JPH06502551A

JPH06502551A - 付着性動物細胞の増殖のための細胞培養方法および培地

Info

Publication number: JPH06502551A
Application number: JP5505023A
Authority: JP
Inventors: ボラストン，ロバート・チャールズ
Original assignee: アルスイス・ホールディングス・アクチェンゲゼルシャフト
Priority date: 1991-08-30
Filing date: 1992-08-28
Publication date: 1994-03-24
Anticipated expiration: 2015-12-11
Also published as: GB9118664D0; ES2118827T3; WO1993005145A1; EP0555454B1; JP3116066B2; EP0555454A1; DK0555454T3; ATE168717T1; DE69226350T2; US5871999A; DE69226350D1

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】付着性動物細胞の増殖のための細胞培養方法および培地２訓Ｉと氷！一本発明は動物細胞培養における改良、特に動物細胞を増殖させる方法およびその栄養培地の改良に関する。

ｌ且座１１細胞生成物、例えば免疫グロブリン、ホルモン、酵素および他の有用な生物学的活性物質の大量生産のために動物細胞培養を使用することは、産業的見地からますます重要となってきており、現在、これらの物質の大量生産に最適な細胞培養技術の開発に大きな努力が払われている。

現在、動物細胞の大量培養のために選択される一般的方法は、撹拌栄養培地中で浮遊細胞を増殖させるものである。細胞増殖のために選択される培地は、細胞の種類により異なることが予想されるであろうが、一般には、塩、糖類、アミノ酸およびビタミンの基本的栄養混合物を含むであろう。基本的混合物には、生物学的液体または抽出物、例えば血清を補充することが出来る。血清がなければ殆どの細胞は生育力を失うか、または増殖しない、また、補充物を含まない培地を用いることもできるが、それは、一般にはアミノ酸、塩、ビタミン、微量元素、炭水化物およびインシュリン、グルタミン、トランスフェリンおよびエタノールアミン等の他の増殖支持成分の複雑な混合物を含んでいる。かような培地で培養するとき、動物細胞は、培地中の１つまたは２つ以上の必須栄養物が枯渇するまでの限られた期間、生育を維持することができる。そのような時、１つまたは２つ以上のエネルギー源および１つまたは２つ以上のアミノ酸を含む供給物を培地に補充することができる（例えば国際特許出願第ＷＯ３７１００１９５号明細書参照）。このようにして、培養を延長して、細胞または細胞生成物の収量を増すことができる。

チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は大量培養に広く用いられている。

これらの細胞は慣用的には付着培養物として増殖させられてきたが、又、撹拌タンクおよびエアーリフトバイオリアクター中で、比較的簡単にスケールアップさせることができる特性のある、浮遊状態でも増殖するであろう６残念ながら、浮遊増殖に適応させた、いくつかのＣＨＯ由来系は、培養時に大きい堅く結合した凝集塊を形成し得る。ＣＨＯおよび他の細胞系について、凝集塊としての細胞培養は既に記述されており、実際、細胞沈降に基づく細胞再循環リアクターのいくつかで有利に用いられてきた（例えば、Ｂｒｏｗｎ、Ｐ、Ｃ，ら、（１９９１）、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ　ｆｒｏｍ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ１ｌｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ、Ｒ，Ｅ、５ｐｉｓｒ、Ｊ、Ｂ、Ｇｒｉｆｆｉｔｈｓ　＆　Ｂ、Ｍａｇｎｉｅｒｌｉ＋Ｂｕｔｔｅｒｗｏｒｔｈ　Ｈｅｉｎｅｍａｎｎ、Ｃ）ｃｆｏｒｄ、Ｕ、に、、４１６−４２０ベージ；Ｇｏｅｔｇｈｒｌｒｕｄ、Ｓ、Ｅ、＆Ｗｅｉ−３ｈｏｕ　Ｈｕ、同書、４２３−４２７ページ；Ｌｉｔｗｉｎ、Ｊ、、同書、４２９−４３３ページ参照）。しかし浮遊バッチ培養では、細胞の凝集は正確な細胞数測定、細胞環境のモニターおよび制御を妨げ、さらに、細胞への栄養物の移送や細胞からの生成物の輸送を妨げることがある。

培養時の細胞凝集の問題を解決するために提唱されたアプローチの１つは、カルシウムイオン濃度を下げた培地を利用するものである（欧州特許第３４３６３５号明細書参照）。

しかし、カルシウムイオンは細胞付着以外の細胞機能のために必要とされ、したがって細胞増殖および生育に悪影響を及ぼすので、この方法は特に満足できるというものではない。

見五血炎ム本発明者らは、培地中に存在する総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比を制御することにより、ＣＨＯ由来細胞系培地における細胞凝集を排除できることを見いだした。我々はこの方法を用いて、付着性動物細胞の浮遊培養のための一般的手段を開発した。これは操作が容易で、低濃度のカルシウムイオンを含む培地を用いる必要性を避けるという有利性がある。

したがって、本発明の一特徴によれば、我々は付着性動物細胞を培養するための方法であって、該方法において付着性動物細胞が培養容器に入れた栄養培地で浮遊状態で培養される。付着性動物細胞の培養方法において、該栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、殆どまたは全く細胞凝集を起こさない水準に維持されていることを特徴とする付着性動物細胞を培養するための方法を提供する。

λ訃座ｌ爽全１肌本発明の方法では、栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比は、一般に、培養の過程において培地中に細るか、または、細胞凝集はいくらか起こるが、１０個以下の細胞を含む塊として存在するモル比とする。

本発明の方法にしたがって用いられる、総無機イオンお毒びアミノ酸の正確なモル比は、用いる細胞系および存在する他の培地成分により異なることがあるということが理解されるであろう、しかし一般に、既知の培地の対応する比と比べた場合、無機イオン対アミノ酸のモル比は実質的に低いものであろう。したがって、例えば、既知の培地の比が約１５：１から約４０＝１の範囲（例えば、以下の表１に挙げた培地およびＲ，Ｇ、Ｈａｍ及びＷ、Ｌ、ＭｅＫｅｅｈａｎ、Ｍｅｔｈｏｄｓ　ｉｎ　Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ）、（１９７９）、ＬＶＩＩＩ、４４− ９３ページ参照）であるのに対し、本発明の方法では、その比を約１０：１から約１：１．特に約５：１から約１：１、例えば、４．５　：　１から２＝１の範囲に減少させることができる。

本明細書中で用いられる、総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比という用語は、一定の容積中の無機イオンのモル数対同じ容積中のアミノ酸のモル数の比を意味することを意図する。無機イオンが意味するものは、一般に培養培地に加えられる基本無機イオン（ｂｕｌｋ　ｉｎｏｒｇａｎｉｃ　１ｏｎｓ）を指し、例えば、カルシウム、マグネシウム、カリウム、ナトリウム、塩化物、硝酸塩、リン酸塩および硫酸塩イオンが含まれる。一般に培養培地に加えられる他の微量無機イオン、例えば鉄、亜鉛およびセレニウムイオンは、基本イオンより通常ずっと低いモル濃度で用いられ、この濃度において本発明の背景においては、細胞凝集に殆どまたは全く影響を及ぼさない、アミノ酸という用語は、一般的に培養培地に加えられる必須アミノ酸を意味することを意図し１例えば、アルギニン、システィン、シスチン、グルタミン、ヒスチジン、イソロイシン、ロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン５スレオニン、トリプトファン、チロシンおよびバリン並びに一般に培養培地に使用される非必須アミノ酸１例えばアラニン、アスパラギン、アスパルテート、グルタメート、グリシン、プロリンおよびセリンを含む。

一般に、本発明の方法において無機イオンおよびアミノ酸の所望のモル比を達成するために、ナトリウムおよび塩化物イオン並びにアミノ酸のモル数が好ましく調節され、一方、他の基本無機イオン、特にカルシウムイオンは培養培地に通常用いられる量に維持される（例えば、以下の表１およびＲ，Ｇ、Ｈａｍ及びＷ、Ｌ、Ｍｃｋｅｅｈａｎ前掲書参照）。

したがって、慣用的な細胞培養方法と対照的に１本発明の方法は、慣用的な方法で用いられる既知の培地よりも低いモル数のナトリウムおよび塩化物イオン並びに高いモル数のアミノ酸を含む培地を用いて実施される。したがって、例えば本発明の方法における培地中の総ナトリウムイオン濃度は７５から１２０ｍＭの範囲で、特に９０から１１５ｍＭの範囲であってもよく、総塩化物イオン濃度は５０から９０ｍＭ、例えば６０から８０ｍＭの範囲であってもよく、一方、総アミノ酸濃度は２０から５０ｍＭの範囲であってもよい、正確なナトリウム、塩化物およびアミノ酸モル濃度は、総無機イオンおよび総アミノ酸の前述の比に従うという条件で、用いら−れる細胞系に合わせて上記範囲内で選択し得るということは理解できよう。

本発明の方法で使用される培地は新規で、さらに本発明の別の特徴をなすものである。それゆえ本発明の別の特徴にしたがって、我々は付着性動物細胞の浮遊培養に使用するための栄養培地であって、資化性炭素源、窒素、アミノ酸、無機イオン、微量元素並びに任意に脂質および成長促進物質または調整物質を混合状態で含む栄養培地において、該培地中に存在する総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、約１０＝１から約１：１の範囲にあることを特徴とする付着性動物細胞の浮遊培養に使用するための栄養培地を提供する。

本発明の好ましい培地では、総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比は、約５対１から約１対１の範囲、特に４．５対１から２対１の範囲にあってもよい。

本発明の培地では、総ナトリウムおよび塩化物イオン濃度並びにアミノ酸濃度は好ましくは本発明の方法に関して上記に述べたようなものであってもよい。

一般に、当該培地は、生物学的液体または抽出物が補充された、既知のいかなる基本培地またはその変更培地で、またはそのような補充物を含まない、いかなる複合培地であってもよく、その培地の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比は、約１０対１から約１対１の範囲にあるように調節される。

そのような培地は、慣用的な方法を用いて、個々の成分を適切に混合することにより調製してもよく、さらに、液体の形状において、または使用前に適切な緩衝液、例えば重炭酸塩緩衝液で再構成するように乾燥した形状において提供してもｔい０本発明にしたがって使用する適切な培地は、慣用的な方法にしたがって予備的な小規模試験を用いて決定してもよい、したがって、例えば、総無機イオンおよび総アミノ酸の適切なモル比は、総無機イオンおよび総アミノ酸濃度のある範囲に渡って、細胞を培養することにより得らる細胞凝集の程度を１１Ｉ察することによって（例えば、以下の実施例に記載するように顕微鏡的測定を用いて）、いずれの細胞の種類について決定してもよい。

本発明の方法および培地は、いずれの付着性動物細胞の培養について用いてもよい。細胞は、例えば、自然に生じる細胞でも、遺伝子工学的につくられた細胞でも、リンパ球、例えばミエローマ細胞でも、またはハイブリドーマもしくは他の融合細胞でもよい。鴫乳類細胞が特に好ましい。特別な種類の細胞には、ヒト、ラット、マウスまたはハムスター起源の細胞が含まれる。本発明の方法および培地は、ＣＨＯ由来組み換え細胞系を含むチャイ、；−ズハムスター卵巣細胞（以降ＣＨＯ細胞と呼ぶ）で使用するのが特に適切である。

本発明の方法および培地は、付着性動物細胞を培養し、動物細胞生成物を得るために用いてもよい。したがって、本発明の別の特徴により、我々は、細胞培養によって動物細胞生成物を得るための方法であって、（１）培養容器に入れた栄養培地中で浮遊状態で前記生成物を産生ずる付着性動物細胞を培養し、（２）前記生成物が蓄積するまで培養を続け、さらに（３）前記生成物を回収する工程を含む動物細胞生成物を得るための方法において、栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、殆どまたは全く細胞凝集を起こさない水準に維持されていることを特徴とする、細胞培養によって動物細胞の生成物を得るための方法を提供する。

本発明にしたがって得ることができる細胞生成物は、培養動物細胞により産生されるいかなる生成物をも含む。代表的な生成物には、ポリペプチドおよび蛋白、例えばモノクローナル抗体および組み換え抗体並びにそのフラグメント等の免疫グロブリン、エリスロポイエチンおよび成長ホルモン、例えばヒト成長ホルモン等のホルモン、インターフェロン等のリンホカイン、例えばインターロイキン１およびインターロイキン２等のインターロイキン、ティシュプラスミノーゲンアクティベーター等の産業上および治療上有用な酵素および金スプロテイナーゼのティシュインヒビター等の酵素インヒビターが含まれる０本発明の方法では、動物細胞は一般に適切な培養容器、例えば撹拌タンクまたはエアーリフトファーメンタ−中において、栄養培地中に浮遊状態で既知の培養技術を用いて培養することができる。

したがって、例えば、慣用的な技術により得られる適切な細胞の種培養を栄養培地の接種に用いてもよい。一般には。

接種に用いる細胞数は、ｌＸｌ０’から５　Ｘ　１０’ｍ　ｌ””以下の範囲にあるであろう。それから、所望の、Ｍｌ胞１度に達するまで、および／または十分な生成物が蓄積するまで細胞を培養する。

所望の場合には１つまたは２つ以上のアミノ酸、エネルギー源および他の栄養物を、培養中に例えば濃厚供給物の一部分として、または個別に、慣用的な方法に従い、加えてもよいが、もちろん、総、Ｖ機イオンおよび総アミノ酸のモル比は、細胞凝集を防ぐのに十分な範囲内に維持されていることを条件とする。

培養中の所望生成物の産生は、対象となる特定の生成物に適したアッセーのいずれかを用いてモニターしてもよい。したがって、例えば、生成物がポリペプチドまたは蛋白である場合は、この生成は、特定のポリペプチドまたは蛋白と使用するために調製した酵素結合免疫吸収アッセーまたは免疫放射能測定アノセー等の一般的なアッセー技術によってモニターしてもよい。

本発明の方法において、得られた細胞生成物の分離を望む場合は、慣用的な分離および精製技術を用いて、これを達成してもよい。したがって１例えば、生成物が細胞により培地中に分泌される場合は、遠心沈殿および濾過等の技術を用いて細胞から分離してもよく、その後さらに、例えばアフィニティークロマトグラフィー等のアフィニティー精製技術を用いて精製できる。細胞が生成物を分泌しない場合でも上記の方法を用いることができるが、まず最初に細胞を溶解させて生成物を遊離させなければならない。

Ｗ口Ｌ１胛これから本発明を添付図面を参照して下記の実施例において説明のためのみに記載する。

図１は、ダルベツコ−修正イーグル培養液（Ｄｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ　Ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｅａｇｌｓ’ｓｍｅｄｉｕｍ）（ＤＭＥＭ）を基にした浮遊培地中でのＣＨ○由来組み換え細胞系１１Ｇ９の増殖曲線を示すグラフである。

図２は、低塩、高アミノ酸浮遊培地中でのＣＨＯ由来組み換え細胞系１１Ｇ９の増殖曲線を示すグラフである。

＠３は、ダルベツコ−修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を基にした浮遊培地中でのＣＨ○由来組み換え細胞系１１Ｇ９の培養の時間経過における、単一細胞および異なるサイズの細胞凝集塊分布を示す。

図４は、低塩、高アミノ酸浮遊培地中でのＣＨＯ由来組み換え細胞系１１Ｇ９の培養の時間経過における、単一細胞および異なるサイズの細胞凝集塊分布を示す。

図５は、ダルベツコ−修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）を基にした浮遊培地中でＣＨＯ由来組み換え細胞系１１Ｇ９を培養したときの種々の時間点における。ＪＩ胞およびｍ胞凝集塊の頻度の百分率を示す。

図６は、低塩、高アミノ酸浮遊培地中でＣＨＯ由来組み換え細胞系１１Ｇ９を培養したときの種々の時間点における、細胞および細胞凝集塊の頻度の百分率を示す。

の　の大−施例− 用いられた細胞系、１１Ｇ９は、ＣＨＯ由来組み換え細胞系で、キメラＴｒＧ抗体の重鎖および軽＃をエンコードする各遺伝子を１コピーずつ含んでいた（Ｆｉｕｌ、ｄ、Ｒ，Ｐ。

ら、Ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ　ｏｆ　Ｂｉｏｌｏｇｉｅａｌｓｆｒｏｍ　Ａｎｉｍａｌ　Ｃｅ］、１ｓ　ｉｎ　Ｃｕ１ｔｕｒｊ３．同上著、７４２−７４４ページ）。この系は慣用の組成の培地で培養するとき、大きい凝集塊を形成することが観察されている。

培養は６リツトルの実働容積で撹拌バイオリアクター中で行った。培養温度は３６．５℃に維持され、溶解酸素圧は空気または酸素をそれぞれ自動注入して、パラストガスとして窒素または空気を散布することにより１５−２０％飽和空気に維持され、ｐＨは散布ガス混合物中にｃＯ２を自動注入して、またはモルのＮａＯＨを培養中に自動注入して７．０−７．２に維持された。総ガス散布率は、１分間に１容につき０．１５容までであり、撹拌チップの速度は４５ｃｍ／ｓであった。

２種の基本組成物を調べた。第一は、ダルベツコ−修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）由来基本培地で、ＣＨＯ細胞の特定な栄養要求に応えるために、グルタミン酸の代わりにグルタミンが代用されており、さらに他の多くのアミノ酸の濃度が高められた。第二はＣＨ○浮遊増殖用に特別に開発された同様な基本培地（以下ＣＨＯｉ遊培地と呼ぶ）であったが、慣用の培地と比較して、これのナトリウムおよび塩化物イオン１１度は低く、アミノ着Ｊ度は高くなっている（下記表１参照。

：こでは他の４種の楯中培地の無機イオンおよびアミノａ組成も示されている。

）１両方の例で、カルシウムイオン濃度は、！＄培地に見られる水巾辺りに維持された。

表１ダルベツコ−修正イーグル培地（ＤＭＥＭ）　１５５　１２０　１．８　１６２　１１　１４．７ＨａｍのＦ１２　１４６　１３５０，３　１４９　４　３７．３ＭＥＭアルファ　１４５　１２６　１．８　１５２　９　１６．９Ｆｉｓｃｈｅｒの培地　１５２　１４５　０．６　１５８　５　３１．６ＲＰＭ１１６４（１１３８１０４０，４１３８６２３゜０低塩／高アミノ酸浮遊培地　１１３　７５　１．０　ｔｏｏ　４１　２．４バイオマス濃度および細胞凝集の程度の概算は、以下のようにいくつかの方法により行った。

細胞は、血球計算器を用いて顕微鏡で計数した。トリバンブルー染色除外により生存度を判定した。１０細胞より多い凝集塊では計数が不可能であったので、目盛り付きマイクロメーターアイピースを用いて凝集直径を概算した（４つの測定値の平均（Ｉｆ）　、凝集容積は４／３Ｘ３．１４２Ｘｒ’として計算したが、ここでｒは凝集半径である。細胞をトリプシン処理して凝集塊を単一細胞に分散した後にも、生存細胞および総青色細胞の計数を行った。

核の計数は、０．１％（ｗ／ｖ）クリスタルバイオレット染色液含有０．１Ｍクエン酸で細胞溶解後に顕微鏡下で行った。この方法により、トリプシン処理後トリパンブルーで得られる「総数」に一般的に近い「総数」が得られた。

遠心沈殿細胞体積（ｐｃｖ）を測定した。細胞を培養サンプルから遠心沈殿により沈降させてから、細胞ペレットを目盛り付き毛細管に移し、一定体積になるまで遠心沈殿により沈降させた。

これら種々の測定から、以下のように平均細胞体積値を計算することができた。

平均細胞体積＝遠心沈殿細胞体積／クリスタルバイオレット数さらに、寸法を測定した凝集塊の細胞数は以下のように計算した。

細胞数＝凝集体積／平均細胞体積したがって、これら顕微鏡的および物理的測定から、ファーメンタ−培養での経過時間にしたがって凝集塊寸法の分布分析を行うことが可能であった。

凝集塊の寸法分布の分析とともにバイオマス濃度も、コールタ−マルチサイザー（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｍｕｌｔｉｓｉｚｅｒ）ＩＩ　（Ｃｏｕｌｔｅｒ　Ｅｌｅｃｔｒｏｎｉｃｓ　Ｌｔｄ、、Ｌｕｔｏｎ、Ｂｅｄｓ、ＵＫ）を用いて測定した。

積置− トリバンブルー計数に基づく生存度の概算とともに核計数およびＰＣｖにより測定された。ＤＭＥＭを基とする培地およびＣＨＯ浮遊培地における細胞増殖面線が図１および図２にそれぞれ示される。

顕微鏡的測定による、培養の時間経過における凝集程度の分析は図３および４に示される。これらのプロットは、トリパンブルー染色計数により得られた増殖曲線を表している（単一細胞および１０細胞までの凝集は直接計数；１ｏ細胞より多い凝集塊については凝集１当たりの計算による細胞概数）。各プロットは面積によって分けられ、単一細胞および種々の寸法の凝集塊として集団分布を示している。ＤＭＥＭを基とする培地では、凝集はよく目につき、培養の時間経過にしたがって増加した。計算では２２９個までの細胞を含む直径８６μＭの大きさの凝集塊が認められた。対照的に、低塩／高アミノ酸ＣＨＯ浮遊培地では、大半の細胞は単一細胞か、またはわずか２−３細胞の凝集塊であった。凝集塊の寸法が１０細胞に近づくかまたは１０細胞を越えることはめったになかった。

コールタ−マルチサイザーを用いて行った分析はこれらの観察を裏付けた。図５ａは、接種後９９時時間、細胞濃度がおよそｌＸｌ０’／ｍＬのときのＤＭＥＭを基とする培地での培養における細胞および種々の寸法の凝集塊の頻度百分率を示している。

粒子の大半は単一細胞（直径１３−１４μＭは、ＰＣｖの測定から計算して得た平均細胞直径の概数とよく一致する）から成るが、分布は右に歪んでおり、比較的大きい細胞凝集塊が少ないことを示している。この分布を体積で表すと（図５ｂ）、全バイオマスの大部分は単一細胞よりむしろ凝集塊として存在することが明らかとなる。培養時間が経過するにつれ（図５０および図５ｄ）、細胞凝集塊は、大半のバイオマスが大きい凝集塊となるまで、細胞濃度の増加とともに増加する１図６は、低塩／高アミノ酸ＣＨ○浮遊培地中で増殖された培養物の分析の時間経過を示す、８５時間における直径に対する細胞数の分析により、分布における歪みが比較的わずかで単一細胞が優勢であることが示されている（図６ａ）。

これはバイオの体積分析により立証され（図６ｂ）、このバイオマスの大半は単一細胞として存在する。実際、８５時間に存在する凝集塊は、おそらくフラスコ増殖接種細胞に由来するものであった。なぜならば、図６Ｃおよび６ｄを通して時間経過を追ってみると、これらの凝集塊は消失し、はとんどすべてのバイオマスは単一細胞として出現しているからである。

と記の実験を、上記の低塩／高アミノ酸浮遊培地と同様な培地で繰り返したが、この例では、培地は、１０４ｍＭの総ナトリウムイオン、７４　ｍ　Ｍの総塩化物イオン、１．０ｍＭの総カルシウムイオン、９９ｍＭの総無機イオン、２３ｍＭの総アミノ酸イオンを含み、イオン：アミノ酸比は４．３であった。この培地でも、細胞凝集塊は消失し、前のように、はとんどすべてのバイオマスは単一細胞として出現する。

慣用の培地では、培養ＣＨ○由来由来細胞内然に凝集し。

ＤＭＥＭを基とする培地に関して上記に示したように大きなることにより排除することができた。

図１ＤＭＥＭ由来ＣＨＯ浮遊培地での増殖曲線核／ｍＬｘ１０−’　ＰＣＶｍＬ／ｍＬｘｌＱ−３時間一兼一　楼　口　Ｐ　ＣＶ −Ｘ−生存比（ｙｌ軸）図２を塩ｃＨｏ浮遊培地での増殖曲線時間ｍ−“−核　口　ｐｃｖ、−Ｘ−生存比（ｙｌ軸）図３ＤＭＥＭ由来ＣＨＯ培地中の凝集塊サイズ分布：顕微鏡検査細胞／ｍＬｘｌＱ−” 時間図４低塩ＣＨ○浮遊培地中の凝集塊サイズ分布：顕微鏡検査細胞／ｍＬＸ１０−’ 時間ミ　ｑ　♂ ≠　≦　訴〇テ　≦　メ社　Ｓ　訴娠　咥　蓼４　≦　ミモ域　；　訴紮　≦　メ国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．付着性動物細胞を培養するための方法であって、該方法において付着性動物細胞が培養容器に入れた栄養培地で浮遊状態で培養される、付着性動物細胞の培養方法において、該栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、殆どまたは全く細胞凝集を起こさない水準に維持されていることを特徴とする付着性動物細胞を培養するための方法。
２．栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、約１０：１から約１：１の範囲内に維持される請求の範囲第１項に記載の方法。
３．栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、総ナトリウムイオン濃度を７５から１２０ｍＭの範囲内に、総塩化物イオン濃度を５０から９０ｍＭの範囲内に、さらに総アミノ酸含量を２０から５０ｍＭの範囲内に調節することによって達成される請求の範囲第１項または第２項に記載の方法。
４．該付着性動物細胞が哺乳類細胞である先行するいずれかの請求項に記載の方法。
５．該哺乳類細胞がヒト、ラット、マウスまたはハムスター起源である請求の範囲第４項に記載の方法。
６．該哺乳類細胞がチャイニーズハムスター卵巣細胞である請求の範囲第４項に記載の方法。
７．付着性動物細胞の浮遊培養に使用するための栄養培地であって、資化性炭素源、窒素、アミノ酸、無機イオン、微量元素並びに任意に脂質および成長促進物質または調整物質を混合状態で含む栄養培地において、該培地中に存在する総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、約１０：１から約１：１の範囲にあることを特徴とする付着性動物細胞の浮遊培養に使用するための栄養培地。
８．総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、約５：１から約１：１の範囲にある請求の範囲第７項に記載の栄養培地。
９．総ナトリウムイオン濃度が７５から１２０ｍＭの範囲内にあり、総塩化物イオン濃度が５０から９０ｍＭの範囲内にあり、さらに総アミノ酸濃度が２０から５０ｍＭの範囲内にある請求の範囲第７項または第８項に記載の栄養培地。
１０．細胞培養によって動物細胞生成物を得るための方法であって、（１）培養容器に入れた栄養培地中で浮遊状態で前記生成物を産生する付着性動物細胞を培養し、（２）前記生成物が蓄積するまで培養を続け、さらに（３）前記生成物を回収する工程を含む動物細胞生成物を得るための方法において、栄養培地中の総無機イオンおよび総アミノ酸のモル比が、殆どまたは全く細胞凝集を起こさない水準に維持されていることを特徴とする、細胞培養によって動物細胞の生成物を得るための方法。