CN101466357A

CN101466357A - 直接细胞能量递送系统

Info

Publication number: CN101466357A
Application number: CNA2007800115376A
Authority: CN
Inventors: 威廉·D·埃林格; 钱苏帆
Original assignee: University of Louisville Research Foundation ULRF
Current assignee: University of Louisville Research Foundation ULRF
Priority date: 2006-02-07
Filing date: 2007-01-25
Publication date: 2009-06-24
Also published as: ZA200806831B; US20110311442A1; EP2020991A2; AU2007212679A1; US9066866B2; CA2641638A1; KR20080110589A; WO2007092161A2; JP2009526049A; WO2007092161A3; US20060193905A1

Abstract

提供了包含是稳定泡囊形成者的磷脂和至少一种不稳定泡囊形成成员的脂质泡囊，其中所述不稳定泡囊形成成员选自不是稳定泡囊形成者的极性脂质、PET、筏形成者和融合蛋白。所述泡囊可以进一步包含生物分子，实例例如ATP。还提供了使用所述泡囊用于递送生物分子的方法。

Description

直接细胞能量递送系统

相关的申请

本申请要求2006年2月7日提交的美国专利申请No.11/349,023的权益，美国专利申请No.11/349,023是2003年3月25日提交的美国专利申请No.10/397,048的部分连续申请，美国专利申请No.10/397,048基于2002年5月14日提交的美国临时专利申请No.60/380,762并要求它的优先权，上述每一项申请的公开内容通过引用完全合并在此。

政府利益

当前公开的主题是在国家卫生研究所(National Institutes of Health)授予的拨款号No.HL64186-01A1、HL073578-01、DK067702-01的政府支持下做出的。政府在本主题中享有某些权利。

技术领域

当前公开的主题涉及对于向细胞递送生物分子有用的脂质泡囊以及使用它的方法。

背景技术

例如，由于紧张的环境条件，细胞和组织可能变得缺乏特别的生物分子。为了细胞和组织能够生存，在所述细胞和组织内缺乏的生物分子的水平必须被提高以满足代谢需求。例如，ATP作为能量的主要来源是细胞所依赖的生物分子，提高的代谢需求或者对细胞的ATP供应不足可以引起细胞的死亡，如果需求没有被很快地满足。

ATP是驱动所有细胞——动物、植物、细菌、真菌等等的燃料。如同没有汽油的汽车一样，具有空的ATP“罐”的人和其他生物将不能运转。实际上，他们会死亡。来自营养物的分解的能量最终保存在ATP的高能磷酸键中。当这些键断裂时，它们向细胞、组织、器官和器官系统提供可使用的能量。细胞持续地合成并代谢ATP。ATP可以通过氧化磷酸化，用氧气作为末端电子受体并产生二氧化碳(CO₂)和水作为副产品来有氧地产生，或在糖酵解期间厌氧地产生。虽然糖酵解可以向细胞提供能量，由于细胞环境变得酸性化，损害细胞并抑制ATP产生，这种供应是有限的。

血管循环系统输送来自氧气和营养物的能量的持续供应。在血管系统中，内皮细胞的屏障分隔了从血管管腔给养的细胞。为了到达血管系统之外的细胞，氧气和营养物必须穿过内皮内衬进入细胞间隙。作为疾病或外伤的结果，血液的流动，因而营养物和氧的流动可能被切断或降低。例如，心肌梗塞(心脏病发作)、中风、血压过低和严重的外伤，例如在车祸中切断颈动脉，导致氧损失，导致内环境平衡的丧失，可能引起死亡。

当在引起组织的氧和营养物损失的缺血性事件之后血液供给被重新建立时，可能发生缺血-重灌注损伤。在复氧(reoxygenation)之后，随着细胞试图合成ATP，产生了有毒的代谢物，例如自由基。缺血不仅仅是与外伤或疾病相关的现象，也可以作为手术的副作用被诱导，所述手术例如主动脉搭桥、开放心脏手术、主要组织重构、肿瘤移除、肠切除术和器官移植。

缺血是对成功的组织和器官移植的巨大挑战。在美国每年移植约14,000个肾脏和2500个心脏。在取出之后，器官在缺乏营养物和氧气的情况下具有有限的生命期。心脏必须在取出之后4到6小时内移植，而肾脏必须在72小时内移植。由于接受者通常远离供体，这种短的生存时间妨碍了移植。血液可以在4℃保存仅仅约45天，然后必须被丢弃。更复杂的是在等待手术时自体血液的获取。患者通常在45天内仅可以提供两个单位的血液。这个数量是不足够的，因为许多外科操作使用三个、四个或更多单位的血液。

已经进行了一些尝试来克服或抑制低氧供应的不利影响。这些方法包括：(1)提供糖酵解中间体来增加厌氧性ATP产生；(2)降低代谢需求，例如在4℃保存细胞、组织和器官；以及(3)直接向细胞、组织或器官添加ATP。向细胞提供能量优选地通过直接施用ATP来实现；然而，细胞很少地接受外源ATP，因为它们缺乏ATP受体或通道。此外，细胞质膜是疏水性的，而ATP是亲水性的，阻止了ATP穿过。向血流中导入ATP是低效的，因为ATP不能跨越内皮屏障，并且ATP倾向于水解。此外，ATP是嘌呤能受体激动剂，当静脉内地施用时，ATP可能引起血管舒张和血压过低。使用脂质体来递送ATP的尝试已经是很不成功的和低效的(Arakawa et al.1998，Puisieux et al.1994)。例如，Puisieux等人构建了磷脂酰胆碱、胆固醇和磷脂酰丝氨酸脂质泡囊，其封装了ATP，然后与精细胞、肝脏及脑组织温育所述泡囊。虽然观察到一些摄取，没有实现匹配ATP的代谢需求的受控的递送。当在血流中施用时，脂质体通常不能突破内皮细胞屏障；此外，它们通常不具有与细胞膜融合的高速度，融合是泡囊递送它的ATP有效载荷进入细胞所必需的事件。

动物细胞质膜含有四种主要的磷脂，其代表了超过总脂质的一半：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸和鞘磷脂。磷脂酰胆碱和鞘磷脂主要在外叶中存在，而磷脂酰乙醇胺和磷脂酰丝氨酸主要在内叶中存在。磷脂酰胆碱是动物细胞中最丰富的磷脂。因而，任何脂质体递送系统应当主要由这种磷脂构成。此外，磷脂酰胆碱是形成闭合的脂质泡囊的仅有的天然形成的磷脂，脂质泡囊保护泡囊内的内容物并降低渗漏。质膜帮助维持细胞的完整性并是选择透过性的。虽然某些分子能够扩散通过膜，大多数的分子，包括ATP，需要其他方式来进入，例如转运蛋白或通道。

因而，一直地需要新的方法来为了各种应用将生物分子递送给细胞，包括但不限于提供生物分子，例如ATP给未接受足够数量的生物分子的细胞和组织来满足代谢需求。

发明内容

发明内容部分列出了当前公开的主题的几个实施方式，在很多情况下列出了这些实施方式的变体和变换体。发明内容部分仅仅示例了很多和不同的实施方式。提及给定实施方式的一个或多个代表性的特征同样是示范性的。这样的实施方式一般可以在有或没有提及上述特征的情况下存在；同样地，那些特征可以应用于当前公开的主题的其他实施方式，无论是否在发明内容部分中列出。为了避免过多的重复，发明内容部分没有列出或暗示这样的特征的所有可能的组合。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了泡囊，其包含是稳定泡囊形成者(former)的磷脂和至少一种不稳定泡囊形成成员，其中所述不稳定泡囊形成成员选自不是稳定泡囊形成者的极性脂质、PEG、筏形成者(raftformer)和融合蛋白。是稳定泡囊形成者的磷脂或者不是稳定泡囊形成者的极性脂质可以具有式(I)的结构：

X-L-(Z)₂ (I)

其中X是H、A，或具有式(II)的结构

B是阳离子或烷基基团，

A是H或烷基基团，

L是进一步缺少两个氢原子的烷基，和

每个Z独立地是H、E或式(XI)的结构，

其中E是烷基或烯基，当一个Z是H时，另一个Z不是H。

在当前公开的泡囊的某些实施方式中，A是H，或具有选自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的结构。

其中n是0到4的整数；

L具有选自式(VIII)、(IX)或(X)的结构

；以及

E具有选自(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)的结构

进一步的，在某些实施方式中，E可以是细菌脂肪酸。示范性的细菌脂肪酸包括，但不限于，异支链脂肪酸、反异支链脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不饱和或顺式-不饱和脂肪酸、a-羟基脂肪酸、b-羟基脂肪酸、a-羟基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羟基脂肪酸、环己基脂肪酸、(Z，Z)-不饱和脂肪酸、a-羟基-(bE)-烯和2-己基环丙烷癸酸。

在泡囊的某些实施方式中，所述是稳定泡囊形成者的磷脂是磷脂酰胆碱，在某些实施方式中，所述磷脂酰胆碱是大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、大肠杆菌(E.coli)提取的磷脂酰胆碱、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PDPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。进一步的，在某些实施方式中，所述不稳定泡囊形成成员是具有选自式(XXIV)、(XXV)、(XXVI)、(XXVII)、(XXIX)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的结构的不稳定泡囊形成极性脂质。在其他实施方式中，所述不稳定泡囊形成成员是具有约20到约8000个重复单元的分子量、约3000到约4000个重复单元的分子量、或约3350个重复单元的分子量的PEG。更进一步，在某些实施方式中，所述不稳定泡囊形成成员是选自胆固醇和鞘磷脂的筏形成者，或所述不稳定泡囊形成成员是选自受精素(fertilin)、可溶的N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白受体(SNARE)、secl/munc18(SM)多肽、病毒包膜融合蛋白和膜联蛋白(annexin)的融合蛋白。在某些实施方式中，所述泡囊包含两种或更多的所述不稳定泡囊形成成员。

在所述泡囊的某些实施方式中，所述泡囊进一步包含生物分子。在某些实施方式中，所述生物分子是脂质可溶的生物分子，其可以选自a-生育酚(维生素E)、视黄醇(维生素A)、phyllochinon(维生素K)、麦角钙化醇(维生素D)、胆固醇、胆固醇酯、类固醇、藿烷类(hopanoids)、洗涤剂、脂肪酸、细菌支链脂肪酸、类异戊二烯化合物、长链醇、脂质可溶的麻醉剂、神经节苷脂、脂多糖、生物素标记的磷脂、膜离子电导通道、转运蛋白、葡萄糖转运蛋白、粘附蛋白、间隙连接蛋白、联会接点蛋白、半胱氨酸蛋白酶(caspases)、粘着蛋白(adherence protein)、G-蛋白、MHC蛋白、补体蛋白、脂质可溶的病毒蛋白、细胞受体、脂质可溶的荧光探针分子和脂质可溶的放射性示踪分子。在某些实施方式中，所述生物分子是水溶性的生物分子，其可以选自氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、二糖、多糖、核苷酸、多核苷酸、水溶性维生素、矿物质、高能磷酸、糖酵解中间物、氧化中间物、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+或NADH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+或FADH2)、水溶性细胞酶、胰岛素、水溶性荧光探针分子、水溶性放射性示踪分子和水溶性药物。进一步的，在某些实施方式中，所述生物分子是选自ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鸟嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP和次黄苷的高能磷酸。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了泡囊，其包含生物分子(例如ATP)、大豆磷脂酰胆碱和DOTAP。在某些实施方式中，所述ATP以约0.01mM到约200mM的浓度存在。进一步的，在某些实施方式中，所述泡囊具有约50:1的大豆磷脂酰胆碱比DOTAP的比例。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了泡囊，其包含生物分子(例如ATP)、DOPC和DOTAP。在某些实施方式中，所述ATP以约0.01mM到约200mM的浓度存在。进一步的，在某些实施方式中，所述泡囊具有约50:1的大豆磷脂酰胆碱比DOTAP的比例。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了向细胞递送生物分子的方法，包括用当前公开的主题的泡囊接触所述细胞。在某些实施方式中，所述泡囊进一步包含生物分子，所述生物分子在某些实施方式中是ATP。进一步的，在某些实施方式中，通过所述泡囊递送给细胞的ATP的数量足以在低氧或低营养物的期间补偿ATP利用事件并帮助维持细胞。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了治疗伤口的方法，包括用包含当前公开的主题的泡囊的组合物接触所述伤口，所述泡囊包含生物分子。在某些实施方式中，所述生物分子是ATP。在某些实施方式中，所述泡囊进一步包括贝卡普勒明(becaplermin)、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、抗生素、含银组合物、皮肤移植组合物或其组合。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了提高具有至少一个细胞的生物反应器的生产率的方法，包括用泡囊接触所述细胞。所述泡囊可以包含生物分子，其在某些实施方式中是ATP。

在某些实施方式中，当前公开的主题提供了保存组织的方法，包括用当前公开的主题的泡囊接触组织。所述泡囊可以包含生物分子。在某些实施方式中，所述生物分子是ATP。

因而，当前公开的主题的目的是提供脂质泡囊，用向细胞递送于生物分子，以及使用脂质泡囊的方法。通过当前公开的主题完全地或部分地实现了这个目的和其他目的。

以上已经声明了当前公开的主题的目的，随着描述的进行，当结合下文中描述的实施例和附图时，其他的目的将变得明显。

附图说明

图1是显示在一小时之后ATP在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)内的分配系数的柱形图。

图2是显示在裸鼠中当前公开的主题的组合物对伤口愈合的效果的线形图。

图3是显示大鼠中切断的肢体的成功再植的一对相片。在重新连接之后，肢体是完全有功能的。

图4是显示通过GC/MS测定的大豆磷脂酰胆碱(PC)的脂肪酸成分的图表。大豆PC具有非常低的饱和/不饱和比例(0.3)，这表明不饱和脂质的优势，其可以提高融合。

图5A至图5C是显示包含大豆PC/DOTAP(50:1)的泡囊提高细菌生长速率(图5A)以及还帮助肝脏保存(图5B和图5C)的图表。

图6A和图6B是显示用于向股静脉递送生物素化的脂质的、当前公开的主题的泡囊的显微照片。大鼠后肢用含有生物素化的PE的泡囊灌注。图6A是在用生物素化的泡囊和荧光链霉抗生物素蛋白灌注14天之后的显微照片。图6B是非生物素化的泡囊和荧光链霉抗生物素蛋白的显微照片。图6A和6B的放大率为100×。

图7是显示了与对照动物相比施用ATP-SUV的动物的出血性休克模型中提高的存活率的线形图。

图8是显示了与对照动物相比施用ATP-SUV的动物的化学诱导的缺氧模型中提高的存活率的柱形图。

具体实施方式

当前的主题利用了这一发现，即，与细胞双层脂质膜吸收性相容的小的脂质泡囊可以封装生物分子并将生物分子直接递送给细胞。生物分子递送的速率可以通过改变脂质泡囊组成，以及通过其他方式，产生不同的吸收速率来控制。此外，泡囊组成可以被调整来适应不同的的施用方式。例如，可以制成小的脂质泡囊，从而当被注射到循环中时，泡囊可以绕过内皮细胞，打开缺口，从而它们可以被目标细胞有效地吸收。为了促进或靶向吸收，其他成分可以添加到泡囊，例如某特定的多肽。通过装载到脂质泡囊中，生物分子可以被稳定以对抗水解作用。

当前公开的主题的组合物和方法满足了对于向细胞的有效生物分子递送，例如向细胞递送ATP的需求。向细胞的有效的生物分子递送的四个目标是：第一，取决于要递送的生物分子，生物分子必须穿过或进入细胞膜。第二，生物分子的数量必须以一定速率递送，其可以帮助补偿细胞对生物分子的基础代谢需求，例如，在各种条件下细胞对ATP的代谢需求。第三，含有生物分子的组合物必须与给药途径相容。最后，为了有效，生物分子必须在生物分子降解之前进入细胞或细胞膜。

脂质泡囊膜相似于浆细胞膜；此外，它们是容易制取的。因为它们具有水性部分，脂质泡囊可以封装各种溶液，包括含有生物分子例如ATP的那些。然而，泡囊还包含疏水性成分，因而也可以被利用来向细胞递送疏水性生物分子。脂质泡囊可以制成被细胞膜吸收，容许脂质泡囊的内容物的递送。

在此公开的主题的方法和组合物具有广泛的用途，包括治疗出血性休克、心脏病发作、冠心病、中风、血压过低、严重外伤、伤口愈合、组织和器官保存、心肺复苏和移植。在严重外伤的情况下，当前公开的主题的组合物可以就地施用来最小化损伤直到获得医学帮助。所述方法和组合物也可以用于延长血液和血小板保存。

在整个说明书和权利要求中，给定的化学式或名称应当涵盖所有的光学和立体异构体以及外消旋混合物，在外消旋混合物中存在这样的异构体和混合物。

以下的秒行速并非意图限制当前公开的主题，而是被呈现以帮助医师，但是可以使用其他的方法、技术、细胞、试剂和途径。

定义

“烷基”(或烷基-或烷-)是指取代的或未取代的、直链的、支化的或环状的烃链，优选地含有1到20个碳原子。未取代的烷基的适合的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、环丙基、丁基、异丁基、叔-丁基、仲-丁基、环丁基、戊基、环戊基、己基、环己基，等等。沿着烷基链可以有任选地插入的一个或多个氧、硫或取代或未取代的氮原子。“烷基芳基”和“烷基杂环”基团是分别共价结合到芳基或杂环基团的烷基。

“烯基”是指取代的或未取代的、直链的、分支的或环状的、不饱和的烃链，其含有至少一个双键，优选地2到22个碳原子。示范性的未取代的烯基基团包括乙烯基、1-丙烯基、2-丙烯基(或烯丙基)、1，3-丁间二烯基、己烯基、戊烯基、1，3，5-己三烯基，等等。优选的环烯基含有五到八个碳原子和至少一个双键。环烯基的实例包括环己二烯基、环己烯基、环戊烯基、环庚烯基、环辛烯基、环己二烯基、环庚二烯基、环辛三烯基等等。

“烷氧基”是指取代的或未取代的，-O-烷基。示范性的烷氧基包括甲氧基、乙氧基、n-丙氧基、异丙氧基、n-丁氧基、t-丁氧基，等等。

“芳基”是指任何单价的芳香族碳环的或芳香杂环的基团，优选具有3到10个碳原子。芳基基团可以是二环的(即，苯基(或Ph))或多环的(即，萘基)，并可以是取代的或未取代的。优选的芳基基团包括苯基、萘基、呋喃基、噻吩基、吡啶基、吲哚基、喹啉基或异喹啉基。

“氨基”是指未取代的或取代的-NRR′基团。胺可以是伯胺(-NH₂)、仲胺(-NHR)或叔胺(-NRR′)，取决于取代基(R或R′)的数目。取代的氨基的实例包括甲基胺基、二甲基氨基、乙基氨基、二乙基氨基、2-丙基氨基、1-丙基氨基、二(n-丙基)氨基、、二(异-丙基)氨基、甲基-n-丙基氨基、t-丁基氨基、苯胺基，等等。

术语“季氮”是指氮原子，其参与四个单键、两个单键和一个双键、一个单键和一个三键、或两个双键。因而，在当前公开的主题的某些实施方式中，术语“季氮”是指被四个取代基团取代的氮原子，包括一个基团，其进一步用于将该季氮连接到连接基团“L”或在此公开的式(II)的化合物的氧原子上。因而，在某些实施方式中，所述季氮具有以下结构：

其中每个R₁独立地选自H、烷基、取代的烷基、支链烷基、环烷基、烯基、羟烷基、烷氧基烷基、芳基、取代的芳基和芳烷基。

“杂环基”是指稳定的饱和环、部分不饱和环或芳香环，优选含有5到10个、更优选含有5个或6个原子。环可以被取代基取代1次或更多次(优选地，1、2、3、4或5次)。环可以是单环、双环或多环的。杂环基团由碳原子和1到3个杂原子组成，所述杂原子独立地选自氮、氧和硫。杂原子可以是保护的或未保护的。有用的杂环基团的实例包括取代的或未取代的、保护的或未保护的吖啶、苯并噻唑啉(benzathiazoline)、苯并咪唑、苯并呋喃、苯并噻吩、苯并噻唑(benzthiazole)、苯并苯硫基(benzothiophenyl)、咔唑、肉啉、呋喃、咪唑、1H-吲唑、吲哚、异吲哚、异喹啉、异噻唑、吗啉、噁唑(即，1，2，3-噁二唑)、吩嗪、吩噻嗪、吩噁嗪、酞嗪、哌嗪、蝶啶、嘌呤、吡嗪、吡唑、哒嗪、吡啶、嘧啶、吡咯、喹唑琳、喹啉、喹喔啉、噻唑、1，3，4-噻二唑、噻吩、1，3，5-三嗪、三唑(即，1，2，3-三唑)，等等。

“取代的”是指所述部分含有至少一个、优选1-3个取代基。适合的取代基包括氢(H)和羟基(-OH)、氨基(-NH2)、氧基(-O-)、羰基(-CO-)、硫氢基、烷基、烯基、炔基、烷氧基、卤、腈、硝基、芳基和杂环基团。这些取代基任选地可以进一步被1-3个取代基取代。被取代的取代基的实例包括氨甲酰、烷基巯基、烷基磺酰基、烷基氨基、二烷基氨基、季氮、羧化物(carboxylate)、烷氧羰基、烷基芳基、芳烷基、烷基杂环基，等等。

脂质泡囊

脂质泡囊相似于质膜，它们可以被制成被细胞膜吸收。早先的脂质体研究显示了在脂质体和细胞膜之间观察到四种主要类型的相互作用：对细胞表面的吸附；内吞作用(脂质体被吞噬细胞的主动摄取)；脂质交换(涉及脂质体和质膜之间各种脂质分子的转移)；和融合(其中脂质体膜与浆细胞膜结合)。“吸收(absorb)”、“吸收(absorption)”和“吸收的(absorptive)”，作为在此使用的术语，涵盖了脂质体和细胞膜之间的所有的相互作用，包括吸附、内吞作用、脂质交换和融合。

融合物提供了感兴趣的机制，因为它容许浆泡囊内容物直接进入细胞内。吸收或脂质交换也是感兴趣的，特别是当希望脂质可溶的生物分子向目标细胞递送时。内吞作用可以在特定细胞类型中发生，例如白细胞，也可以是泡囊被目标细胞吸收的机制。

大多数脂质体和多层泡囊不容易融合，主要是因为泡囊曲率半径的保存的能量是最小的。然而，当前公开的主题的单层小泡囊，其具有非常小的曲率半径，可以被制成具有强吸收性的，在某些实施方式中包括融合。当前公开的主题的单层小泡囊(SUV)的平均水动力学直径在某些实施方式中是约20nm到约600nm；在某些实施方式中是约100nm到约300nm；在其他实施方式中是约10nm到约100nm，更优选的是约20nm到约60nm，包括约40nm。这种大小容许泡囊穿过内皮细胞之间的缺口。当前公开的主题的有用的泡囊可以在大小上大大地变化，并根据特定的应用和向目标细胞递送的期望机制(例如，融合、脂质交换、内吞作用，等等)来选择。

形成当前公开的泡囊的组合物可以包含极性磷脂，其是稳定泡囊形成者，优选地，与至少一种不稳定泡囊形成成员一起，所述不稳定泡囊形成成可以选自不是稳定泡囊形成者的极性脂质、PEG、筏形成者和/或融合蛋白。

极性脂质，包括磷脂稳定泡囊形成者，以及，在某些实施方式中，不是稳定泡囊形成者的极性脂质，是具有疏水性末端和亲水性末端的有机分子，并含有至少六个碳原子。它们可以具有式(I)的结构

X-L-(Z)₂ (I)，

其中X是头部基团，L是主干基团，每个Z是脂肪基团。两个Z基团可以是相同的或不同的。

磷脂是极性脂质，其具有包括磷脂的头部基团。当前公开的主题包括磷脂，其被具有式(II)的头部基团的组合物涵盖，其中A和B是头部基团的取代基。

当前公开的主题涵盖的极性脂质包括例如稳定泡囊形成脂质和不是稳定泡囊形成者的脂质，所述极性脂质的头部基团X可以是任何极性基团，优选的是阳离子的、阴离子的或两性离子的基团，或H。在某些实施方式中，X是具有式(II)的基团。在其他实施方式中，X是A。A可以是H，或烷基。在某些实施方式中，A是被胺取代的烷基，在某些实施方式中A是具有式(III)、(IV)、(V)、(VI)或(VII)的基团，其中n是从0到4的整数。B可以是阳离子，例如Na⁺、K⁺或四甲基铵离子，或烷基。

要注意的是，在整个说明书中，结构式可以显示质子化形式的结构，但是它们还包括非质子化的形式(反之亦然)；在任何组合物中存在哪种形式将取决于组合物的确切pH值、水和/或适合的对抗离子的存在。

主干基团L可以是进一步缺少两个氢原子的烷基(来得到总共三个开放的连接位点)，在某些实施方式中可以是烷氧基，或氨基取代的烷基。在特定的实施方式中，L是具有式(VIII)、(IX)或(X)的基团。

脂肪基团Z可以是相同的或不同的，在某些实施方式中是H、E基团或式(XI)的结构，其中E是烷基或烯基。在某些实施方式中，E是未取代的直链烷基或烯基，具有6-26个碳原子。在特定的实施方式中，E是式(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)或(XXII)的组。在其他特定的实施方式中，E是细菌脂肪酸。示范性的细菌脂肪酸包括，但不限于，异支链脂肪酸、反异支链脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不饱和或顺式-不饱和脂肪酸、a-羟基脂肪酸、b-羟基脂肪酸、a-羟基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羟基脂肪酸、环己基脂肪酸、(Z，Z)-不饱和脂肪酸、a-羟基-(bE)-烯和2-己基环丙烷癸酸。如果脂肪基团之一是H，则另一个是不同的。如果存在双键，在特定的实施方式中顺式构型是优选的。

X—L—(Z)₂ (I)

是稳定泡囊形成者的磷脂(或极性脂质)是一种磷脂(或极性脂质)，当如下制备时其将形成泡囊，它的至少50％将存留至少一个小时：磷脂溶于氯仿中并置于玻璃试管中。通过在氮气的稳定气流下蒸发来除去溶剂，随后使样品经历十二小时真空来除去溶剂。干燥的脂质材料然后在10mMNa₂HPO₄中、在高于脂质相变温度的温度下重新水化60分钟；期望的终浓度是25mg/ml。然后利用在40％负载周期下使用的microtip 450瓦超声发生器的超声处理来搅动脂质混合物。在某些情况下，优选的是使用高压均质化和/或高压挤压通过固定直径的过滤器。

适合用作稳定泡囊形成成员的极性脂质的实例包括，但不限于1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)(式XXIII)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PDPC)(式XXVIII)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)、大豆磷脂酰胆碱(大豆PC)、卵磷脂酰胆碱、大肠杆菌提取物磷脂酰胆碱或其混合物。

在当前公开的主题的某些实施方式中，稳定泡囊形成极性脂质可以来源于天然来源，例如来自天然脂质的提取物，所述天然脂质来自植物、动物、酵母和细菌的。来自天然来源的极性脂质的提取物可以提供适合的脂质以及节省成本的益处。例如，对当前公开的主题有用的极性脂质可以来源于大豆来源。大豆油是食品工业的大宗商品，被用于大豆磷脂(大豆PC)的提取。获得了从30％-100％的不同程度纯度的大豆PC。大豆PC具有二不饱和亚油酸和混合链(例如，sn-1饱和的和sn-2不饱和的)的优势，其可以提高这种天然脂质提取物的吸收能力。参见图4。大豆PC的主要“成分”是溶血磷脂酰胆碱(溶血PC)和游离脂肪酸，其是提取和精致加工的副产物。有趣地，溶血PC和游离脂肪酸可以用来促进目标细胞对泡囊的吸收。因此，在当前公开的主题的某些实施方式中，泡囊可以包含，例如，95％的大豆PC作为稳定泡囊形成者，和5％的溶血PC和游离脂肪酸作为不稳定泡囊形成成员。这种配方降低了为了实现相同的期望的吸收率所必需的其他不稳定泡囊形成成员的数量，例如DOTAP或POPA。因而，这种制剂可以或可以不需要添加其他不稳定泡囊形成成员，这取决于期望的吸收率。

除了以上特别提及的大豆PC的益处之外，来自动物、植物、酵母和细菌的脂质的天然提取物可以用作脂质的循环来源，用于当前公开的主题的泡囊的生产。作为非限制性的实例，利用大肠杆菌用于胰岛素生产的生物反应器可以用作当前公开的主题的脂质体中稳定的形成脂质的脂质材料来源(来自大肠杆菌)。照这样，大的批次所需的脂质材料的数量被降低了，从而降低成本。

在某些实施方式中，除了是稳定泡囊形成者的磷脂之外，包括了至少一种其他的极性脂质，例如，不是稳定泡囊形成者的一种或多种极性脂质。

用于当前的主题中是不稳定泡囊形成成员的极性脂质的实例包括但不限于，1-棕榈酰-2-油酰基-sn甘油基-3-磷酸(POPA)(式XXIV)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOPC-e)(式XXV)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(DOPE)(式XXVI)、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-[磷酸-L-丝氨酸](DOPS)(式XXVII)、典型的鞘磷脂(例如，式XXIX)(当添加到鞘磷脂和DOPC的混合物形成泡囊中时胆固醇(式XXX)将形成筏)、1，2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油(式XXXI)、1-棕榈酰-2-羟基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(XXXII)、1，2-二油酰-3-三甲基铵-丙烷(DOTAP)(式XXXIII)和1，2-二油酰-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)(式XXXIV)。

作为不稳定泡囊形成成员对于当前公开的主题的实践有用的其他极性脂质包括磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰甘油(PGG)、混合链磷脂酰胆碱(MPC)、磷脂酰基乙醇(PE)和含有二十二碳六烯酸的磷脂。cit-DOPC和cit-DOPC-e是作为不稳定泡囊形成成员有用的极性脂质的实例。可以使用磷脂酰胆碱，包括在sn-1和sn-2位置中具有二十二碳六烯酸的那些(DHPC)。其他二不饱和的脂质，例如二花生西烯酰基磷脂酰胆碱(例如，20:4 DOPC:DArPC)，二亚麻酰基磷脂酰胆碱(例如18:3 DOPC:DLnPC)是有用的。例如，DOPC可以在泡囊制备期间与提高数量的DLnPC、DArPC和DHPC混合。有用的比例包括(DOPC:DLnPC、DArPC或DHPC)从1-1000:1，实例例如25-500:1，包括1:1、25:1、50:1、100:1、500:1和1000:1。也可以使用具有大的平均分子面积的磷脂的组合，例如DOPC:DLnPC:DHPC。非层状相脂质甘油二酯也可以与DOPC混合。

在某些实施方式中，不稳定泡囊形成成员是DOTAP和/或DODAP。DOTAP和DODAP是在生理学的pH值下携带净正电荷的修饰的脂质。DOTAP和DODAP与带负电的物质的相互作用是复杂的。然而，不希望受理论的限制，当DOTAP和/或DODAP在当前公开的主题的泡囊组合物中被利用作为不稳定泡囊形成成员时，细胞内递送的可能的机制是经由提高的膜透过性的被动进入。当DOTAP和/或DODAP被添加到磷脂酰胆碱脂质泡囊时，例如，DOTAP和/或DODAP可以作为络合剂用于带负电的物质，以及，作为提高脂质泡囊的表面电荷密度的手段。提高的表面电荷可能是膜吸收事件中的重要因素。此外，DOTAP和DODAP具有头部基团，例如，当植入磷脂酰胆碱泡囊中时，其占据较少的空间并因而可以诱导装填约束结果(packing constraint issue)。

有趣的是注意到，由DOTAP和/或DODAP组成的脂质泡囊很可能具有对带负电试剂的细胞内递送有用的超过一种机制。例如，DOTAP和DODAP可以提高细胞的脂质泡囊吸收，容许细胞内的内容物递送，或作为选择，DOTAP和/或DODAP可以结合带负电的物质，并在细胞质膜中存在的带负电物质的数量上起帮助作用(即，吸收DOTAP和/或DODAP进入质膜可以引起物质在膜上的沉积，包括外叶和内叶)。DOTAP和DODAP也是商业上生产的，因而是容易获得的。它们也已经在GMP过程中使用。

因而，DOTAP和DODAP是当前公开的主题的泡囊中不稳定泡囊形成成员的非常适合的实例。在特定的实施方式中，所述泡囊包含大豆PC/DOTAP(50:1mol/mol)。在其他特定的实施方式中，所述泡囊包含DOPC/DOTAP(50:1mol/mol)。进一步的，在某些实施方式中，所述泡囊包含ATP(例如，10mM的浓度)。这些制剂已经用于肝脏保存应用。这种脂质组合引起的肝脏ATP水平的显著的维持，还在延长的体外保存时间上维持了肝脏保存(图5B和图5C)。进一步的，这些制剂已经成功地用于提高细菌生长速率(图5A)。

筏形成者也可以被利用作为当前公开的主题的泡囊中的不稳定泡囊形成成员。筏形成者是一种化合物，其将形成独立的区域或引起独立的区域的形成，所述区域含有膜双分子层内的筏形成化合物。这些独立的区域倾向于使泡囊不稳定，提高它的吸收性，即，它的融合性。筏形成者的实例是胆固醇(式XXX)、鞘磷脂和已知为膜结合的蛋白质和多肽。吸收性也可以通过选择极性脂质来增强，其将引起泡囊上的表面电荷，这与目标细胞的Gouey-Chapman层的电荷是相反的(一般地，Gouey-Chapman层是带正电的)。

在某些实施方式中，一种或多种融合蛋白，即参与膜融合的多肽，可以被利用作为不稳定泡囊形成成员来控制泡囊的吸收速率。用于掺入当前公开的主题的泡囊的融合蛋白的非限制性实例包括参与膜融合的多肽，例如受精素、可溶的N-乙基马来酰亚胺-敏感因子附着蛋白质受体(SNARE)、SM(secl/munc18)多肽(例如，Vps33p、Sly1p和Vps45p的哺乳动物同种型(isomer)；(Jahn and Sudhof1999)和病毒包膜融合蛋白，例如来自人类免疫缺陷病毒(HIV；例如，gp41)，Semiliki Forest病毒，和流感的那些)。哺乳动物SNARE家族包括突触融合蛋白(syntaxins)(1A、1B、1C；2(和剪接变体)；3、3A、3B、3C、3D；4；5、5A、5B、6、7、8、10、11、12、13(可以是相同于12)；16(A、B、C)；和17)、Hsyn16、rbet1、GS15、GOS32、GOS28、Membrin、SNAP(25、25a、25b；23、23A、23B；29)、vtilb、突触泡蛋白(Synaptobrevins)(1和剪接变体；2)、缩纤蛋白(Cellubrevin)、VAMP4、VAMP5/6、Ti-VAMP、Endobrevin、Tomosyn和msec22b(Jahnand Sudhof1999)。在此使用的术语“融合蛋白”还指使膜不稳定的两亲性肽，即使它们的主要功能不是介导膜融合，实例例如膜联蛋白(Jahn and Sudhof 1999)。

为了靶向特定的细胞，与特异于目标细胞的多肽相互作用(例如配体受体相互作用(至少在施用泡囊的区域中))的多肽，或与识别细胞特异性抗原的抗体相互作用的多肽可以被掺入当前公开的主题的泡囊中，并也被认为是在此使用的术语“融合蛋白”。其他靶向多肽包括在细胞间膜转运期间使用的那些以及Rab GTPase蛋白。病毒融合蛋白也可以被采用作为靶向分子。也可以使用膜结合物质，例如生物素化的脂质和碳水化物。

此外，在某些实施方式中，聚乙二醇(PEG)可以被利用作为不稳定泡囊形成成员。在某些实施方式中PEG可以具有从约20直到约8,000个重复单元的分子量，在某些实施方式中具有从约1,000到约6,000个重复单元的分子量，在某些实施方式中具有从约3,000直到约4,000个重复单元的分子量。在特定的实施方式中，PEG具有约3,350个重复单元的分子量。在某些实施方式中，PEG可以与稳定泡囊形成成员同时地掺入泡囊中。例如，所述稳定泡囊形成成员和PEG在泡囊的形成之前或期间混合在一起。

稳定泡囊形成成员与不稳定泡囊形成成员的比例(稳定：不稳定)在某些实施方式中可以是1:9到100,000:1，在某些实施方式中是1:1到1,000:1，在某些实施方式中是1:1到500:1，在某些实施方式中是1:1到250:1，更优选地是10:1到100:1(例如，50:1)。非限制性的实例包括：DOPC/DOPC-e(1:1)；DOPC/POPA(50:1)，DOPC/POPA(1:1)，DOPC/DOTAP(50:1)，大豆PC/DOTAP(50:1)和大豆PC/PEG3350(1:1)。

脂质泡囊构建

为了构建脂质泡囊，在一个实施方式中，脂质溶于氯仿或其他合适的有机溶剂中，并置于器皿，例如玻璃试管中。通过在氮气或其他惰性气体的稳定气流下蒸发，随后排气，来除去溶剂，例如，使样品经历真空达0.1到48小时，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、15、20、24、25、30、36、40、42或48小时。十二个小时通常是足够的。干燥的脂质材料然后在合适的缓冲液，例如Hank’s平衡盐溶液(HBSS)或10mM Na₂HPO₄中、在高于脂质相变温度的温度下重新水化30-60分钟，期望的终浓度通常是大约1到30mg/ml，一般约10mg/ml。然后搅动脂质混合物。例如，可以使用超声处理；例如，在40％负载周期下使用的microtip 450瓦超声发生器来产生SUV。超声处理的持续时间取决于脂质材料的数量；在任何情况下，当没有观察到透光百分率的进一步降低时、或通过利用颗粒大小分析器分析实现了恰当的泡囊大小时，停止超声处理。

在另一个实施方式中，通过将脂质材料(例如，基础脂质(base lipid)和融合脂质)溶解到有机溶剂中、冻干一定时间足以除去溶剂(例如，过夜)，来构建脂质泡囊。然后可以用缓冲液在大约45℃水化脂质。脂质泡囊在45℃搅拌大约1小时。将要封装到泡囊中的化合物，包括例如海藻糖和Mg-ATP，添加到溶液中，产生的多层泡囊在基础脂质的相变温度以上经历高压匀质化。从这个步骤形成的单层泡囊可以通过高压挤压另外处理。这样制备的泡囊可以直接冻干用于最后使用。

可以进行动态光散射(DLS)来测定乳化的脂质体的直径，如本领域一般已知的，使用基于荧光素的分析通过发光来测定封装百分比。进一步的，如果希望，通过UV光谱和薄层层析(TLC)来分析脂质，以评估氧化的程度。

当再水化干燥的脂质时，可以使用其他的溶液。这些包括用以下物质缓冲的那些：N，N-二(2-羟基乙基)-2-氨基乙磺酸(BES)、组氨酸、二(2-羟基乙基)氨基-三(羟基甲基)甲烷(BIS-Tris)、N-(2-羟基乙基)哌嗪-N’3-丙磺酸(EPPS或HEPPS)、glyclclycine、N-2-羟基乙基哌嗪-N’-2-乙磺酸(HEPES)、3-(N-吗啉代)丙烷磺酸(MOPS)、哌嗪-N，N’-二(2-乙烷-磺酸)(PIPES)、碳酸氢钠、3-(N-三(羟基甲基)-甲基-氨基)-2-羟基-丙磺酸)TAPSO、(N-三(羟基甲基)甲基-2-氨基乙磺酸(TES)、N-三(羟基甲基)甲基-甘氨酸(Tricine)和三(羟基甲基)-氨基甲烷(Tris)。适合的溶液的其他实例包括盐溶液，例如Alseverr’s溶液、Dulbecco’s磷酸盐缓冲盐水(DPBS)、Earle’s平衡盐溶液、Gey’s平衡盐溶液(GBSS)、Puck’s盐水A、Tyrode’s盐溶液、St.Thomas溶液和威斯康星大学溶液(University of Wisconsin solution)。

生物分子封装和递送

当前公开的主题公开了脂质泡囊，其可以被利用来递送分子，例如生物分子，其是细胞在特定条件下(例如，代谢应激)需要的以满足在特定条件下的代谢需求。当前公开的主题的脂质泡囊可以被目标细胞质膜吸收，并递送所述泡囊携带的生物分子给目标细胞。由于当前公开的主题的泡囊包含疏水性脂质膜和由所述膜封装的水性区室，在此公开的泡囊可以递送两种不同类别的物质；泡囊膜中携带的疏水性分子和由所述泡囊封装的水溶性分子。

所述泡囊携带的疏水性生物分子可以沉积到目标细胞质膜中，沉积的速率可以通过改变泡囊的吸收速率(例如，大小，电荷、聚集剂、不同的脂质种类)和每个泡囊中脂质可溶生物分子的浓度来控制。通过使用本领域技术人员已知的方法将生物分子添加到目标细胞双分子层上，每种脂质可溶生物分子的膜溶解度可以实验地测定。每个泡囊可以递送的每种生物分子的数量可以通过本领域技术人员广泛可用的放射示踪实验测量脂质可溶生物分子进入目标组织的摄取来测定。例如，³H-ATP可以封装到上述的脂质泡囊中，然后添加到细胞。在给定的时间之后，洗涤细胞几次来除去没有被细胞吸收的泡囊。从它们的平皿中移除细胞，然后置于液体闪烁液中，使用β计数器可以测定³H-ATP的掺入程度。

可以由在此公开的包含脂质可溶生物分子的泡囊递送的脂质可溶生物分子的实例包括，但不限于，α-生育酚(维生素E)、视黄醇(维生素A)、phyllochinon(维生素K)、麦角钙化醇(维生素D)、胆固醇、胆固醇酯、类固醇、藿烷、洗涤剂、脂肪酸、支链脂肪酸(例如细菌中发现的)、类异戊二烯化合物、长链醇、和麻醉剂、神经节苷脂、脂多糖、生物素标记的磷脂、膜结合蛋白质、膜离子电导通道(例如，Na/K-ATPase、H-ATPase、Ca-通道、Na-通道、K-通道、Cl-通道)、转运蛋白、葡萄糖转运蛋白、GLUT-1、GLUT-2、GLUT-3、GLUT-4)、粘附蛋白、间隙连接蛋白、联会接点蛋白质蛋白、半胱氨酸蛋白酶、粘着蛋白(例如，ICAM、PECAM、VCAM)、G-蛋白、主要组织相容性复合体(MHC)蛋白、补体蛋白、病毒蛋白、细胞受体、脂质可溶的荧光探针和脂质可溶的放射性示踪剂。例如，图6A和图6B描绘了用使用在此公开的脂质泡囊递送的膜结合荧光探针染色的大鼠股静脉的切片。

水溶性分子也可以通过将所述生物分子封装到在此公开的泡囊的水性区室内来递送给目标细胞。各种各样的水溶性分子可以通过当前公开的主题的脂质泡囊来递送，只有少数的限制指标，例如，分子可以放入所述脂质泡囊的内部。在200nm的平均大小下，大多数分子可以放入这个空间。可以封装到当前公开的主题的脂质泡囊内的水溶性生物分子的实例包括，但不限于氨基酸、肽、多肽、蛋白质、单糖、二糖、多糖、核苷酸和多核苷酸(例如，DNA、RNA、mRNA、tRNA、siRNA和miRNA)、水溶性维生素、矿物质、高能磷酸(例如，ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鸟嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP和次黄苷)、磷酸肌酸、糖酵解中间物(例如，葡萄糖、葡糖-6-磷酸、葡萄糖-1，6-二磷酸、FDP、DHA-P、G-3-P、PEP和丙酮酸)、氧化中间物(例如，乙酰基Co-A、柠檬酸和异柠檬酸)、烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FADH2)、水溶性细胞酶、胰岛素、水溶性荧光探针、水溶性放射性示踪剂和水溶性药物。

在当前公开的主题的某些实施方式中，ATP是掺入所述脂质泡囊的生物分子。存在着当前公开的主题可以利用的几种不同的腺苷-5’-三磷酸(ATP)的盐，包括ATP镁(Mg-ATP)、ATP的二钠盐、ATP的二钾盐、和ATP的二Tris盐。

对于代表性的实施方式，利用ATP的Mg盐(Mg II)。ATP的Mg盐具有稍微更大的γ磷酸盐的水解作用的ΔG′，发现的是所有细胞ATP的超过90％是镁盐。虽然Mg-ATP的水解作用的ΔG′已经被报道为-8.4千卡/mol，它在细胞的胞质溶液内可能不同。例如，Mg-ATP的水解作用的ΔG′可能受到pH值和存在的其他二价金属的影响。在某些环境中，Mg-ATP的水解作用的ΔG′在细胞内可以高达-12.5千卡/mol。

Mg-ATP的重要特征是它作为高能磷酸的根本来源的中心作用，高能磷酸作为供体(例如，葡糖-6-磷酸)或接受体(例如，磷酸肌酸)。Mg-ATP通过它在细胞中的负反馈作用充当了所有高能磷酸的中央调节物。例如，随着细胞内Mg-ATP水平提高，存在着果糖磷酸激酶的抑制，降低了葡萄糖的利用。此外，对于它的中心细胞内作用，Mg-ATP还以几种不同的方式起到了细胞外作用。例如，Mg-ATP结合并活化嘌呤能受体(P₂X)，引起多种细胞内影响，包括但不限于，通过K+进入的去极化、提高细胞内钙、蛋白激酶的活化、细胞回缩、氧化氮(NO)释放、以及血管平滑肌细胞(VSMC)松弛。在通过生物反应或合成来合成性生产ATP方面的新近进展显著地改善了商品市场上可获得的Mg-ATP的数量和质量。

在某些实施方式中，ATP的镁盐或其他盐可以掺入泡囊中，可以在脂质重新水化的时候添加。ATP浓度可以改变，并将取决于特定的应用。在某些实施方式中使用的ATP的浓度包括约0.001mM到约1M，在某些实施方式中包括约1mM到约200mM或约1mM到约50mM。在特定的实施方式中，ATP的浓度可以是约0.1mM、1mM、2.5mM、5mM、7.5mM、10mM、25mM或50mM。含有ATP的缓冲液可以具有低的蛋白含量以降低脂质材料的非特异性吸收的概率。为了方便起见，含有ATP的SUV被称为ATP-SUV。

评估了通过SUV的ATP封装。例如，使用了标记的ATP分子(使得标记物不干扰泡囊形成)，例如放射性标记的ATP。放射性标记物包括³²P和³H，在干燥之后、搅动之前当脂质重新水化时添加。溶液施加到SephadexG-25柱(或其他适合的基质)上来除去未封装的ATP。收集柱的流出物，分析泡囊的存在。SUV通常在最早的级分中洗脱。通过测定泡囊和上清液级分中的放射性，确定封装的ATP的比例并乘以100，来测定封装百分比。优选的封装百分比从大约1％到20％。

除了ATP以外的分子可以使用SUV递送给细胞，例如有机和无机分子，包括药物、多肽、核酸和与细胞内抗原作用的抗体。

测量SUV吸收性的分析

可以测定吸收速率，作为HUVEC细胞吸收的脂质泡囊的数量的度量，单位孔/秒(约10⁶个细胞)。分析包括以下步骤：

(1)培养HUVEC细胞(美国典型培养物保藏所(ATCC)；Manassas，Virginia or BioWhittaker；Maryland)；

(2)制备SUV并用荧光探针例如羧基荧光素装载；

(3)SUV接触细胞并容许吸收；

(4)在选定的时间，除去任何残余的SUV；并且

(5)测量荧光。

在除去SUV之后荧光信号的存在和强度表明了SUV被细胞膜吸收和递送内容物的能力。

给出人脐静脉内皮细胞(HUVEC)作为实例。细胞在标准的12孔培养皿(例如，来自COSTAR；细胞的数目是大约10⁶个)中在内皮细胞生长培养基(EGM)中生长到汇合。然后用缓冲液例如HBSS洗涤HUVEC3次。制备的脂质泡囊(实例例如，DOPC/DOPC-e(1:1)；DOPC/POPA(50:1)，DOPC/POPA(1:1)，PS，PG，MPC，PE，cit-DOPC和cit-DOPCe)，用1mM羧基荧光素装载。在37℃、95％空气/5％CO₂下，泡囊与细胞温育120分钟，每5分钟分析荧光，在此之后用缓冲液洗涤细胞来除去残余的泡囊。如果使用带负电的脂质泡囊，在吸收步骤添加钙(终浓度0.1-10mM)。

通过用胰蛋白酶处理来将细胞从平皿上除下。使用荧光分光光度计或其他适合的设备测量荧光(在495nm激发和在520nm发射)。

在某些实施方式中，生物分子-SUV组合物的吸收速率是大约20个泡囊吸收/秒/细胞到8.0×10¹¹个泡囊吸收/秒/细胞，包括500到1×10⁸个泡囊吸收；750,000到50×10⁷个泡囊吸收/秒/细胞；5×10⁶到1×10⁷个泡囊吸收/秒/细胞；包括1×10⁶到8×10⁸个泡囊吸收/秒/细胞；1×10⁷到5×10⁸个泡囊吸收/秒；以及5×10⁷到1×10⁸个泡囊吸收/秒/细胞。吸收速率的实例是至少100、1000、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰和10¹¹个泡囊吸收/秒/细胞。这些值的一些是使用DOPC和DOPC/DOPC-e和DOPC/POPA的混合物、在37℃、有和没有钙的情况下，使用人内皮细胞实验地获得的。脂质泡囊的吸收性速率是在细胞到细胞之间不同的。此外，吸收速率可以受到温度、离子强度和压力的影响。

由于质膜的脂质组成随细胞类型而变化，用于该分析中的细胞的选择被仔细地考虑，应当最好地匹配目标细胞类型。例如，肝脏细胞质膜包括约7％磷脂酰乙醇胺，而红细胞质膜含有18％(Alberts et al.2002)。原代培养细胞以及细胞系(可从美国典型培养物保藏所(ATCC)；Manassas，Virginia获得)是有用的，然而原代培养物是优选的，因为质膜脂质组成在转化的细胞中可能改变。细胞类型包括胰腺、肠、免疫系统、神经元(包括脑、眼、鼻和耳的)、肺、心脏、血液、循环(淋巴和血液)、骨骼、软骨、生殖、腺体、牙釉质、脂肪、皮肤和肝脏的。细胞系包括来自这些组织的那些，例如Madin-Darby犬肾脏(MDCK)、中国仓鼠卵巢(CHO)、HeLa，等等。细胞可以来自其他有机体，例如植物、真菌(包括酵母)和细菌。这些其他细胞类型的吸收速率的实例包括至少100、1000、10⁴、10⁵、10⁶、10⁷、10⁸、10⁹、10¹⁰和10¹¹个泡囊吸收/秒/细胞。除非另作说明，吸收速率是针对在以上指定的条件下的HUVEC。对于其他细胞类型的吸收速率是对于大约10⁶个细胞、使用缓冲液，例如HBSS，泡囊与细胞在37℃、95％空气/5％CO₂温育120分钟，此后通过用缓冲液洗涤细胞除去残余的泡囊。

优化吸收速率的分析

吸收速率的分析可以进一步改进，此时优化特定细胞类型对特定的泡囊组成的吸收速率。例如，脂质泡囊可以含有作为泡囊的膜双分子层的一部分的荧光或放射性示踪剂。

可以利用的荧光探针包括，但不限于，异硫氰酸荧光素；荧光素二氯三嗪(fluorescein dichlorotriazine)和荧光素的氟化的类似物；萘荧光素羧酸和它的琥珀酰亚胺基酯；羧基罗丹明6G；吡啶基噁唑衍生物；Cy2、3和5；藻红素；琥珀酰亚胺基酯、羧酸、异硫氰酸、磺酰氯和丹磺酰氯的荧光物质，包括丙酸琥珀酰亚胺基酯和戊酸琥珀酰亚胺基酯；羧基四甲基罗丹明的琥珀酰亚胺基酯；罗丹明Red-X琥珀酰亚胺基酯；得克萨斯Red磺酰氯；得克萨斯Red-X琥珀酰亚胺基酯(Texas Red-X sodium tetrafluorophenol ester)；得克萨斯Red-X钠四氟苯酚酯；Red-X；得克萨斯Red染料；四甲基罗丹明；丽丝胺罗丹明B；四甲基罗丹明；四甲基罗丹明异硫氰酸酯；萘荧光素；香豆素衍生物；嵌二萘；吡啶基噁唑衍生物；dapoxyl染料；Cascade Blue和Yellow染料；苯并呋喃异硫氰酸酯；四氟苯酚钠(soium tetrafluorophenols)；和4，4-二氟-4-硼-3a，4a-二氮杂-s-引达省(4，4-difluoro-4-bora-3a，4a-diaza-s-indacene)。这些化合物的激发波长将不同。在以例如1:800脂质/探针的比例存在示踪物的情况下制成脂质泡囊。其他有用的比例包括1:200到1:10,000，包括1:400、1:500、1:600、1:700、1:800、1:900和1:1000。

改变吸收速率

通过改变多种因素，例如温度、离子、脂质浓度、脂质泡囊组成、流速、脂质泡囊大小等等，任何脂质泡囊的吸收速率可以被改变。改变脂质泡囊的磷脂配方可以用于最大化吸收速率以及最小化毒性。例如，为了保存用于移植的器官或悬浮中的细胞(例如血液)，具有更慢的、延迟的吸收速率的脂质泡囊是期望的。这种速率可以使用仅含有DOPC的泡囊来获得。另一方面，如果生物分子的细胞内浓度的立即提高是关键的，例如对于中风、心脏病发作或外伤患者，具有非常快速的递送速度的脂质泡囊是期望的。例如，DOPC/POPA组合物以足够的浓度递送生物分子例如ATP，以在少于5分钟内满足受影响组织的代谢需求(参见实施例)。

四种通用的方法可以用于通过操作脂质组成来改变吸收速率：

(1)提高静电相互作用；

(2)使膜双分子层不稳定化；

(3)增加非双分子层相；和

(4)产生不同的脂质相。

提高静电相互作用

可以采用静电相互作用来提高吸收速率。磷脂根据它们的电荷来分类(阳离子的、阴离子的和两性离子的)。许多阳离子磷脂，例如PE，和阴离子磷脂，例如磷脂酸(POPA)，在生理学的pH值下不形成封闭的泡囊。然而，与两性离子的磷脂酰胆碱混合的阴离子和阳离子脂质可以在生理学pH值下形成封闭的泡囊。

大多数细胞的质膜具有净负电荷。由于这种负电荷，存在着抗衡离子层，一般是钙、镁、钠和钾，其呈现净正电荷。利用脂质体和质膜之间的静电相互作用，脂质泡囊可以被工程化以具有净负电荷，因而最大化细胞-脂质泡囊吸收。然而，某些细胞质膜含有更多的阳离子脂质，其被阴离子层抗衡。在这些位置，脂质泡囊被工程化以具有净正电荷来最大化细胞-脂质吸收。

产生不同的脂质相

质膜含有富含特定的脂质种类的脂质结构域或筏。在这种膜筏的边界处是不同的脂质种类的区域。这种区域具有不稳定性的潜力，影响着膜与其他的膜如何相互作用。已知几种磷脂提高脂质筏形成，包括磷脂酰胆碱、鞘磷脂和胆固醇的混合物。例如，DOPC、18:0鞘磷脂和胆固醇在脂质泡囊制备期间以1:1:1比例混合。胆固醇优选在鞘磷脂相中分布，产生富含DOPC并缺少胆固醇的区域，以及富含鞘磷脂和富含胆固醇的区域。

改变吸收、温度、浓度、离子强度和吸收周期的物理参数，可以用于影响吸收速率。通过改变温度，系统的自由能(G)被改变，产生不同的吸收速率。提高脂质泡囊浓度还影响膜吸收速率，特别是在非常高的浓度下。吸收周期(吸收的长度)和吸收周期的数量也影响SUV的封装内容物的递送速率。

温度

例如，含有ATP的脂质泡囊在组织被保存的温度下(4℃-低温，22℃-室温，37℃-正常体温)与组织温育5、10、15、30、60或120分钟。提高泡囊溶液的温度产生提高的泡囊动能，由此提高吸收能力。温度还影响泡囊的自由扩散。

泡囊吸收的浓度

虽然提高的浓度引起提高的脂质泡囊内容物递送是直观的，膜融合的速率不是线性的。一旦脂质泡囊脂质占据了所有可用的质膜表面，进一步的吸收受到限制。质膜吸收的程度影响膜体积和性质，例如离子渗透性和脂质结构。因而，当使用SUV时，SUV浓度必须被控制，使得目标细胞被有效地处理。

吸收周期

容许发生吸收的时间长度帮助控制封装的物质被递送的程度。优选的吸收周期包括1-180分钟，例如，1、5、10、30、60、120和180分钟。为了停止吸收，除去泡囊(例如通过用缓冲液洗涤)，或者施用的泡囊的浓度是这样，从而在希望的时间的终点泡囊被耗尽。吸收可以被优化，从而泡囊的总体递送通过一次或多次施用被控制。例如，如果目标吸收周期是120分钟，可以使用两个60分钟的周期，或四个30分钟，十二个10分钟，或24个五分钟的吸收周期。只要可获得适当的设备，1分钟或更短的吸收周期也可以实现，虽然这些周期通常是麻烦的和需要技术的。

测定目标细胞和组织的生物分子需求

生物分子施用的最佳速率是，其接近细胞对特定生物分子的基础需求，实例例如，细胞的基础代谢ATP需求，其可以通过本领域已知的任何方法来测定。例如，可以计算耗氧速率、丙酮酸、葡萄糖、乳酸和质子漏，根据这些数据，测定组织的ATP消耗，为消耗的ATP/分钟。

测量ATP水解的速率

细胞内ATP水平可以使用本领域一般已知的几种技术之一来测量。例如，HPLC提供了细胞的核苷酸含量的信息，但是受限于它提供给定时间的核苷酸水平的“快照”。³¹P-NMR可能是测量特定环境下细胞内核苷酸的更优选的方法，因为它提供了细胞中ATP水平的动态测量。

膜电位和质子漏

分离组织样品，与膜电位荧光探针MC540(Sigma；St.Louis，Missouri)温育。测量在添加各种数量的钾时MC540的荧光的改变作为膜电位和质子漏出的指标，如早先描述的(Brand，1995)。

葡萄糖、丙酮酸和乳酸水平

使用标准方法或商业上可获得的分析试剂盒(例如，可从Sigma获得的那些)来测定这些代谢中间物。这些中间物的水平被调节成蛋白质水平，在120分钟的时间周期上测量。

ATP消耗的测定

根据乳酸盐、丙酮酸和葡萄糖积累、氧消耗以及质子漏出的速率，通过使用如Ainscow和Brand(1999)所描述的反应化学计量法，能够计算通过系统的所有流量。

施用

药物组合物

在很多情况下，当前公开的泡囊可以作为包含泡囊和用来制备泡囊的缓冲液的简单组合物来递送，所述泡囊也可以包含生物分子。然而，如果希望，可以添加其他产品，例如，通常在药物组合物用作载体的那些。

“药学上可接受的载体”包括与药物施用相容的任何和所有的溶剂、分散介质、包被、抗细菌和抗真菌试剂、等渗和吸收延迟试剂，等等(Remington2000)。这种载体或稀释剂的优选的实例包括水、盐水、Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。补充的活性化合物也可以掺入到组合物中。

一般施用考虑

当前公开的主题的药物组合物被配制成相容于它预定的施用途径，包括静脉内的、皮内的、皮下的、口服的、吸入、穿表皮的、穿粘膜的和直肠的施用。用于胃肠外、皮内或皮下的应用的溶液和悬浮液可以包括无菌的稀释剂，例如注射用水、盐水溶液、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其他合成溶剂；抗菌剂，例如苯甲醇或对羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，例如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；缓冲液，例如醋酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐，和用于调节渗涨度(tonicity)的试剂例如氯化钠或葡萄糖。使用酸或碱，例如盐酸或氢氧化钠，可以调节pH值。胃肠外的制品可以封装到由玻璃或塑料制成的安瓿、一次性注射器或多剂量小瓶中。

如果带负电的脂质泡囊用于在此公开的组合物中，可以包括钙，使得在吸收部位的终浓度优选地是0.1mM-10mM；包括0.1、1、2、3、4、5、6、7、8、9或10mM。

在ATP脂质泡囊中，例如，ATP通常是处于与围绕ATP-SUV的任何溶液中的ATP的平衡中的；一般仅1-10％的总ATP处于ATP-SUV之内。其余的ATP可以与受体结合，例如嘌呤受体P2y，引起离子流出细胞，并感染离子平衡和稳态。虽然细胞通常可以重建离子平衡和稳态，这消耗额外的ATP。因此，特别是对于期望功能立即恢复的组织(例如，在器官移植或肢体重接期间)，在组合物中包括一种或多种嘌呤受体P2y拮抗剂将是有益的。嘌呤受体P2y拮抗剂可以在形成泡囊之后，或仅在施用之前添加到组合物中，因为拮抗剂不需要处于SUV之内。嘌呤受体P2y拮抗剂的实例包括吡哆醛5-磷酸、维生素B6(吡哆醛-5-磷酸)和活性蓝(Reactive Blue)2(1-氨基-4-[[4-[[4-氯-6-[[3(或4)-磺苯基]氨基]-1，3，5-三嗪-2-基]氨基]-3-磺苯基]氨基-9，10-二氢-9，10-二氧代-2-蒽磺酸)，和其组合。嘌呤受体P2y拮抗剂优选地可以在0.1到250微摩尔/L、更优选在1-100微摩尔/L的浓度下使用。

可注射制剂

适合于注射的药物组合物包括无菌水溶液或分散体，用于无菌可注射溶液或分散体的临时制备。对于静脉内施用，适合的载体包括，生理盐水、抑菌水、Cremophor EL^TM(BASF；Parsippany，N.J.)或磷酸盐缓冲盐水(PBS)。在所有情况中，组合物必须是无菌的，并应当是液体以便使用注射器施用。这种组合物应当在制造和保存期间是稳定的，必须对抗微生物例如细菌和真菌的污染来保存。载体可以是分散介质，其含有，例如水、多元醇(例如甘油、丙二醇、和液体聚乙二醇)和其他相容的、适合的混合物。各种抗细菌和抗真菌试剂，例如，对羟苯甲酸酯、氯代丁醇、苯酚、抗坏血酸和硫柳汞，可以含有微生物污染。等渗试剂，例如糖类、多元醇，例如甘露醇、山梨醇，和氯化钠可以被包括入组合物中。可以延迟吸收的组合物包括试剂，例如单硬脂酸铝和明胶。

通过将在此公开的脂质泡囊以所需的数量掺入到具有所需成分的一种或组合的适合的溶剂中，继之以灭菌，来制备无菌可注射溶液。用于制备无菌可注射溶液的无菌固体的制备方法包括真空干燥和冻干，来产生在无菌溶液中含有脂质泡囊和任何希望的成分(例如，生物分子，例如ATP)的固体。

口服组合物

口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食用的载体。它们可以封装入胶囊中或压缩成片剂。对于口服治疗施用来说，活性化合物可以与赋形剂混合，以片剂、锭剂或胶囊的形式使用。口服组合物也可以使用液体载体制备来用作嗽口水，其中所述液体载体中的化合物口服地施用。可以包括药学上相容的结合试剂，和/或佐剂材料。片剂、药丸、胶囊、锭剂等等可以含有任何以下的成分，或类似性质的化合物：粘合剂，例如微晶纤维素、黄蓍树胶或明胶；赋形剂，例如淀粉或乳糖，崩解剂，例如藻酸、Primogel或玉米淀粉；润滑剂，例如硬脂酸镁或STEROTES；助流剂，例如胶体二氧化硅；甜味剂，例如蔗糖或糖精；调味剂，例如薄荷、水杨酸甲酯或橙味调味剂。

用于吸入的组合物

对于通过吸入来施用，化合物作为来自喷雾器或压缩空气容器的气溶胶喷雾被递送，所述压缩空气容器含有适合的推进剂，例如气体如二氧化碳。

穿粘膜或穿表皮的

施用可以是穿粘膜或穿表皮的。对于穿粘膜或穿表皮的施用，选择可以渗透目标屏障的渗透剂。穿粘膜渗透剂包括洗涤剂、胆汁盐和梭链孢酸衍生物。鼻喷雾或栓剂可以用于穿粘膜施用。对于穿表皮施用，活性化合物被配制成软膏剂、油膏剂、凝胶剂或乳膏剂。还可以制备栓剂(例如，具有基质例如可可脂和其他甘油酯)或保留灌肠剂用于直肠递送。

载体

在一个实施方式中，使用载体制备活性化合物，所述载体将保护所述化合物对抗身体的快速消除，例如控释制剂，包括植入物和微密封的递送系统。可以使用生物可降解的或生物相容的聚合物或例如乙烯醋酸乙烯酯、聚酐、聚羟基乙酸、胶原、聚原酸酯(polyorthoester)和聚乳酸。这些材料可以商业地获自Alza Corporation(Mountain View，California)和NOVAPharmaceuticals，Inc.(Lake Elsinore，California)，或由本领域的技术人员制备。

剂量

剂量由脂质泡囊的独特特征指示或直接取决于脂质泡囊的独特特征，剂量将随不同的脂质组合物、特定的期望治疗效果以及给药途径而变化。任何特定患者或应用的特定剂量水平和频率可以变化。应当考虑一些因素，包括(1)进行施用和允许吸收时的温度；(2)施用部位的离子环境和脂质泡囊组合物的离子强度；和(3)允许吸收的时间长度。控制这些因素帮助控制封装的物质被递送的程度，所述封装的物质包括例如ATP。

当施用脂质泡囊时，通过用脂质泡囊脂质饱和质膜，控制脂质泡囊浓度来有效地处理目标细胞，而不抑制它们的功能。取决于脂质组合物、目标细胞分散体和施用的体积，脂质泡囊的优选的浓度可以是0.5mg/ml-100mg/ml，例如0.5mg/ml、1mg/ml、5mg/ml、10mg/ml、20mg/ml、30mg/ml、40mg/ml、50mg/ml、60mg/ml、70mg/ml、80mg/ml、90mg/ml和100mg/ml。

经由静电相互作用发生的泡囊吸收显著地受到钙和/或镁浓度方面的改变的影响，在较低的程度上，受到钠和/或钾浓度方面的改变的影响。调节用于施用脂质泡囊的组合物中的这些离子浓度、或在泡囊施用之前或之后施用到目标位点的组合物中的这些离子浓度，影响剂量考虑。优选地，使用0.01nM到1mM的离子浓度，包括0.1nM、1nM、10nM、100nM、1000nM、10微摩尔/L和100微摩尔/L的离子浓度。也可以使用这些离子和其他离子的组合。

可以使用长期施用或单次给药的方式，并根据治疗的类型、施用途径和泡囊本身来选择。优选的吸收周期包括1-180分钟，例如，1、5、10、30、60、120和180分钟。为了停止吸收，除去泡囊(例如通过用缓冲液洗涤)，或者施用的泡囊的浓度是这样，从而在希望时间的终点泡囊被耗尽。吸收也可以被优化，从而泡囊的总体递送通过一次或多次施用被控制。例如，如果目标吸收周期是120分钟，可以使用两个60分钟的周期，或四个30分钟，十二个10分钟，或24个五分钟的吸收周期。

ATP-SUV的用途

由于对ATP存在普遍的细胞需求，ATP-SUV和其他SUV/ATP组合物具有跨越生物学领域的广泛的应用。

已经确定的是，当静脉内地(IV)注射时，简单的脂质泡囊一般具有非常短的循环时间(15分钟-2小时的数量级)(Oku et al.1994)。对于药物用途，为了最大的组织分布，这不是高度有益的，因为药物被网状内皮系统(RES)快速地清除。可以潜在地“屏蔽”脂质泡囊的物质，例如聚乙二醇、神经节苷脂、硫苷脂作为脂质泡囊的部分，可以产生“隐形泡囊”(Oku et al.1994)。隐形泡囊容许长得多的循环时间(超过24小时直到2-3天)。对于需要缓释的抗生素或药物，这可能是有益的。然而，在需要向组织快速递送ATP的缺血期间，这种类型的脂质泡囊就其递送特征而言是所期望的正相反的。例如，在心脏中，最长的可容忍缺血时间是约10分钟(Childs & Lower1969)，“隐形”的脂质泡囊将不足以按需要快速地提高心脏ATP水平。

在体内ATP-SUV与RES系统的相互作用已经有文献记载。当静脉内(IV)给药时ATP-SUV可以与内皮细胞和巨噬细胞非常快速地相互作用。

发明人在过去10年中的研究显示了，血管内皮是缺血-重灌注损伤中的主要“罪犯”之一。因而，有益的是在严重的缺血期间维持内皮细胞ATP水平(Ehringer et al.2000，Ehringer et al.2006(In press)，Ehringer et al.2001，Ehringer et al.2002)。降低的内皮细胞ATP水平可以引起次黄嘌呤的积累，其在重灌注时被转变成黄嘌呤和氧自由基(Albrecht et al.2003)。此外，内皮对于低流动性缺血条件也更为敏感(Eltzschig & Collard 2004)，其最终可以引起酸中毒和代谢废物副产品的积累(例如，用盐水冲洗组织可以降低重灌注损伤)。本发明人对内皮细胞、血管、复合组织、器官和有机体的研究都表明，内皮可能是ATP-SUV的摄取的重要区域。一定百分比的ATP-SUV还逃逸进入实质间隙，可以被血管系统外的细胞获得。很好的实例似乎是心脏，在其中发明人检测到在存在ATP-SUV时在缺氧之下心肌ATP的近乎加倍(与仅仅乳酸化的ringers相比较)。

RES也由免疫细胞、特别是单核细胞组成，其通过吞噬作用引起ATP-SUV在这些细胞和在内皮中的积累。RES的这些细胞中最为活性的是肝脏的Kupfer细胞(Arii & Imamura 2000)，一种对于缺氧高度敏感的非常重要的细胞。Kupfer细胞、嗜中性细胞、淋巴细胞和甚至RBC，通过多种机制主动地摄取ATP-SUV泡囊(通过融合或吞噬作用)。这维持了这些对氧化剂敏感的细胞中的ATP水平，并产生较少的重灌注副产物。

因为几个理由，ATP-SUV被选择性地靶向，用于RES的最大摄取。首先，ATP-SUV包含液体双分子层，在某些实施方式中主要由磷脂酰胆碱组成，向其中添加了不稳定泡囊形成成员，或“融合剂”。Pusieux等(1994)使用了含有PC、胆固醇和硫苷脂的泡囊，它们是隐形脂质体的主要成分，所述泡囊不具有在此公开的ATP-SUV的快速递送特征。Arkawa等人(1998)使用了各种比例的PC和胆固醇来实现更高的ATP原生质水平，向组织的ATP递送非常缓慢。实际上，同一个小组报道说，“约35％的封装的ATP在37℃在90小时后从脂质体释放”，(Arkawa et al.1998)。在两种情况中，递送给对缺血最敏感的细胞、内皮细胞和WBC的ATP的数量是最小的。在生理学的温度下，泡囊的液体特性加速了ATP-SUV从血流中到RES的清除。此外，ATP-SUV可能携带净电荷，其对于RES的细胞是可以自由接近的。这种电荷密度提高了进入RES的ATP-SUV清除和吸收。此外，泡囊的大小，在某些实施方式中为100-200nm的数量级，使得泡囊更可能被RES的细胞获取。

血液

在红细胞变得不能存活之前，血液可以在冷冻下保存约45天。红细胞一般在循环中存活约120天，之后脾脏和肝脏除去并破坏它们。因而如果不能存活的细胞被输血，它们同样地被立即从循环中除去。

向采集的血液添加ATP-SUV或其他SUV封装的ATP组合物维持红细胞更久，提高了存活保存时间以及细胞将保留在循环中且不被破坏的可能性。

脂质组合物可以被改变来优化ATP递送。例如，由于血液保存在4℃，对ATP的代谢需求将是低的。即使SUV的吸收速率在这个温度下也将被降低，该速率对于活体保存可能是过高的，获得SUV脂质组合物来更好地匹配血细胞的代谢需求。

当全部采集的血液与当前公开的主题的组合物接触地被保存时，白血球和血小板也将受益并保持存活更久。

维持切断的身体部分用于再植

在身体部分切断(通常是无意的)之后，再植的成功率很大部分取决于肢体离开它的所有者而存活的能力。缺血的时间越久，再植产生功能性的肢体或甚至任何种类的成功的可能性越低。

在一个实例中，回收的断肢的主要供养动脉被插管用于灌流。每4个小时肢体用ATP-SUV灌注，或如由于组织ATP水平的改变必要确定的。在灌流期间监视肢体的动脉血压以降低流动诱导的损伤的几率，并监视断肢的总体保存，更高的灌流压力可以表明肢体病态。在保存期之后，肢体用Ringers或其他适合的溶液洗涤来除去痕量的ATP-SUV。然后使用公知的方法外科地重新连接肢体。评估在接合之后肢体功能的外部指标(颜色、微血栓的证据、温度、脉搏、氧饱和、Doppler流量测定)来监视成功性。在再植之前和之后，应用肝素，开始抗生素疗法来降低感染的可能性。

心博停止

在低氧发作之后立即地或尽可能快地，将ATP-SUV通过静脉内或心内注射而注射到心脏中。操作SUV脂质组合物，使得ATP递送小心地与心脏组织的代谢需求匹配，最大化心脏功能。ATP-SUV可以在生理学条件下持续地灌注到心脏中，直到度过了缺血危险的时间。

递送ATP用于器官保存

器官(例如，心脏、肝脏、肺、肾脏或胰腺)从供体中移出，进入该器官的主要供养动脉被插管。使用盐水、Ringers溶液或其他适合的溶液洗出器官中的血液。ATP-SUV添加到常规的保存溶液或添加到缓冲液中，轻轻地灌注(≥80mm Hg)到器官中，其频率将取决于器官。

在动物实验组中可以使用相同的ATP-SUV。例如，使用Lagendorff心脏(或其他器官)灌注设备。主动脉被插管，心脏置于灌流室中。用已经添加ATP-SUV的充氧的灌注液灌注心脏。可以注射高浓度的钾溶液以引起心动停止。使用ATP-SUV的心麻痹可以在保存期期间使用。心脏可以被重灌注用于功能研究，或可以在缺血保存之后移植。

全身地递送ATP

为了各种原因，ATP-SUV可以被施用给有机体。例如，ATP-SUV可以用于补充体内的能量(优选的给药途径是口服地、局部地和吸入地)，或者它可以用于降低全身对氧的依赖(这种情况下优选的给药途径将是静脉内的)。当ATP-SUV通过经颈动脉的连续输注施用给动物时，心跳速度和血压降低，呼吸停止。甚至在9分钟的缺氧之后，动物可以复苏(参见实施例)。

用于伤口的ATP-SUV

由于伤口的血流减少，在伤口中和伤口周围的细胞可获得的氧较少。氧递送的降低引起ATP产生量的降低，其减慢伤口愈合必需的许多细胞事件，包括蛋白和核酸合成、离子通道功能、信号转导和运动。

如痊愈的程度或伤口的ATP消耗所需的，将ATP-SUV施加到伤口上。例如，为了向伤口的边缘细胞提供足够的ATP来加速伤口闭合，优选地可以每天1-12次地施用ATP-SUV，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12次/天。优选地，ATP-SUV被直接置于伤口上特别设计的敷涂器中，其保持水基ATP-SUV与伤口边缘细胞直接接触。做为选择，ATP-SUV可以作为乳膏剂或其他体表药物组合物局部地施用。

ATP-SUV也可以与已经可获得的痊愈组合物组合来进一步增强痊愈。例如，ATP-SUV可以与

(Ethicon，Johnson & Johnson，Somerville，New Jersey)中存在的贝卡普勒明组合到组合物中。此外，ATP-SUV可以与生长因子(例如，成纤维细胞生长因子和血管内皮生长因子)、一种或多种抗生素、含银的伤口软膏剂、和/或局部氧气疗法共同施用或组合到组合物中。与ATP-SUV一起有用的其他的伤口治疗成分包括防腐剂、抗生素、麻醉剂和皮肤移植组合物。术语“伤口治疗成分”不包括SUV。

在此使用的术语“皮肤移植组合物”是指由于例如损伤、例如灼伤，其他皮肤外伤，或甚至老化，对于皮肤组织的临时或永久替代有用的天然的和人造的材料。“天然”材料将包括来自供体组织的表皮和/或真皮组织。供体组织可以来源于接受皮肤移植组合物的患者(即，自体组织)、来源于同一物种的不同个体(即，同种异体组织)、或来源于与接受者不同物种的供体有机体(即，异种组织)。供体组织可以在移植之前被处理，例如，以降低接受者的免疫排斥的风险、或富集或耗尽某些组织成分，例如，某些细胞，包括但不限于真皮细胞(例如，成纤维细胞)和表皮细胞(例如，角质形成细胞)。在此使用的“人造的材料”包括完全合成的皮肤代替物(实例例如基于胶原的基质)以及包含活组织(实例例如成纤维细胞和/或角质形成细胞)和合成的生物材料(实例例如生物可降解的支架)的杂合组合物。特别是，人造皮肤移植组合物包括“人工皮肤”组合物，所述“人工皮肤”组合物例如包括

(Smith & Nephew，San Diego，California)和

(Integra Life LifeSciences，Plainsboro，New Jersey)，

包含人类成纤维细胞衍生的皮肤代替物，

包含用于替代真皮组织的双分子层膜系统。参见，例如，美国专利NO.4,947,840，通过引用合并在此，其公开了

皮肤替代组合物的组成和用途。在此公开的ATP-SUV可以与皮肤移植组合物共同施用以促进伤口愈合。

用于出血休克的ATP-SUV

出血休克由血液的大量损失引起，起因于内部或外部的损伤。由于血液供给是不充分的，受试者常常变为低血压者，引起器官衰竭并邻近死亡。

为了对抗出血休克的影响，ATP-SUV作为对输血的补充静脉内地注入。随着整个身体供氧改善，然后ATP-SUV可以被降低。参见实施例9，数据显示了ATP-SUV用于对抗出血性休克的影响的有效性。

用于血小板保存的ATP-SUV

血小板具有约5天的保存期，之后它们必须被丢弃。血小板功能的丧失部分地由于ATP的损失。

根据维持细胞内ATP水平的需要，将ATP-SUV给予分离的血小板。然后延长了血小板的保存期。ATP-SUV悬浮在用于血小板保存的适合的溶液中，例如盐水。可以改变SUV脂质组成来优化ATP施用。例如，由于血小板被保存在室温下(22-24℃)，ATP的代谢需求将低于生理学的温度(37℃)下。即使SUV的融合速率在这个温度下也将被降低，该速率对于活体保存可能是过高的，改变SUV脂质组成来更好地匹配血小板的代谢需求。

用于器官和组织工程化的ATP-SUV

组织现在可以以很高的效力离体生长。然而，这种组织缺乏血管系统来连接到血液供给。ATP-SUV帮助克服了这种缺点。

ATP-SUV可以用于选择性地保持来自分离的组织例如骨骼肌的血管网络。构造ATP-SUV的脂质组合物，使得ATP-SUV不容易从血管中逃逸。ATP-SUV的施用维持了血管系统，而不是死亡的实质细胞。完整的血管系统然后被播种并在合适的条件下与干细胞一起培养，所述干细胞对于分化成特定的组织是感受态的。可以照这样来血管化的离体产生的组织包括肝脏、胰腺、心脏、肺和脾脏。

做为选择，经历了体外构建的器官可以使用这种相同的方法部分地血管化，只是在器官细胞已经开始生长之后收获和处理血管系统。

手术期间的ATP-SUV

在大多数外科操作中经历血流和氧气的减少。ATP-SUV可以施用给整个身体或涉及外科操作的区域来最小化来自缺血或缺氧的任何损伤。ATP-SUV有用的手术的实例包括冠状动脉架桥术、开放心脏手术、游离皮瓣转移和某些整形手术操作。

在某些手术中，由于在操作期间脊髓没有接受足够的氧气，有时产生麻痹。这主要在主动脉瘤切除术中发生。ATP-SUV向受影响区域的应用或静脉内地施用允许外科医生有更多时间来工作，并降低缺氧诱导的损伤的可能性，并产生降低的发病。

用于中风的ATP-SUV

当前，在中风之后高葡萄糖溶液的立即施用被用于降低脑部降低的血流的影响。预计葡萄糖提高神经细胞ATP水平并降低神经细胞死亡。然而，当供氧有限时这个目标难以实现。ATP-SUV将更有效地向神经组织提供ATP。

用于呼吸问题的ATP-SUV

许多呼吸性给养降低生活质量，常常导致死亡。在这些情况中，死亡的主要原因是血液中缺乏氧气，引起组织和器官死亡。用ATP-SUV灌注受试者来减小血液含氧量降低的影响。

用于癌症患者的ATP-SUV

末期的癌症患者死于产生的并发症。由于癌或治疗已经削弱了他们，癌症患者常常死于肺炎。虚弱来自于癌细胞争夺有价值的代谢资源以及因而衰竭的健康细胞，或者非癌健康细胞在治疗期间被破坏，或这两者。癌症患者每天施用ATP-SUV来补充整个身体的ATP水平，因而降低癌细胞盗用代谢资源的影响。通过施用ATP-SUV，癌症的后遗症被降低，延长了预期寿命。

用于化学毒物的ATP-SUV

阻断线粒体ATP产生或以其他方式降低细胞ATP产生的氰化物和其他化学物质可以通过使用ATP-SUV来抵制。当浸浴在氰化物中时，ATP-SUV维持了细胞和组织生存力和功能，在没有线粒体ATP产生的情况下ATP-SUV提高了细胞质ATP。ATP-SUV可以用作氰化物和其他按照与氰化物类似的方式起作用的其他毒物的解毒剂。参见实施例10，实验数据显示了ATP-SUV用于减轻氰化物中毒的影响的有效性。ATP-SUV也可以用于降低一氧化碳中毒的影响。

用于递送蛋白、碳水化物、寡核苷酸和其他药物的生物分子-SUV

在此公开的的高度吸收性的脂质泡囊可以在存在水溶性和膜结合蛋白、碳水化物、寡核苷酸和其他药物的情况下制成，从而获得对细胞质或对细胞膜的任何上述物质的有效递送。这种药物递送的方法可以绕过许多传统的难题，(1)容许导入膜不渗透性的药物，因而大大地扩展可以使用的药物的范围，以及提高那些具有低的膜穿透速率的药物的效力；和(2)容许向细胞膜直接掺入多肽和碳水化物。这后一种益处容许，例如，绕过不确定的基因治疗方法的替代治疗。例如，如果受试者缺乏细胞上的受体，该受体可以被掺入在此公开的脂质泡囊中并适当地施用。

这些方法模拟了将ATP导入细胞的方法，只是SUV含有泡囊内的物质，和/或膜掺入的分子。

用于其他低氧情形的ATP-SUV

氧气稀少的水下潜水、空间旅行、高空和其他情形可以引起对身体的降低的氧气递送。为了补偿氧气缺乏，静脉内地、口服地或通过吸入来施用ATP-SUV。

用于肉类保存的ATP-SUV

除了它在组织和器官保存、动物和患者中的用途之外，ATP-SUV可以在缺氧的情况下保持肉类中的细胞存活。在屠宰之后，动物被放血，残余血液从尸体中流出。ATP-SUV经由颈动脉或其他大动脉注入动物中，用ATP-SUV填充血管系统。动物然后与就位的ATP-SUV装运，保持动物的细胞存活，因而延长肉类的保存期，如同ATP-SUV延长血液的保存期一样。由于ATP-SUV利用了内源的成分，肉类的口味和纹理不受影响。

用于植物的ATP-SUV

植物利用光合作用来维持生命和生长。光合作用可以分成两种反应：光反应，其从阳光收获能量并转变成化学能、ATP，乙基尼克酰胺腺嘌呤磷酸二核苷酸(NADPH)的还原形式；以及暗反应，其使用ATP和NADPH来固定CO₂。

经由根系或直接施加到叶、茎、花、分生组织或其他植物部分来向植物提供ATP-SUV。ATP-SUV向植物细胞递送暗反应所需的ATP。利用ATP-SUV的ATP递送降低了或回避了对阳光的需要，允许它们在暗处或在较少光照的条件下生长。此外，ATP-SUV提高了植物生长并维持植物寿命，这是市场的新鲜蔬菜、切花工业和水培园艺的重要方面。

用于生物反应器的ATP-SUV

生物反应器生产力的主要限制因素是，来自生物反应器的分子的初级生产者细菌和酵母必须具有足够的底物来产生ATP。因而，细菌或酵母的数量在任何一个培养中都受到限制。ATP-SUV被注入到生物反应器中来提高微生物的数量，提高生物反应器的产量。这种应用不局限于细菌和真菌，因为培养的昆虫、动物、植物和其他真核细胞对ATP产生具有相似的需求。

实施例

提供以下的实施例来说明当前公开的主题。本领域技术人员可以容易地在当前公开的主题的组合物和方法中进行无关紧要的改变。这些实施例无论如何不意味着限制当前的主题。

实施例1

脂质泡囊的构建

从1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)；1，2-二油酰基-sn-甘油基-3-乙基磷酸胆碱(DOPC-e)和1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油基-3-磷酸(POPA)脂质(都来自Avanti Polar Lipids；Alabaster，AL)构建泡囊。没有进一步纯化地使用脂质。在将脂质溶解在氯仿中并置于玻璃试管中之后，通过在稳定的氮气气流下蒸发来除去氯仿，随后抽真空过夜。干燥的脂质材料在HBSS实验缓冲液(Sigma；St.Louis，MO)中在高于它的相变温度(25℃)下重新水化30分钟。两种玻璃珠添加到缓冲液/脂质混合物中，悬浮液涡旋五分钟来产生多层泡囊。然后使用microtip Branson超声波仪450，用置入试管中的微小尖端来对乳状溶液进行超声。然后在第5级用40％负载周期对泡囊进行超声五分钟来产生单层小泡囊(SUV)。

实施例2

ATP的封装

为了展现ATP向实施例1的泡囊中的掺入，将30μCi的³H-ATP(Amersham；Arlington Heights，IL)添加到实验缓冲液中，然后制备多层泡囊。悬浮液通过Sephadex G-25(Sigma)柱(1cm×40cm)来除去未封装的ATP。在流出物的前50ml中收集泡囊。通过液体闪烁计数测量泡囊内和上清液中含有的放射性来测定封装百分比。包含DOPC、DOPC:DOPC-e(1:1)、DOPC:POPA(50:1)和DOPC:POPA(1:1)的泡囊都得到了大约相同的ATP封装百分比，在溶液中ATP的原始数量的1到2.5％之间变动。

实施例3

HUVEC的泡囊吸收率和封装的内容物向细胞质的释放

为了测定SUV的吸收速率(例如，融合速率)，用荧光探针加载SUV，体外呈现给细胞，洗涤，然后分析细胞荧光。

传代I的人脐静脉内皮细胞(HUVEC)购自BioWhitaker(Walkersville，MD)，培养直到传代8，之后不再使用它们。HUVEC在内皮细胞生长培养基(EGM；BioWhitaker)中在12孔培养皿上在EGM培养基中生长到汇合。然后用HBSS洗涤HUVEC3次。如实施例1中那样构建脂质泡囊，但是将1mM羧基荧光素加载到泡囊中。然后泡囊在37℃在湿润的CO₂孵化器中与细胞温育5、10、30、45、60、90、120或240分钟，之后从细胞洗涤泡囊，通过用胰蛋白酶柔和处理从培养皿移除细胞。使用Perkin-Elmer LS5OB发光分光光度计(Wellesly，MA)，利用495nm的激发和520nm的发射来测量HUVEC中的羧基荧光素的荧光。在某些实验中，细胞不被胰蛋白酶化，采集细胞的显微照片以展现吸收事件的均匀性。这个实验的荧光单位(FU)的范围是0到450单位。吸收速率高度取决于SUV的脂质组成。对于前30分钟，DOPC显示了很少的吸收或根本没有吸收，之后吸收速率变为对数性的，达到大约350FU。相比之下，DOPC:DOPC-e(1:1)得到快得多的初始吸收速率，和更慢的末期吸收速率(在5分钟大约35FU；在120分钟大约100FU)。使用DOPC:POPA(1:1)发现最快的吸收速率，其显示了5分钟内羧基荧光素的显著的递送。如所设计的，三种泡囊的吸收速率可以被表征为快速、中速和慢速。

解决的一个问题是泡囊是否与细胞实际地融合或仅是聚集在细胞表面上。为了检查这一点，通过荧光显微镜来检查暴露于脂质泡囊和未从培养孔移除的HUVEC的荧光分布。暴露于所有三种组合物的细胞显示了5分钟后全部细胞的弥散荧光，而不是点状的荧光，产生点状的荧光表明溶酶体隔离了泡囊，从而防止细胞接近羧基荧光素。做为选择，泡囊聚集在细胞表面上。这些结果表明，脂质泡囊融合到细胞并释放封装的内容物到细胞质内，而不是聚集在细胞表面上或被溶酶体隔离。

为了测定ATP是否如羧基荧光素一样被导入细胞，使用实施例2的含³H-ATP的泡囊进行向HUVEC中的泡囊吸收和ATP释放。泡囊与HUVEC温育5、10、15、30、45、60、90、120或240分钟。图1中显示的结果是1小时后细胞内ATP的分配系数。DOPC/POPA在这个长的时间周期得到了最大的掺合百分比，随后是DOPC/DOPC-e，然后是没有泡囊的仅3H-ATP。当反复地洗涤细胞时，细胞的放射性发生显著的变化。DOPC显示了轻微的但是显著的放射性降低；在反复洗涤之后DOPC/DOPC-e没有显示放射性的降低，而游离³H-ATP显示了放射性的完全损失，确认了游离ATP不能穿透细胞膜的观察结果。这些数据，与融合数据结合起来，表明了DOPC泡囊是细胞吞噬性的，DOPC:DOPC-e泡囊是融合的，游离ATP不进入细胞。DOPC:POPA也不能被洗去，表明它们也与细胞融合并将封装的内容物递送到细胞质中。

实施例4

内皮的高分子透过性

与直接向细胞递送分子相比，当前公开的主题的泡囊通过循环系统体内递送封装的分子的任何用途需要所述泡囊和/或分子必须穿透血管内皮。血管内皮构成了屏障，但是细胞与细胞间的屏障可以被跨越，例如，当白细胞离开循环并进入细胞间隙时。为了解决这个问题，测量了当前主题的脂质泡囊对内皮透过性的影响。

HUVEC在EGM中在多微孔过滤器(0.8μm)上生长到汇合。细胞被置于特殊的室中，其容许测量跨越内皮单层的蛋白质流量。用于检查脂质泡囊对内皮透过性的影响的示踪物是FITC-白蛋白(1mg/ml)。FITC-白蛋白和脂质泡囊在零时间添加给内皮细胞。每5分钟，收集500μl上清液样品，然后使用Perkin-Elmer LS5OB发光分光光度计分析荧光。DOPC泡囊对透过性没有影响，然而在存在DOPC/DOPC-e的情况下HUVEC透过性提高，表明这些泡囊在邻近的内皮细胞之间创建了小的缺口。

实施例5

对ATP的代谢需求

作为测定需要的最佳速率的实例，测定了大鼠肝细胞对ATP的代谢需求。分离完整的大鼠肝脏，植入分离缓冲液(0.25M蔗糖、0.04M Tris、pH值7.2)中，用无菌剪刀切碎，小心地修整结缔组织的碎片。然后肝脏通过#_60不锈钢金属网筛，在冰上收集细胞流出物。在4℃离心悬浮液5分钟来团化细胞。丢弃上清液，细胞重新悬浮在充氧缓冲液(200mM蔗糖、70mMKCL、5mM马来酸盐和40mM Tris，pH7.3)中。五毫升的充氧缓冲液置于Yellow Springs Instruments测氧计(Yellow Springs，Ohio)中，并容许平衡到37℃。50μl的细胞提取物置于室中，达到2-3mg/ml的最终蛋白质浓度。然后监视基线氧消耗达1分钟，之后100mM ADP添加到细胞中，测量状态2的呼吸作用。然后，添加5mM谷氨酸盐，测量状态3的呼吸作用。通过测量添加的ADP的数量和消耗的氧的数量来测定ADP/O₂比例。因而状态3的呼吸作用是基于每毫克组织，在每分钟内被细胞消耗的ATP的量的量度。

实施例6

ATP-SUV加速伤口痊愈

在裸鼠上在颅骨顶部区域的皮肤上产生浅表创伤(大约80mm²圆形)。然后每天两次将ATP-SUV施加到伤口，为伤口的边缘细胞提供ATP。ATP-SUV直接置于伤口上特别设计的敷涂器中，其保持水基ATP-SUV与伤口直接接触。

如图2所示，与用对照物质处理的伤口相比，用ATP-SUV处理的伤口更快地痊愈。对于ATP-SUV处理的伤口，相对于痊愈时间标绘的伤口面积的曲线表现对数性的曲线，而对照显示了更为线性的痊愈速度。在第4天，在ATP-SUV处理(≈30mm²；低于原始伤口面积的一半)和对照处理(≈60mm²)之间观察到大约30mm²的差异；而在第10天，在ATP-SUV处理的伤口中伤口面积实际上消失，但对照处理的伤口没有消失(≈25mm²)。定性地，ATP-SUV处理第4天的伤口情况相似于对照中第10天的伤口情况；而第10天的伤口情况类似于对照的第17天的伤口情况。用ATP-SUV处理的伤口到第17天伤口痊愈，而对照在这一天还没有完全痊愈。

实施例7

肢体重连接

从大鼠上切断后腿，切断的肢体的主要供养动脉被插管用于ATP-SUV(1mM ATP)溶液的输注。每3个小时、或如认为组织ATP水平的改变所必需的，肢体用ATP-SUV或对照溶液(参见表1)灌注。在输注期间监视肢体的动脉血压以降低流动诱导的损伤的几率，并监视断肢的总体保存(高的输注压力可以表明肢体病态)。在保存期之后，肢体用Ringers溶液洗涤来除去痕量的ATP-SUV。然后外科地重新连接肢体，评估在接合之后肢体功能的外部指标(肢体颜色、微血栓的证据、凝胶、肢体温度)。在再植之前和之后动物接受肝素来防止凝血。此外，动物进行抗生素疗法来降低感染。对照肢体用仅媒介物、仅媒介物和ATP、或仅媒介物和SUV来灌注。

在再植后21小时，ATP-SUV处理的肢体展现了健康的粉色，并具有重新获得的生理学温度。在超过150天之后，接受ATP-SUV处理的断肢的那些动物运用这些肢体就好像肢体从未被切断一样。仅有的性质上的副作用是趾部的卷曲，最可能是由于缺乏物理治疗所致，物理治疗将很可能矫正这种微小的缺陷。然而，在对照中，肢体是暗色的，触摸时是冷的，展现了坏死的病征。在保存之后后肢的组织学检查表明ATP-SUV组维持了内皮细胞和肌细胞生存力。所有的对照具有非存活的内皮和肌肉。这些结果的概述在表1中示出。定性结果在图3中示出。

表1

肢体再植研究的结果的概述

组	肢体结局	n
组	肢体结局	n	仅仅媒介物	坏死	2

仅仅媒介物和1mMATP	坏死	2
仅仅媒介物和1mMATP	坏死	2	仅仅媒介物和SUV	坏死	2
媒介物和ATP-SUV	存活	5	仅仅媒介物和SUV	坏死	2

实施例8

ATP-SUV保护分离的心脏免于缺氧

从大鼠移除的心脏使用Lagendorff心脏灌流设备来监视。心脏被插管并置于特别设计的室中，其灌注心脏并容许注射ATP-SUV。循环到心脏的充氧的灌注液被停止，ATP-SUV注射到心脏中。然后通过注射高钾溶液使心脏置于心博停止。在无流动条件下在37℃在心脏中保持ATP-SUV 120分钟。然后心脏用充氧的灌注溶液冲洗，监视心脏的性能。与对照相比，ATP-SUV处理的心脏恢复了心脏功能。

实施例9

ATP-SUV提高了出血性休克之后的存活率

使用戊巴比妥麻痹Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。颈动脉被插管，插入压力传感器用于测量血压和心率。股动脉被插管用于放血。在30分钟的稳定期之后，以1cc/分钟的速率从动物中抽出血液，直到33％的动物总血液供给被除去。动物保持在这种降低的血液体积中60分钟的时间。在60分钟时间的末期，将乳酸化的ringers盐水(传统的晶体复苏)或ATP-SUV腹膜内(IP)地给予动物。监视存活时间、血压和心率，持续另外的120分钟。在实验的末期，动物被安乐死，移除血液的样品用于pCO₂、乳酸的分析和高能磷酸的测量。当与盐水处理的对照动物相比时，ATP-SUV处理的动物显示了跨越所有时间点的提高的存活率，如图7中显示的数据所指示的。此外，ATP-SUV组具有显著更低的pCO₂、乳酸，并具有血液和组织高能磷酸水平的显著提高。

实施例10

在化学诱导的缺氧之后ATP-SUV提高存活率

使用戊巴比妥麻痹Sprague-Dawley大鼠(200-250g)。颈动脉被插管，插入压力传感器用于测量血压和心率。股动脉被插管用于施用氰化钾(KCN)(2.5mM)。在30分钟的稳定期之后，IP地给予动物ATP-SUV(在图8中标记为“Vitasol”)或乳酸化的ringer’s盐水。五分钟之后，经由股动脉注射大量(bolus)KCN药剂。在4小时时间内测量存活时间、血压和心率。图8中显示的结果显示与对照动物相比施用ATP-SUV的动物的存活率提高。

实施例11

血液保存的改进(预测实施例)

为了确定含有ATP的泡囊是否能够保存血液以及添加糖酵解中间物磷酸烯醇丙酮酸(PEP)和果糖-1，6-二磷酸(FDP)是否能够进一步改善生存力，进行了以下的实验。仅使用DOPC构建泡囊，遵照实施例2的方法。血液将根据标准方法收集到含有标准的葡萄糖-柠檬酸-腺嘌呤-磷酸混合物(Baxter；Deerfield，Illinois)的袋中。对于每组实验，一个单位的血液被分成相等的等分量，无菌地转移到不含有其他添加剂(对照)的聚乙烯袋中。测试物质将添加到其他等分量中，如下：

·对照，没有添加剂

·对照，含有PEP、FDP和核糖的泡囊

·ATP-SUV。

在30、45、60和90天，收回等分量，根据以下参数评估红细胞的状况：ATP含量、血细胞比容、血红蛋白和细胞生存力(使用锥虫蓝(Sigma)排阻或LIVE/DEAD试剂盒(Molecular Products；Eugene，Oregon)。预期的结果：在存在含ATP的泡囊的情况下保持的细胞将处于相比对照更好的状态；也就是说，ATP含量将更高，pH将降低更少(表明更少的糖酵解)，红细胞将保持功能性红细胞典型的双面凹的形状。

参考文献

以下列出的参考文献和在说明书中引用的所有参考文献通过引用合并在此，达到它们补充、说明、提供背景或教导方法、技术和/或在此采用的组合物的程度。本申请中引用的所有引证的专利和公开物通过引用明确地合并在此。

Alberts B，Johnson MA，Lewis J，Raff M，Roberts K，Walter P，(2002)Molecular Biology of the Cell.Garland Science，New York.

Ainscow，E.K.，and Brand，M.D.(1999)Top-down control analysis of ATPturnover，glycolysis and oxidative phosphorylation in rat hepatocytes.Eur.J.Biochem.263：671-685.

Albrecht EW.Stegeman CA.Heeringa P.Henning RH.van Goor H.(2003)Protective role of endothelial nitric oxide synthase.Journal of Pathology.199(1)：8-17.

Arakawa A，Ishiguro S，Ohki K，Tamai M.(1998)Preparation ofliposome-encapsulating adenosine triphosphate.Tohoku J Exp Med 184：39-47.

Arii S.Imamura M.(2000)Physiological role of sinusoidal endothelialcells and Kupffer cells and their implication in the pathogenesis ofliver injury.Journal of Hepato-Biliary-Pancreatic Surgery.7(1)：40-8.

Brand，M.D.(1995).Measurement of mitochondrial proton motive force.In Bioenergetics，a Practical Approach/Brown，G.C.，and Cooper，C.E.，eds.Oxford University Press，Oxford.39-62.

Childs JW，Lower RR.(1969)Preservation of the heart.Prog CardiovascDis.12：149-163.

Ehringer W，Niu W，Chiang B et al.(2000)Membrane permeability offructose-1，6-diphosphate in lipid vesicles and endothelial cells.Mol Cell Biochem210：35-45.

Ehringer WD，Chiang B，Chien S.(2001)The uptake and metabolism offructose-1，6-diphosphate in rat cardiomyocytes.Mol Cell Biochem.；221：33-40.

Ehringer WD，Su S，Chiang B et al.(2002)Destabilizing effects offructose-1，6-bisphosphate on membrane bilayers.Lipids；37：885-892.

Eltzschig HK.Collard CD.(2004)Vascular ischaemia and reperfusioninjury.British Medical Bulletin.70：71-86.

J ahn R，Sudhof TC.(1999)Membrane fusion and exocytosis.Annu RevBiochem 68：863-911.

Oku N.Namba Y.(1994)Long-circulating liposomes.Critical Reviews inTherapeutic Drug Carrier Systems 11(4)：231-70.

Puisieux F，Fattal E，Lahiani M，Auger J，Jouannet P，CouvreurP，Delattre J.(1994)Liposomes，an interesting tool to deliver a bioenergetic substrate(ATP).in vitro and in vivo studies.J Drug Target 2：443-448.

Remington：the science and practice of pharmacy(2000)Alfonso R.Gennaro，chairman of the editorial board and editor.Edition：20th ed.LippincottWilliams & Wilkins，Baltimore，Md.

要理解的是，当前公开的主题的各种细节可以改变而不背离当前的主题的范围。此外，上述的描述仅是为了说明的目的，而不是为了限制的目的。

Claims

1.一种泡囊，包含：

(a)是稳定泡囊形成者的磷脂；和

(b)至少一种不稳定泡囊形成成员，其中所述不稳定泡囊形成成员选自不是稳定泡囊形成者的极性脂质、PEG、筏形成者和融合蛋白。

2.权利要求1的泡囊，其中是稳定泡囊形成者的磷脂或不是稳定泡囊形成者的极性脂质具有式(I)的结构：

X-L-(Z)₂　　　　　　　(I)，

其中X是H、A，或具有式(II)的结构

B是阳离子或烷基基团；

A是H或烷基基团；

L是进一步缺少两个氢原子的烷基；和

每个Z独立地是H、E或式(XI)的结构，

其中E是烷基或烯基，且当一个Z是H时，另一个Z不是H。

3.权利要求2的泡囊，其中

A是H，或具有选自式(III)、(IV)、(V)、(VI)和(VII)的结构

其中n是0到4的整数；

L具有选自式(VIII)、(IX)或(X)的结构

　和

E是选自异支链脂肪酸、反异支链脂肪酸、15-甲基脂肪酸、反式-不饱和的或顺式-不饱和脂肪酸、a-羟基脂肪酸、b-羟基脂肪酸、a-羟基-b-甲基脂肪酸、a，b-二羟基脂肪酸、环己基脂肪酸、(Z，Z)-不饱和脂肪酸、a-羟基-(bE)-烯和2-己基环丙烷癸酸的细菌脂肪酸，或E具有选自(XII)、(XIII)、(XIV)、(XV)、(XVI)、(XVII)、(XVIII)、(XIX)、(XX)、(XXI)和(XXII)的结构

4.权利要求1的泡囊，其中是稳定泡囊形成者的所述磷脂是磷脂酰胆碱。

5.权利要求4的泡囊，其中所述磷脂酰胆碱是大豆磷脂酰胆碱、卵磷脂酰胆碱、大肠杆菌提取物磷脂酰胆碱、1，2-二油酰-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DOPC)、1-棕榈酰基-2-二十二碳六烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(PDPC)、二肉豆蔻酰基磷脂酰胆碱(DMPC)、二棕榈酰基磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰基磷脂酰胆碱(DSPC)或其混合物。

6.权利要求1的泡囊，其中所述不稳定泡囊形成成员是具有选自式(XXIV)、(XXV)、(XXVI)、(XXVII)、(XXIX)、(XXXI)、(XXXII)、(XXXIII)和(XXXIV)的结构的不稳定泡囊形成极性脂质：

7.权利要求1的泡囊，其中所述不稳定泡囊形成成员是具有约20到约8000个重复单元的分子量的PEG。

8.权利要求7的泡囊，其中所述PEG具有约3000到约4000个重复单元的分子量。

9.权利要求8的泡囊，其中所述PEG具有约3350个重复单元的分子量。

10.权利要求1的泡囊，其中所述不稳定泡囊形成成员是选自胆固醇和鞘磷脂的筏形成者。

11.权利要求1的泡囊，其中所述不稳定泡囊形成成员是选自受精素、可溶的N-乙基马来酰亚胺敏感因子附着蛋白受体(SNARE)、secl/munc18(SM)多肽、病毒包膜融合蛋白和膜联蛋白的融合蛋白。

12.权利要求1的泡囊，其中所述泡囊进一步包含生物分子。

13.权利要求12的泡囊，其中所述生物分子是脂质可溶的生物分子。

14.权利要求13的泡囊，其中所述脂质可溶的生物分子选自a-生育酚(维生素E)、视黄醇(维生素A)、phyllochinon(维生素K)、麦角钙化醇(维生素D)、胆固醇、胆固醇酯、类固醇、藿烷类、洗涤剂、脂肪酸、细菌支链脂肪酸、类异戊二烯化合物、长链醇、脂质可溶的麻醉剂、神经节苷脂、脂多糖、生物素标记的磷脂、膜离子电导通道、转运蛋白、葡萄糖转运蛋白、粘附蛋白、间隙连接蛋白、联会接点蛋白、半胱氨酸蛋白酶、粘着蛋白、G-蛋白、MHC蛋白、补体蛋白、脂质可溶的病毒蛋白、细胞受体、脂质可溶的荧光探针分子和脂质可溶的放射性示踪分子。

15.权利要求12的泡囊，其中所述生物分子是水溶性的生物分子。

16.权利要求15的泡囊，其中所述水溶性的生物分子选自氨基酸、多肽、蛋白质、单糖、二糖、多糖、核苷酸、多核苷酸、水溶性维生素、矿物质、高能磷酸、糖酵解中间物、氧化中间物、烟酰胺二核苷酸(NAD+/NADH)、黄素腺嘌呤二核苷酸(FAD+/FADH2)、水溶性细胞酶、胰岛素、水溶性荧光探针分子、水溶性放射性示踪分子和水溶性药物。

17.权利要求16的泡囊，其中所述高能磷酸选自ATP、ADP、AMP、腺苷、CTP、CDP、CMP、胞嘧啶、UTP、UDP、UMP、尿嘧啶、GTP、GDP、GMP、鸟嘌呤核苷、TTP、TDP、TMP、胸腺嘧啶、ITP、IDP、IMP、次黄苷和磷酸肌酸。

18.权利要求17的泡囊，其中所述高能磷酸生物分子是ATP。

19.权利要求18的泡囊，其中所述ATP是Mg-ATP。

20.权利要求18的泡囊，其中所述ATP以约1M或更低的浓度存在。

21.权利要求20的泡囊，其中所述ATP以约0.001mM到约200mM的浓度存在。

22.权利要求21的泡囊，其中所述ATP以约1mM到约50mM的浓度存在。

23.权利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有至少1个泡囊吸收/秒/细胞的吸收速率。

24.权利要求23的泡囊，其中所述泡囊具有至少10³个泡囊吸收/秒/细胞的吸收速率。

25.权利要求24的泡囊，其中所述泡囊具有至少10⁶个泡囊吸收/秒/细胞的吸收速率。

26.权利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有1:9到100,000:1的稳定泡囊形成成员比不稳定泡囊形成成员的比例。

27.权利要求26的泡囊，其中所述泡囊具有1:1到1,000:1的稳定泡囊形成成员比不稳定泡囊形成成员的比例。

28.权利要求1的泡囊，其中所述泡囊是单层泡囊。

29.权利要求1的泡囊，其中所述泡囊具有约20nm到约600nm的水动力学半径。

30.权利要求29的泡囊，其中所述泡囊具有约100nm到约300nm的水动力学半径。

31.一种泡囊，包含：

生物分子；

大豆磷脂酰胆碱；和

DOTAP。

32.权利要求31的泡囊，其中所述生物分子是ATP。

33.权利要求32的泡囊，其中所述ATP以约0.01mM到约200mM的浓度存在。

34.权利要求31的泡囊，其中所述泡囊具有50:1的大豆磷脂酰胆碱比DOTAP的比例。

35.权利要求31的泡囊，其中所述泡囊具有约100nm到约300nm的水动力学半径。

36.一种泡囊，包含：

生物分子；

DOPC；和

DOTAP。

37.权利要求36的泡囊，其中所述生物分子是ATP。

38.权利要求37的泡囊，其中所述ATP以约0.01mM到约200mM的浓度存在。

39.权利要求36的泡囊，其中所述泡囊具有50:1的DOPC比DOTAP的比例。

40.权利要求36的泡囊，其中所述泡囊具有约100nm到约300nm的水动力学半径。

41.一种向细胞递送生物分子的方法，包括用权利要求12的泡囊接触所述细胞。

42.权利要求41的方法，其中所述生物分子是ATP。

43.权利要求42的方法，其中递送给所述细胞的ATP的数量足以满足细胞的代谢需求。

44.一种处理伤口的方法，所述方法包括用包含权利要求12的泡囊的组合物接触所述伤口。

45.权利要求44的方法，其中所述组合物进一步包括贝卡普勒明、成纤维细胞生长因子、血管内皮生长因子、抗生素、含银组合物、皮肤移植组合物或其组合。

46.权利要求44的方法，所述方法进一步包括用皮肤移植组合物和包含权利要求12的泡囊的组合物接触所述伤口。

47.一种保存组织的方法，包括用权利要求12的泡囊接触组织。

48.一种提高具有至少一个细胞的生物反应器的生产率的方法，包括用权利要求12的泡囊接触所述细胞。