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина. В другой вариации питательная среда включает в себя от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина. Например, базальная среда, включающая в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых аспектах 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2; от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12, которая в одном аспекте может дополнительно включать в себя любой один или больше из: (1) витамина B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамина B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамина B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (4) витамина B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ), может быть подкреплена питательной средой, включающей в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина (в некоторых аспектах от 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина). В другой вариации базальная среда, включающая в себя от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых аспектах 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2; от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30 мкМ витамина B6 (который в одном аспекте является пиридоксином); от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22 мкМ витамина B9; и от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12, которая в одном аспекте может дополнительно включать в себя любой один или больше из: (1) витамина B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамина B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамина B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (4) витамина B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ) может быть подкреплена питательной средой, включающей в себя от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина (в некоторых аспектах от 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина). В любой вариации в настоящем документе базальная среда может дополнительно включать в себя источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ). В любой вариации в настоящем документе базальные среды могут дополнительно включать в себя гидрокортизон (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ).
[0085] Предлагаемая в настоящем документе среда (например, химически определенная среда или среда неопределенного химического состава) в одной вариации включает в себя лимоннокислое железо и не содержит сернокислого железа. Среда без сернокислого железа может использоваться в базальных средах или в питательных средах. В одной вариации базальная среда не содержит сернокислого железа и включает в себя лимоннокислое железо.
[0086] В одной конкретной вариации предлагаемая в настоящем документе среда не содержит цистеина и сернокислого железа. В одной такой вариации среда не содержит цистеина и сернокислого железа и включает в себя цистин и/или лимоннокислое железо.
[0087] Предлагаемая в настоящем документе среда в одной вариации не содержит гидрокортизона. В другой вариации среда включает в себя гидрокортизон. В одном аспекте среда включает в себя гидрокортизон и не содержит цистеина и/или сернокислого железа. В другом аспекте среда включает в себя гидрокортизон, а также цистин и лимоннокислое железо. В одной конкретной вариации среда, включающая в себя гидрокортизон, является базальной средой. В одной вариации базальная среда включает в себя от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых аспектах 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона, причем базальная среда может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л); (2) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л); (3) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л); и (4) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л). В другой вариации базальная среда включает в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых аспектах 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина; от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона, причем базальная среда может дополнительно включать в себя один или больше из следующих компонентов: (1) витамин В2 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л); (2) витамин B6 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л); (3) витамин B9 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л); и (4) витамин B12 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л). В любой из вариаций в настоящем документе базальная среда может дополнительно включать в себя любой один или больше из: (1) витамина B1 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ), (2) витамина B3 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ), (3) витамина B5 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ), и (4) витамина B7 (который в одном аспекте присутствует в концентрации от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ).
[0088] Также предлагается способ приготовления среды для культивирования клеток для использования в культивировании клеток, который включает в себя комбинирование любого одного или больше компонентов среды, выбранных из группы, состоящей из (a) цистина и/или цистеина; (b) витамина В2, (c) витамина B6 (пиридоксина и/или пиридоксаля), (d) витамина B9, (e) витамина B12, (f) источника железа, такого как лимоннокислое железо и (g) гидрокортизона, в котором каждый из компонентов (a)-(g) предусматривается в количестве, описанном в Таблице 1. Также в настоящем документе предлагается способ приготовления среды для культивирования клеток для использования в культивировании клеток, который включает в себя комбинирование любого одного или больше количества компонентов среды, выбранных из группы, состоящей из (a) витамина B1; (b) витамина В2; (c) витамина B3; (d) витамина B5; (e) витамина B6; (f) витамина B7; (g) витамина B9; (h) витамина B12; (i) источника железа, такого как лимоннокислое железо; (j) цистина; и (k) цистеина, в количестве, описанном в Таблице 1A. В одной вариации способ включает в себя добавление любого одного или больше компонентов среды, описанных в настоящем документе (например, в Таблице 1 или в Таблице 1A), к композиции, подходящей для клеточной культуры, причем один или больше компонентов среды могут добавляться к композиции последовательно или одновременно. В дополнительной вариации способ включает в себя комбинирование любого одного или больше компонентов среды, описанных в настоящем документе (например, в Таблице 1 или в Таблице 1A) в композицию, подходящую для для культивирования клеток в первый период времени, причем способ дополнительно включает в себя добавление некоторого количества одного или более компонентов среды во второй период времени, например по меньшей мере один раз, по меньшей мере два раза, по меньшей мере три раза, по меньшей мере четыре раза, по меньшей мере пять раз, по меньшей мере шесть раз, по меньшей мере семь раз, и т.д. во время цикла клеточной культуры. В некоторых вариантах осуществления цикл клеточной культуры составляет по меньшей мере 1 день, 2 дня, 3 дня, 4 дня, 5 дней, 6 дней, 7 дней, 8 дней, 9 дней, 10 дней, 11 дней, 12 дней, 13 дней, 14 дней, 15 дней, 16 дней, 17 дней, 18, дни, 19 дней, 20 дней, или любое количество дней, в течение которого клетки могут оставаться в клеточной культуре, все еще оставаясь жизнеспособными. В одной вариации способа приготовления среды для культивирования клеток для использования в культивировании клеток цистин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 300 мг/л (в некоторых аспектах 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина, витамин В2 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2, витамин B6 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6, витамин B9 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9, и витамин B12 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12 в среде клеточной культуры. В другой вариации способа приготовления среды для культивирования клетокдля использования в культивировании клеток цистин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых аспектах 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина, витамин В2 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2, витамин B6 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6, витамин B9 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9, и витамин B12 добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12 в среде клеточной культуры.
[0089] В некоторых вариациях в настоящем документе среда для культивирования клеток является базальной средой клеточной культуры. В других вариациях в настоящем документе среда для культивирования клеток является питательной средой клеточной культуры. В некоторых вариациях в настоящем документе среда для культивирования клеток является базальной средой клеточной культуры, включающей в себя любой один или больше компонентов среды, выбранных из группы, состоящей из (a) цистина; (b) витамина В2, (c) витамина B6 (пиридоксина и/или пиридоксаля), (d) витамина B9, (e) витамина B12, (f) источника железа, такого как лимоннокислое железо, и (g) гидрокортизона, в количестве, указанном в Таблице 1, причем базальная среда для культивирования клеток подкрепляется (например, в период времени, следующий после инициирования цикла клеточной культуры, такой как любой из по меньшей мере двух раз, по меньшей мере трех раз, по меньшей мере четырех раз, по меньшей мере пяти раз, по меньшей мере шести раз, по меньшей мере семи раз и т.д. за цикл клеточной культуры) питательной средой клеточной культуры, включающей в себя (a) цистеин в количестве, указанном в Таблице 1. В некоторых вариациях в настоящем документе среда для культивирования клеток является базальной средой клеточной культуры, включающей в себя любой один или больше компонентов среды, выбранных из группы, состоящей из (a) витамина B1; (b) витамина В2; (c) витамина B3; (d) витамина B5; (e) витамина B6; (f) витамина B7; (g) витамина B9; (h) витамина B12; (i) источника железа, такого как лимоннокислое железо; и (j) цистина в количестве, указанном в Таблице 1A, причем базальная среда для культивирования клеток подкрепляется (например, в период времени, следующий после инициирования цикла клеточной культуры, такой как любой из по меньшей мере двух раз, по меньшей мере трех раз, по меньшей мере четырех раз, по меньшей мере пяти раз, по меньшей мере шести раз, по меньшей мере семи раз и т.д. за цикл клеточной культуры) питательной средой клеточной культуры, включающей в себя (k) цистеин в количестве, указанном в Таблице 1A.
[0090] Как будет понятно специалисту в данной области техники, среды клеточной культуры, подробно описанные в настоящем документе, могут включать в себя другие компоненты (например, кроме одного или больше из цистина, витамина B1, витамина В2, витамина B3, витамина B5, витамина B6, витамина B7, витамина B9 и витамина B12, железа и опционально гидрокортизона), которые полезны для клеточной культуры. Например, понятно, что среды для культивирования клеток могут включать в себя дополнительные компоненты, такие как аминокислоты (например, глютамин, аргинин или аспарагин), витамины (включая, но не ограничиваясь этим, аскорбиновую кислоту), микроэлементы, переходные металлы (включая, но не ограничиваясь этим, никель, медь или цинк), и другие компоненты среды, такие как, не ограничиваясь этим, продукт гидролиза, полученный из животных и/или растений. Любые среды, предложенные в настоящем документе, также могут быть подкреплены гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), и глюкозой или эквивалентным источником энергии. Дополнительные компоненты среды клеточной культуры, такие как перечисленные в настоящем документе, могут быть включены в среду для культивирования клеток в подходящих концентрациях в различные моменты времени в течение цикла клеточной культуры, который известен специалистам в данной области техники.
[0091] Предложенная в настоящем документе среда в одном аспекте приводит к одному или более благоприятным качественным признакам продукта при использовании в способе производства полипептидов по сравнению с качественными признаками полипептидов, произведенных в другой среде. Производство белкового продукта (например, антител) с измененным распределением вариантов, отличающихся зарядами, может воздействовать на качественные признаки белкового продукта, такие как цвет белковых продуктов. В дополнение к этому, реакционноспособные разновидности кислорода (ROS), образуемые при использовании определенных компонентов среды, могут окислять конкретные аминокислоты и образовывать продукты окисления. Присутствие таких разновидностей продукта может также изменить качественные признаки белкового продукта, такие как цвет. Цвет композиции, включающей в себя полипептид, произведенный с использованием подробно описанной в настоящем документе среды (включая композицию, включающую в себя по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл полипептида, такого как антитело) в одном аспекте имеет значение цвета исходного эталона, описанное в Таблице 2. В конкретных вариациях цвет композиции, включающей в себя полипептид, произведенный с использованием подробно описанной в настоящем документе среды (включая композицию, включающую в себя по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл полипептида, такого как антитело) в одном аспекте имеет значение цвета исходного эталона, выбранное из группы, состоящей из B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, GY3, GY4, GY5, GY6, GY7, R3, R4, R5, R6 и R7. В другом аспекте цвет композиции, включающей в себя полипептид, произведенный с использованием подробно описанной в настоящем документе среды (включая композицию, включающую в себя по меньшей мере 1 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл полипептида, такого как антитело) в одном аспекте имеет значение цвета исходного эталона, описанное в Таблице 2. В некоторых вариациях цвет композиции, включающей в себя полипептид, произведенный с использованием подробно описанной в настоящем документе среды (включая композицию, включающую в себя по меньшей мере 1 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл полипептида, такого как антитело) в одном аспекте имеет значение цвета исходного эталона, выбранное из группы, состоящей из B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, GY3, GY4, GY5, GY6, GY7, R3, R4, R5, R6 и R7. Для описания значений цвета исходного эталона коричневый (B), коричневато-желтый, желтый (Y), зеленовато-желтый (GY) или красный (R), см. публикации USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927 и Council of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 7th Ed. P.22. В одной вариации предлагаемая в настоящем документе среда уменьшает присутствие вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), при использовании в способе олучения полипептида по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами (например, кислыми вариантами, отличающимися зарядами), получаемыми при производстве полипептида в другой среде. В другой вариации среда уменьшает присутствие реакционноспособных разновидностей кислорода при использовании в способе получения полипептида по сравнению с реакционноспособными разновидностями кислорода, получаемыми при производстве полипептида в другой среде. В другой вариации среда уменьшает присутствие загрязнителей при использовании в способе получения полипептида по сравнению с загрязнителями, получаемыми при производстве полипептида в другой среде.
[0092] Предлагаются описанные в настоящем документе различные способы (такие как способы культивирования клеток и способы получения полипептидов), которые используют среды клеточной культуры, описанные в данном разделе, а также в других местах.
Способы
[0093] Среды клеточной культуры, подробно описанные в настоящем документе (включая любые химически определенные среды или среды неопределенного химического состава, подробно описанные в настоящем документе), могут использоваться в способе культивирования клеток для получения полипептидов, включая специфические антитела. Среда может использоваться в способе культивирования клеток независимо от того, используется ли пакетная культура, питаемая пакетная клеточная культура или перфузионная культура, и может использоваться в способе производства антител, включая любые аспекты или вариации или варианты осуществления антитела, описанные в настоящем документе.
[0094] Предлагаются способы выращивания клеток (то есть, культивирования клеток) путем контактирования клеток со средой клеточной культуры, как подробно описано в настоящем документе. В одной вариации способ включает в себя контактирование клеток со средой клеточной культуры, включающей в себя один или больше компонентов среды, показанных в Таблице 1 (например, среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d) и (e), или среда, включающая в себя компоненты (a), (f) и (g), или среда, включающая в себя каждый из компонентов (a)-(g) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1). В одной вариации способ включает в себя контактирование клеток со средой клеточной культуры, включающей в себя один или больше компонентов среды, показанных в Таблице 1A (например, среда, включающая в себя компоненты (a)-(j), или среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), и (i), или среда, включающая в себя компоненты (b), (e), (g), (h) и (j) или среда, включающая в себя только один из компонентов (a)-(j) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1A). В конкретной вариации способа выращивания клеток (то есть, культивирования клеток) среда для культивирования клеток является химически определенной средой. В одном аспекте данных способов клетки выращиваются (то есть, культивируются) в химически определенной базальной среде. В другой конкретной вариации способа выращивания клеток (то есть, культивирования клеток) среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры. В одном аспекте данных способов клетки выращиваются (то есть, культивируются) в химически неопределенной базальной среде клеточной культуры. В некоторых аспектах клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы роста клеток. В некоторых аспектах клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время стадии производства клеток. В некоторых аспектах способ дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры. В дополнительном аспекте цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В другом дополнительном аспекте цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В еще одном дополнительном аспекте цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В другом дополнительном аспекте цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина в среде клеточной культуры. В еще одном дополнительном аспекте цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить до приблизительно 0,8 мМ цистеина в среде клеточной культуры.
[0095] Также предлагаются способы получения полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в которых: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) химически определенная среда для культивирования клеток включает в себя один или больше компонентов среды, описанных в Таблице 1 (например, среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d) и (e), или среда, включающая в себя компоненты (a), (f) и (g), или среда, включающая в себя каждый из компонентов (a)-(g) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1). В другой вариации предлагаются способы получения полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в которых: (a) клетка экспрессирует полипептид и (b) среда для культивирования клеток включает в себя один или более компонентов среды, описанных в Таблице 1A (например, среда, включающая в себя компоненты (a)-(j), или среда, включающая в себя компоненты (a), (b), (c), (d), (e), (f), (g), (h), и (i), или среда, включающая в себя компоненты (b), (e), (g), (h) и (j), или среда, включающая в себя только один из компонентов (a)-(j) в любом количестве, перечисленном в Таблице 1A). В одной конкретной вариации способа получения полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде клеточной культуры) клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, среда для культивирования клеток является химически определенной средой. В одном аспекте данных способов клетки выращиваются (то есть, культивируются) в базальной химически определенной среде. В другой конкретной вариации способа получения полипептида путем выращивания в среде для культивирования клеток (то есть, культивирования в среде для культивирования клеток) клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, среда для культивирования клетокявляется химически неопределенной средой клеточной культуры. В одном аспекте данных способов клетки выращиваются (то есть, культивируются) в химически неопределенной базальной среде клеточной культуры. В некоторых аспектах культивирование осуществляется во время фазы роста клетки. В некоторых аспектах культивирование осуществляется во время фазы производства клетки. В некоторых вариациях способ дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры. В дополнительной вариации цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В другой дополнительной вариации цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В еще одной дополнительной вариации цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры. В другой дополнительной вариации цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ цистеина в среде клеточной культуры. В еще одной дополнительной вариации цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить до приблизительно 0,8 мМ цистеина в среде клеточной культуры.
[0096] Также предлагаются способы назначения полипептида, подробно описанные в настоящем документе. Например, предлагается способ назначения человеку рецептуры, включающей в себя полипептид, в которой полипептид содержится в концентрации больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и которая имеет значение интенсивности цвета, измеренное пробой COC, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах значение интенсивности цвета, определенное пробой COC, может быть любым из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY или R, причем более высокие значения указывают более светлую интенсивность цвета. В другом примере предлагается способ назначения человеку рецептуры, включающей в себя полипептид, в которой полипептид содержится в концентрации больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и которая имеет значение интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). Рецептуры полипептидов могут назначаться любым подходящим способом, включая парентеральный, внутрилегочный и интраназальный, и, если это желательно для местного лечения, введение внутрь повреждения. Парентеральные инъекции включают в себя внутримышечное, внутривенное, внутриартериальное, внутрибрюшное или подкожное введение. Дозировка может осуществляться любым подходящим способом, например, инъекциями, такими как внутривенные или подкожные инъекции, в зависимости частично от того, является ли назначение кратковременным или долговременным. Соответственно, предлагаемые в настоящем документе содержащие полипептид рецептуры могут быть подходящими для инъекций, таких как подкожная инъекция индивиду (например, подкожная инъекция человеку). В некоторых аспектах содержащие полипептид рецептуры, подходящие для инъекции (например, подходящие для подкожной инъекции), имеют концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеют значение интенсивности цвета, измеренное пробой COC, больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах определенное пробой COC значение интенсивности цвета может быть любым из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY, или R, причем более высокие значения указывают на более светлую интенсивность цвета. В некоторых аспектах содержащие полипептид рецептуры, подходящие для инъекции (например, подходящие для подкожной инъекции), имеют концентрацию больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеют значение интенсивности цвета меньше чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). В настоящем документе также рассматриваются различные планы дозировки, включая, но не ограничиваясь этим, однократные или многократные назначения в различные моменты времени, назначение болюса, а также пульсовую инфузию.
[0097] Также предлагаются другие способы, например в разделе «КРАТКАЯ СУЩНОСТЬ ИЗОБРЕТЕНИЯ», а также в других местах.
Клетки
[0098] Предлагаемые способы и композиции могут использовать любую клетку, которая является подходящей для выращивания и/или получения полипептида (например, антитела) в описанной в настоящем документе среде, включая клетки животных, дрожжей или насекомых. В одном аспекте клетка способов и композиций является любой клеткой млекопитающего, или типом клетки, подходящим для культивирования и экспрессии полипептидов. Следовательно, предлагаемые в настоящем документе способы (например, способы выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) и/или получения полипептида), а также композиции могут использовать любой подходящий тип клетки, включая клетку животного. В одном аспекте эти способы и композиции используют клетку млекопитающего. Данные способы и композиции могут также использовать клетки гибридомы. В одной вариации клетка млекопитающего представляет собой негибридомную клетку млекопитающего, которая была трансформирована экзогенной выделенной нуклеиновой кислотой, кодирующей желаемый полипептид, такой как антитело, фрагмент антитела (включая связанный лигандом фрагмент), и химерные антитела. В одной вариации данные способы и композиции используют клетки млекопитающего, выбранные из группы, состоящей из человеческих ретинобластов (PER.C6 (CruCell, Лейден, Нидерланды)); клеток почки обезьяны линии CV1, трансформированных с помощью SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); человеческой эмбриональной почечной линии (клетки 293 или клетки 293, субклонированные для выращивания в суспензии, см. публикацию Graham et al., J. Gen Virol., 36:59 (1977)); клеток почек новорожденных хомяков (BHK, ATCC CCL 10); клеток яичников Китайского хомячка/-DHFR (CHO, см. публикацию Urlaub and Chasin, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77:4216 (1980)); клеток сертоли мыши (TM4, см. публикацию Mather, Biol. Reprod., 23:243-251 (1980)); клеток почки обезьяны (CV1 ATCC CCL 70); клеток почки африканских зеленых обезьян (VERO-76, ATCC CRL-1 587); человеческих цервикальных клеток рака (HeLa, ATCC CCL 2); собачьих почечных клеток (MDCK, ATCC CCL 34); клеток печени буйволовых крыс (BRL 3A, ATCC CRL 1442); человеческих клеток легкого (W138, ATCC CCL 75); человеческих клеток печени (Hep G2, HB 8065); клеток опухоли молочной железы мыши (MMT 060562, ATCC CCL51); клеток TRI (см. публикацию Mather et al., Annals N.Y. Acad. Sci., 383:44-68 (1982)); клеток MRC 5; клеток FS4; а также линии человеческих клеток гепатомы (Hep G2). В одной конкретной вариации данные способы и композиции используют клетки CHO. В одной конкретной вариации используется культивирование клеточных линий CHO и экспрессия полипептидов (например, антител) из клеточных линий CHO. Полипептиды (например, антитела) могут быть выделены в среду (например, в химически определенную среду), из которой полипептиды могут быть выделены и/или очищены, или полипептид может быть выпущен в среду при распаде клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид.
[0099] Способы, векторы и клетки-хозяева, подходящие для адаптации к синтезу интересующего полипептида в рекомбинантной клеточной культуре позвоночных, известны в данной области техники и описываются, например, в публикациях Gething et al., Nature, 293:620-625 (1981); Mantei et al., Nature, 281:40-46 (1979); Levinson et al.; EP 117060; и EP 117058. Особенно полезной плазмидой для экспрессии полипептида клеточной культурой млекопитающего является pRK5 (EP 307247) или pSVI6B (международная патентная заявка PCT WO 91/08291, опубликованная 13 июня 1991).
[0100] Клетки-хозяева трансформируются с векторами экспрессии или клонирующими векторами и культивируются в питательных средах, модифицированных по мере необходимости для стимулирования активаторов, выбора трансформантов или амплификации генов, кодирующих желаемые последовательности. Для клеток млекопитающих предпочтительным является способ осаждения фосфорнокислым кальцием (см. публикацию Graham and van der Erb, Virology, 52:456-457 (1978)) или способ Lipofectamine™ (Gibco BRL), см. публикацию Hawley-Nelson, Focus 15:73 (1193). Общие аспекты трансформации системы клеток-хозяев млекопитающих известны в данной области техники и были описаны, например, Акселем (Axel) в патенте США № 4399216, выданном 16 августа 1983 г. Различные методики для трансформации клеток млекопитающих описаны, например, в публикациях Keown et al., Methods in Enzymology (1989), Keown et al., Methods in Enzymology, 185:527-537 (1990), и Mansour et al., Nature, 336:348-352 (1988).
[0101] Данные способы и композиции также охватывают использование гибридом, которые выделяют моноклональные антитела в клеточной культуре. Моноклональные антитела приготавливаются путем выделения иммунных клеток (обычно клеток селезенки или лимфоцитов из ткани лимфатического узла) из иммунизированных животных и увековечивания клетки обычным способом, например, путем слияния с миеломными клетками или путем трансформации в вирус Эпштейна-Барра (EB) и проверки клонов на экспрессию желаемого антитела. Методика гибридомы, описанная первоначально в публикации Kohler and Milstein, Eur. J. Immunol., 6:511 (1976), а также, описанная в публикации Hammerling et al., In: Monoclonal Antibodies and T-Cell Hybridomas, Elsevier, N.Y., pp. 563-681 (1981), широко применяется для производства гибридных клеточных линий, которые выделяют высокие уровни моноклональных антител против многих специфических антигенов.
Полипептиды
[0102] Полипептиды, полученные композициями (клетками) и способами, подробно описанными в настоящем документе, и присутствующие в предложенных в настоящем документе композициях, могут быть гомологичными клетке-хозяину, или предпочтительно могут быть экзогенными, что означает, что они являются ксеногенными, то есть, чужеродными, по отношению к используемой клетке-хозяину, такими как человеческий белок, произведенный клеткой яичника китайского хомячка, или дрожжевой полипептид, произведенный клеткой млекопитающего. В одной вариации полипептид является полипептидом млекопитающего (таким как антитело), непосредственно выделяемым в среду клеткой-хозяином. В другой вариации полипептид выпускается в среду при распаде клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую данный полипептид.
[0103] В одной вариации полипептид является последовательностью аминокислот, для которых длина цепи достаточна для того, чтобы производить более высокие уровни третичной и/или четвертичной структуры. В одном аспекте полипептид будет иметь молекулярную массу по меньшей мере приблизительно 5-20 кДа, альтернативно по меньшей мере приблизительно 15-20 кДа, предпочтительно по меньшей мере приблизительно 20 кДа.
[0104] Любой полипептид, который является экспрессируемым в клетке-хозяине, может быть получен в соответствии с настоящим раскрытием и может присутствовать в предложенных композициях. Полипептид может быть экспрессирован из гена, который является эндогенным по отношению к клетке-хозяину, или из гена, который вводится в клетку-хозяина посредством генной инженерии. Полипептид может быть полипептидом, который встречается в природе, или альтернативно может иметь последовательность, которая была спроектирована или выбрана рукой человека. Спроектированный полипептид может быть собран из других полипептидных сегментов, которые по отдельности встречаются в природе, или может включать в себя один или более сегментов, которые не встречаются в природе.
[0105] Полипептиды, которые в соответствии с желанием могут быть экспрессированы в соответствии с настоящим изобретением, часто будут выбираться на основе интересной биологической или химической активности. Например, настоящее изобретение может использоваться для того, чтобы экспрессировать любой фармацевтически или коммерчески важный фермент, рецептор, антитело, гормон, регулирующий фактор, антиген, связующее вещество и т.д.
[0106] Различные полипептиды могут быть получены в соответствии с предложенными в настоящем документе способами, и могут присутствовать в предложенных в настоящем документе композициях. Примеры бактериальных полипептидов включают в себя, например, щелочную фосфатазу и β-лактамазу. Примеры полипептидов млекопитающих включают в себя молекулы, такие как ренин, гормон роста, включая человеческий гормон роста; гормон роста крупного рогатого скота; релизинг-фактор гормона роста; паратиреоидный гормон; гормон, стимулирующий деятельность щитовидной железы; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, фактор ткани, и фактор фон Виллебрандса; препятствующие свертыванию крови факторы, такие как Протеин C; предсердный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество легкого; активатор плазминогена, такой как урокиназа или человеческая моча или активатор плазмогена тканевого типа (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа- и бета-фактор некроза опухоли; энкефалиназу; RANTES (хемокин, выделяемый T-клетками при активации); человеческий макрофагальный воспалительный белок (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующее вещество Мюллера; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; связанный с гонадотропином белок мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; дезоксирибонуклеазу; ингибин; активин; сосудистый фактор эндотелиального роста (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; интегрин; протеин A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как получаемый из костей нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), инсулиноподобные связывающие белки фактора роста (IGFBPs); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8 и CD19; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как альфа-, бета- и гамма-интерферон; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлeйкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксид-дисмутазу; рецепторы Т-клеток; поверхностные мембранные белки; фактор ускорения затухания; вирусный антиген, такой как, например, часть защитного покрытия вируса СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регулирующие белки; антитела; а также фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
[0107] Антитела являются примерами полипептидов млекопитающих, произведенных в соответствии с предложенными в настоящем документе способами и которые могут присутствовать в предложенных композициях. Антитела являются предпочтительным классом полипептидов, которые демонстрируют специфичность связывания с конкретным антигеном. Естественные антитела обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами с молекулярной массой приблизительно 150000 Дальтон, составленными из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связывается с тяжелой цепью одним ковалентным дисульфидным мостиком, в то время как число дисульфидных связей для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина является различным. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет внутрицепные дисульфидные связи с равными интервалами. У каждой тяжелой цепи на одном ее конце имеется переменный домен (VH), за которым следует ряд постоянных доменов. У каждой легкой цепи на одном ее конце имеется переменный домен (VL), а на другом ее конце - постоянный домен; постоянный домен легкой цепи выровнен с первым постоянным доменом тяжелой цепи, а переменный домен легкой цепи выровнен с переменным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные остатки аминокислоты формируют интерфейс между переменными доменами легкой и тяжелой цепей.
[0108] Антитела являются естественными молекулами иммуноглобулина, которые имеют изменяющиеся структуры, основанные на характерной для иммуноглобулинов укладке цепи. Например, антитела IgG имеют две «тяжелых» цепи и две «легких» цепи, которые связаны дисульфидными мостиками и образуют функциональное антитело. Каждая тяжелая и легкая цепь включает в себя «постоянную» (C) и «переменную» (V) области. Переменные области определяют антигенсвязывающую специфичность антитела, в то время как постоянные области обеспечивают структурную поддержку и участвуют в антигенно-неспецифичных взаимодействиях с иммунными эффекторами. Антигенсвязывающая специфичность антитела или антигенсвязывающий фрагмент антитела является способностью антитела специфично связываться с конкретным антигеном.
[0109] Антигенсвязывающая специфичность антитела определяется структурными характеристиками V-области. Вариабельность неравномерно распределяется между 110 аминокислотами переменных доменов. Вместо этого эти V-области состоят из относительно инвариантных участков, называемых каркасными областями (FR), состоящими из 15-30 аминокислот, разделенных более короткими областями чрезвычайной вариабельности, называемыми «гипервариабельными участками», каждый из которых имеет в длину 9-12 аминокислот. Переменные домены естественных тяжелых и легких цепей включают в себя каждый четыре каркасные области, принимая в значительной степени конфигурацию β-листа, соединенную тремя гипервариабельными участками, которые формируют петли, соединяющие, и в некоторых случаях являющиеся частью, структуры β-листа. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга каркасными областями, и вместе с гипервариабельными участками другой цепи способствуют формированию антигенсвязывающего участка антител (см. публикацию Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)). Постоянные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC).
[0110] Каждая V-область обычно включает в себя три области определения комплементарности («CDR», каждый из которых содержит «гипервариабельную петлю»), и четыре каркасные области. Следовательно, связывающая область антитела, минимальный структурный блок, требуемый для связывания с существенным сродством с конкретным желаемым антигеном, будет обычно включать в себя эти три области определения комплементарности, а также по меньшей мере три, предпочтительно четыре, каркасные области, распределенные между ними для того, чтобы удерживать и представлять области определения комплементарности в подходящей конформации. Классические четырехцепочечные антитела имеют антигенсвязывающие участки, которые определяются совместно доменами VH и VL. Некоторые антитела, такие как антитела верблюда и акулы, испытывают недостаток в легких цепях и полагаются только на связывающие участки, сформированные тяжелыми цепями. Могут быть приготовлены спроектированные однодоменные иммуноглобулины, в которых связывающие участки формируются тяжелыми цепями или одними только легкими цепями, при отсутствии сотрудничества между VH и VL.
[0111] Термин «вариабельный» относится к тому факту, что некоторые части переменных доменов экстенсивно различаются по своей последовательности среди антител и используются в связывании и специфичности каждого конкретного антитела для его конкретного антигена. Однако вариабельность не распределяется по переменным доменам антител неравномерно. Она сконцентрирована в трех сегментах, называемых гипервариабельными участками, в переменных доменах как легкой цепи, так и тяжелой цепи. Более устойчивые части переменных доменов называются каркасными областями (FR). Переменные домены естественных тяжелых и легких цепей включают в себя по четыре FR, принимая в значительной степени конфигурацию β-листа, соединенную тремя гипервариабельными участками, которые формируют соединение петель структуры β-листа и в некоторых случаях формируют их часть. Гипервариабельные участки в каждой цепи удерживаются в непосредственной близости друг от друга каркасными областями, и вместе с гипервариабельными участками другой цепи способствуют формированию антигенсвязывающего участка антител (см. публикацию Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD. (1991)). Постоянные домены не вовлечены непосредственно в связывание антитела с антигеном, но выполняют различные эффекторные функции, такие как участие антитела в зависимой от антитела клеточной цитотоксичности (ADCC).
[0112] Используемый в настоящем документе термин «гипервариабельный участок» относится к аминокислотным остаткам антитела, которые ответственны за связывание антигена. Гипервариабельный участок может включать в себя аминокислотные остатки из «области определения комплементарности» или «CDR» (например, приблизительно вокруг остатков 24-34 (L1), 50-56 (L2) и 89-97 (L3) в VL, и приблизительно вокруг остатков 31-35B (H1), 50-65 (H2) и 95-102 (H3) в VH (см. публикацию Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md. (1991)), и/или остатки из «гипервариабельной петли» (например, остатки 26-32 (L1), 50-52 (L2) и 91-96 (L3) в VL, и 26-32 (H1), 52A-55 (H2) и 96-101 (H3) в VH (см. публикацию Chothia and Lesk J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987)).
[0113] «Каркасные» или «FR» остатки являются остатками переменных доменов, которые отличаются от остатков гипервариабельного участка, определенных в настоящем документе.
[0114] Папаиновая ферментация антител производит два идентичных антиген-связывающих фрагмента, называемых фрагментами «Fab», каждый из которых имеет один антиген-связывающий участок, и остаточный фрагмент «Fc», название которого отражает его способность легко кристаллизоваться. Обработка пепсином дает фрагмент F(ab')2, который имеет два антиген-связывающих участка и при этом способен сшивать антиген.
[0115] «Fv» представляет собой минимальный фрагмент антитела, который содержит полный антиген-распознающий и антиген-связывающий участок. Эта область состоит из димера одной тяжелой цепи и одного переменного домена легкой цепи, находящихся в тесной нековалентной связи. Именно в этой конфигурации три гипервариабельных участка каждого переменного домена взаимодействуют для того, чтобы определить антиген-связывающий участок на поверхности димера VH-VL. В общей сложности эти шесть гипервариабельных участков придают антителу антиген-связывающую специфичность. Однако даже одиночный переменный домен (или половина Fv, включающая в себя только три гипервариабельных участка, специфичные для антигена) обладает способностью распознавать и связывать антиген, хотя и с более низким сродством, чем весь связывающий участок.
[0116] Fab-фрагмент (антигенсвязывающий домен) также содержит постоянный домен легкой цепи и первый постоянный домен (CH1) тяжелой цепи. Fab’-фрагменты отличаются от Fab-фрагментов добавлением нескольких остатков к карбоксильному окончанию домена CH1 тяжелой цепи, включающих в себя один или более цистеинов из шарнирной области антитела. Fab'-SH представляет собой в настоящем документе обозначение для Fab', в котором цистеиновый остаток (остатки) постоянных доменов имеет по меньшей мере одну свободную тиоловую группу. Фрагменты антитела F(ab')2 первоначально производились как пары фрагментов Fab', имеющие шарнирные цистеины между ними. Также известны другие химические сопряжения фрагментов антитела.
[0117] «Легкие цепи» антител (иммуноглобулинов) от любых видов позвоночных могут быть отнесены к одному из двух четко различающихся типов, называемых каппа (κ) и лямбда (λ), на основе последовательностях аминокислот их постоянных доменов.
[0118] В зависимости от последовательности аминокислот постоянного домена их тяжелых цепей антитела могут быть отнесены к различным классам. Существует пять главных классов интактных антител: IgA, IgD, IgE, IgG и IgM, и некоторые из них могут быть далее разделены на подклассы (изотипы), например, IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA и IgA2. Постоянные домены тяжелой цепи, которые соответствуют различным классам антител, называются α, δ, ε, γ, и μ, соответственно. Структуры субъединиц и трехмерные конфигурации различных классов иммуноглобулинов являются хорошо известными.
[0119] «Одноцепочечные Fv» или «scFv»-фрагменты антитела включают в себя VH и VL домены антитела, в котором эти домены присутствуют в единственной полипептидной цепи. В некоторых вариантах осуществления полипептид Fv дополнительно включает в себя полипептид-связывающий агент между доменами VH и VL, который позволяет scFv сформировать желаемую структуру для связывания антигена. Обзор scFv можно найти в публикации Plückthun, The Pharmacology of Monoclonal Antibodies, vol. 113, Rosenburg and Moore eds., Springer-Verlag, New York, pp. 269-315 (1994).
[0120] Термин «диатела» относится к малым фрагментам антитела с двумя антиген-связывающими участками, причем эти фрагменты включают в себя переменный домен тяжелой цепи (VH), связанный с переменным доменом легкой цепи (VL) в той же самой полипептидной цепи (VH-VL). Путем использования связывающего агента, который является слишком коротким, чтобы позволить соединение между этими двумя доменами на той же самой цепи, домены вынуждаются соединяться с комплементарными доменами другой цепи и создают два антиген-связывающих участка. Диатела описываются более полно, например, в патенте EP 404097; в международной патентной заявке WO 93/11161; а также в публикации Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444-6448 (1993).
[0121] Для целей настоящего документа «интактное антитело» представляет собой антитело, включающее в себя тяжелые и легкие переменные домены, а также область Fc. Постоянные домены могут быть постоянными доменами естественной последовательности (например, постоянными доменами естественной последовательности человека) или варианта аминокислотной последовательности. Предпочтительно интактное антитело имеет одну или более эффекторных функций.
[0122] «Естественные антитела» обычно являются гетеротетрамерными гликопротеинами с молекулярной массой приблизительно 150000 Дальтон, составленными из двух идентичных легких (L) цепей и двух идентичных тяжелых (H) цепей. Каждая легкая цепь связывается с тяжелой цепью одним ковалентным дисульфидным мостиком, в то время как число дисульфидных связей для тяжелых цепей различных изотипов иммуноглобулина является различным. Каждая тяжелая и легкая цепь также имеет внутрицепные дисульфидные связи с равными интервалами. У каждой тяжелой цепи на одном ее конце имеется переменный домен (VH), за которым следует ряд постоянных доменов. У каждой легкой цепи на одном ее конце имеется переменный домен (VL), а на другом ее конце - постоянный домен; постоянный домен легкой цепи выровнен с первым постоянным доменом тяжелой цепи, а переменный домен легкой цепи выровнен с переменным доменом тяжелой цепи. Считается, что конкретные остатки аминокислоты формируют интерфейс между переменными доменами легкой и тяжелой цепей.
[0123] «Голое антитело» является антителом (как определено в настоящем документе), которое не сопряжено с ксеногенной молекулой, такой как цитотоксическая функциональная группа или радиоактивная метка.
[0124] Антитело направлено против интересующего антигена. Предпочтительно антиген является биологически важным полипептидом, и назначение антитела индивиду, страдающему от заболевания или нарушения, может привести к терапевтической выгоде для этого млекопитающего. Однако также могут использоваться антитела, направленные против неполипептидных антигенов (таких как связанные с опухолью гликолипидные антигены; см. патент США. № 5091178).
[0125] Когда антиген является полипептидом, он может быть трансмембранной молекулой (например, рецептором) или лигандом, таким как фактор роста. Примерные антигены включают в себя молекулы, такие как ренин; гормон роста, включая человеческий гормон роста и гормон роста крупного рогатого скота; фактор, высвобождающий гормон роста; паратиреоидный гормон; гормон, стимулирующий деятельность щитовидной железы; липопротеины; альфа-1-антитрипсин; A-цепь инсулина; B-цепь инсулина; проинсулин; фолликулостимулирующий гормон; кальцитонин; лютеинизирующий гормон; глюкагон; факторы свертывания крови, такие как фактор VIIIC, фактор IX, фактор ткани (TF) и фактор фон Виллебрандса; препятствующие свертыванию крови факторы, такие как Протеин C; предсердный натрийуретический фактор; поверхностно-активное вещество легкого; активатор плазмогена, такой как урокиназа или человеческая моча или тканевый активатор плазмогена (t-PA); бомбезин; тромбин; гемопоэтический фактор роста; альфа- и бета-факторы некроза опухоли; энкефалиназу; RANTES (хемокин, выделяемый T-клетками при активации); человеческий макрофагальный воспалительный белок (MIP-1-альфа); сывороточный альбумин, такой как человеческий сывороточный альбумин; ингибирующее вещество Мюллера; A-цепь релаксина; B-цепь релаксина; прорелаксин; связанный с гонадотропином белок мыши; микробный белок, такой как бета-лактамаза; дезоксирибонуклеазу; IgE; антиген, связанный с цитотоксическими Т-лимфоцитами (CTLA), такой как CTLA-4; ингибин; активин; сосудистый фактор эндотелиального роста (VEGF); рецепторы для гормонов или факторов роста; протеин A или D; ревматоидные факторы; нейротрофический фактор, такой как получаемый из костей нейротрофический фактор (BDNF), нейротрофин-3, -4, -5 или -6 (NT-3, NT-4, NT-5 или NT-6), или фактор роста нервов, такой как NGF-β; тромбоцитарный фактор роста (PDGF); фактор роста фибробластов, такой как aFGF и bFGF; эпидермальный фактор роста (EGF); трансформирующий фактор роста (TGF), такой как TGF-альфа и TGF-бета, включая TGF-β1, TGF-β2, TGF-β3, TGF-β4 или TGF-β5; инсулиноподобный фактор роста I и II (IGF-I и IGF-II); дез(1-3)-IGF-I (мозговой IGF-I), инсулиноподобные связывающие белки фактора роста (IGFBP); белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20 и CD40; эритропоэтин; остеоиндуктивные факторы; иммунотоксины; костный морфогенетический белок (BMP); интерферон, такой как альфа-, бета- и гамма-интерферон; колониестимулирующие факторы (CSF), например, M-CSF, GM-CSF и G-CSF; интерлeйкины (IL), например, IL-1-IL-10; супероксид-дисмутазу; рецепторы Т-клеток; поверхностные мембранные белки; фактор ускорения затухания; вирусный антиген, такой как, например, часть защитного покрытия вируса СПИД; транспортные белки; «хоминг»-рецепторы; адрессины; регулирующие белки; интегрины, такие как CD11a, CD11b, CD11c, CD18, ICAM, VLA-4 и VCAM; опухолевый специфический антиген, такой как рецептор HER2, HER3 или HER4; а также фрагменты любого из вышеперечисленных полипептидов.
[0126] Предпочтительные молекулярные цели для антител, подробно описанных в настоящем документе, включают в себя белки CD, такие как CD3, CD4, CD8, CD18, CD19, CD20, CD34 и CD40; члены семейства рецепторов ErbB, такие как рецептор EGF, рецептор HER2, HER3 или HER4; молекулы клеточной адгезии, такие как LFA-1, Mac1, p150.95, VLA-4, ICAM-1, VCAM, интегрин α4/β7, и интегрин αv/β3, включая его любые α или β субъединицы (например, антитела против CD11a, против CD18 или против CD11b); факторы роста, такие как VEGF; фактор ткани (TF); альфа-интерферон (α-IFN); интерлeйкин, такой как IL-8; IgE; антигены группы крови; рецептор flk2/flt3; рецептор ожирения (OB); рецептор mpl; CTLA-4; протеин C и т.п.
[0127] Антитела (включая их фрагменты, включающие в свою очередь их антиген-связывающие фрагменты), которые могут быть произведены с помощью способов, описанных в настоящем документе, включают в себя без ограничения анти-HER2, антитело 2C4, анти-VEGF, антитело C2B8, анти-CD11a, антитканевый фактор, IgG4b, анти-CD40, анти-CD20, анти-IgE, E25, E26, анти-PCSK9 и анти-Beta7.
Выращивание клеток и получение полипептида
[0128] В большинстве случаев клетки комбинируются (контактируют) с любой из сред клеточной культуры, описанных в настоящем документе, при одном или более условиях, которые вызывают любое из роста клеток, поддержания и/или получения полипептида. Способы выращивания клетки (то есть, культивирования клетки) и получения полипептида используют культивирующий сосуд (биореактор) для того, чтобы содержать клетку и среду клеточной культуры. Культивирующий сосуд может быть изготовлен из любого материала, который является подходящим для культивирования клеток, включая стекло, пластмассу или металл. Как правило, культивирующий сосуд будет иметь объем по меньшей мере 1 л и может иметь объем 10, 100, 250, 500, 1000, 2500, 5000, 8000, 10000 л или больше. Условия культивирования, которые могут настраиваться во время процесса культивирования, включают в себя, не ограничиваясь этим, pH-фактор и температуру.
[0129] Клеточная культура обычно поддерживается в начальной фазе роста в условиях, способствующих выживанию, росту и жизнеспособности (поддержанию) клеточной культуры. Точные условия будут изменяться в зависимости от типа клетки, организма, из которого клетка была получена, а также природы и особенностей экспрессируемого полипептида.
[0130] Температура клеточной культуры в начальной фазе роста будет выбрана прежде всего на основе диапазона температур, в котором клеточная культура остается жизнеспособной. Например, во время начальной фазы роста клетки CHO хорошо растут при температуре 37°C. Обычно большинство клеток млекопитающих хорошо растет в пределах диапазона приблизительно от 25°C до 42°C. Предпочтительно клетки млекопитающих хорошо растут в пределах диапазона приблизительно от 35°C до 40°C. Специалист в данной области техники будет в состоянии выбрать подходящую температуру или температуры, при которых можно вырастить клетки, в зависимости от потребностей клеток и производственных требований.
[0131] В одном варианте осуществления настоящего изобретения температура начальной фазы роста поддерживается постоянной. В другом варианте осуществления температура начальной фазы роста поддерживается в пределах диапазона температур. Например, температура может монотонно увеличиваться или уменьшаться во время начальной фазы роста. Альтернативно температура может многократно увеличиваться или уменьшаться на дискретную величину во время начальной фазы роста. Специалист в данной области техники будет в состоянии определить, должна ли использоваться постоянная или переменная температура, а также должна ли температура изменяться плавно или дискретно.
[0132] Клетки могут быть выращены во время первоначальной фазы роста за большее или меньшее количество времени. В одной вариации клетки выращиваются за период времени, достаточный для того, чтобы достичь жизнеспособной плотности клеток, которая является заданным процентом максимальной жизнеспособной плотности клеток, которую клетки, в конечном счете, достигли бы, если бы им было позволено расти без помех. Например, клетки могут быть выращены за период времени, достаточный для того, чтобы достичь желаемой жизнеспособной плотности клетки, равной 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов от максимальной жизнеспособной плотности клетки.
[0133] В другом варианте осуществления клеткам позволяют расти в течение определенного промежутка времени. Например, в зависимости от начальной концентрации клеточной культуры, температуры, при которой клетки выращиваются, и свойственной клеткам скорости их роста, клетки могут выращиваться в течение 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 или больше дней. В некоторых случаях клеткам может быть позволено расти в течение месяца или больше.
[0134] Клеточная культура может перемешиваться или взбалтываться во время первоначальной фазы для того, чтобы увеличить оксигенацию и распространение питательных веществ к клеткам. В соответствии с настоящим изобретением специалист в данной области техники поймет, что может быть выгодным управлять или регулировать некоторые внутренние условия биореактора во время первоначальной фазы роста, включая, но не ограничиваясь этим, pH, температуру, насыщение кислородом и т.д. Например, величиной pH можно управлять путем подачи подходящего количества кислоты или основания, а насыщением кислородом можно управлять с помощью барботирующих устройств, которые известны в данной области техники.
[0135] Первоначальная стадия культивирования является фазой роста, в которой характеристики партии клеточной культуры модифицированы для того, чтобы улучшить рост рекомбинантных клеток с тем, чтобы произвести посевной материал. Фаза роста обычно относится к периоду экспоненциального роста, когда клетки обычно быстро делятся, например, при росте. Во время этой фазы клетки культивируются в течение некоторого периода времени, обычно 1-4 дня, например, 1, 2, 3 или 4 дня, причем в таких условиях, что рост клеток является оптимальным. Определение цикла роста для клетки-хозяина может быть сделано для конкретной клетки-хозяина способами, известными специалистам в данной области техники.
[0136] В фазе роста базальная культуральная среда и клетки могут быть поданы в сосуд для культивации единой порцией. Культуральная среда в одном аспекте содержит меньше чем приблизительно 5% или меньше чем 1% или меньше чем 0,1% сыворотки и других белков животного происхождения. Однако сыворотка и белки животного происхождения могут использоваться при желании. В одной конкретной вариации базальная среда является химически определенной средой. Могут использоваться аминокислоты, витамины, микроэлементы и другие компоненты среды, подаваемые один или два раза в диапазонах, определенных в европейском патенте EP 307247 или в патенте США № 6180401, которые, тем самым, включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.
[0137] Альтернативно, коммерчески доступные среды, такие как среда Хэма (Ham) F10 (Sigma), минимальная поддерживающая среда ([MEM], Sigma), RPMI-1640 (Sigma) и модифицированная Далбекко (Dulbecco) среда Игла (Eagle) ([DMEM], Sigma) являются подходящими для культивирования животных клеток и могут быть подкреплены компонентами подробно описанных в настоящем документе сред химически определенного состава (например, при помощи предлагаемого набора). В дополнение к этому, любая из сред, описанных в публикациях Ham and Wallace, Meth. Enz., 58:44 (1979), Barnes and Sato, Anal. Biochem., 102:255 (1980), в патентах США № 4767704; №4657866; №4927762; или №4560655; международных патентных заявках WO 90/03430; WO 87/00195; в патенте США № Re. 30985; или в патенте США № 5122469, все раскрытия которых включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте, могут использоваться в качестве культуральных сред для клеток-хозяев, причем каждая из них может быть подкреплена компонентами подробно описанных в настоящем документе сред химически определенного состава (например, при помощи предлагаемого набора). В одном аспекте, если среда содержит продукт животного происхождения, среда может быть подкреплена химически определенной средой.
[0138] Любые среды, предлагаемые в настоящем документе, могут также быть подкреплены по мере необходимости гормонами и/или другими факторами роста (такими как инсулин, трансферрин или эпидермальный фактор роста), ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами (такими как HEPES), нуклеозидами (такими как аденозин и тимидин), микроэлементами (определяемыми как неорганические соединения, обычно присутствующие в конечных концентрациях в микромолярном диапазоне), а также глюкозой или эквивалентным источником энергии. Любые другие необходимые добавки также могут быть включены в подходящих концентрациях, которые известны специалистам в данной области техники.
[0139] В конкретной точке их роста клетки могут сформировать инокулум, чтобы засеять культуральную среду при начале культивирования в производственной фазе. Альтернативно производственная фаза может быть непрерывной с фазой роста. После фазы роста клеток обычно следует фаза получения полипептида.
[0140] Во время фазы получения полипептида клеточная культура может поддерживаться при втором наборе условий культивирования (по сравнению с фазой роста), способствующем выживанию и жизнеспособности клеточной культуры и подходящем для экспресии желаемого полипептида. Например, во время последующей производственной фазы клетки CHO хорошо экспрессируют рекомбинантные полипептиды и белки в пределах диапазона температур от 25°C до 35°C. Многократные дискретные изменения температуры могут использоваться для того, чтобы увеличить плотность клеток или их жизнеспособность или увеличить экспрессию рекомбинантного гена полипептида или белка. В одном аспекте предлагаемая в настоящем документе среда уменьшает наличие загрязнителей при использовании в способе увеличения получения полипептида по сравнению с загрязнителями, получаемыми при производстве полипептида в другой среде. В одной вариации загрязнители представляют собой варианты, отличающиеся зарядами, или реакционноспособные разновидности кислорода. В одном аспекте предлагаемая в настоящем документе среда уменьшает интенсивность цвета полипептидного продукта при использовании в способе увеличения получения полипептида по сравнению с интенсивностью цвета, получаемой при производстве полипептида в другой среде. В одной вариации способ увеличения получения полипептида включает в себя шаг изменения температуры во время фазы получения полипептида. В одной дополнительной вариации шаг изменения температуры включает в себя изменение температуры от 31°C до 37°C, от 32°C до 37°C, от 33°C до 37°C, от 34°C до 37°C, от 35°C до 37°C, от 36°C до 37°C, от 31°C до 32°C, от 31°C до 33°C, от 31°C до 34°C, от 31°C до 35°C или от 31°C до 36°C.
[0141] Клетки могут поддерживаться в последующей фазе производства до желаемой плотности клеток или до достижения производственного титра. В одном варианте осуществления клетки поддерживаются в последующей фазе производства до достижения максимального титра рекомбинантного полипептида. В других вариантах осуществления культура может быть собрана до этой точки. Например, клетки могут поддерживаться в течение времени, достаточного для того, чтобы достичь жизнеспособной плотности клеток, равной 1, 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 55, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 95 или 99 процентов максимальной жизнеспособной плотности клеток. В некоторых случаях может быть желательно позволить жизнеспособной плотности клеток достичь максимума, а затем позволить жизнеспособной плотности клеток уменьшиться до некоторого уровня прежде, чем собрать культуру.
[0142] В некоторых случаях может быть выгодно или необходимо подкрепить клеточную культуру во время последующей фазы производства питательными веществами или другими компонентами среды, которые были исчерпаны или усвоены клетками. Например, может быть выгодно подкрепить клеточную культуру питательными веществами или другими компонентами среды, исчерпание которых было установлено во время мониторинга клеточной культуры. Альтернативно или дополнительно к этому может быть полезным или необходимым подкрепить клеточную культуру перед последующей фазой производства. В качестве неограничивающих примеров, может быть полезным или необходимым подкрепить клеточную культуру гормонами и/или другими факторами роста, конкретными ионами (такими как натрий, хлорид, кальций, магний и фосфат), буферами, витаминами, нуклеозидами или нуклеотидами, микроэлементами (неорганические соединения, обычно присутствующие в очень низких конечных концентрациях), аминокислотами, липидами или глюкозой или другим источником энергии.
Очистка полипептида
[0143] Интересующий полипептид предпочтительно получается из культуральной среды как выделенный клетками полипептид, хотя он также может получаться из лизатов клетки-хозяина при непосредственном экспрессировании без секреторного сигнала. В одном аспекте полученный полипептид является антителом, таким как моноклональное антитело.
[0144] Культуральная среда или лизат могут центрифугироваться для того, чтобы удалить дисперсные остатки клеток. Полипептид после того может быть очищен от загрязняющих растворимых белков и полипептидов с помощью следующих процедур, являющихся примерами подходящих процедур очистки: фракционированием на иммуноаффинных или ионообменных колонках; осаждением этанолом; обратной фазой высокопроизводительной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ); хроматографией на кремнеземе или на катионообменной смоле, такой как DEAE; хроматофокусированием; SDS-PAGE; осаждением сульфатом аммония; гелевой фильтрацией с использованием, например, Sephadex G-75; и колонками с протеин А сефарозой для того, чтобы удалить такие загрязнители, как IgG. Ингибитор протеазы, такой как метилфенилсульфонилфторид (PMSF) также может быть полезным для того, чтобы ингибировать протеолитическое разложение во время очистки. Специалисту в данной области техники будет понятно, что способы очистки, подходящие для интересующего полипептида, могут потребовать модификации для учета изменений в особенностях полипептида при экспресии в рекомбинантной клеточной культуре. Антитела обычно могут быть очищены путем использования хроматографических методик (например, аффинная к протеину A хроматография со стадией элюирования с низким значением pH и ионообменная хроматография для удаления примесей процесса). Очищенные белки могут быть сконцентрированы для того, чтобы обеспечить концентрированный белковый фармацевтический продукт, например, продукт с концентрацией белков по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл или с концентрацией приблизительно 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл. Очищенные белки могут также быть сконцентрированы для того, чтобы обеспечить концентрированный белковый фармацевтический продукт, например, продукт с концентрацией белков по меньшей мере 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл или с концентрацией по меньшей мере от приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл или до приблизительно 150 мг/мл). Понятно, что концентрированные полипептидные продукты могут быть сконцентрированы до уровней, которые допустимы при условиях концентрации, например, до концентрации, при которой полипептид больше не является растворимым в растворе. Например, процесс очистки полипептида может включать в себя стадии сбора жидкой клеточной культуры из производящих полипептид клеток и очистки полипептида посредством аффинной к протеину А хроматографии с дальнейшей очисткой посредством анионообменной и катионообменной хроматографии, фильтрацией для удаления вируса, и заключительной стадией ультрафильтрации и диафильтрации для получения окончательной рецептуры и концентрации полипептида. Неограничивающие примеры способов для получения и очистки полипептидов для лекарственных рецептур описаны в публикации Kelley, B. MAbs., 2009, 1(5):443-452, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.
Оценка цвета полипептида
[0145] Полипептиды, полученные способами, подробно описанными в настоящем документе и присутствующие в предложенных композициях, могут быть подвергнуты оценке цвета на любой стадии процесса очистки белка. Способ для оценки цвета может включать в себя сбор жидкости клеточной культуры из клеток, выращенных в средах, подробно описанных в настоящем документе, очистку полипептида из жидкости клеточной культуры для того, чтобы получить композицию (например, раствор), включающую в себя полипептид, и оценку цвета раствора, включающего в себя полипептид. В одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки с помощью аффинной к протеину А хроматографии. В одной дополнительной вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки ионообменной хроматографией. В другой вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки высокоэффективной жидкостной хроматографией. В еще одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки хроматографией гидрофобного взаимодействия. В еще одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки эксклюзионной хроматографией. В одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, подвергается оценке цвета после очистки фильтрацией, включая микрофильтрацию или ультрафильтрацию. В одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, концентрируется перед тем, как подвергнуться оценке цвета (например, композиция может содержать по меньшей мере 100 мг/мл, 125 мг/мл или 150 мг/мл полипептида, такого как антитело). В некоторых вариациях концентрированная композиция включает в себя по меньшей мере 1 мг/мл, 25 мг/мл, 50 мг/мл или 75 мг/мл полипептида (например, антитела) перед тем, как подвергнуться оценке цвета. Композиция, включающая в себя полипептид, может быть сконцентрирована центрифугированием, фильтрующими устройствами, полупроницаемыми мембранами, диализом, осаждением, ионообменной хроматографией, аффинной хроматографией, высокоэффективной жидкостной хроматографией или хроматографией гидрофобного взаимодействия. В одной вариации полипептид может быть сконцентрирован лиофилизацией и повторно суспендирован перед тем, как подвергнуться оценке цвета. Композиция, включающая в себя полипептид, может быть подвергнута оценке цвета после очистки с помощью одной или более методик, подробно описанных в настоящем документе. В настоящем документе также рассматривается оценка цвета композиции, включающей в себя полипептид, после того, как композиция перенесла один или более циклов замораживания и размораживания. Далее в настоящем документе рассматриваются способы оценки цвета содержащей полипептид жидкости клеточной культуры перед очисткой или концентрированием полипептида.
[0146] Полипептиды, полученные с помощью способов, подробно описанных в настоящем документе, с описанными в настоящем документе средами (или присутствующие в предложенных композициях), могут быть подвергнуты оценке цвета при помощи одного или более визуальных цветовых эталонов. Способы оценки цвета композиции, включающей в себя полипептид, включают в себя использование международного или национального цветового эталона, такого как, не ограничиваясь этим, цветовой эталон Фармакопеи США и цветовой эталон европейской Фармакопеи. См. публикации USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927 и Council of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 7th Ed. P.22, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте. Например, для того, чтобы оценить цвет раствора, содержащего полипептид, может использоваться проба Цвета, Опалесценции и Окраски (проба COC). В одной вариации идентичные пробирки из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла наружным диаметром на 12 мм используются для того, чтобы сравнить 2,0 мл композиции, включающей в себя полипептид, с 2,0 мл воды или растворителя или контрольного раствора, предписанного в упомянутой монографии. Цвета сравниваются в рассеянном дневном свете и рассматриваются горизонтально на белом фоне для определения, измерения или оценки цвета. В другой вариации идентичные пробирки из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром от 15 мм до 25 мм используются для того, чтобы сравнить композицию, включающую в себя полипептид, с водой или растворителем или контрольным раствором, предписанным в упомянутой монографии, причем глубина слоя составляет 40 мм. Цвета сравниваются в рассеянном дневном свете и рассматриваются вертикально на белом фоне для определения, измерения, или оценки цвета. В одной вариации определение, измерение или оценка цвета могут быть произведены путем визуального осмотра человеком. В другой вариации определение, измерение, или оценка цвета могут быть произведены путем использования автоматизированного процесса. Например, пробирки могут быть загружены в механизм, получающий изображения трубок для того, чтобы обработать эти изображения с помощью некоторого алгоритма для определения, измерения или оценки цвета. Понятно, что исходные эталоны для пробы COC могут быть любыми из, но не ограничиваясь этим, коричневого (B), коричневато-желтого (BY), желтого (Y), зеленовато-желтого (GY) или красного (R). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с коричневым исходным эталоном, могут быть присвоены значения коричневого исходного эталона (самый темный) B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с коричневато-желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения коричневато-желтого исходного эталона (самый темный) BY1, BY2, BY3, BY4, BY5, BY6 или BY7 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения желтого исходного эталона (самый темный) Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6 или Y7 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с зеленовато-желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения зеленовато-желтого исходного эталона (самый темный) GY1, GY2, GY3, GY4, GY5, GY6 или (самый светлый) GY7. Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с красным исходным эталоном, могут быть присвоены значения красного исходного эталона (самый темный) R1, R2, R3, R4, R5, R6 или (самый светлый) R7. В одном аспекте приемлемым цветом является любой цвет, за исключением того, который в результате оценки по предложенной шкале определяется как самый темный (например, R1 для красного значения исходного эталона). В одной вариации цвет композиции, включающей в себя полипептид, произведенный клетками, культивируемыми в средах, подробно описанных в настоящем документе, имеет значение исходного эталона, приведенного в Таблице 2. Как описано в настоящем документе, понятно, что в одном аспекте среды, которые могут использоваться в способах и композициях, предложенных в настоящем документе, приводят к полипептидной композиции (которая в одной вариации является композицией, включающей в себя по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл полипептида), имеющей значение цвета исходного эталона, выбираемое из группы, состоящей из B3, B4, B5, B6, B7, B8, B9, BY3, BY4, BY5, BY6, BY7, Y3, Y4, Y5, Y6, Y7, GY3, GY4, GY5, GY6, GY7, R3, R4, R5, R6 и R7. В одном аспекте среды, которые могут использоваться в способах и композициях, предложенных в настоящем документе, приводят к полипептидной композиции (которая в одной вариации является композицией, включающей в себя по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл полипептида), имеющей значение цвета исходного эталона больше, чем любое из B4, B5, B6, B7, B8, BY4, BY5, BY6, Y4, Y5, Y6, GY4, GY5, GY6, GY7, R3, R4, R5 и R6. Как будет понятно специалисту в данной области техники, описания значений цвета исходного эталона применимы к любому из сред, способов или композиций, подробно описанных в настоящем документе, и могут дополнительно модифицировать их описания.
Таблица 2 Примерные значения исходного эталона |
|
Исходный эталон | Значение исходного эталона |
(a) коричневый | от приблизительно B1 до приблизительно B9; от приблизительно B1 до приблизительно B8; от приблизительно B1 до приблизительно B7; от приблизительно B1 до приблизительно B6; от приблизительно B1 до приблизительно B5; от приблизительно B1 до приблизительно B4; от приблизительно B1 до приблизительно B3; от приблизительно B1 до приблизительно B2; от приблизительно B2 до приблизительно B9; от приблизительно B3 до приблизительно B9; от приблизительно B4 до приблизительно B9; от приблизительно B5 до приблизительно B9; от приблизительно B6 до приблизительно B9; от приблизительно B7 до приблизительно B9; от приблизительно B8 до приблизительно B9; от приблизительно B2 до приблизительно B8; от приблизительно B3 до приблизительно B7; от приблизительно B4 до приблизительно B6; от приблизительно B5 до приблизительно B7; от приблизительно B6 до приблизительно B8; приблизительно любое значение из B1 или B2 или B3 или B4 или B5 или B6 или B7 или B8 или B9; по меньшей мере приблизительно любое значение из B1 или B2 или B3 или B4 или B5 или B6 или B7 или B8 или B9. Предпочтительно от B3 до B9. Наиболее предпочтительно от B4 до B9. |
(b) коричневато-желтый | от приблизительно BY1 до приблизительно BY7; от приблизительно BY1 до приблизительно BY6; от приблизительно BY1 до приблизительно BY5; от приблизительно BY1 до приблизительно BY4; от приблизительно BY1 до приблизительно BY3; от приблизительно BY1 до приблизительно BY2; от приблизительно BY2 до приблизительно BY7; от приблизительно BY3 до приблизительно BY7; от приблизительно BY4 до приблизительно BY7; от приблизительно BY5 до приблизительно BY7; от приблизительно BY6 до приблизительно BY7; от приблизительно BY2 до приблизительно BY6; от приблизительно BY3 до приблизительно BY5; от приблизительно BY4 до приблизительно BY6; от приблизительно BY5 до приблизительно BY6; приблизительно любое значение из BY1 или BY2 или BY3 или BY4 или BY5 или BY6 или BY7; по меньшей мере приблизительно любое значение из BY1 или BY2 или BY3 или BY4 или BY5 или BY6 или BY7. Предпочтительно от BY3 до BY7. Наиболее предпочтительно от BY4 до BY7. |
(c) желтый | от приблизительно Y1 до приблизительно Y7; от приблизительно Y1 до приблизительно Y6; от приблизительно Y1 до приблизительно Y5; от приблизительно Y1 до приблизительно Y4; от приблизительно Y1 до приблизительно Y3; от приблизительно Y1 до приблизительно Y2; от приблизительно Y2 до приблизительно Y7; от приблизительно Y3 до приблизительно Y7; от приблизительно Y4 до приблизительно Y7; от приблизительно Y5 до приблизительно Y7; от приблизительно Y6 до приблизительно Y7; от приблизительно Y2 до приблизительно Y6; от приблизительно Y3 до приблизительно Y5; от приблизительно Y4 до приблизительно Y6; от приблизительно Y5 до приблизительно Y6; приблизительно любое значение из Y1 или Y2 или Y3 или Y4 или Y5 или Y6 или Y7; по меньшей мере приблизительно любое значение из Y1 или Y2 или Y3 или Y4 или Y5 или Y6 или Y7. Предпочтительно от Y3 до Y7. Наиболее предпочтительно от Y4 до Y7. |
(d) зеленовато-желтый | от приблизительно GY1 до приблизительно GY7; от приблизительно GY1 до приблизительно GY6; от приблизительно GY1 до приблизительно GY5; от приблизительно GY1 до приблизительно GY4; от приблизительно GY1 до приблизительно GY3; от приблизительно GY1 до приблизительно GY2; от приблизительно GY2 до приблизительно GY7; от приблизительно GY3 до приблизительно GY7; от приблизительно GY4 до приблизительно GY7; от приблизительно GY5 до приблизительно GY7; от приблизительно GY6 до приблизительно GY7; от приблизительно GY2 до приблизительно GY6; от приблизительно GY3 до приблизительно GY5; от приблизительно GY4 до приблизительно GY6; от приблизительно GY5 до приблизительно GY6; приблизительно любое значение из GY1 или GY2 или GY3 или GY4 или GY5 или GY6 или GY7; по меньшей мере приблизительно любое значение из GY1 или GY2 или GY3 или GY4 или GY5 или GY6 или GY7. Предпочтительно от GY3 до GY7. Наиболее предпочтительно от GY4 до GY7. |
(e) красный | от приблизительно R1 до приблизительно R7; от приблизительно R1 до приблизительно R6; от приблизительно R1 до приблизительно R5; от приблизительно R1 до приблизительно R4; от приблизительно R1 до приблизительно R3; от приблизительно R1 до приблизительно R2; от приблизительно R2 до приблизительно R7; от приблизительно R3 до приблизительно R7; от приблизительно R4 до приблизительно R7; от приблизительно R5 до приблизительно R7; от приблизительно R6 до приблизительно R7; от приблизительно R2 до приблизительно R6; от приблизительно R3 до приблизительно R5; от приблизительно R4 до приблизительно R6; от приблизительно R5 до приблизительно R6; приблизительно любое значение из R1 или R2 или R3 или R4 или R5 или R6 или R7; по меньшей мере приблизительно любое значение из R1 или R2 или R3 или R4 или R5 или R6 или R7. Предпочтительно от R3 до R7. Наиболее предпочтительно от R4 до R7. |
[0147] В другом примере полипептиды, полученные способами, подробно описанными в настоящем документе, с описанными в настоящем документе средами (или присутствующие в предложенных композициях), могут быть подвергнуты оценке цвета с помощью количественной пробы. В одной вариации количественная проба может быть сделана с использованием автоматизированного процесса. В одной вариации количественная проба представляет собой пробу нормализованной интенсивности флюоресценции (NIFTY) или Полную цветовую пробу, описанную в настоящем документе. Например, интенсивность цвета раствора, содержащего полипептид, произведенный любым из описанных в настоящем документе способов, может быть оценена пробой NIFTY путем выполнения с раствором, включающим в себя полипептид, следующих стадий: 1) эксклюзионная хроматография (SEC) тестового образца полипептида, в которой подвижная фаза для эксклюзионной хроматографии включает в себя буфер с конкретным значением pH, а колонка поддерживается при конкретной температуре; 2) мониторинг элюента эксклюзионной хроматографии на предмет ультрафиолетового поглощения на конкретной длине волны (например, 280 нм) и на предмет флюоресценции с конкретной длиной волны возбуждения (например, 350 нм) и длиной волны излучения (например, 425 нм); 3) интегрирование пиков эксклюзионной хроматографии разновидностей полипептидов с использованием программного обеспечения, известного в данной области техники (например, программного обеспечения Agilent Chemstation) на хроматограммах ультрафиолетового поглощения и флюоресцентного излучения, и нормализация флюоресценции путем деления площади главного пика флюоресцентного излучения на площадь главного пика ультрафиолетового поглощения; и 4) вычисление отношения нормализованной флюоресценции тестового образца полипептида к аналогичному значению для эталонного образца полипептида, имеющего известное значение пробы COC, основанное на любом из исходных эталонов, раскрытых в настоящем документе, таких как коричневый (B), коричневато-желтый (BY), желтый (Y), зеленовато-желтый (GY) или красный (R), с тем, чтобы получить численное значение, причем более высокое численное значение (например, более высокое значение пробы NIFTY) означает более высокую интенсивность цвета, а более низкое численное значение (например, более низкое значение пробы NIFTY) означает более низкую интенсивность цвета. В другом примере раствор, содержащий полипептид, полученный любым из описанных в настоящем документе способов, оценивается на интенсивность его цвета Полной цветовой пробой, описанной в настоящем документе. Например, раствор, содержащий полипептид, полученный любым из описанных в настоящем документе способов, может быть оценен на интенсивность его цвета Полной цветовой пробой путем выполнения с раствором, включающим в себя полипептид, следующих стадий: 1) получение спектра поглощения тестового образца полипептида путем измерения образца в видимой области спектра (380-780нм) с использованием спектрофотометра; 2) преобразование спектра поглощения в цветовую шкалу CIE L*a*b*, как описано в публикации Standard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 06.01, (2011); 3) получение Полного цветового измерения, которое представляет собой значение ΔE, которое соответствует эвклидовому расстоянию между тестовым образцом полипептида и водой в трехмерном цветовом пространстве CIE L*a*b*; и 4) определение значения интенсивности цвета путем вычисления отношения «Полного цветового» измерения тестового образца полипептида к аналогичному значению эталонного образца полипептида, имеющего известное значение пробы COC, основанное на любом из исходных эталонов, раскрытых в настоящем документе, таких как коричневый (B), коричневато-желтый (BY), желтый (Y), зеленовато-желтый (GY) или красный (R), причем более высокое значение Полного цвета указывает на более высокую интенсивность цвета, и более низкое значение Полного цвета указывает на более низкую интенсивность цвета.
[0148] Цветовая проба, подробно описанная в настоящем документе, может найти свое применение в оценке цвета любого раствора (например, раствора, содержащего полипептид), включая, но не ограничиваясь этим, предложенные в настоящем документе полипептидные композиции.
Оценка вариантов полипептида, отличающихся зарядами
[0149] Предлагаются способы для уменьшения присутствия вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), в которых среды, содержащие компоненты в концентрациях, подробно описанных в настоящем документе, уменьшают присутствие вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), при использовании в способе получения полипептида по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами (например, кислыми вариантами, отличающимися зарядами), получаемыми при производстве полипептида в других средах (например, в средах, которые не включают в себя компоненты, подробно описанные в настоящем документе, и/или имеющие концентрации, отличающиеся от подробно описанных в настоящем документе). Как будет понятно специалисту в данной области техники, описания справочных вариантов, отличающихся зарядами, применимы к любому из сред, способов или композиций, подробно описанных в настоящем документе, и могут дополнительно модифицировать их описания. Также понятно, что любые вариации или варианты осуществления сред, предлагаемых в этом разделе, одинаково применимы к описаниям сред, данным во всем документе. Используемый в настоящем документе термин «уменьшает присутствие вариантов, отличающихся зарядами» может относиться к уменьшенному количеству или присутствию всех типов вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами, основных вариантов, отличающихся зарядами, и нейтральных вариантов, отличающихся зарядами) или к уменьшенному количеству или наличию конкретных вариантов, отличающихся зарядами, таких как кислые варианты, отличающиеся зарядами.
[0150] Предлагаются способы для уменьшения присутствия вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), а также композиции, включающие в себя пониженный уровень вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), причем среды, подробно описанные в настоящем документе, уменьшают присутствие вариантов, отличающихся зарядами, при использовании в способе производства полипептида по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами, получаемыми при производстве полипептида в других средах. В одной вариации среда является химически неопределенной средой клеточной культуры, включающей в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 и от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12. В одной вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,50 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,40 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,30 мг/л. В одной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л. В другой вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л. В другой вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В одной вариации химически неопределенная среда для культивирования клетокдополнительно включает в себя источник железа. В одной вариации источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо. В одной вариации химически неопределенная среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ. В любой из вариаций в настоящем документе химически неопределенная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон. В одной вариации гидрокортизон содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
[0151] Предлагаются способы для уменьшения присутствия вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), а также композиции, включающие в себя пониженный уровень вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), причем среды, подробно описанные в настоящем документе, уменьшают присутствие вариантов, отличающихся зарядами, при использовании в способе производства полипептида по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами, получаемыми при производстве полипептида в других средах. В одной вариации среда является химически определенной средой клеточной культуры, включающей в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина, от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа, и от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона. В одной вариации химически определенная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и витамин B12. В одной вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,50 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,40 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,30 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л, от приблизительно 0,05мг/л до приблизительно 8,0 мг/л, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л или от приблизительно 0,05мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B9 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B9 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B12 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B12 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л.
[0152] Предлагаются способы для уменьшения присутствия вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), а также композиции, включающие в себя пониженный уровень вариантов, отличающихся зарядами (например, кислых вариантов, отличающихся зарядами), причем среды, подробно описанные в настоящем документе, уменьшают присутствие вариантов, отличающихся зарядами, при использовании в способе производства полипептида по сравнению с вариантами, отличающимися зарядами, получаемыми при производстве полипептида в других средах. В одной вариации среда является химически неопределенной средой клеточной культуры, включающей в себя от приблизительно 300 мг/л (в некоторых вариантах осуществления 200 мг/л) до приблизительно 1200 мг/л цистина, от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа, и от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона. В одной вариации химически неопределенная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и витамин B12. В одной вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,50 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,40 мг/л. В другой вариации витамин В2 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 0,30 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 8,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л, от приблизительно 0,05мг/л до приблизительно 8,0 мг/л, от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 7,0 мг/л или от приблизительно 0,05мг/л до приблизительно 6,0 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B6 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B9 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B9 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л. В одной дополнительной вариации витамин B12 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л. В любой из вариаций в настоящем документе витамин B12 содержится в концентрации от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л.
[0153] Полипептиды, включая композиции, включающие в себя полипептиды, полученные способами, подробно описанными в настоящем документе, могут быть оценены на присутствие вариантов, отличающихся зарядами, на любой стадии процесса очистки белка. Способ для оценки присутствия вариантов, отличающихся зарядами, может включать в себя сбор жидкости клеточной культуры из клеток, выращенных в средах, подробно описанных в настоящем документе, очистку полипептида из жидкости среды для культивирования клеток с тем, чтобы получить композицию, включающую в себя полипептид, и оценку композиции, включающей в себя полипептид, на уменьшенное присутствие вариантов, отличающихся зарядами, по сравнению с присутствием вариантов, отличающихся зарядами, в композиции, включающей в себя полипептид, произведенный в других средах. В одной вариации композиция, включающая в себя полипептид, может содержать кислые варианты, отличающиеся зарядами, или основные варианты, отличающиеся зарядами. В другой вариации композиция, включающая в себя полипептид, включает в себя кислые варианты, отличающиеся зарядами. Варианты, отличающиеся зарядами, могут образовываться вследствие, но не ограничиваясь этим, дезамидирования, сиалилирования, отрыва C-окончания лизина, гликирования, амидирования C-окончания лизина, амидирования C-окончания глицина, формирования амида янтарной кислоты, окисления аминокислоты, удаления сиаловой кислоты или комбинаций перечисленного. В настоящем документе дополнительно рассматриваются способы оценки присутствия вариантов, отличающихся зарядами, в жидкости клеточной культуры, содержащей полипептид, перед очисткой или концентрированием полипептида. Способы обнаружения вариантов, отличающихся зарядами, в растворах, содержащих полипептид, включают в себя использование методик хроматографии, такой как, но не ограничиваясь этим, ионообменная хроматография. См. публикацию Khawli, L.A., mAbs., 2010, 2(6):613-624, которая включена в настоящий документ посредством ссылки во всей ее полноте.
[0154] В одной вариации предложенных в настоящем документе композиций варианты, отличающиеся зарядами (которые в одном аспекте являются кислыми вариантами, отличающимися зарядами), составляют не больше, чем 25% или 20% или 18% или 15% или 10% полипептидного продукта. В другой вариации предложенных в настоящем документе композиций и способов по меньшей мере 75% или 80% или 85% или 90% или 95% или больше от количества полипептидного продукта составляет основной вид белка. Используемый в настоящем документе термин «основной вид белка» может дополнительно включать в себя количественно преобладающий белок, идентифицируемый последовательностью аминокислот, вторичной структурой и/или третичной структурой белка, а также любую посттрансляционную модификацию, такую как гликозилирование.
Наборы
[0155] Описывается набор для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов. Данный набор может содержать высушенные компоненты, которые будут воссозданы, и может также содержать инструкции по его использованию (например, для использования при дополнении в среду компонентов набора). Набор может содержать предложенные в настоящем документе компоненты среды в количестве, подходящем для дополнения в среду клеточной культуры. В одной вариации набор включает в себя компоненты среды, описанные в Таблице 1. В другой вариации набор включает в себя компоненты среды, описанные в Таблице 1A. Различные примерные варианты осуществления набора предлагаются в разделе «Примерные варианты осуществления». В дополнение к этому настоящее изобретение также включает в себя вариации, в которых набор для дополнения в среду для культивирования клеток включает в себя любой один или больше компонентов среды из Таблицы 1 или Таблицы 1A в количестве, обеспечивающем этот один или больше компонентов среды в среду для культивирования клеток в концентрации, показанной в Таблице 1 или Таблице 1A. В одной вариации набор для дополнения в среду для культивирования клеток включает в себя цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,8 мМ (в одном аспекте 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина в среде клеточной культуры; витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2 в среде клеточной культуры; витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6 в среде клеточной культуры; витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9 в среде клеточной культуры; и витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12 в среде клеточной культуры. В любой вариации в настоящем документе набор может дополнительно включать в себя источник железа, такой как лимоннокислое железо или сернокислое железо, в таком количестве, чтобы обеспечить его содержание в среде для культивирования клеток от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ (в некоторых аспектах от 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ).
[0156] В другой вариации набор для дополнения в среду для культивирования клеток включает в себя цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,8 мМ (в некоторых аспектах 0,7 мМ) до приблизительно 2,5 мМ цистина в среде клеточной культуры; лимоннокислое железо в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа в среде клеточной культуры; гидрокортизон в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона в среде клеточной культуры; витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2 в среде клеточной культуры; витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6 в среде клеточной культуры; витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9 в среде клеточной культуры; и витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12 в среде клеточной культуры.
[0157] В любой вариации в настоящем документе набор может дополнительно включать в себя любой один или больше из витамина B1 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1 в среде клеточной культуры; витамина B3 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3 в среде клеточной культуры; витамина B5 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5 в среде клеточной культуры; и витамина B7 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,24 мкМ витамина B7 в среде клеточной культуры.
[0158] В любой из вариаций в настоящем документе набор может дополнительно включать в себя цистеин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина (в некоторых аспектах от 0,5 мМ до приблизительно 2,0 мМ) в среде клеточной культуры.
[0159] В любой из вариаций в настоящем документе среды для культивирования клеток могут быть химически определенными средами или химически неопределенными средами клеточной культуры.
Композиции
[0160] Также предлагаются композиции, включающие в себя среду для культивирования клеток и один или более других компонентов, таких как клетка или желаемый полипептид (например, антитело). В одной вариации предлагается композиция, включающая в себя: (a) клетку, включающую в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую некоторый полипептид; и (b) среду клеточной культуры, предложенную в настоящем документе. В другой вариации предлагается композиция, включающая в себя: (a) полипептид; и (b) среду клеточной культуры, предложенную в настоящем документе, где в одном аспекте полипептид выделяется в среду клеткой, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. В еще одной вариации предлагается композиция, включающая в себя: (a) полипептид; и (b) среду клеточной культуры, предложенную в настоящем документе, где в одном аспекте полипептид выпускается в среду путем распада клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид. Клетка композиции может быть любой клеткой, подробно описанной в настоящем документе (например, клеткой CHO), а среда композиции может быть любой средой, подробно описанной в настоящем документе, такой как среда (которая может быть химически определенной средой), включающая в себя компоненты среды, подробно описанные в Таблице 1 или в Таблице 1A. Аналогичным образом полипептид данной композиции может быть любым полипептидом, подробно описанным в настоящем документе, таким как антитело.
[0161] В одной вариации композиция может иметь цвет. В одной вариации цвет определяется, измеряется, или оценивается при помощи одного или более визуальных цветовых эталонов. Визуальный цветовой эталон может быть международным или национальным цветовым эталоном, таким как, но не ограничиваясь этим, цветовой эталон Фармакопеи США и цветовой эталон европейской Фармакопеи. См. публикации USP-24 Monograph 631 Color and Achromaticity. United States Pharmacopoeia Inc., 2000, p. 1926-1927 и Council of Europe. European Pharmacopoeia, 2008, 7th Ed. P.22, которые включены в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте. Например, цвет композиции может быть определен, измерен или оценен при помощи пробы Цвета, Опалесценции и Окраски (пробы COC). Понятно, что исходные эталоны для пробы COC могут быть любыми из, не ограничиваясь этим, коричневого (B), коричневато-желтого (BY), желтого (Y), зеленовато-желтого (GY) или красного (R). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с коричневым исходным эталоном, могут быть присвоены значения коричневого исходного эталона (самый темный) B1, B2, B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с коричневато-желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения коричневато-желтого исходного эталона (самый темный) BY1, BY2, BY3, BY4, BY5, BY6 или BY7 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения желтого исходного эталона (самый темный) Y1, Y2, Y3, Y4, Y5, Y6 или Y7 (самый светлый). Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с зеленовато-желтым исходным эталоном, могут быть присвоены значения зеленовато-желтого исходного эталона (самый темный) GY1, GY2, GY3, GY4, GY5, GY6 или (самый светлый) GY7. Композициям, включающим в себя полипептид, которые сравниваются с красным исходным эталоном, могут быть присвоены значения красного исходного эталона (самый темный) R1, R2, R3, R4, R5, R6 или (самый светлый) R7. Композиции, подробно описанные в настоящем документе, могут иметь значение исходного эталона, описанное в Таблице 2 или подробно описанное в настоящем документе. В одной конкретной вариации предложенная в настоящем документе композиция включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл, или в концентрации приблизительно 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл или 175 мг/мл или 200 мг/мл. В другой вариации предложенная в настоящем документе композиция включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл, или в концентрации приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл. В другой вариации предложенная в настоящем документе композиция включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере приблизительно от любого значения из 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл или до приблизительно 150 мг/мл. Любая предложенная в настоящем документе композиция может включать в себя полипептид в концентрации вплоть до предела растворимости полипептида или в концентрации, которая обеспечивает терапевтически эффективное количество полипептида при назначении ее субъекту. Используемый в настоящем документе термин «терапевтически эффективное количество» полипептида (например, антитела) относится к количеству, эффективному при профилактике или лечении нарушения, для лечения которого полипептид является эффективным. В одной дополнительной вариации предложенная в настоящем документе композиция имеет значение исходного цветового эталона, выбранное из любого из диапазонов B4-B9, BY4-BY7, Y4-Y7, GY4-GY7 и R4-R7. Также предлагаются композиции, включающие в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл, или в концентрации приблизительно 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл или 175 мг/мл или 200 мг/мл, и в которых композиция имеет значение исходного цветового эталона, выбранное из любого из диапазонов B4-B9, BY4-BY7, Y4-Y7, GY4-GY7 и R4-R7. Также в настоящем документе предлагаются композиции, включающие в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл, или в концентрации приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл, или по меньшей мере от приблизительно любого значения из 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл или до приблизительно 150 мг/мл, и в которых композиция имеет значение исходного цветового эталона, выбранное из любого из диапазонов B4-B9, BY4-BY7, Y4-Y7, GY4-GY7 и R4-R7.
[0162] В другом примере цвет композиции может быть определен, измерен или оценен при помощи количественной пробы, такой как проба NIFTY или Полная цветовая проба. В одной вариации более высокие численные значения, полученные с помощью количественной пробы, указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета.
[0163] Композиции (например, фармацевтические рецептуры) полипептидов (например, антител), произведенные любым из описанных в настоящем документе способов, готовятся путем смешивания полипептида, имеющего желаемую степень чистоты, с одним или более дополнительными фармацевтически приемлемыми носителями (см. публикацию Remington's Pharmaceutical Sciences 16th edition, Osol, A. Ed. (1980)), в форме лиофилизированных рецептур или водных растворов. Фармацевтически приемлемые носители обычно являются нетоксичными для реципиентов в используемых дозировках и концентрациях, и включают в себя, не ограничиваясь этим: буферы, такие как фосфат, цитрат, а также другие органические кислоты; антиоксиданты, включая аскорбиновую кислоту и метионин; консервирующие средства (такие как хлористый октадецилдиметилбензиламмоний; гексаметоний хлорид; бензалконий хлорид; бензетоний хлорид; фенол, бутиловый или бензиловый спирт; алкилпарабены, такие как метилпарабен или пропилпарабен; катехол; резорцинол; циклогексанол; 3-пентанол; и мета-крезол); низкомолекулярные (меньше чем приблизительно 10 остатков) полипептиды; белки, такие как сывороточный альбумин, желатин или иммуноглобулины; гидрофильные полимеры, такие как поливинилпирролидон; аминокислоты, такие как глицин, глютамин, аспарагин, гистидин, аргинин или лизин; моносахариды, дисахариды и другие углеводы, включая глюкозу, маннозу или декстрины; хелатирующие агенты, такие как EDTA; сахар, такой как сахароза, маннит, трегалоза или сорбит; солеобразующие противоионы, такие как натрий; комплексные соединения металла (например, комплексные соединения Zn-белок); и/или неионогенные поверхностно-активные вещества, такие как полиэтиленгликоль (PEG). Примерные фармацевтически приемлемые носители в настоящем документе дополнительно включают в себя агенты внутритканевого диспергирования лекарственного средства, такие как растворимые нейтрально-активные гликопротеины гиалуронидазы (sHASEGP), например, человеческие растворимые гликопротеины гиалуронидазы PH-20, такие как rHuPH20 (HYLENEX® производства компании Baxter International, Inc.). Некоторые примерные гликопротеины sHASEGP и способы их использования, включая rHuPH20, описываются в американских патентных публикациях № 2005/0260186 и № 2006/0104968. В одном аспекте гликопротеин sHASEGP комбинируется с одной или более дополнительными гликозаминогликаназами, такими как хондроитиназы. Примерные лиофилизированные полипептидные рецептуры описываются в американском патенте № 6267958. Водные полипептидные рецептуры включают в себя рецептуры, описанные в американском патенте № 6171586 и в международной патентной заявке WO2006/044908, причем последние рецептуры включают в себя гистидин-ацетатный буфер. Рецептуры, предназначенные для использования в назначениях in vivo, обычно являются стерильными. Стерильность может быть легко достигнута, например, с помощью фильтрации через стерильные фильтрующие мембраны. В одной конкретной вариации предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл, или в концентрации приблизительно 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл или 175 мг/мл или 200 мг/мл. В другой вариации предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл, или в концентрации приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл. В другой вариации предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации по меньшей мере от приблизительно любого значения из 1 мг/мл или 10 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл до приблизительно 125 мг/мл или до приблизительно 150 мг/мл. В одной вариации фармацевтические рецептуры, включающие в себя полипептид, произведенный способами, раскрытыми в настоящем документе, оцениваются на интенсивность цвета с использованием цветовой пробы, такой как, но не ограничиваясь этим, проба COC, Полная цветовая проба или проба NIFTY. В некоторых аспектах предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет измеренное пробой COC значение интенсивности цвета больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл, и имеет измеренное пробой COC значение интенсивности цвета больше, чем B3, B4, B5, B6, B7, B8 или B9. В некоторых аспектах определенное пробой COC значение интенсивности цвета может быть любым из, не ограничиваясь этим, B, ВY, Y, GY или R, причем более высокие значения указывают на более светлую интенсивность цвета. В некоторых аспектах предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 100 мг/мл, по меньшей мере 125 мг/мл или по меньшей мере 150 мг/мл, и имеет значения интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY). В некоторых аспектах предложенная в настоящем документе фармацевтическая рецептура включает в себя полипептид в концентрации, больше, чем по меньшей мере 1 мг/мл, по меньшей мере 10 мг/мл, по меньшей мере 25 мг/мл, по меньшей мере 50 мг/мл или по меньшей мере 75 мг/мл, и имеет значения интенсивности цвета меньше, чем значение интенсивности цвета контрольного раствора, измеренное цветовой пробой (например, Полной цветовой пробой или пробой NIFTY).
[0164] Все ссылки, раскрытые в настоящем документе, являются включенными в настоящий документ посредством ссылки во всей их полноте.
[0165] Примерные варианты осуществления
1. Способ культивирования клеток, включающий в себя стадию контактирования клеток со средой клеточной культуры, включающей в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
2. Способ варианта осуществления 1, включающий в себя стадию контактирования клеток со средой клеточной культуры, включающей в себя:
от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина;
от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2;
от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6;
от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и
от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12.
3. Способ по варианту осуществления 1 или 2, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
4. Способ по варианту осуществления 3, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из:
от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1;
от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3;
от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5; и
от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7.
5. Способ по любому из вариантов осуществления 1-4, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя источник железа.
6. Способ по варианту осуществления 5, в котором источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо.
7. Способ по любому из вариантов осуществления 1-6, в котором среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ.
8. Способ по любому из вариантов осуществления 1-7, в котором среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ.
9. Способ по любому из вариантов осуществления 1-8, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон.
10. Способ по варианту осуществления 9, в котором концентрация гидрокортизона в среде для культивирования клеток составляет от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
11. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, в котором среда для культивирования клеток является химически определенной средой для культивирования клеток.
12. Способ по любому из вариантов осуществления 1-10, в котором среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры.
13. Способ по любому из вариантов осуществления 1-12, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы роста клеток.
14. Способ по любому из вариантов осуществления 1-13, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы производства клеток.
15. Способ по варианту осуществления 14, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры.
16. Способ по варианту осуществления 15, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
17. Способ по варианту осуществления 15, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
18. Способ по варианту осуществления 15, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
19. Способ производства полипептида, включающий в себя стадию культивирования в среде для культивирования клеток клетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором:
(a) среда для культивирования клеток включает в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и
(b) клетка экспрессирует полипептид.
20. Способ по варианту осуществления 19, в котором среда для культивирования клеток включает в себя:
от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина;
от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2;
от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6;
от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и
от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12.
21. Способ по варианту осуществления 19 или 20, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
22. Способ по варианту осуществления 21, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из:
от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1;
от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3;
от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5; и
от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7.
23. Способ по любому из вариантов осуществления 19-22, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя источник железа.
24. Способ по варианту осуществления 23, в котором источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо.
25. Способ по любому из вариантов осуществления 19-24, в котором среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ.
26. Способ по любому из вариантов осуществления 19-25, в котором среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ.
27. Способ по любому из вариантов осуществления 19-26, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон.
28. Способ по варианту осуществления 27, в котором концентрация гидрокортизона в среде для культивирования клеток составляет от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
29. Способ по любому из вариантов осуществления 19-28, в котором среда для культивирования клеток является химически определенной средой клеточной культуры.
30. Способ по любому из вариантов осуществления 19-28, в котором среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры.
31. Способ по любому из вариантов осуществления 19-30, в котором культивирование происходит во время фазы роста клетки.
32. Способ по любому из вариантов осуществления 19-31, в котором культивирование происходит во время фазы производства клетки.
33. Способ по варианту осуществления 32, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры.
34. Способ по варианту осуществления 33, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
35. Способ по варианту осуществления 33, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
36. Способ по варианту осуществления 33, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
37. Способ по любому из вариантов осуществления 19-36, в котором полипептид является антителом.
38. Способ по варианту осуществления 37, в котором антитело является антителом IgG1.
39. Способ по варианту осуществления 37 или 38, в котором антитело является антителом против VEGF, против мезотелина, против PCSK9 или против Beta7.
40. Способ по любому из вариантов осуществления 19-39, дополнительно включающий в себя стадию выделения полипептида из среды клеточной культуры.
41. Способ по варианту осуществления 40, в котором композиция, включающая в себя выделенный полипептид, выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость.
42. Способ по варианту осуществления 41, в котором композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл.
43. Полипептид, полученный способом по любому из вариантов осуществления 19-42.
44. Фармацевтическая композиция, включающая в себя полипептид по варианту осуществления 43 и фармацевтически приемлемый носитель.
45. Набор для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенными компонентами, включающий в себя:
цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина в среде клеточной культуры;
витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2 в среде клеточной культуры;
витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 в среде клеточной культуры;
витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 в среде клеточной культуры; и
витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
46. Набор по варианту осуществления 45, включающий в себя:
цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина в среде клеточной культуры;
витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2 в среде клеточной культуры;
витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6 в среде клеточной культуры;
витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9 в среде клеточной культуры; и
витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12 в среде клеточной культуры.
47. Набор по варианту осуществления 45 или 46, который дополнительно включает в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
48. Набор по варианту осуществления 47, который дополнительно включает в себя любой один или больше из:
витамина B1 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1 в среде клеточной культуры;
витамина B3 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3 в среде клеточной культуры;
витамина B5 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5 в среде клеточной культуры; и
витамина B7 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7 в среде клеточной культуры.
49. Набор по любому из вариантов осуществления 45-48, который дополнительно включает в себя источник железа.
50. Набор по варианту осуществления 49, в котором источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо.
51. Набор по любому из вариантов осуществления 45-50, который дополнительно включает в себя гидрокортизон.
52. Среда клеточной культуры, включающая в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9; и
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
53. Среда по варианту осуществления 52, включающая в себя:
от приблизительно 0,7 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина;
от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2;
от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6;
от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и
от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12.
54. Среда по варианту осуществления 52 или 53, дополнительно включающая в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
55. Среда по варианту осуществления 54, дополнительно включающая в себя любой один или больше из:
от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1;
от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3;
от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5; и
от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7.
56. Среда по любому из вариантов осуществления 52-55, которая дополнительно включает в себя источник железа.
57. Среда по варианту осуществления 56, в которой источник железа представляет собой лимоннокислое железо или сернокислое железо.
58. Среда по варианту осуществления 57, которая включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ.
59. Среда по варианту осуществления 58, которая включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ.
60. Среда по любому из вариантов осуществления 52-59, которая дополнительно включает в себя гидрокортизон.
61. Среда по варианту осуществления 60, которая включает в себя гидрокортизон в концентрации от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
62. Способ культивирования клеток, включающий в себя стадию контактирования клеток со средой клеточной культуры, включающей в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и
от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона.
63. Способ по варианту осуществления 62, в котором среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и/или витамин B12.
64. Способ по варианту осуществления 62 или 63, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2.
65. Способ по любому из вариантов осуществления 62-64, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6.
66. Способ по любому из вариантов осуществления 62-65, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9.
67. Способ по любому из вариантов осуществления 62-66, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
68. Способ по любому из вариантов осуществления 62-67, в котором среда для культивирования клеток является химически определенной средой клеточной культуры.
69. Способ по любому из вариантов осуществления 62-67, в котором среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры.
70. Способ по любому из вариантов осуществления 62-69, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы роста клеток.
71. Способ по любому из вариантов осуществления 62-70, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы производства клеток.
72. Способ по варианту осуществления 71, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры.
73. Способ по варианту осуществления 72, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
74. Способ по варианту осуществления 72, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
75. Способ по варианту осуществления 72, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
76. Способ получения полипептида, включающий в себя стадию культивирования в среде для культивирования клетокклетки, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором:
(a) среда для культивирования клетоквключает в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и
от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона; и
(b) клетка экспрессирует полипептид.
77. Способ по варианту осуществления 76, в котором среда для культивирования клетокдополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и/или витамин B12.
78. Способ по варианту осуществления 76 или 77, в котором среда для культивирования клетоквключает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2.
79. Способ по любому из вариантов осуществления 76-78, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6.
80. Способ по любому из вариантов осуществления 76-79, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9.
81. Способ по любому из вариантов осуществления 76-80, в котором среда для культивирования клеток включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
82. Способ по любому из вариантов осуществления 76-81, в котором среда для культивирования клеток является химически определенной средой клеточной культуры.
83. Способ по любому из вариантов осуществления 76-81, в котором среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой клеточной культуры.
84. Способ по любому из вариантов осуществления 76-83, в котором культивирование происходит во время фазы роста клетки.
85. Способ по любому из вариантов осуществления 76-84, в котором культивирование происходит во время фазы производства клетки.
86. Способ по варианту осуществления 85, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде клеточной культуры.
87. Способ по варианту осуществления 86, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
88. Способ по варианту осуществления 86, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
89. Способ по варианту осуществления 86, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде клеточной культуры.
90. Способ по любому из вариантов осуществления 76-89, в котором полипептид является антителом.
91. Способ по варианту осуществления 90, в котором антитело является антителом IgG1.
92. Способ по варианту осуществления 90 или 91, в котором антитело является антителом против VEGF, против мезотелина, против PCSK9 или против Beta7.
93. Способ по любому из вариантов осуществления 76-92, дополнительно включающий в себя стадию выделения полипептида из среды клеточной культуры.
94. Способ по варианту осуществления 93, в котором композиция, включающая в себя выделенный полипептид, выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость.
95. Способ по варианту осуществления 94, в котором композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл.
96. Полипептид, полученный способом по любому из вариантов осуществления 76-95.
97. Фармацевтическая композиция, включающая в себя полипептид по варианту осуществления 96 и фармацевтически приемлемый носитель.
98. Набор для дополения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов, включающий в себя:
цистин в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина в среде клеточной культуры;
лимоннокислое железо в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа в среде клеточной культуры; и
гидрокортизон в таком количестве, чтобы обеспечить концентрацию от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона в среде клеточной культуры.
99. Набор по варианту осуществления 98, который дополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и/или витамин B12.
100. Набор по варианту осуществления 98 или 99, который включает в себя витамин В2 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2 в среде клеточной культуры.
101. Набор по любому из вариантов осуществления 98-100, который включает в себя витамин B6 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6 в среде клеточной культуры.
102. Набор по любому из вариантов осуществления 98-101, который включает в себя витамин B9 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9 в среде клеточной культуры.
103. Набор по любому из вариантов осуществления 98-102, который включает в себя витамин B12 в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12 в среде клеточной культуры.
104. Среда клеточной культуры, включающая в себя:
от приблизительно 200 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа; и
от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,5 мкМ гидрокортизона.
105. Среда по варианту осуществления 104, которая дополнительно включает в себя витамин В2, витамин B6, витамин B9 и/или витамин B12.
106. Среда по варианту осуществления 104 или 105, которая включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2.
107. Среда по любому из вариантов осуществления 104-106, которая включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6.
108. Среда по любому из вариантов осуществления 104-107, которая включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9.
109. Среда по любому из вариантов осуществления 104-108, которая включает в себя от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12.
110. Композиция, включающая в себя (a) клетку, включающую в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид; и (b) среду согласно любому из вариантов осуществления 52-61 и 104-109.
111. Композиция, включающая в себя: (a) полипептид; и (b) среду согласно любому из вариантов осуществления 52-61 и 104-109.
[0166] Следующие Примеры предлагаются для того, чтобы проиллюстрировать, но не ограничивать настоящее изобретение.
ПРИМЕРЫ
[0167] Были идентифицированы среды, которые производят белковый фармацевтический продукт с приемлемыми качественными признаками, такими как цвет, в частности, когда белковый продукт присутствует как концентрированный раствор (например, с концентрацией по меньшей мере 100 мг/мл). В некоторых аспектах белковый продукт присутствует как композиция, содержащая по меньшей мере 1 мг/мл. Описываются способы культивирования клеток в предложенных в настоящем документе средах, а также способы получения полипептида с использованием данных сред. В одном аспекте среды могут включать в себя цистин и/или цистеин и витамины B2, B6, B9 и B12, с необязательным добавлением источника железа и гидрокортизона. В другом аспекте среды могут включать в себя цистин и/или цистеин, гидрокортизон и источник железа, с необязательным добавлением витаминов B2, B6, B9 и B12. В частности, рассматриваются композиции, содержащие цистин. Каждый из компонентов среды может присутствовать в любом количестве, предложенном в настоящем документе. Среды могут быть химически определенными или химически неопределенными. Среды могут уменьшать присутствие полипептидных вариантов, отличающихся зарядами, и/или уменьшить присутствие реакционноспособных разновидностей кислорода при использовании в способе получения полипептида по сравнению с полипептидом, полученным в других средах. Среды находят применение во всех фазах производства клеточной культуры и полипептида и могут использоваться в базальной среде и/или в питательной среде. Предлагается полипептид, полученный любым из способов, подробно описанных в настоящем документе, а также фармацевтическая композиция, включающая в себя полипептид, полученный способами, подробно описанными в настоящем документе. В одном аспекте фармацевтические композиции включают в себя полипептид в концентрации по меньшей мере или приблизительно 100 мг/мл или 125 мг/мл или 150 мг/мл. В другом аспекте фармацевтические композиции включают в себя полипептид в концентрации по меньшей мере или приблизительно 1 мг/мл или 10 мг/мл или 25 мг/мл или 50 мг/мл или 75 мг/мл. В частности, рассматриваются способ изготовления и композиции, включающие в себя антитела. Также описываются наборы для дополнения в среду для культивирования клеток химически определенных компонентов.
[0168] Во время всего процесса разработки лекарственных веществ важно, чтобы качество продукта соответствовало определенным промышленным стандартам для использования в клинике. Последние тенденции в направлении подкожного введения моноклональных антител потребовали увеличения концентрации лекарственного вещества в рецептуре до значений ≥100 мг/мл. Однако при таких высоких концентрациях цвет лекарственного вещества становится более интенсивным, затрудняя обеспечение соответствия установленным качественным ожиданиям в плане цвета продукта. Как описано в настоящем документе, были идентифицированы несколько модификаций среды (как химически неопределенных, так и химически определенных), которые могут уменьшить интенсивность цвета лекарственного вещества с тем, чтобы соответствовать стандартам качества продукта.
[0169] Клеточная линия CHO, описанная в Примерах, была генетически спроектирована для того, чтобы выделять гуманизированное антитело рекомбинантного гена (упоминаемое в настоящем документе как моноклональное антитело IgG1) с использованием способа отбора дигидрофолат редуктаза (dhfr) / метотрексат, подобного способу, ранее описанному в публикации Kaufman et al., Mol. Cell. Biol., 2(11):1304-1319 (1982). Оригинальная трансфекция использовала систему отбора GS с метионин сульфоксимином в качестве агента селекции, а также среды, не содержащие глютамина. Последующая супертрансфекция использовала систему выбора dhfr и метотрексат в качестве агента селекции. Перед инициированием фазы роста в 2-литровых суспензионных биореакторах с мешалками криогенно замороженные ампулы этой клеточной линии CHO размораживались и культивировались в химически определенной среде во встряхиваемых колбах в течение по меньшей мере двух недель при температуре 37°C в увлажненном инкубаторе в атмосфере с 5% содержанием CO2 для того, чтобы получить суспензию клеточной культуры с хорошими характеристиками роста и жизнеспособности.
Пример 1: Интенсивность цвета рецептур, содержащих антитело, выделенное из производящих антитело клеточных линий.
[0170] Клеточная линия CHO, способная к производству моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7), культивировалась в пептоне, содержащем химически неопределенную среду. Выделенное антитело очищалось и анализировалось на цвет с использованием стандартной пробы Светлоты, Опалесценции и Окраски (проба COC) (см. публикацию Council of Europe. European Pharmacopoeia., 2008, 7th Ed., p. 22). Вкратце, проба COC выполнялась путем использования идентичных трубок бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским основанием и внутренним диаметром от 15 мм до 25 мм. Пробирка заполнялась до глубины 40 мм раствором белка с концентрацией 150 г/л, приготовленным из очищенной и сконцентрированной жидкости клеточной культуры, содержащей выделенное клетками моноклональное антитело IgG1. Пробирка, содержащая раствор антитела, сравнивалась с девятью референсными пробирками, каждая из которых была заполнена референсным раствором, имеющим цвет в пределах от B1 (самый темный) до B9 (самый светлый), путем ее рассматривания вертикально на белом фоне в рассеянном дневном свете. Измерение значения COC для раствора моноклонального антитела IgG1 дало результат ≤B5 (Фиг. 1; Рецептура I).
[0171] Клеточная линия CHO, которая производит моноклональное антитело IgG1 (анти-Beta7), культивировалась в химически определенной среде. Для приготовления клеточной среды растворы базальных химически определенных сред (среды 1) и питательных химически определенных сред (среды 2) были приготовлены путем объединения компонентов в один индивидуально сформулированный смешанный порошок, который растворялся в воде и доводился до конечных значений pH и осмотического давления, которые гарантировали оптимальный рост клеток. Каждая из базальных сред 1 и питательных сред 2 имела более 20 компонентов с интересующими компонентами, перечисленными в Таблице A. Некоторые компоненты среды, такие как глюкоза, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно во время приготовления среды. Для того чтобы инициировать фазу роста клеточной культуры, клетки CHO были посеяны в количестве приблизительно 1,0×106 клеток/мл в 2-литровых биореакторах с мешалками (производства компании Applikon, г. Фостер-Сити, штат Калифорния), содержащих 1 л базальной среды 1. Клетки культивировались в прерывистом режиме питания с добавлением по 100 мл питательных сред 2 на литр жидкости клеточной культуры на 3-й, 6-й и 9-й дни для инициирования фазы производства. Концентрация глюкозы анализировалась каждый день, и если концентрация глюкозы падала ниже 3 г/л, она пополнялась с помощью концентрированного раствора с концентрацией глюкозы 500 г/л для профилактики истощения глюкозы. Реакторы были оборудованы калиброванными датчиками растворенного кислорода, pH и температуры. Управление количеством растворенного кислорода осуществлялось в реальном масштабе времени путем барботирования воздуха и/или кислорода. Управление величиной pH осуществлялось посредством добавления CO2 или Na2CO3, при этом пеногаситель добавлялся к культурам по мере необходимости. Клеточные культуры выдерживались при pH 7,0 и температуре 37°C с нулевого по третий день, а после 3-го дня - при температуре 33°C. Клеточные культуры перемешивались со скоростью 275 об/мин, а количество растворенного кислорода составляло 30% от насыщения воздухом. Осмотическое давление отслеживалось с использованием осмометра производства компании Advanced Instruments (г. Норвуд, штат Массачусетс). В дополнение к этому, офлайновое значение pH и концентрации метаболитов также определялись ежедневно с использованием прибора Nova Bioprofile 400 (производства компании Nova Biomedical, г. Уолтхэм, штат Массачусетс). Плотность жизнеспособных клеток (VCC) и жизнеспособность клеток измерялись ежедневно с использованием автоматизированного счетчика клеток ViCell® (производства компании Beckman Coulter, г. Фуллертон, штат Калифорния). Градуированные центрифужные пробирки (производства компании Kimble Science Products, г. Фуллертон, штат Калифорния) использовались для того, чтобы измерить гематокритное число (PCV) после центрифугирования суспензии клеток в течение 10 минут при ускорении 700×g или 836×g. PCV выражалось как процент от общего объема культуры. В конце цикла клеточной культуры, на 14-й день, когда количество белка в культуре составляло приблизительно 2-10 г/л, жидкость клеточной культуры собиралась центрифугированием. Моноклональное антитело, содержавшееся в собранной жидкости клеточной культуры, очищалось с использованием аффинной к протеину А хроматографии. После очистки концентрация белка в пуле элюированного протеина А составляла приблизительно 5-10 г/л. Пул протеина А дополнительно концентрировался до 150 г/л с использованием центрифужных фильтров Amicon Centricon (производства компании Millipore Corporation, г. Биллерика, штат Массачусетс). Цвет в концентрированном пуле протеина А измерялся с использованием стандартной пробы COC. Альтернативно собранная жидкость клеточной культуры очищалась с использованием стандартного процесса очистки антитела, который включал в себя аффинную очистку посредством аффинной к протеину А хроматографии, дополнительную очистку посредством анионообменной и катионообменной хроматографии, фильтрацию для удаления вируса, а также заключительную стадию ультрафильтрации и диафильтрации для окончательной формулировки и концентрирования антитела перед измерением цвета с помощью стандартной пробы COC. См. публикацию Kelley, B. mAbs., 2009, 1(5):443-452. Даже при том, что оно давало несколько завышенные показатели, измерение цвета в концентрированном пуле протеина А было достаточно показательным в плане ожидаемого цвета окончательной рецептуры антитела, произведенной путем описанного стандартного процесса очистки антитела. Жидкость клеточной культуры ежедневно собиралась для определения титра антитела путем центрифугирования 1 мл жидкости клеточной культуры перед очисткой с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проба COC выполнялась с использованием идентичных пробирок из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским дном и внутренним диаметром от 15 мм до 25 мм. Две пробирки заполнялись каждая до глубины 40 мм раствором белка с концентрацией 150 г/л, приготовленным из очищенной и сконцентрированной жидкости клеточной культуры, содержащей выделенное клетками моноклональное антитело IgG1. Каждая пробирка, которая содержала раствор антитела, сравнивалась с девятью референсными пробирками, каждая из которых была заполнена референсным раствором, имеющим цвет в пределах от B1 (самый темный) до B9 (самый светлый), путем ее рассматривания вертикально на белом фоне в рассеянном дневном свете. Анализ цвета содержащих антитела растворов показал значение COC ≤B4 или ≤B3 (Фиг.1; Рецептуры II и III, соответственно).
Таблица A Интересующие компоненты |
||
Компоненты сред | Среды 1 (базальная) | Среды 2 (питательная) |
Сернокислое железо (мкМ) | 75 | 0 |
Витамин B2 (мг/л) | 1,41 | 10 |
Витамин B6/ пиридоксин (мг/л) | 15,42 | 7 |
Витамин B6/ пиридоксаль (мг/л) | 0 | 60 |
Витамин B9 (мг/л) | 9,93 | 197 |
Витамин B12 (мг/л) | 3,05 | 48 |
Цистеин (мг/л) | 525 | 1500 |
Цистин (мг/л) | 0 | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 | 0 |
Пример 2: Уменьшение интенсивности цвета антител, выделенных из производящих антитело клеточных линий, путем изменения конкретных компонентов в средах клеточной культуры.
[0172] Базальные среды 1 и питательные среды 2 были изменены так, чтобы они содержали уменьшенные концентрации нескольких питательных веществ для использования в экспериментах с клеточной культурой для того, чтобы определить, может ли изменение состава среды уменьшить интенсивность цвета выделенного моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7), произведенного клеточной линией CHO. Вкратце, растворы базальных химически определенных сред (среды 3) и питательных химически определенных сред (среды 4) были приготовлены путем объединения компонентов в один индивидуально сформулированный смешанный порошок, который растворялся в воде и доводился до конечных значений pH и осмотического давления, которые гарантировали оптимальный рост клеток. Каждая из базальных сред 3 и питательных сред 4 имела более 20 компонентов с интересующими компонентами, перечисленными в Таблице B. Некоторые компоненты среды, такие как глюкоза, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно во время приготовления среды. Аналогичным образом те компоненты среды, которые изменялись для этого исследования, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно в подходящем количестве во время приготовления среды (Таблица B). Лимоннокислое железо добавлялось в виде концентрированного раствора с концентрацией 5 г/л, витамин В2 обеспечивался как порошок рибофлавина, витамин B6 обеспечивался как пиридоксин HCl или как пиридоксаль HCl, витамин B9 обеспечивался как порошок фолиевой кислоты, витамин B12 обеспечивался как порошок цианокобаламина, цистеин обеспечивался как порошок моногидрата моногидрохлорида L-цистеина, цистин обеспечивался как порошок моногидрата двунатриевой соли, и гидрокортизон добавлялся в виде концентрированного раствора с концентрацией 150 мкМ.
Таблица B Интересующие компоненты |
||||
Компоненты сред | Среды 1 (базальная) |
Среды 2 (питательная) |
Среды 3 (базальная) |
Среды 4 (питательная) |
Железо (мкМ) | 75a | 0 | 18b | 0 |
Витамин B2 (мг/л) | 1,41 | 10 | 0,25 | 0 |
Витамин B6/ пиридоксин (мг/л) | 15,42 | 7 | 5,35 | 0 |
Витамин B6/ пиридоксаль (мг/л) | 0 | 60 | 0 | 0 |
Витамин B9 (мг/л) | 9,93 | 197 | 8,61 | 0 |
Витамин B12 (мг/л) | 3,05 | 48 | 1,76 | 0 |
Цистеин (мг/л) | 525 | 1500 | 0 | 1500 |
Цистин (мг/л) | 0 | 0 | 480 | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 | 0 | 150 | 0 |
a Источник железа - сернокислое железо b Источник железа - лимоннокислое железо |
[0173] Для того, чтобы инициировать фазу роста клеточной культуры, клетки CHO были посеяны в количестве приблизительно 1,0×106 клеток/мл в 2-литровых биореакторах с мешалками (производства компании Applikon, г. Фостер-Сити, штат Калифорния), содержащих 1 л базальных сред 3. Клетки культивировались в прерывистом режиме питания с добавлением по 100 мл питательных сред 4 на литр жидкости клеточной культуры на 3-й, 6-й и 9-й дни для инициирования фазы производства. Концентрация глюкозы анализировалась каждый день, и если концентрация глюкозы падала ниже 3 г/л, она пополнялась с помощью концентрированного раствора с концентрацией глюкозы 500 г/л для профилактики истощения глюкозы. Реакторы были оборудованы калиброванными датчиками растворенного кислорода, pH и температуры. Управление количеством растворенного кислорода осуществлялось в реальном масштабе времени путем барботирования воздуха и/или кислорода. Управление величиной pH осуществлялось посредством добавления CO2 или Na2CO3, при этом пеногаситель добавлялся к культурам по мере необходимости. Клеточные культуры выдерживались при pH 7,0 и температуре 37°C с нулевого по третий день, а после 3-го дня - при температуре 35°C. Клеточные культуры перемешивались со скоростью 275 об/мин, а количество растворенного кислорода составляло 30% от насыщения воздухом. Осмотическое давление отслеживалось с использованием осмометра производства компании Advanced Instruments (г. Норвуд, штат Массачусетс). В дополнение к этому, офлайновое значение pH и концентрации метаболитов также определялись ежедневно с использованием прибора Nova Bioprofile 400 (производства компании Nova Biomedical, г. Уолтхэм, штат Массачусетс). Плотность жизнеспособных клеток (VCC) и жизнеспособность клеток измерялись ежедневно с использованием автоматизированного счетчика клеток ViCell® (производства компании Beckman Coulter, г. Фуллертон, штат Калифорния). Градуированные центрифужные пробирки (производства компании Kimble Science Products, г. Фуллертон, штат Калифорния) использовались для того, чтобы измерить гематокритное число (PCV) после центрифугирования суспензии клеток в течение 10 минут при ускорении 700×g или 836×g. PCV выражалось как процент от общего объема культуры. В конце цикла клеточной культуры, на 14-й день, когда количество белка в культуре составляло приблизительно 2-10 г/л, жидкость клеточной культуры собиралась центрифугированием. Моноклональное антитело, содержавшееся в собранной жидкости клеточной культуры, очищалось с использованием аффинной к протеину А хроматографии. После очистки концентрация белка в пуле элюированного протеина А составляла приблизительно 5-10 г/л. Пул протеина А дополнительно концентрировался до 150 г/л с использованием центрифужных фильтров Amicon Centricon (производства компании Millipore Corporation, г. Биллерика, штат Массачусетс). Цвет в концентрированном пуле протеина А измерялся с использованием стандартной пробы COC. Параллельно с этим собранная жидкость клеточной культуры очищалась с использованием стандартного процесса очистки антитела, который включал в себя аффинную очистку посредством аффинной к протеину А хроматографии, дополнительную очистку посредством анионообменной и катионообменной хроматографии, фильтрацию для удаления вируса, а также заключительную стадию ультрафильтрации и диафильтрации для окончательной формулировки и концентрирования антитела перед измерением цвета с помощью стандартной пробы COC. См. публикацию Kelley, B. mAbs., 2009, 1(5):443-452. Даже при том, что оно давало несколько завышенные показатели, измерение цвета в концентрированном пуле протеина А было достаточно показательным в плане ожидаемого цвета окончательной рецептуры антитела, произведенной путем описанного стандартного процесса очистки антитела. Жидкость клеточной культуры ежедневно собиралась для определения титра антитела путем центрифугирования 1 мл жидкости клеточной культуры перед очисткой с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии. Проба COC выполнялась с использованием идентичных пробирок из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским дном и внутренним диаметром от 15 мм до 25 мм. Пробирка заполнялась до глубины 40 мм раствором белка с концентрацией 150 г/л, приготовленным из очищенной и сконцентрированной жидкости клеточной культуры, содержащей выделенное клетками моноклональное антитело IgG1. Пробирка, содержащая раствор антитела, сравнивалась с семью референсными пробирками, каждая из которых была заполнена референсным раствором, имеющим цвет в пределах от BY1 (самый темный) до BY7 (самый светлый), путем ее рассматривания вертикально на белом фоне в рассеянном дневном свете. Измерение значения COC для раствора моноклонального антитела IgG1 дало результат ≤BY5 (Фиг.1; Рецептура VII). Значение гематокритного числа (PCV) было немного уменьшено в клеточной культуре, выращенной в базальных средах 3 и питательных средах 4 по сравнению с клеточной культурой, выращенной в базальных средах 1 и питательных средах 2 (Фиг.2A). Это сокращение коррелировало с немного уменьшенным производством антитела (Фиг.2B). Дополнительный эксперимент для оценки влияния этих сред на PCV и титр антитела подтвердили, что значение PCV уменьшалось, когда клетки культивировались с базальными средами 3 и питательными средами 4 по сравнению с клетками, культивируемыми с базальными средами 1 и питательными средами 2 (Фиг.2C). Как и до этого, уменьшение значения PCV коррелировало с уменьшенным производством антитела (Фиг.2D).
[0174] Эти результаты показывают, что интенсивность цвета моноклонального антитела IgG1, произведенного путем культивирования клеток CHO с базальными средами 3 и питательными средами 4, уменьшается по сравнению с интенсивностью цвета моноклонального антитела IgG1, произведенного путем культивирования клеток в базальных средах 1 и питательных средах 2.
Пример 3: Уменьшение интенсивности цвета антител, выделенных из производящих антитело клеточных линий, путем изменения уровней содержания витамина В в средах клеточной культуры.
[0175] Для того, чтобы определить влияние компонентов, которые изменялись в базальных средах 3 и питательных средах 4, на интенсивность цвета выделенного антитела, уровни содержания витамина В2, B6, B9 и B12 изменялись, в то время как уровни содержания других компонентов среды сохранялись постоянными. Среды были приготовлены, как описано в Примере 2. Те компоненты среды, которые изменялись для этого исследования, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно в подходящем количестве во время приготовления среды. Базальные среды 5 составлялись так, чтобы они имели уменьшенные уровни содержания витаминов, подобно базальным средам 3, а все другие компоненты были подобны базальным средам 1 (Таблица C). Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO питание клеточной культуры осуществлялось базальными средами 5 на начальной фазе роста, а на 3-й, 6-й и 9-й дни - питательными средами 2 или питательными средами 4. Измерения жизнеспособности клеток и выделение моноклонального антитела IgG1 выполнялись, как описано в Примере 2. После очистки антитела интенсивность цвета и титр антитела также определялись, как описано в Примере 2. Измерение значения COC для раствора моноклонального антитела IgG1, полученного из клеток, культивированных с базальными средами 5 и питательными средами 2, дало результат COC ≤B4 (Фиг.1; Рецептура V). Измерение значения COC для раствора моноклонального антитела IgG1, полученного из клеток, культивированных с базальными средами 5 и питательными средами 4, дало результат COC ≤B4 (Фиг.1; Рецептура IV).
Таблица C Среды с пониженными уровнями содержания витаминов B2, B6, B9 и B12 |
|
Компоненты сред | Среды 5 (базальная) |
Сернокислое железо (мкМ) | 75 |
Витамин B2 (мг/л) | 0,25 |
Витамин B6/пиридоксин (мг/л) | 5,35 |
Витамин B6/пиридоксаль (мг/л) | 0 |
Витамин B9 (мг/л) | 8,61 |
Витамин B12 (мг/л) | 1,76 |
Цистеин (мг/л) | 525 |
Цистин (мг/л) | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 |
[0176] Для того, чтобы оценить вклад отдельных компонентов витамина В (витамин В2, B6, B9 и B12) в интенсивность цвета выделенного антитела, был выполнен полный факторный эксперимент. В то время как уровень содержания витамина В2 рассматривался как отдельный фактор, уровни содержания пиридоксина и пиридоксаля были объединены в один фактор - витамин B6, так что концентрация этих двух питательных веществ изменялась одновременно. Аналогичным образом уровни содержания витаминов B9 и B12 изменялись вместе как один фактор, так что концентрация этих двух питательных веществ изменялась одновременно. Были приготовлены несколько рецептур среды, включая среды, перечисленные в Таблицах D, E и F. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клеточная культура питалась базальными средами 5 и питательными средами 4, базальными средами 6 и питательными средами 7, базальными средами 8 и питательными средами 9, или базальными средами 10 и питательными средами 11 в прерывистом режиме питания. Дополнительные клеточные культуры питались базальными средами, содержащими витамин В2 в концентрации 1,41 мг/л и/или витамин B6 в концентрации 15,42 мг/л (в виде пиридоксина) и питательными средами, содержащими витамин В2 в концентрации 10 мг/л и/или витамин B6 в концентрации 76 мг/л (7мг/л пиридоксина и 60 мг/л пиридоксаля). Измерения жизнеспособности клеток и выделение моноклонального антитела IgG1 выполнялись, как описано в Примере 2. После очистки антитела титры антитела определялись, как описано в Примере 2. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Для этой цветовой пробы, упоминаемой в настоящем документе как проба нормализованной интенсивности флюоресценции (NIFTY), образцы моноклонального антитела массой приблизительно от 50 до 125 мкг были проанализированы с помощью эксклюзионной хроматографии (SEC) с использованием колонки G3000SWXL (TOSOH) с изократной скоростью потока 0,5 мл/мин. Подвижная фаза для эксклюзионной хроматографии представляла собой раствор 0,2M фосфорнокислого калия, 0,25M хлористого калия со значением pH, равным 6,2. Температура колонки поддерживалась равной 15°C. Осуществлялся мониторинг элюента эксклюзионной хроматографии на предмет ультрафиолетового поглощения на длине волны 280 нм и на предмет флюоресценции с длиной волны возбуждения 350 нм и длиной волны излучения 425 нм. Пики на хроматограммах SEC для ультрафиолетового поглощения и флюоресцентного излучения для разновидностей моноклонального антитела интегрировались с использованием программного обеспечения Agilent Chemstation. Для каждого образца моноклонального антитела нормализованная флюоресценция определялась путем деления площади главного пика флюоресцентного излучения на площадь главного пика ультрафиолетового поглощения, что корректировало флюоресцентный отклик с учетом вклада массы антитела. Значение интенсивности цвета затем определялось путем вычисления отношения нормализованной флюоресценции тестового образца моноклонального антитела к аналогичному значению для эталонного образца моноклонального антитела, имеющего значение пробы COC ≤B5. Анализ изменения гематокритного числа во времени (IVPCV) и уровней титра антитела с помощью статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал, что хотя изменение уровней содержания витамина В2 и витамина B6 как в базальных средах, так и в питательных средах незначительно воздействовало на жизнеспособность клетки и уровни титра антитела (Фиг.3A и B; средняя линия тренда), увеличенные уровни этих двух витаминов в средах для культивирования клеток значительно увеличивали интенсивность цвета в выделенном антителе (Фиг.4; средняя линия тренда). В противоположность этому, увеличенные уровни содержания витамина B9 и витамина B12 не оказывали значительного влияния на жизнеспособность клетки, уровни титра антитела или интенсивность цвета (Фиг.3 и Фиг.4; средняя линия тренда). Дополнительно к этому, низкие уровни интенсивности цвета наблюдались в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими витамин В2 в концентрации 0,25 мг/л и витамин B6 в концентрации 5,35 мг/л (в виде пиридоксина), и питательными средами, не содержащими витамина В2 и витамина B6.
[0177] Влияние витаминов B1, B3, B5 и B7 также было исследовано; однако влияние этих питательных веществ на интенсивность цвета содержащих антитела растворов было незначительным.
Таблица D Среды с вариациями витамина B2 |
||
Компоненты сред | Среды 6 (базальная) | Среды 7 (питательная) |
Сернокислое железо (мкМ) | 75 | 0 |
Витамин B2 (мг/л) | 1,41 | 10 |
Витамин B6/пиридоксин (мг/л) | 5,35 | 0 |
Витамин B6/пиридоксаль (мг/л) | 0 | 0 |
Витамин B9 (мг/л) | 8,61 | 0 |
Витамин B12 (мг/л) | 1,76 | 0 |
Цистеин (мг/л) | 525 | 1500 |
Цистин (мг/л) | 0 | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 | 0 |
Таблица Е Среды с вариациями витамина B6 |
||
Компоненты сред | Среды 8 (базальная) | Среды 9 (питательная) |
Железо (мкМ) | 75 | 0 |
Витамин B2 (мг/л) | 0,25 | 0 |
Витамин B6/пиридоксин (мг/л) | 15,42 | 7 |
Витамин B6/пиридоксаль (мг/л) | 0 | 60 |
Витамин B9 (мг/л) | 8,61 | 0 |
Витамин B12 (мг/л) | 1,76 | 0 |
Цистеин (мг/л) | 525 | 1500 |
Цистин (мг/л) | 0 | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 | 0 |
Таблица F Среды с вариациями витамина B9 и B12 |
||
Компоненты сред | Среды 10 (базальная) |
Среды 11 (питательная) |
Железо (мкМ) | 75 | 0 |
Витамин B2 (мг/л) | 0,25 | 0 |
Витамин B6/пиридоксин (мг/л) | 5,35 | 0 |
Витамин B6/пиридоксаль (мг/л) | 0 | 0 |
Витамин B9 (мг/л) | 9,93 | 197 |
Витамин B12 (мг/л) | 3,05 | 48 |
Цистеин (мг/л) | 525 | 1500 |
Цистин (мг/л) | 0 | 0 |
Гидрокортизон (нМоль) | 150 | 0 |
Пример 4: Уменьшение интенсивности цвета антител, выделенных из производящих антитело клеточных линий, путем изменения источника железа и уровней его содержания в средах клеточной культуры
[0178] Для того чтобы оценить влияние уровней содержания железа на интенсивность цвета выделенного антитела, уровень содержания железа изменялся, в то время как уровни содержания других компонентов среды сохранялись постоянными. Среды были приготовлены, как описано в Примере 2. Те компоненты среды, которые изменялись для этого исследования, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно в подходящем количестве во время приготовления среды. Рецептуры базальных сред 1 были изменены так, чтобы уменьшить уровни содержания сернокислого железа с тем, чтобы получить базальные среды 12, содержащие 18 мкМ сернокислого железа, и базальные среды 13, содержащие 10 мкМ сернокислого железа. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO питание клеточной культуры осуществлялось базальными средами 1 и питательными средами 2, базальными средами 12 и питательными средами 2, или базальными средами 13 и питательными средами 2 в прерывистом режиме. Измерения жизнеспособности клеток и выделение моноклонального антитела IgG1 выполнялись, как описано в Примере 2. После очистки антитела титры антитела определялись, как описано в Примере 2. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Эта цветовая проба, также называемая пробой NIFTY, осуществлялась как описано в Примере 3. Анализ изменения гематокритного числа во времени (IVPCV) и уровней титра антитела с помощью статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал, что хотя жизнеспособность клетки и уровни титра антитела уменьшились при более низких уровнях концентрации железа по сравнению с концентрацией железа 75 мкМ (Фиг.5A и B), более низкая концентрация железа в средах для культивирования клеток значительно уменьшила интенсивность цвета в выделенном антителе (Фиг.5C).
[0179] Для того, чтобы установить, происходит ли наблюдаемый эффект влияния характеристик клеточной культуры на цвет из-за внутриклеточных или внеклеточных феноменов, был проведен ряд инкубационных экспериментов in vitro. Моноклональное антитело в количестве 1 г/л было помещено в свежеприготовленную среду для культивирования клетоки выдерживалось при температуре 33°C в течение шести дней. Среды клеточной культуры, использованные для инкубации in vitro, имели концентрацию сернокислого железа 10, 18 и 75 мкМ. Концентрация витамина В сохранялась постоянной на пониженном уровне с концентрациями 0,25 мг/л витамина В2, 5,35 мг/л витамина B6 (5,35 мг/л пиридоксина+0 мг/л пиридоксаля), 8,61 мг/л витамина B9 и 1,76 мг/л витамина B12. Образцы инкубированной смеси брались на 0-й, 3-й и 6-й дни, и антитело очищалось с помощью хроматографии с протеином А. Выделенный, содержащий антитело раствор, измерялся на интенсивность его цвета пробой NIFTY. Наблюдалось увеличение интенсивности цвета от 1,0 единицы в нулевой день до 1,8, 1,44 или 1,27 единиц на 6-й день в содержащих антитела растворах, выделенных из клеток, выращенных в средах, содержащих 75, 18 или 10 мкМ сернокислого железа, соответственно (Фиг.5D). Увеличенное формирование цвета при более высоких концентрациях железа отражало результаты экспериментов с клеточной культурой, указывающих на то, что внеклеточные механизмы играют некоторую роль в окрашивании антитела.
[0180] Для дальнейшей оценки вклада железа в интенсивность цвета выделенного антитела источник и уровень содержания железа изменялись, в то время как уровни содержания других компонентов среды сохранялись постоянными. Среды были приготовлены, как описано в Примере 2. Те компоненты среды, которые изменялись для этого исследования, не добавлялись в смешанный порошок, а вместо этого добавлялись отдельно в подходящем количестве во время приготовления среды. Рецептуры базальных сред 1 были изменены так, чтобы уменьшить уровни содержания сернокислого железа с тем, чтобы получить базальные среды 12, содержащие 18 мкМ сернокислого железа, и базальные среды 13, содержащие 10 мкМ сернокислого железа. Дополнительно к этому рецептуры базальных сред 1 были изменены так, чтобы уменьшить уровни содержания железа, а также различные источники железа с тем, чтобы получить базальные среды 14, содержащие 18 мкМ азотнокислого железа, базальные среды 15, содержащие 18 мкМ лимоннокислого железа и базальные среды 16, содержащие 10 мкМ лимоннокислого железа. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO питание клеточной культуры осуществлялось базальными средами 1 и питательными средами 2, базальными средами 12 и питательными средами 2, базальными средами 13 и питательными средами 2, базальными средами 14 и питательными средами 2, базальными средами 15 и питательными средами 2, или базальными средами 16 и питательными средами 2 в прерывистом режиме. Измерения жизнеспособности клеток и выделение моноклонального антитела IgG1 выполнялись, как описано в Примере 2. После очистки антитела титры антитела определялись, как описано в Примере 2. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Эта цветовая проба, также называемая пробой NIFTY, осуществлялась, как описано в Примере 3. Анализ изменения гематокритного числа во времени (IVPCV) и уровней титра антитела с помощью статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал, что жизнеспособность клетки и уровни титра антитела были понижены при более низких уровнях концентрации сернокислого железа по сравнению с сернокислым железом в концентрации 75 мкМ (Фиг.6A и 6B). Жизнеспособность клетки и уровни титра антитела для клеточной культуры, использовавшей среды, содержащие 18 мкМ лимоннокислого железа, были сопоставимы со средами, содержащими 75 мкМ сернокислого железа (Фиг.6A и 6B). Однако, использование 18 мкМ лимоннокислого железа в средах для культивирования клеток значительно уменьшило интенсивность цвета в выделенном антителе по сравнению с сернокислым железом во всех проверенных концентрациях (Фиг.6C). Жизнеспособность клетки, титры антитела, и цвет антитела, выделенного из клеточной культуры, выращенной в средах, содержащих 18 мкМ азотнокислого железа, были сопоставимы с аналогичными показателями, полученными при использовании сред, содержащих 10 мкМ или 18 мкМ сернокислого железа (Фиг.6A-C).
[0181] Пониженные уровни содержания витамина В и уменьшенные концентрации железа были скомбинированы для того, чтобы проверить, не являются ли аддитивными выгодные влияния на цвет витаминов и железа. Рецептуры базальных сред 13, 14, 15 и 16 были изменены так, чтобы уменьшить уровни содержания витаминов В с тем, чтобы получить базальные среды 21, 22, 23 и 25, соответственно. Дополнительно к этому, рецептуры базальных сред 1 были изменены так, чтобы иметь уменьшенный уровень содержания витаминов В и 10 мкМ азотнокислого железа в качестве источника железа с тем, чтобы получить базальные среды 24. Пониженные уровни содержания витаминов для сред 21-25 были следующими: 0,25 мг/л витамина В2, 5,35 мг/л витамина B6 (5,35 мг/л пиридоксина+0 мг/л пиридоксаля), 8,61 мг/л витамина B9 и 1,76 мг/л витамина B12. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO питание клеточной культуры осуществлялось базальными средами 21, 22, 23, 24 или 25 и питательными средами 2 в прерывистом режиме. Выделение моноклонального антитела IgG1 и измерение титров антитела были выполнены, как описано в Примере 2. Интенсивность цвета была измерена пробой NIFTY. Анализ уровней титра антитела и интенсивности цвета показал, что, когда концентрация сернокислого железа была понижена от 75 мкМ до 18 мкМ и объединена с более низкими концентрациями витамина, получающийся цвет и титр были ниже, чем при уменьшении только одного из этих факторов (Фиг.6D и 6E, значки «+»). Однако, похоже, что нет никакой дополнительной выгоды от уменьшения концентрации железа с 18 мкМ до 10 мкМ как для азотнокислого железа, так и для сернокислого железа (Фиг.6D и 6E, значки «+»).
[0182] Для того, чтобы исследовать вклад реакционноспособных разновидностей кислорода (ROS) в интенсивность цвета антитела, были выполнены эксперименты in vitro путем помещения образца моноклонального антитела IgG1 в количестве 2 г/л в пробирку, содержащую среды клеточной культуры, подкрепленные сернокислым железом в количестве 75 мкМ или 18 мкМ. Дополнительные эксперименты in vitro были выполнены путем помещения образца моноклонального антитела IgG1 моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) в количестве 2 г/л в пробирку, содержащую среды клеточной культуры, подкрепленные витамином В2 в концентрации 1,41 мг/л или витамином В2 в концентрации 0,25 мг/л. Образцы были выдержаны при температуре 37°C в течение 5 дней без каких-либо клеток в отсутствие каталазы или в присутствии 203 ед/мл каталазы. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Эта цветовая проба, также называемая пробой NIFTY, осуществлялась, как описано в Примере 3. Анализ интенсивности цвета с помощью статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал, что в то время как повышенные уровни содержания железа увеличивали интенсивность цвета раствора антитела (Фиг.7A), это увеличение интенсивности цвета было уменьшено добавлением каталазы (Фиг.7B; средняя линия тренда). И напротив, хотя повышенные уровни содержания витамина В2 увеличивали интенсивность цвета раствора антитела, интенсивность цвета не уменьшалась при добавлении каталазы (Фиг.7A и 7B; средняя линия тренда).
Пример 5: Уменьшение формирования кислых вариантов антител, отличающихся зарядами, выделенных из производящих антитело клеточных линий, путем изменения конкретных компонентов в средах клеточной культуры.
[0183] Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались с одним из трех растворов измененных базальных сред 1, каждый из которых содержал 10 мкМ или 18 мкМ или 75 мкМ сернокислого железа. Питание (то есть, культивирование) дополнительных клеточных культур осуществлялось растворами одной из двух измененных базальных сред 3, каждый из которых содержал 10 мкМ или 18 мкМ лимоннокислого железа. Питание всех клеточных культур осуществлялось не содержащими железа питательными средами в прерывистом режиме. Выделение моноклонального антитела IgG1 и определение титра антитела выполнялись как описано в Примере 2. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Эта цветовая проба, также называемая пробой NIFTY, осуществлялась, как описано в Примере 3. Для обнаружения кислых вариантов антитела, отличающиеся зарядами, в очищенном растворе разнородность зарядов моноклональных антител анализировалась с помощью ионообменной хроматографии (IEC) с использованием колонки Dionex ProPac WCX-10 (4×250 мм). Анализ выполнялся на системе высокоэффективной жидкостной хроматографии Agilent 1100 с отслеживанием эффлюента на длине волны 280 нм. Подвижная фаза A представляла собой 25 мМ фосфорнокислого натрия (pH 6,6), а мобильная фаза B представляла собой 150 мМ сульфата натрия в мобильной фазе A. Использовался линейный градиент от 0 до 37% в течение 45 минут со скоростью потока 0,5 мл/мин. Температура колонки поддерживалась на уровне 40°C. Остатки лизина с C-окончанием на тяжелых цепях моноклональных антител удалялись Карбоксипептидазой B перед анализом IEC для того, чтобы уменьшить сложность разнородности зарядов в основной области. Анализ интенсивности цвета на ее зависимость от присутствия кислых вариантов, отличающихся зарядами, с использованием статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал сильную корреляцию между высокой интенсивностью цвета и увеличенным уровнем кислых вариантов, отличающихся зарядами, в растворе антитела (Фиг.8A). Кроме того, присутствие кислых вариантов, отличающихся зарядами, было значительно уменьшено в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с модифицированными средами 3 и средами 4 по сравнению с клеточными линиями, культивированными с модифицированными средами 1 и средами 2, причем самое большое уменьшение наблюдалось при самых низких концентрациях железа (Фиг.8A).
[0184] Корреляция между интенсивностью цвета и формированием кислых вариантов, отличающихся зарядами, была исследована в содержащих антитела растворах, полученных из клеточных линий, культивированных со средами, содержащими различные уровни содержания железа или витамина В. Моноклональные антитела IgG1 были произведены из клеток CHO, культивированных в базальных средах, содержащих 18 мкМ или 75 мкМ сернокислого железа, или в базальных средах, содержащих низкие, средние или высокие уровни витамина В при сохранении концентрации железа на уровне 18 мкМ. Низкие уровни витамина были следующими: 0,25 мг/л витамина В2, 5,35 мг/л витамина B6 (5,35 мг/л пиридоксина+0 мг/л пиридоксаля), 8,61 мг/л витамина B9 и 1,76 мг/л витамина B12. Средние уровни витамина были следующими: 0,70 мг/л витамина В2, 7,7 мг/л витамина B6 (7,7 мг/л пиридоксина+0 мг/л пиридоксаля), 4,9 мг/л витамина B9 и 1,5 мг/л витамина B12. Высокие уровни витамина были следующими: 1,41 мг/л витамина В2, 15,42 мг/л витамина B6 (15,42 мг/л пиридоксина+0 мг/л пиридоксаля), 9,93 мг/л витамина B9 и 3,05 мг/л витамина B12. Выделение моноклональных антител IgG1 и определение титра антитела выполнялись, как описано в Примере 2. Интенсивность цвета определялась с использованием Полной цветовой пробы. Для Полной цветовой пробы количественное значение относительного цвета образцов выводилось путем использования системы цветового измерения CIE, описанной в публикации Berns et al., Billmeyer and Saltzman’s Principles of Color Technology, 3rd Edition. New York, NY, John Wiley & Sons, Inc., (2000). Вкратце, после очистки водой, спектр поглощения беспримесного тестового образца измерялся в видимой области (380-780 нм) с использованием спектрофотометра HP8453A (кювета с пробегом луча 1 см). Спектр поглощения затем преобразовывался в цветовую шкалу CIE L*a*b*, как описано в публикации Standard Practice for Calculation of Color Tolerances and Color Differences from Instrumentally Measured Color Coordinates, Annual Book of ASTM Standards, Vol. 06.01, (2011). Для этих вычислений в качестве источника света использовался искусственный плоский спектр в видимой области. «Полный цвет» представляет собой значение ΔE, которое соответствует эвклидовому расстоянию между тестовым образцом и водой в трехмерном цветовом пространстве CIE L*a*b*. В дополнение к этому, «Полный цвет» представляет собой полный цвет тестового образца моноклонального антитела без дифференциации между различающимися оттенками. Значение интенсивности цвета затем определялось путем вычисления отношения «Полного цветового» измерения тестового образца моноклонального антитела к аналогичному значению эталонного образца моноклонального антитела, имеющего известное значение пробы COC ≤B5. Положительная корреляция была замечена между увеличенной концентрацией железа и увеличенной интенсивностью цвета (Фиг.8B). Кроме того, увеличенные концентрации железа приводили к увеличенным уровням кислых вариантов, отличающихся зарядами. Для сравнения, одновременное изменение уровней содержания витаминов В2, B6, B9 и B12 в средах, содержащих постоянную концентрацию железа, не показало корреляции между кислыми вариантами, отличающимися зарядами, и интенсивностью цвета (Фиг.8C).
[0185] Была исследована корреляция интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими различные уровни витаминов B2 и B6. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO питание клеточной культуры осуществлялось в прерывистом режиме базальными и питательными средами, содержащими различные уровни содержания витаминов В2 и B6. Антитела были затем выделены и измерены на интенсивность цвета с использованием пробы NIFTY, как описано в Примере 3, в дополнение к присутствию кислых вариантов, отличающихся зарядами. Анализ интенсивности цвета на ее зависимость от присутствия кислых вариантов, отличающихся зарядами, с использованием статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал сильную корреляцию между высокой интенсивностью цвета и увеличенным уровнем кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими 1,41 мг/л витамина В2 и/или 15,42 мг/л витамина B6 (в виде пиридоксина), и питательными средами, содержащими 10 мг/л витамина В2 и/или 76 мг/л витамина B6 (7 мг/л пиридоксина и 60 мг/л пиридоксаля) (Фиг.9A и 9B). Самые низкие уровни интенсивности цвета и содержания кислых вариантов, отличающихся зарядами, наблюдались в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими 0,25 мг/л витамина В2 и 5,35 мг/л витамина B6 (в виде пиридоксина), и питательными средами, не содержащими витамина В2 и витамина B6 (Фиг.9A и 9B).
[0186] Для того, чтобы определить корреляцию интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими различные уровни пиридоксаля в присутствии различных источников железа, был выполнен полный факторный эксперимент. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались с базальными и питательными средами, содержащими различные уровни пиридоксаля. Лимоннокислое железо или сернокислое железо были обеспечены в базальных средах, и процесс культивирования клеточной культуры выполнялся в прерывистом режиме питания. Антитела были затем выделены и измерены на интенсивность цвета с использованием Полной цветовой пробы, в дополнение к присутствию кислых вариантов, отличающихся зарядами. Анализ интенсивности цвета на ее зависимость от присутствия кислых вариантов, отличающихся зарядами, с использованием статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал сильную корреляцию между высокой интенсивностью цвета и увеличенным уровнем кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими 0 мг/л пиридоксаля и 18 мкМ сернокислого железа, и питательными средами, содержащими 0 мг/л или 60 мг/л пиридоксаля по сравнению с антителами, выделенными из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими 0 мг/л пиридоксаля и 18 мкМ лимоннокислого железа, и питательными средами, содержащими пиридоксаль 0 мг/л или 60 мг/л пиридоксаля (Фиг.10A и 10B).
[0187] Была исследована корреляция интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими различные уровни витаминов В2, B6, B9 и B12 в присутствии различных источников железа. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались с базальными средами, содержащими 1,41 мг/л витамина В2, 15,42 мг/л пиридоксина, 0 мг/л пиридоксаля, 9,93 мг/л витамина B9 и 3,05 мг/л витамина B12, и с одной из трех различных питательных сред, каждая из которых содержала различные уровни витаминов B2, B6, B9 и B12. Лимоннокислое железо или сернокислое железо были обеспечены в базальных средах, и процесс культивирования клеточной культуры выполнялся в прерывистом режиме питания. Антитела были затем выделены и измерены на интенсивность цвета с использованием Полной цветовой пробы, в дополнение к присутствию кислых вариантов, отличающихся зарядами. Анализ интенсивности цвета на ее зависимость от присутствия кислых вариантов, отличающихся зарядами, с использованием статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал уменьшенную интенсивность цвета в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с питательными средами, содержащими 5 мг/л витамина В2, 3,5 мг/л пиридоксина, 30 мг/л пиридоксаля, 98,5 мг/л витамина B9, и 24 мг/л витамина B12 в присутствии 18 мкМ сернокислого железа либо 18 мкМ лимоннокислого железа, по сравнению с питательными средами, содержащими 10 мг/л витамина В2, 7 мг/л пиридоксина, 60 мг/л пиридоксаля, 197 мг/л витамина B9, и 48 мг/л витамина B12 (Фиг.11A; уровень 2 витамина и уровень 3 витамина, соответственно). Самое большое уменьшение интенсивности цвета было отмечено в антителах, выделенных из клеток, культивированных с питательными средами, которые испытывали недостаток витаминов В2, B6, B9 и B12 (Фиг.11A; уровень 1 витамина). Несмотря на то, что было значительное уменьшение интенсивности цвета антитела при пониженных концентрациях витаминов В2, B6, B9 и B12, предварительные результаты показали, что не было никакого существенного изменения в присутствии кислых вариантов, отличающихся зарядами (Фиг.11B).
[0188] Была исследована корреляция интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими увеличивающиеся концентрации железа из различных источников. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались с базальными средами 1, содержащими 75 мкМ сернокислого железа, базальными средами 12, содержащими 18 мкМ сернокислого железа, или базальными средами 13, содержащими 10 мкМ сернокислого железа, в прерывистом режиме питания. Питание дополнительных клеточных культур осуществлялось базальными средами 15, содержащими 18 мкМ лимоннокислого железа, или базальными средами 16, содержащими 10 мкМ лимоннокислого железа. Питание всех клеточных культур осуществлялось не содержащими железа питательными средами в прерывистом режиме. Интенсивность цвета определялась с использованием пробы NIFTY как описано в Примере 3. Самое большое уменьшение интенсивности цвета было отмечено в антителах, выделенных из клеток, культивированных с базальными средами, содержащими пониженные уровни железа (Фиг. 12A). Уменьшенная интенсивность цвета коррелировала с уменьшенным наличием в выделенном растворе антитела кислых вариантов, отличающихся зарядами (Фиг.12B).
[0189] Была исследована корреляция интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими увеличивающиеся концентрации лимоннокислого железа. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались в модифицированных базальных средах 1 или модифицированных базальных средах 3, каждая из которых содержала 18 мкМ лимоннокислого железа или 36 мкМ лимоннокислого железа. Питание всех клеточных культур осуществлялось не содержащими железа питательными средами в прерывистом режиме. Моноклональное антитело IgG1 выделялось из клеточных культур, культивированных при температуре 33°C или 37°C. Интенсивность цвета определялась цветовой пробой, конкретно Полной цветовой пробой, в которой более высокие численные значения указывают на более высокую интенсивность цвета, а более низкие численные значения указывают на более низкую интенсивность цвета. Самое большое уменьшение интенсивности цвета было отмечено в антителах, выделенных из клеток, культивированных с базальными средами, содержащими пониженные уровни лимоннокислого железа (Фиг.13A). Уменьшенная интенсивность цвета коррелирует с уменьшенным присутствием в выделенном растворе антитела кислых вариантов, отличающихся зарядами. Антитела, выделенные из клеток, культивированных при температуре 33°C, продемонстрировали самое большое уменьшение кислых вариантов, отличающихся зарядами (Фиг.13B). Увеличение температуры от 33°C до 37°C привело к значительному увеличению производства антител, приблизительно от 2500 мг/л до 4250 мг/л, производящими антитело клетками, культивированными как в модифицированных базальных средах 1, так и в модифицированных базальных средах 3.
[0190] Базальные среды 3 были модифицированы так, чтобы они содержали 525 мг/л цистеина вместо 480 мг/л цистина для использования в экспериментах с клеточной культурой для того, чтобы определить вклад цистеина в интенсивность цвета выделенного моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7), произведенного клеточной линией CHO. Для производства моноклонального антитела IgG1 из клеток CHO клетки культивировались в модифицированных базальных средах 3, содержащих 525 мг/л цистеина, и в питательных средах 4 в прерывистом режиме питания. Антитела выделялись, и их цвет измерялся с использованием стандартной пробы COC. Проба COC выполнялась с использованием идентичных пробирок из бесцветного, прозрачного, нейтрального стекла с плоским дном и внутренним диаметром от 15 мм до 25 мм. Две пробирки заполнялись каждая до глубины 40 мм раствором белка с концентрацией 150 г/л, приготовленным из очищенной и сконцентрированной жидкости клеточной культуры, содержащей выделенное клетками моноклональное антитело IgG1. Каждая пробирка, которая содержала раствор антитела, сравнивалась либо с семью референсными пробирками, каждая из которых была заполнена референсным раствором, имеющим цвет в пределах от BY1 (самый темный) до BY7 (самый светлый), либо с девятью референсными пробирками, каждая из которых была заполнена референсным раствором, имеющим цвет в пределах от B1 (самый темный) до B9 (самый светлый), путем ее рассматривания вертикально на белом фоне в рассеянном дневном свете. Анализ цвета содержащих антитела растворов показал значение COC ≤B5 или ≤BY5 (Фиг.1; Рецептуры VI и VIII, соответственно). Рецептура VI антитела далее анализировалась на интенсивность цвета с использованием описанной выше Полной цветовой пробы и пробы NIFTY, как описано в Примере 3. Анализ цвета рецептуры антитела показал значение интенсивности цвета 0,71 и 1,00 при измерении пробой NIFTY и Полной цветовой пробой, соответственно. Эта рецептура антитела имела более светлый цвет по сравнению c интенсивностью цвета рецептуры III антитела (описанной в Примере 1) и рецептуры IV антитела (описанной в Примере 3). Рецептура III антитела показала значение интенсивности цвета 1,59 и 2,61 при измерении пробой NIFTY и Полной цветовой пробой, соответственно. Рецептура IV антитела показала значение интенсивности цвета 1,47 и 2,04 при измерении пробой NIFTY и Полной цветовой пробой, соответственно.
[0191] Многофакторное исследование было выполнено для того, чтобы определить корреляцию интенсивности цвета и формирования кислых вариантов, отличающихся зарядами, в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с клеточными средами, содержащими различные концентрации витаминов B2, B6, B9 и B12 в присутствии или в отсутствие цистина или цистеина, и в присутствии или в отсутствие гидрокортизона. Для производства моноклонального антитела IgG1 (анти-Beta7) из клеток CHO клетки культивировались в базальных средах, содержащих 1,41 мг/л витамина В2, 15,42 мг/л пиридоксина, 0 мг/мл пиридоксаля, 9,93 мг/л витамина B9 и 3,05 мг/л витамина B12, или в базальных средах, содержащих 0,7 мг/л витамина В2, 7,7 мг/л пиридоксина, 0 мг/л пиридоксаля, 4,9 мг/л витамина B9, и 1,5 мг/л витамина B12. В дополнение к этому базальные среды содержали либо 525 мг/л цистеина, либо 480 мг/л цистина (Таблица G). Дополнительные базальные среды были подготовлены, как указано в Таблице G и подкреплены гидрокортизоном в количестве 150 нМоль. Питание всех клеточных культур осуществлялось не содержащими железа питательными средами в прерывистом режиме.
Таблица G Эксперимент с многовариантными компонентами |
||||
Компоненты сред | Среды 17 (базальная) | Среды 18 (базальная) | Среды 19 (базальная) | Среды 20 (базальная) |
Витамин B2 (мг/л) | 1,41 | 1,41 | 0,7 | 0,7 |
Витамин B6/ пиридоксин (мг/л) |
15,42 | 15,42 | 7,7 | 7,7 |
Витамин B6/ пиридоксаль (мг/л) |
0 | 0 | 0 | 0 |
Витамин B9 (мг/л) | 9,93 | 9,93 | 4,9 | 4,9 |
Витамин B12 (мг/л) | 3,05 | 3,05 | 1,5 | 1,5 |
Цистеин (мг/л) |
525 | 0 | 525 | 0 |
Цистин (мг/л) |
0 | 480 | 0 | 480 |
[0192] Моноклональное антитело IgG1 выделялось из клеточных культур и измерялось на интенсивность цвета, а также на присутствие кислых вариантов, отличающихся зарядами. Интенсивность цвета определялась с использованием описанной выше Полной цветовой пробы. Анализ интенсивности цвета на ее зависимость от присутствия кислых вариантов, отличающихся зарядами, с помощью статистического программного обеспечения JMP 8.0.2 показал корреляцию между уменьшенной интенсивностью цвета и уменьшенными уровнями содержания кислых вариантов, отличающихся зарядами в антителах, выделенных из клеточных линий, культивированных с базальными средами, содержащими цистин по сравнению с цистеином (Фиг.14A и 14B). Кроме того, снижение уровней содержания витамина В также приводило к снижению интенсивности цвета и к снижению образования кислых вариантов, отличающихся зарядами, причем добавление гидрокортизона усиливало это снижение (Фиг. 14A и 14B).
Пример 6: Уменьшение интенсивности цвета моноклонального антитела IgG1, выделенного из клеточной линии, путем изменения конкретных компонентов в средах клеточной культуры.
[0193] Эффект уменьшения интенсивности цвета при использовании цистина в базальной среде для культивирования клеток был дополнительно исследован с клеточной линией CHO, которая производила другое моноклональное антитело IgG1 (mAb10). Эта клеточная линия культивировалась в неопределенных базальных средах с аминокислотой цистеин либо в форме мономера в концентрации 2,6 мМ (цистеин), либо в форме димера в концентрации 1,3 мМ (цистин). Производство mAb10 инициировалось в клеточной культуре путем посева клеток в неопределенной базальной среде, и порция питательной среды добавлялась на 3-й день 14-дневного цикла клеточной культуры в биореакторе. Клетки культивировались при температуре 37°C в первый день, и температурное изменение инициировалось в течение цикла клеточной культуры. Среды были собраны, и mAb10 был извлечен как композиция перед оценкой интенсивности цвета с помощью пробы COC. Композиции, включающие в себя mAb10, извлеченный из клеток, культивированных в базальных средах, содержащих цистеин, выглядели как бесцветная или слегка окрашенная жидкость и имели значение интенсивности цвета B7 в соответствии с пробой COC. Композиция, включающая в себя mAb10, извлеченный из клеток, культивированных в базальных средах, в которых цистеин был замещен цистином, выглядели как бесцветная или слегка окрашенная жидкость с улучшенной интенсивностью цвета, которая имела значение COC B8.
[0194] В многофакторном исследовании для производства mAb10 из клеток CHO использовались четыре различных протокола для того, чтобы оценить влияние некоторых компонентов среды на интенсивность цвета композиции, включающей в себя антитело, извлеченное из клеточной культуры (Таблица H). Уровни содержания железа, а также и сам источник железа в неопределенных базальных средах для культивирования клеток различались между протоколами. Уровни содержания витамина В и аминокислота цистеин в форме мономера (цистеин) или в форме димера (цистин) в неопределенных базальных средах также различались между протоколами. Производство mAb10 инициировалось в клеточной культуре путем посева клеток в неопределенной базальной среде, и порция питательной среды добавлялась на 3-й день 14-дневного цикла клеточной культуры в биореакторе. Среды были собраны, и mAb10 был извлечен как композиция перед оценкой интенсивности цвета с помощью пробы COC. Анализ интенсивности цвета композиций, включающих в себя извлеченный mAb, показал, что Протоколы 1, 2, и 3 приводили к композиции антитела с уменьшенной интенсивностью цвета (значение COC B7) по сравнению с интенсивностью цвета композиции антитела, полученной с помощью Протокола 4 (значение COC B6). Эти результаты показали, что использование цистина вместо цистеина в базальных средах, уменьшенные уровни содержания витамина В и/или уменьшенные уровни содержания железа, так же как и изменение самого источника железа, приводили к снижению интенсивности цвета в композициях mAb10 (Таблица H). Например, в Протоколе 3 по сравнению с Протоколом 4 понижение уровней содержания витамина В и замена лимоннокислого железа на сернокислое железо с более низкой концентрацией уменьшали интенсивность цвета композиции антитела без необходимости изменить используемый цистеин на цистин. То же самое влияние на снижение интенсивности цвета наблюдалось в Протоколе 2 по сравнению с Протоколом 4, когда лимоннокислое железо было заменено на сернокислое железо в более низкой концентрации, а цистин был заменен на цистеин без изменения уровней содержания витамина В. Понижение уровней содержания витамина В, сокращение уровня содержания железа и изменение источника железа, так же как и использование цистина вместо цистеина, как видно из Протокола 1, также уменьшали интенсивность цвета композиции mAb10 по сравнению с композицией mAb10, полученной в соответствии с Протоколом 4 (Таблица H).
Таблица H Сводка компонентов базальной сред |
||||
Компонент | Протокол 1 | Протокол 2 | Протокол 3 | Протокол 4 |
Железо (мкМ) | 25%a | 50%a | 50%a | 100%b |
Витамин B1 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
Витамин B2 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
Витамин B3 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
витамин B5 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
витамин B6 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
витамин B7 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
витамин B9 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
витамин B12 (мкМ) | 25% | 100% | 50% | 100% |
Цистеин | ||||
Цистин | ||||
Значение COC | B7 | B7 | B7 | B6 |
a Источник железа - лимоннокислое железо; b Источник железа - сернокислое железо |
Пример 7: Проба NIFTY и Полная цветовая проба сопоставимы со стандартной пробой COC для измерения интенсивности цвета в содержащих антитела растворах.
[0195] Проявившийся в последнее время акцент на составах с высокой концентрацией в целом увеличил интенсивность цвета рецептур жидкости моноклонального антитела. Цвет рассматривается как качественный признак продукта, и соответственно с этим важно, чтобы цвет лекарственного вещества внимательно отслеживался при разработке и реализации изменений процесса. Одна из проблем измерения цвета заключается в использовании подходящих проб. Даже несмотря на то, что она является промышленным стандартом, проба COC не является полностью количественной и является уязвимой для субъективного суждения человека, выполняющего эту пробу. Для того, чтобы преодолеть эту проблему, два различных способа для измерения цвета, а именно Полная цветовая проба и проба NIFTY, были разработаны и использовались как описано в Примерах для измерения интенсивности цвета.
[0196] Корреляция между этими тремя способами измерения цвета была определена путем откладывания значений Полного цвета по оси абсцисс, значений NIFTY по оси ординат, и классификации точек данных в соответствии с фактическими измерениями COC, выполненными для содержащих антитела растворов, измеренных с помощью Полной цветовой пробы и пробы NIFTY (Фиг.15A). Наблюдалась хорошая корреляция между количественными измерениями с помощью Полной цветовой пробы и пробы NIFTY (R2=0,75). В дополнение к этому, можно заметить, что эти пробы приемлемо хорошо коррелируют с фактическими измерениями COC, указывая на то, что результаты Полной цветовой пробы и пробы NIFTY являются полезными прогностическими факторами интенсивности цвета образцов.
[0197] Антитела собирались и очищались от клеточной культуры двумя различными способами перед измерением интенсивности цвета. В одном способе моноклональное антитело в собранной жидкости клеточной культуры очищалось с использованием аффинной к протеину А хроматографии. После очистки концентрация белка в пуле элюированного протеина А составляла приблизительно 5-10 г/л. Пул протеина А дополнительно концентрировался до 150 г/л с использованием центрифужных фильтров Amicon Centricon. Цвет в концентрированном пуле протеина А измерялся с использованием стандартной пробы COC, Полной цветовой пробы или пробы NIFTY. В другом способе собранная жидкость клеточной культуры очищалась с использованием стандартного процесса очистки антитела, который включал в себя аффинную очистку с использованием аффинной к протеину А хроматографии, дополнительную очистку посредством анионообменной и катионообменной хроматографии, фильтрацию для удаления вируса, а также заключительную стадию ультрафильтрации и диафильтрации для окончательной формулировки и концентрирования антитела перед измерением цвета с помощью стандартной пробы COC, Полной цветовой пробы или пробы NIFTY.
[0198] Из-за практических соображений было решено использовать цвет пула протеина А в качестве представителя цвета заключительного лекарственного вещества в нескольких из экспериментов, описанных в Примерах. Было оценено прогнозное значение интенсивности цвета, измеренное в рецептурах антитела, приготовленных из пула протеина А, для интенсивности цвета, которая была бы получена для окончательной, полностью очищенной рецептуры антитела. Сравнение интенсивности цвета, измеренной с помощью пробы NIFTY (Фиг.15B) или с помощью Полной цветовой пробы (Фиг.15C) в содержащих антитела растворах, полученных из пула протеина А, с аналогичными показателями для окончательной, полностью очищенной рецептуры антитела показало приемлемо хорошую корреляцию для Полных цветовых измерений (R2=0,73) и измерений NIFTY (R2=0,98). Полный цвет получается из спектра поглощения пула и, следовательно, более высокая интенсивность цвета может ожидаться в более ранних незавершенных пулах из-за наличия примесей неантител или из-за увеличенного рассеивания света. В противоположность этому, значения NIFTY измеряются по главному пику эксклюзионной хроматограммы и, следовательно, можно ожидать, что они останутся постоянными во время всего процесса очистки, если только не проводилась предпочтительная очистка только окрашенных или только бесцветных молекул белка. В целом, наблюдались обоснованные корреляции между измерениями цвета для пулов протеина А и для полученного лекарственного вещества.
Claims (68)
1. Способ культивирования клеток млекопитающего, включающий в себя стадию контактирования клеток с базальной средой для культивирования клеток, включающей в себя:
от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и
от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа.
2. Способ по п. 1, включающий в себя стадию контактирования клеток с базальной средой для культивирования клеток, включающей в себя:
от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина;
от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2;
от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6;
от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и
от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12.
3. Способ по п.1, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
4. Способ по п.3, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из:
от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1;
от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3;
от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5; и
от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7.
5. Способ по любому из пп.1-4, в котором базальная среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ.
6. Способ по любому из пп.1-4, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон.
7. Способ по п.6, в котором концентрация гидрокортизона в базальной среде для культивирования клеток составляет от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
8. Способ по любому из пп.1-4, в котором базальная среда для культивирования клеток является химически определенной средой для культивирования клеток.
9. Способ по любому из пп.1-4, в котором базальная среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой для культивирования клеток.
10. Способ по любому из пп.1-4, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы роста клеток.
11. Способ по любому из пп.1-4, в котором клетки контактируют со средой для культивирования клеток во время фазы продуцирования у клеток.
12. Способ по п.11, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде для культивирования клеток.
13. Способ по п.12, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
14. Способ по п.12, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
15. Способ по п.12, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
16. Способ получения полипептида, включающий в себя стадию культивирования в базальной среде для культивирования клеток клетки млекопитающего, включающей в себя выделенную нуклеиновую кислоту, кодирующую полипептид, в котором:
(a) среда для культивирования клеток включает в себя:
от приблизительно 300 мг/л до приблизительно 1200 мг/л цистина;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 1,0 мг/л витамина В2;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 10,0 мг/л витамина B6;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 12,0 мг/л витамина B9;
от приблизительно 0,05 мг/л до приблизительно 2,5 мг/л витамина B12; и
от приблизительно 2 мкМ до приблизительно 80 мкМ лимоннокислого железа и
(b) клетка экспрессирует полипептид.
17. Способ по п.16, в котором базальная среда для культивирования клеток включает в себя:
от приблизительно 0,8 мМ до приблизительно 2,5 мМ цистина;
от приблизительно 0,11 мкМ до приблизительно 0,72 мкМ витамина В2;
от приблизительно 4,5 мкМ до приблизительно 30,0 мкМ витамина B6;
от приблизительно 3,4 мкМ до приблизительно 22,0 мкМ витамина B9; и
от приблизительно 0,2 мкМ до приблизительно 1,5 мкМ витамина B12.
18. Способ по п.16, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из витамина B1, витамина B3, витамина B5 и витамина B7.
19. Способ по п.18, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя любой один или больше из:
от приблизительно 2,0 мкМ до приблизительно 14,0 мкМ витамина B1;
от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 72,0 мкМ витамина B3;
от приблизительно 6,8 мкМ до приблизительно 44,0 мкМ витамина B5; и
от приблизительно 0,02 мкМ до приблизительно 0,14 мкМ витамина B7.
20. Способ по любому из пп.16-19, в котором базальная среда для культивирования клеток включает в себя лимоннокислое железо в концентрации от приблизительно 11,0 мкМ до приблизительно 36,0 мкМ.
21. Способ по любому из пп.16-19, в котором базальная среда для культивирования клеток дополнительно включает в себя гидрокортизон.
22. Способ по п. 21, в котором концентрация гидрокортизона в среде для культивирования клеток составляет от приблизительно 0,05 мкМ до приблизительно 0,25 мкМ.
23. Способ по любому из пп.16-19, в котором базальная среда для культивирования клеток является химически определенной средой для культивирования клеток.
24. Способ по любому из пп.16-19, в котором базальная среда для культивирования клеток является химически неопределенной средой для культивирования клеток.
25. Способ по любому из пп.16-19, в котором культивирование происходит во время фазы роста клетки.
26. Способ по любому из пп.16-19, в котором культивирование происходит во время фазы продуцирования у клетки.
27. Способ по п.26, который дополнительно включает в себя стадию добавления цистеина к среде для культивирования клеток.
28. Способ по п.27, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить от приблизительно 80 мг/л до приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
29. Способ по п.27, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 1500 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
30. Способ по п.27, в котором цистеин добавляется в таком количестве, чтобы обеспечить приблизительно 140 мг/л цистеина в среде для культивирования клеток.
31. Способ по любому из пп.16-19, в котором полипептид является антителом.
32. Способ по п.31, в котором антитело является антителом IgG1.
33. Способ по п.31, в котором антитело является антителом против VEGF, против мезотелина, против PCSK9 или против Beta7.
34. Способ по любому из пп.16-19, дополнительно включающий в себя стадию выделения полипептида из среды для культивирования клеток.
35. Способ по п.34, в котором композиция, включающая в себя выделенный полипептид, выглядит как бесцветная или слегка окрашенная жидкость.
36. Способ по п.35, в котором композиция включает в себя выделенный полипептид в концентрации по меньшей мере 100 мг/мл.
Applications Claiming Priority (7)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
US201261637778P | 2012-04-24 | 2012-04-24 | |
US201261637780P | 2012-04-24 | 2012-04-24 | |
US61/637,780 | 2012-04-24 | ||
US61/637,778 | 2012-04-24 | ||
US13/841,864 | 2013-03-15 | ||
US13/841,864 US20130281355A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-03-15 | Cell culture compositions and methods for polypeptide production |
PCT/US2013/037992 WO2013163294A1 (en) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Cell culture compositions and methods for polypeptide production |
Related Child Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018146497A Division RU2018146497A (ru) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Композиции клеточной культуры и способы получения полипептидов |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2014147018A RU2014147018A (ru) | 2016-06-10 |
RU2678142C2 true RU2678142C2 (ru) | 2019-01-23 |
Family
ID=49380652
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018146497A RU2018146497A (ru) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Композиции клеточной культуры и способы получения полипептидов |
RU2014147018A RU2678142C2 (ru) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Способ культивирования клеток млекопитающих и получение полипептидов с использованием композиции клеточной культуры |
Family Applications Before (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
RU2018146497A RU2018146497A (ru) | 2012-04-24 | 2013-04-24 | Композиции клеточной культуры и способы получения полипептидов |
Country Status (22)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US20130281355A1 (ru) |
EP (2) | EP3533864A1 (ru) |
JP (4) | JP6367792B2 (ru) |
KR (2) | KR102115052B1 (ru) |
CN (2) | CN111440758A (ru) |
AR (1) | AR090822A1 (ru) |
AU (2) | AU2013251647B2 (ru) |
BR (1) | BR112014026308A8 (ru) |
CA (1) | CA2871006C (ru) |
ES (1) | ES2716301T3 (ru) |
HK (1) | HK1208496A1 (ru) |
HR (1) | HRP20190484T1 (ru) |
IL (1) | IL235235A0 (ru) |
MX (2) | MX363493B (ru) |
MY (1) | MY181513A (ru) |
NZ (1) | NZ701791A (ru) |
PL (1) | PL2841561T3 (ru) |
RU (2) | RU2018146497A (ru) |
SG (2) | SG10201810830UA (ru) |
SI (1) | SI2841561T1 (ru) |
WO (1) | WO2013163294A1 (ru) |
ZA (2) | ZA201408092B (ru) |
Families Citing this family (18)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2013158273A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Methods to modulate c-terminal lysine variant distribution |
WO2013158279A1 (en) | 2012-04-20 | 2013-10-24 | Abbvie Inc. | Protein purification methods to reduce acidic species |
KR102202476B1 (ko) * | 2013-03-15 | 2021-01-12 | 제넨테크, 인크. | 세포 배양 배지 및 항체 생산 방법 |
EP3712252A1 (en) | 2013-03-15 | 2020-09-23 | F. Hoffmann-La Roche AG | Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production |
US9598667B2 (en) * | 2013-10-04 | 2017-03-21 | Abbvie Inc. | Use of metal ions for modulation of protein glycosylation profiles of recombinant proteins |
EP3639171A4 (en) * | 2017-06-16 | 2021-07-28 | Cytiva Sweden AB | PROCESS FOR PREDICTING THE RESULT AND MODELING A PROCESS IN A BIOREACTOR |
EP3492582A1 (en) | 2017-12-01 | 2019-06-05 | UCB Biopharma SPRL | Cell culture methods |
CN108823267B (zh) * | 2018-06-25 | 2020-05-08 | 深圳市菲鹏生物制药股份有限公司 | 调节cho-k1表达系统所分泌抗体的酸性峰含量的方法 |
EP4051790A4 (en) * | 2019-10-31 | 2023-11-01 | William Marsh Rice University | GENETICALLY ENGINEERED CELLS FOR CONTROLLED PRODUCTION |
BR112021025438A2 (pt) | 2019-12-06 | 2022-06-21 | Regeneron Pharma | Composições de proteínas anti-vegf e métodos para produzir as mesmas |
MX2022008339A (es) | 2020-01-31 | 2022-08-04 | Chugai Pharmaceutical Co Ltd | Metodo para producir una composicion que contiene un polipeptido con coloracion suprimida. |
JP7404930B2 (ja) | 2020-02-26 | 2023-12-26 | 富士フイルムビジネスイノベーション株式会社 | 発光装置、光学装置及び計測装置 |
JP7404929B2 (ja) | 2020-02-26 | 2023-12-26 | 富士フイルムビジネスイノベーション株式会社 | 発光装置、光学装置及び計測装置 |
GB202012991D0 (en) | 2020-08-20 | 2020-10-07 | Ucb Biopharma Sprl | Cell culture processes |
US20220251502A1 (en) * | 2020-12-22 | 2022-08-11 | Novartis Ag | Methods for reducing the oxidation level of cysteine residues in a secreted recombinantly-expressed protein during cell culture |
GB202105424D0 (en) | 2021-04-16 | 2021-06-02 | UCB Biopharma SRL | Cell culture processes |
KR20240050373A (ko) | 2021-09-02 | 2024-04-18 | 베링거 인겔하임 인터내셔날 게엠베하 | 미래의 색값 또는 대응하는 특성을 결정하는 방법 및 이를 위한 장치 |
KR20230051921A (ko) * | 2021-10-12 | 2023-04-19 | 프레스티지바이오로직스 주식회사 | 항체 집단의 제조 방법 |
Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO1998015614A1 (en) * | 1996-10-10 | 1998-04-16 | Life Technologies, Inc. | Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients |
US20030096402A1 (en) * | 2001-02-15 | 2003-05-22 | Lee Chichang | Chemically defined medium for cultured mammalian cells |
RU2220201C2 (ru) * | 1996-04-19 | 2003-12-27 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки человека (варианты), бессывороточная культуральная среда, способ иммортализации, способ идентификации мутагенного, токсичного или благоприятного действия агента, диагностический набор |
WO2006026445A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
WO2009014272A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-29 | Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation | Method for the preparation of dermal papilla tissue employing mesenchymal stem cells |
RU2369634C2 (ru) * | 2003-03-03 | 2009-10-10 | ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. | Способ культивирования клеток без компонентов животного происхождения |
WO2009129379A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Wyeth | Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins |
Family Cites Families (47)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
USRE30985E (en) | 1978-01-01 | 1982-06-29 | Serum-free cell culture media | |
US4399216A (en) | 1980-02-25 | 1983-08-16 | The Trustees Of Columbia University | Processes for inserting DNA into eucaryotic cells and for producing proteinaceous materials |
JPS5863385A (ja) | 1981-10-02 | 1983-04-15 | ハナ・バイオロジツクス・インコ−ポレ−テツド | 免疫系由来の細胞用培地 |
US4560655A (en) | 1982-12-16 | 1985-12-24 | Immunex Corporation | Serum-free cell culture medium and process for making same |
US4657866A (en) | 1982-12-21 | 1987-04-14 | Sudhir Kumar | Serum-free, synthetic, completely chemically defined tissue culture media |
US4713339A (en) | 1983-01-19 | 1987-12-15 | Genentech, Inc. | Polycistronic expression vector construction |
AU2353384A (en) | 1983-01-19 | 1984-07-26 | Genentech Inc. | Amplification in eukaryotic host cells |
US4816567A (en) | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
US4767704A (en) | 1983-10-07 | 1988-08-30 | Columbia University In The City Of New York | Protein-free culture medium |
GB8516415D0 (en) | 1985-06-28 | 1985-07-31 | Celltech Ltd | Culture of animal cells |
US4816401A (en) | 1985-09-09 | 1989-03-28 | University Of Rochester | Serum free cell culture medium |
US5091178A (en) | 1986-02-21 | 1992-02-25 | Oncogen | Tumor therapy with biologically active anti-tumor antibodies |
US4927762A (en) | 1986-04-01 | 1990-05-22 | Cell Enterprises, Inc. | Cell culture medium with antioxidant |
IL87737A (en) | 1987-09-11 | 1993-08-18 | Genentech Inc | Method for culturing polypeptide factor dependent vertebrate recombinant cells |
EP0435911B1 (en) | 1988-09-23 | 1996-03-13 | Cetus Oncology Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity and product expression |
US6048728A (en) | 1988-09-23 | 2000-04-11 | Chiron Corporation | Cell culture medium for enhanced cell growth, culture longevity, and product expression |
DE3920358A1 (de) | 1989-06-22 | 1991-01-17 | Behringwerke Ag | Bispezifische und oligospezifische, mono- und oligovalente antikoerperkonstrukte, ihre herstellung und verwendung |
JPH03180176A (ja) * | 1989-11-16 | 1991-08-06 | W R Grace & Co | 細胞培養のための基礎栄養培地 |
CA2068204C (en) | 1989-11-22 | 2002-02-12 | Arthur Levinson | Latency associated peptides and uses therefor |
US5122469A (en) | 1990-10-03 | 1992-06-16 | Genentech, Inc. | Method for culturing Chinese hamster ovary cells to improve production of recombinant proteins |
ES2241710T3 (es) | 1991-11-25 | 2005-11-01 | Enzon, Inc. | Procedimiento para producir proteinas multivalentes de union a antigeno. |
JPH07102147B2 (ja) * | 1992-03-16 | 1995-11-08 | 株式会社ミドリ十字 | ヒト血清アルブミンの着色抑制方法 |
US5856179A (en) | 1994-03-10 | 1999-01-05 | Genentech, Inc. | Polypeptide production in animal cell culture |
US5512477A (en) | 1994-04-21 | 1996-04-30 | Genzyme Corporation | Serum-free medium supplement |
US6267958B1 (en) | 1995-07-27 | 2001-07-31 | Genentech, Inc. | Protein formulation |
US20020012991A1 (en) | 1997-04-07 | 2002-01-31 | Florence Chua Nee Ho Kit Fong | Cell culture media for enhanced protein production |
US6171586B1 (en) | 1997-06-13 | 2001-01-09 | Genentech, Inc. | Antibody formulation |
US6160099A (en) * | 1998-11-24 | 2000-12-12 | Jonak; Zdenka Ludmila | Anti-human αv β3 and αv β5 antibodies |
US20060286668A1 (en) | 1999-04-30 | 2006-12-21 | Invitrogen Corporation | Animal-cell culture media comprising non-animal or plant-derived nutrients |
US20030087372A1 (en) | 2001-06-13 | 2003-05-08 | Genentech, Inc. | Methods of culturing animal cells and polypeptide production in animal cells |
GB0208041D0 (en) * | 2002-04-08 | 2002-05-22 | Lonza Biologics Plc | Method of culturing animal cells |
US7261893B2 (en) | 2002-10-22 | 2007-08-28 | Wyeth | Neutralizing antibodies against GDF-8 and uses therefor |
US20060104968A1 (en) | 2003-03-05 | 2006-05-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminogly ycanases |
US7871607B2 (en) | 2003-03-05 | 2011-01-18 | Halozyme, Inc. | Soluble glycosaminoglycanases and methods of preparing and using soluble glycosaminoglycanases |
US20070134759A1 (en) * | 2003-10-09 | 2007-06-14 | Harue Nishiya | Process for producing antibody composition by using rna inhibiting the function of alpha1,6-fucosyltransferase |
US20060051347A1 (en) | 2004-09-09 | 2006-03-09 | Winter Charles M | Process for concentration of antibodies and therapeutic products thereof |
JO3000B1 (ar) | 2004-10-20 | 2016-09-05 | Genentech Inc | مركبات أجسام مضادة . |
EP1812557A4 (en) | 2004-10-29 | 2009-11-04 | Centocor Ortho Biotech Inc | COMPOSITIONS OF CHEMICALLY DEFINED MEDIA |
CN100569940C (zh) * | 2006-08-16 | 2009-12-16 | 华东理工大学 | 人胚胎肾(hek)293细胞无血清培养基 |
WO2008033517A2 (en) * | 2006-09-13 | 2008-03-20 | Abbott Laboratories | Cell culture improvements |
AU2007331712A1 (en) | 2006-12-11 | 2008-06-19 | F. Hoffmann-La Roche Ag | Abeta antibody parenteral formulation |
WO2008084857A1 (ja) * | 2007-01-12 | 2008-07-17 | Nippon Sheet Glass Company, Limited | 三次元細胞培養担体およびそれを用いた細胞培養方法 |
WO2009029795A1 (en) * | 2007-08-31 | 2009-03-05 | Amgen Inc. | Solid-state protein formulation |
KR20110060911A (ko) * | 2008-09-26 | 2011-06-08 | 쉐링 코포레이션 | 고 역가 항체 생산 |
JO3672B1 (ar) * | 2008-12-15 | 2020-08-27 | Regeneron Pharma | أجسام مضادة بشرية عالية التفاعل الكيماوي بالنسبة لإنزيم سبتيليسين كنفرتيز بروبروتين / كيكسين نوع 9 (pcsk9). |
US9540426B2 (en) * | 2009-10-06 | 2017-01-10 | Bristol-Myers Squibb Company | Mammalian cell culture processes for protein production |
KR101828623B1 (ko) | 2010-04-26 | 2018-02-12 | 노파르티스 아게 | 개선된 세포 배양 배지 |
-
2013
- 2013-03-15 US US13/841,864 patent/US20130281355A1/en not_active Abandoned
- 2013-04-24 CA CA2871006A patent/CA2871006C/en active Active
- 2013-04-24 KR KR1020147032389A patent/KR102115052B1/ko active IP Right Grant
- 2013-04-24 EP EP18213796.8A patent/EP3533864A1/en active Pending
- 2013-04-24 CN CN202010250367.4A patent/CN111440758A/zh active Pending
- 2013-04-24 CN CN201380032959.7A patent/CN104428409A/zh active Pending
- 2013-04-24 SG SG10201810830UA patent/SG10201810830UA/en unknown
- 2013-04-24 MY MYPI2014003007A patent/MY181513A/en unknown
- 2013-04-24 RU RU2018146497A patent/RU2018146497A/ru unknown
- 2013-04-24 SG SG11201406903SA patent/SG11201406903SA/en unknown
- 2013-04-24 EP EP13720203.2A patent/EP2841561B1/en active Active
- 2013-04-24 JP JP2015509107A patent/JP6367792B2/ja active Active
- 2013-04-24 WO PCT/US2013/037992 patent/WO2013163294A1/en active Application Filing
- 2013-04-24 RU RU2014147018A patent/RU2678142C2/ru active
- 2013-04-24 AU AU2013251647A patent/AU2013251647B2/en active Active
- 2013-04-24 NZ NZ701791A patent/NZ701791A/en unknown
- 2013-04-24 PL PL13720203T patent/PL2841561T3/pl unknown
- 2013-04-24 AR ARP130101367 patent/AR090822A1/es unknown
- 2013-04-24 BR BR112014026308A patent/BR112014026308A8/pt not_active Application Discontinuation
- 2013-04-24 SI SI201331376T patent/SI2841561T1/sl unknown
- 2013-04-24 ES ES13720203T patent/ES2716301T3/es active Active
- 2013-04-24 MX MX2014012838A patent/MX363493B/es unknown
- 2013-04-24 KR KR1020207014171A patent/KR102339106B1/ko active IP Right Grant
-
2014
- 2014-10-21 IL IL235235A patent/IL235235A0/en unknown
- 2014-10-23 MX MX2019003427A patent/MX2019003427A/es unknown
- 2014-11-05 ZA ZA2014/08092A patent/ZA201408092B/en unknown
-
2015
- 2015-09-17 HK HK15109118.1A patent/HK1208496A1/xx unknown
-
2017
- 2017-11-03 ZA ZA2017/07452A patent/ZA201707452B/en unknown
-
2018
- 2018-07-05 JP JP2018128429A patent/JP7323272B2/ja active Active
-
2019
- 2019-03-11 HR HRP20190484TT patent/HRP20190484T1/hr unknown
- 2019-04-02 AU AU2019202259A patent/AU2019202259B2/en active Active
-
2021
- 2021-03-16 JP JP2021042702A patent/JP2021104023A/ja not_active Withdrawn
-
2023
- 2023-07-28 JP JP2023123219A patent/JP2023156371A/ja active Pending
- 2023-10-30 US US18/497,162 patent/US20240093143A1/en active Pending
Patent Citations (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2220201C2 (ru) * | 1996-04-19 | 2003-12-27 | Сосьете Де Продюи Нестле С.А. | Линия иммортализованных клеток эпителия толстой кишки человека (варианты), бессывороточная культуральная среда, способ иммортализации, способ идентификации мутагенного, токсичного или благоприятного действия агента, диагностический набор |
WO1998015614A1 (en) * | 1996-10-10 | 1998-04-16 | Life Technologies, Inc. | Animal cell culture media comprising plant-derived nutrients |
US20030096402A1 (en) * | 2001-02-15 | 2003-05-22 | Lee Chichang | Chemically defined medium for cultured mammalian cells |
RU2369634C2 (ru) * | 2003-03-03 | 2009-10-10 | ГлаксоСмитКлайн Байолоджикалз с.а. | Способ культивирования клеток без компонентов животного происхождения |
WO2006026445A1 (en) * | 2004-08-27 | 2006-03-09 | Wyeth Research Ireland Limited | Production of polypeptides |
WO2009014272A1 (en) * | 2007-07-20 | 2009-01-29 | Dongguk University Industry-Academic Cooperation Foundation | Method for the preparation of dermal papilla tissue employing mesenchymal stem cells |
WO2009129379A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-10-22 | Wyeth | Methods for enhanced production of bone morphogenetic proteins |
Also Published As
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2678142C2 (ru) | Способ культивирования клеток млекопитающих и получение полипептидов с использованием композиции клеточной культуры | |
JP6843911B2 (ja) | 抗酸化剤を含む細胞培養組成物およびポリペプチド産生のための方法 | |
CA2637156A1 (en) | Methods for modulating mannose content of recombinant proteins | |
EP3149033B1 (en) | Controlling the formation of disulfide bonds in protein solutions by adding reducing agents | |
US20150267237A1 (en) | Cell culture compositions and methods for polypeptide production | |
US20240052392A1 (en) | Cell culture compositions and methods for polypeptide production | |
NZ712315B2 (en) | Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production | |
NZ751400B2 (en) | Cell culture compositions with antioxidants and methods for polypeptide production |