KR20180018524A - 아커만시아의 배양 방법 - Google Patents
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Abstract
아커만시아 뮤시니필라의 비용-효과적이고 효율적인 배양 방법을 기재한다. 높은 바이오매스 수율을 합성 배지상에서 획득할 수 있다. 상기는 인간에, 예를 들어 약제 또는 식품 용도에 사용하기에 적합한 에이 뮤시니필라의 대규모 생산을 허용한다. 상기 에이 뮤시니필라를 동물-유래된 생성물 없이 생성시킬 수 있으며, 이에 의해 광범위한 용도가 허용될 수 있다.
Description
본 발명은 세균, 특히 아커만시아(Akkermansia) 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 종 세균의 배양 분야이다.
아커만시아 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라 종의 세균은 대사 질환, 예를 들어 비만 관련 질환의 예방 및/또는 치료에 중요한 역할을 하는 것으로 생각된다(WO2014/075745; WO2014/077246). 대조용 식이 또는 고지방(HF) 식이가 공급된 마우스에게 에이 뮤시니필라의 경구 투여는 식이-유발된 대사성 내독소혈증, 비만증 및 지방 조직 CD11c 마커를 음식물 섭취의 어떠한 변화도 없이 정상화하는 것으로 밝혀졌다(WO2014/075745). 더욱이, 에이 뮤시니필라 치료는 체중을 감소시켰고 체 조성(즉 지방/제지방 비)을 개선시켰다. HF-식이하에서, 에이 뮤시니필라 치료는 지방세포 분화 마커의 mRNA 발현 및 지질 산화를, 지방형성에 영향을 미치지 않으면서 증가시키는 것으로 밝혀졌다. 또한, 에이 뮤시니필라에 의한 콜로니화는 식이-유발된 공복 고혈당증을 완전히 역전시키며 치료 후 인슐린-내성 지수를 유사하게 감소시키는 것으로 밝혀졌다. 최종적으로, 에이 뮤시니필라는 장내 방어벽 기능을 증가시키는 것으로 밝혀졌다(J Reunanen et al. 2015, Appl Environ Microbiol. 81:3655-62). 이와 같이, 식품 또는 약학 용도에서 아커만시아 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라 종 세균의 사용이 제안되었다. 그 자체로서, 아커만시아의 높은 바이오매스 수율이 요구된다.
데리앙(Derrien) 등(2004, Int. J. Syst. Evol. Microbiol. 54: 1469-76)은 에이 뮤시니필라 균주 MucT를 단리할 수 있고 유일한 탄소 및 질소원으로서 돼지 위 뮤신을 함유하는 기본 혐기성 배지상에서 증식시킬 수 있음을 교시한다. 상기 저자들은 또한 에이 뮤시니필라를 풍부 배지, 예를 들어 콜럼비아 브로쓰(CB) 및 뇌심장침출액(BHI) 브로쓰상에서, 그러나 상기 뮤신 배지에 의해 획득될 수 있는 최종 광학 밀도의 절반인 최종 광학 밀도로 증식시킬 수 있음을 교시한다. 지금까지 공지된 아커만시아의 배양에 적합한 모든 배지는 동물 성분을 함유한다. BHI는 동물 조직으로부터 유래하고, CB는 소 카제인, 동물 조직 및 심장 근육의 효소적 절단물을 함유한다. 에이 뮤시니필라는, 풍부한 윌킨스 샬그렌(Wilkens-Chalgren) 브로쓰(WCB)(Derrien et al., 2004)상에서 증식이 관찰되지 않았다는 관찰에 의해 예시되는 바와 같이, 쉽게 배양되지 않는다. WCB는 혐기성 세균을 증식시키도록 특별히 설계되며 다른 효소적 절단물 중에서도 소 카제인 및 동물 젤라틴을 함유한다.
더욱이, 에이 뮤시니필라는 하기 화합물들(달리 서술되지 않는 한 각각 10 mM) 글루코스, 셀로비오스, 락토스, 갈락토스, 자일로스, 퓨코스, 람노스, 말토스, 숙시네이트, 아세테이트, 퓨마레이트, 부티레이트, 락테이트, 카시톤(0.5%), 카사미노산(0.5%), 트립톤(0.5%), 펩톤(0.5%), 효모 추출물(0.5%), 프롤린, 글리신, 아스파테이트, 세린, 쓰레오닌, 글루타메이트, 알라닌, N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민 중 하나를 갖는 기본 염 배지상에서 증식할 수 없는 것으로 기재되었다(Derrien et al., 2004).
그러나, 단지 2 g/l(0.2%)의 각각의 펩톤, 효모 추출물, 트립톤 및 카시톤만이 상기 기본 배지에 첨가된 경우, 당 N-아세틸글루코스아민, N-아세틸갈락토스아민 또는 글루코스(각각 10 mM) 중 어느 하나는 증식을 지지하지만 그 증식은 뮤신 배지상의 경우의 1/4 미만이었다(Derrien et al., 2004).
최근의 연구에서, 최초 기재 후 10년째에 에이 뮤시니필라가 10 g/l 카시톤(1%와 같음), 5 mM 글루코스 및 5 mM 퓨코스 및 1 mM 쓰레오닌을 갖는 기본 배지에서 증식됨을 공개하였다(Lukovac et al., 2014, MBio. 12;5(4). pii: e01438-14. (doi: 10.1128/mBio.01438-14)). 또한 여기에서 상기 증식 수율은 낮으며 에이 뮤시니필라를 점액-함유 배지상에서 증식시키는 경우 획득된 경우보다 대략 4x 더 낮았다. 더욱이, 상기 배지는 우유 단백질 카제인의 단백질 분해산물인, 따라서 동물 기원인 카시톤을 고농도로 함유하였다. 최종적으로, 상기 배지는 저렴한 글루코스 당을 함유했을 뿐만 아니라, 주로 동물 유래된 생성물 중에서 발견되고 글루코스보다 100 배 이상 더 비싼 당인 퓨코스를 함유하였다.
따라서, 에이 뮤시니필라는 쉽게 배양될 수 없으며 지금까지 기재된 모든 배지 및 생육 조건은 동물-유래된 화합물의 사용을 포함함이 자명하다. 동물-유래된 생성물은 바이러스, 프리온 또는 세균 기원의 오염물질을 함유하거나 또는 알레르겐, 항원 펩티드 또는 다른 바람직하지 못한 생성물을 함유할 수 있거나, 또는 달리, 예를 들어 상기는 비-코셔 또는 비-하랄 기원을 갖기 때문에, 인간에서 식품 또는 약제 용도를 위해 아커만시아를 배양하기에 부적합한 것으로 간주될 수도 있다. 지금까지, 점액-함유 배지가 가장 많은 양의 바이오매스를 제공하는 것으로 밝혀졌다. 점액은 오직 동물에서만 발견되므로, 에이 뮤시니필라를 증식시키는데 한계가 있고 현재의 과학 및 특허 문헌에 암시되는 바와 같이 인간 또는 동물 건강의 개선을 목적으로 하는 상기 세균의 적용은 도전이다. 더욱이, 균주 MucT 이외의 에이 뮤시니필라의 단리물은 기재되지 않았다. 에이 뮤시니필라의 증식 및 단리는 에이 뮤시니필라의 순수한 배양물이 아닌 오직 농축이 획득된 경우의 연구에서 예시된 바와 같이, 최근에 상당한 노력에도 불구하고(Caputo et al 2015, Biol Direct 10: 5 (doi:10.1186/s13062-015-0041-1)) 도전적인 것으로 밝혀졌으며, 이는 그의 증식이 큰 애로임을 암시한다.
본 발명의 목적은 아커만시아 속의 세균을 높은 최종 광학 밀도(높은 바이오매스 수율)로 배양하는데 사용될 수 있고/있거나 상기 아커만시아 속 세균의 배양에 대해 현재 공지된 조성물에 비해 복잡성이 감소된, 및 바람직하게는 동물 유래된 생성물이 없는 조성물을 제공하는 것이다. 상기와 같은 배양 배지는 인간에 사용하기에, 예를 들어 식품, 사료 또는 약학 용도에 사용하기에 적합한 아커만시아의 대규모 생산을 허용할 것이다.
본 발명은 아커만시아 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라 종의 세균을 배양하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 모노사카라이드, 모노사카라이드의 질소-함유 유도체, 및 아미노산 공급원을 포함하는 조성물을 제공하고; 상기 조성물에 상기 아커만시아 속의 세균을 접종하고; 상기 아커만시아 속 세균을 증식시키는 단계들을 포함한다.
모노사카라이드의 질소-함유 유도체를 N-아세틸-글루코스아민(Glc-NAc) 및 N-아세틸-갈락토스아민(Gal-Nac) 중에서 선택할 수 있다. 상기는 바람직하게는 Glc-NAc이다. 상기 Glc-NAc는 약 0.001 mM 내지 약 1 M, 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 양으로 존재할 수 있다.
상기 모노사카라이드는 바람직하게는 글루코스이다. 상기 글루코스는 약 0.001 M 내지 약 1 M, 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 양으로 존재할 수 있다.
상기 조성물은 쓰레오닌을, 예를 들어 약 0.01 mM 내지 약 100 mM 범위의 양으로 추가로 포함할 수 있다.
상기 조성물 중의 아미노산 공급원은 식물계 아미노산 공급원, 미생물계 아미노산 공급원, 또는 알라닌, 글루타메이트, 프롤린 및 세린의 조합 중에서 선택될 수 있다. 적합한 실시태양에서, 상기 아미노산 공급원은 식물 단백질 가수분해산물, 예를 들어 대두 단백질 가수분해산물, 완두콩 단백질 가수분해산물, 밀 단백질 가수분해산물, 쌀 단백질 가수분해산물, 목화 단백질 가수분해산물 등이다.
상기 식물 단백질 가수분해산물은 약 0.01 g/l 내지 약 1 ㎏/l, 예를 들어 약 0.05 내지 약 500 g/l, 약 0.1 내지 약 250 g/l, 약 0.5 내지 약 150 g/l, 약 1 내지 약 100 g/l, 또는 약 2 내지 약 80 g/l 범위의 양으로 존재할 수 있다.
본 발명자들은 아커만시아 뮤시니필라를 글루코스, N-아세틸-글루코스아민 및 아미노산 공급원을 포함하는 조성물에서 매우 높은 광학 밀도로 배양할 수 있음을 발견하였다. 상기 아미노산 공급원은 이상적으로는 완전히 식물 또는 미생물계일 수 있다.
따라서, 본 명세는 또한, 모노사카라이드, 모노사카라이드의 질소-함유 유도체, 및 아미노산 공급원을 포함하는, 세균, 특히 아커만시아 속, 구체적으로 아커만시아 뮤시니필라를 배양하기 위한 조성물에 관한 것이다.
상기 모노사카라이드는 임의의 모노사카라이드, 특히 세균을 비용-효과적으로 배양하는데 통상적으로 사용되는 것일 수 있으며, 바람직하게는 글루코스이다.
상기 모노사카라이드의 질소-함유 유도체를 N-아세틸-글루코스아민(Glc-NAc) 및 N-아세틸-갈락토스아민(Gal-Nac) 중에서 선택할 수 있으며, 상기는 바람직하게는 N-아세틸-글루코스아민이다.
상기 조성물은 상기 모노사카라이드, 예를 들어 글루코스를 약 0.001 mM 내지 약 1 M, 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 포함할 수 있다.
상기 조성물은 상기 모노사카라이드의 질소-함유 유도체, 예를 들어 Glc-NAc를 약 0.001 M 내지 약 1 M, 예를 들어 약 0.1 mM 내지 약 500 mM, 약 0.5 mM 내지 약 100 mM, 약 1 mM 내지 약 75 mM, 또는 약 5 mM 내지 약 50 mM 범위의 농도로 포함할 수 있다.
본 명세의 조성물은 동물 유래된 생성물이 없을 수도 있다.
상기 아미노산 공급원은 숙련가에게 공지된 임의의 아미노산 공급원일 수 있으며, 비제한적으로 동물로부터 유래된, 식물로부터 유래된, 또는 미생물로부터 유래된 아미노산 공급원을 포함한다. 상기 아미노산 공급원은 예를 들어 단백질 가수분해산물, 예를 들어 식물-유래된 단백질 가수분해산물일 수 있다. 단백질 가수분해산물은 (부분) 가수분해를 사용하여 단백질 공급원으로부터 제조되며 전형적으로는 펩티드, 아미노산, 탄수화물 및 지질의 혼합물, 및 막연한 생물 활성을 갖는 다수의 미확인 성분으로 구성된다. 상기는 종종 다양한 공급원, 예를 들어 비제한적으로 식물 공급원, 예를 들어 대두, 밀, 완두콩, 병아리콩 또는 목화로부터 주어진 원료물질의 효소적, 알칼리 또는 산성 절단에 의해 생성된다.
상기 아미노산 공급원은 상업적인 아미노산 공급원, 예를 들어 효모 추출물, 예를 들어 한외여과된 하이페프(HyPep)(상표) YE 또는 울트라페프(UltraPep)(상표) YE, 또는 하이-예스트(Hy-Yest)(상표); 낙농 가수분해산물, 예를 들어 카제인, 락트알부민 및 우유 고체 가수분해산물로부터 유래된 상기 가수분해산물, 예를 들어 아미카제(Amicase)(상표), 하이-카제(Hy-Case)(상표) 아미노, 하이-카제(상표) SF, N-Z-아민(Amine)(상표) A, N-Z-아민(상표) AS, N-Z-아민(상표) EKC, N-Z-카제(Case)(상표) 플러스(Plus), N-Z-카제(상표) TT, 에다민(Edamin) F, 또는 트립톤(Tryptone)(프로테아제 트립신에 의한 카제인의 절단에 의해 형성된 펩티드의 분류); 식물 단백질 가수분해산물, 예를 들어 하이펩 1510(상표)(대두의 효소적 가수분해산물), 하이펩 1511(상표)(대두의 한외여과된 효소적 절단물), 하이펩 1512(상표)(대두의 효소적 절단물), 하이펩 4601N(상표)(밀 글루텐의 한외여과된 효소적 절단물), 하이펩 5603(상표)(쌀 단백질 및 밀 글루텐의 한외여과된 효소적 절단물), 하이펩7504(상표)(목화 단백질의 한외여과된 효소적 절단물), 울트라펩 코튼(UltraPep Cotton)(상표), 아미소이(Amisoy)(대두 단리물의 산 절단물, 아미노산 및 작은 펩티드의 믹스(트립토판은 없다)를 생성시킴), 피톤(Phytone) 또는 소이톤 펩톤(Soytone Peptone)(디프코(Difco)(상표) 및 BBL 브랜드 펩톤) 또는 울트라펩 소이(UltraPep Soy)(상표)를 포함할 수 있다. 상기 아미노산 공급원은 또한 개별적인 아미노산 또는 개별적인 아미노산들의 조합을 포함하는 아미노산 조성물일 수 있다. 적합한 실시태양에서, 상기 아미노산 공급원은 식물계 아미노산 공급원이다.
상기 아미노산 공급원은 본 발명의 조성물 중에 약 0.01 g/l 내지 약 1 ㎏/l, 예를 들어 약 0.05 내지 약 500 g/l, 약 0.1 내지 약 250 g/l, 약 0.5 내지 약 150 g/l, 약 1 내지 약 100 g/l, 또는 약 2 내지 약 80 g/l 범위의 양으로 포함될 수 있다. 예를 들어, 하이소이 또는 아미소이는 본 명세서에 교시된 조성물 중에 약 0.01 g/l 내지 약 1 ㎏/l, 예를 들어 약 0.05 내지 약 500 g/l, 약 0.1 내지 약 250 g/l, 약 0.5 내지 약 150 g/l, 약 1 내지 약 100 g/l, 또는 약 2 내지 약 80 g/l 범위의 양으로 혼입될 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 조성물은 쓰레오닌을, 예를 들어 약 0.01 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 50 mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25 mM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mM, 예를 들어 약 1 내지 약 8 mM의 양으로 포함한다. 상기 쓰레오닌은 L-쓰레오닌 또는 D,L-쓰레오닌의 형태로 존재할 수 있다.
또한, 본 발명의 조성물은 알라닌, 글루타메이트, 프롤린 및 세린을, 바람직하게는 각각 약 0.01 내지 약 100 mM, 바람직하게는 약 0.05 내지 약 50 mM, 훨씬 더 바람직하게는 약 0.1 내지 약 25 mM, 더욱 더 바람직하게는 약 0.5 내지 약 15 mM, 보다 바람직하게는 약 1 내지 약 10 mM, 예를 들어 약 1 내지 약 8 mM의 양으로 포함할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 조성물은 pH를 5.5 내지 8.0, 바람직하게는 6.0 내지 7.0, 보다 바람직하게는 대략 pH 6.6의 범위로 유지시키기 위해서 완충제 시스템을 추가로 포함한다. 숙련가는 상기 목적에 적합한 완충제 시스템을 선택할 수 있다.
하나의 실시태양에서, 본 명세서에 교시된 바와 같은 조성물은 약 0.1 내지 약 2%, 예를 들어 약 0.3 내지 약 1.5%, 또는 약 0.5 내지 약 1.3%, 또는 대략 약 1.0% 시스테인을 추가로 포함한다.
요구되지 않는다 하더라도, 비타민을 본 명세서에 교시된 조성물에 가할 수 있다. 포함될 수 있는 적합한 비타민은 비제한적으로 비오틴, 코발아민, PABA, 폴산, 피리독스아민 등을 포함한다. 예를 들어, 프로피오네이트가 숙시네이트 대신에 최종-대사산물로서 요구되는 경우, 코발아민-의존성 메틸 말로닐 CoA 뮤타제를 통해 코발아민을 사용할 수 있다.
본 발명은 또한 아커만시아 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라 종의 세균을 배양하는 방법을 제공하며, 상기 방법은
- 본 명세서에 교시된 바와 같은 조성물을 제공하는 단계;
- 상기 조성물에 상기 아커만시아 속의 세균을 접종하는 단계; 및
- 상기 아커만시아 속 세균을 증식시키는 단계
를 포함한다.
아커만시아 뮤시니필라에 적합한 배양 조건은 비제한적으로 20 내지 40 ℃ 범위의 온도 및 5.5 내지 8.0 범위의 pH를 포함하며, 이때 최적의 생육은 약 36 내지 38 ℃의 온도 및 pH 6.0 내지 7.0, 바람직하게는 대략 pH 6.5에서 있다. 아커만시아 뮤시니필라는 엄격한 혐기성 세균이며(Derrien et al. 2004. Int J System Evol Microbiol 54:1469-1476), 이상적으로는 보통 말하는 혐기성 조건을 가능한 정도로 적용해야 하며, 공기와의 접촉을 가능한 정도로 피해야 한다. 숙련가는 혐기성 배양 방법에 익숙하다.
본 발명을 하기의 실시예들에 의해 추가로 예시하나, 제한하지는 않는다.
상기 논의 및 이들 실시예로부터, 당해 분야의 숙련가는 본 발명의 필수적인 특징을 확인할 수 있으며, 본 발명의 교시 및 범위로부터 이탈됨 없이, 본 발명의 다양한 변화 및 변형을 다양한 용도 및 조건에 적합하도록 수행할 수 있다. 따라서, 본 발명의 다양한 변형은 본 명세서에 나타내고 기재한 것들 외에 상기 기재로부터 당해 분야의 숙련가들에게 자명할 것이다. 상기와 같은 변형을 또한 첨부된 청구범위의 범위내에 포함시키고자 한다.
실시예
실시예 1: 에이 뮤시니필라의 증식을 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민에 의해 자극한다
에이 뮤시니필라 MucT(ATTC BAA-835)를 앞서 기재한 바와 같은 기본 혐기성 배지(상기 Derrien et al., 2004)에서 증식시켰다. 상기 배지에 정제된 돼지 점액(III 유형; 시그마(Sigma); 0.5%)을 단독으로, 점액(0.25%) 단독 또는 당 첨가와 함께, 또는 트립톤(디프코; 1%)을 당 첨가와 함께 보충하였다. 상기 사용된 당은 D-글루코스(글루코스), D-퓨코스(퓨코스), 또는 N-아세틸글루코스아민(GlcNac)을 각각 단독으로 20 mM 또는 함께 10 mM 최종 농도로 포함하였다. 당과의 배양은 또한 1 mM D,L 쓰레오닌(쓰레오닌)을 함유하였다. 모든 배양을 182 kPa(1.8 atm) N2/CO2의 기체 상에 의해 제공된 혐기성 조건하에 37 ℃에서 부틸-고무 마개로 밀봉된 혈청 병 중에서 수행하였다. 증식을 600 ㎚에서의 광학 밀도(OD600)로서 분광광도측정에 의해 측정하였으며 결과를 표 A에 나타낸다. 또한, HPLC 분석을, 아세테이트, 프로피오네이트, 1,2-프로판디올을 포함한 생성물뿐만 아니라 지시된 당의 농도를 측정하기 위해서 앞서 기재한 바와 같이 사용하였다(Derrien et al., 2004, 상기; Luzovac et al., 2014, 상기).
[표 A]
다양한 기질상에서의 에이 뮤시니필라의 증식. 상기 기본 배지에 첨가된 화합물을 24 내지 60시간 배양 후 측정되는 OD600과 같이 그의 농도(치수는 괄호안에)와 함께 나타낸다. 기입사항들은 반복된 실험으로부터의 것이며 실험마다 대략 25%까지 변한다. 약어에 대해서는 본문을 참조하시오. 상이한 실험 세트를 명확성을 위해 간격을 두어 구분한다.
상기 결과는 5 g/l 점액이 비교적 높은 증식율(대략 2시간의 세대 시간) 및 2.5의 높은 끝 OD600(이는 대략 5.109 세포/㎖을 나타낸다)으로 에이 뮤시니필라의 양호한 증식을 지속시킨다는 선행 관찰(Derrien et al., 2004, 상기)을 입증하였다. 그러나, 상기 점액 농도의 감소는 에이 뮤시니필라의 증식에 대단히 영향을 미친다. 에이 뮤시니필라의 증식을 조사하기 위해서 글루코스 및 다른 당의 조합을 시험하였다. 흥미롭게도, 퓨코스라기 보다는, 글루코스 또는 N-아세틸글루코스아민이, 에이 뮤시니필라의 증식을 2.0 이상의 OD600으로 지속시키기 위해 상기 점액 농도의 2-배 감소를 보상할 수 있다. 더욱이, 단일 당, 현저하게는 N-아세틸글루코스아민, 및 보다 적은 정도로는 글루코스(퓨코스는 아닌)가 추가적인 질소 공급원, 이 경우 카제인의 트립신 절단물인 트립톤의 존재하에서 에이 뮤시니필라의 증식을 지속시킬 수 있었다. 유사한 결과가, 카제인의 췌장 효소 절단물인 카시톤에 의해 획득되었다. 그러나, 증식은 앞서 보고된 것과 유사하게(Derrien et al., 2004, 상기), 0.5% 점액을 함유하는 기본 배지상에서의 증식에 비해 수배 감소하였다.
상기 기재된 결과로부터, N-아세틸글루코스아민이 에이 뮤시니필라의 증식을 지속시키기에 가장 좋은 당일 것이라는 결론을 내릴 수 있으나; 상기 당의 부족 및 비용에 비추어, 글루코스를 사용하는 것이 보다 이로울 것이다. 놀랍게도, 글루코스를 N-아세틸글루코스아민과 병용함으로써, 에이 뮤시니필라의 증식이 글루코스 단독보다는 훨씬 양호한 것으로 밝혀졌다(표 A).
실시예 2: 에이 뮤시니필라의 증식은 쓰레오닌에 의해 자극된다
글루코스상에서 에이 뮤시니필라의 증식을 위해, N-아세틸글루코스아민을 사용하여 최종 광학 밀도를 증가시킬 수 있었지만, 양호한 증식을 지속시키기 위해서는 외부 단백질 공급원이 필수적인 것으로 밝혀졌다. 현저하게, 증가하는 농도의 트립톤은 에이 뮤시니필라의 증식을, 점막-함유 배지상에서 획득될 수 있는 증식 수준을 초과하는 수준까지 자극하였다(표 B). 32 g/l 량의 트립톤이 실행 가능하며 통상적인 우유와 단백질 농도가 유사하다.
상기 실험을 필수적으로 실시예 1에 제시한 바와 같이 수행하였다.
추가로, 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민이 있는 기본 배지 중 쓰레오닌의 농도를 증가시키는 효과를 시험하였다. 놀랍게도, 2 mM 이상 및 바람직하게는 4 mM 이상의 쓰레오닌의 농도에 의해 상당한 효과가 관찰되었으며, 이는 7.0 이상의 매우 높은 에이 뮤시니필라의 OD600(산업적인 규모의 수준에 도달한다)을 생성시켰다.
흥미롭게, L-쓰레오닌 및 D,L-쓰레오닌을 모두 사용할 수 있었다. D,L-쓰레오닌을 보다 용이하게 입수할 수 있고 비용이 적게 들기 때문에, 본 발명의 배지에 D,L-쓰레오닌을 가하는 것이 바람직하다.
[표 B]
쓰레오닌을 임의로 포함하는, 다양한 기질상에서의 에이 뮤시니필라의 증식.
실시예 3: 비-동물 유래된 합성 배지에서 에이 뮤시니필라의 증식
카제인은 동물-유래된 단백질 공급원이므로, 식물계 또는 미생물계 단백질 공급원을 사용하여 에이 뮤시니필라의 증식을 지지할 수 있는지의 여부를 시험하였다. 대두가 가장 풍부하고 완전한 단백질 공급원 중 하나이므로, 다수의 상업적인 가수분해된 대두 제제를 시험하였다. 에이 뮤시니필라의 양호한 증식이, 앞서 병원성 세균의 증식을 지속시키는 것으로 밝혀진(미국특허 6558926 및 WO 1998054296을 참조하시오) 하이소이 및 아미소이(둘 다 퀘스트 인터내셔널(Quest International)로부터 수득되었다)와 함께 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민이 있는 기본 배지상에서 관찰되었다. 그러나, 모든 경우에 쓰레오닌의 첨가는 표 C에 나타낸 바와 같이 증식을 지지하였다. 16 g/l 하이소이의 존재하에서 2 mM 쓰레오닌에 의해 에이 뮤시니필라의 대단히 효율적인 증식이 획득되었으며 4 mM 쓰레오닌에 의해 훨씬 더 양호한 증식이 획득되었다.
하이소이 및 쓰레오닌의 존재하에서 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민 비의 변화는 에이 뮤시니필라의 증식에 영향을 미쳤으며, 또한 상기 대두-기본 배지상에서 상기 두 당이 모두 필요하지만 그 비는 상이할 수 있음을 보였다(표 C). 이는 카제인-유래된 트립톤상에서 또한 관찰되었으며 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민의 비의 최적화를 상기 질소원과 독립적으로 수행할 수 있음을 암시한다.
또한 미생물 단백질 공급원이 에이 뮤시니필라의 증식을 지지할 수 있는지의 여부를 시험하기 위해서 효모 추출물(디프코)을 가하였다. 효모 추출물은 대개 대두 기본 배지(Kwon et al., Enzyme Microb Technol. 2000 Feb 1;26(2-4):209-215)보다 더 비싸며 따라서 비교적 소량의 효모 추출물을, 에이 뮤시니필라의 증식을 4.4의 OD600으로 지지하는 배지에 가하였고 이는 심지어 에이 뮤시니필라의 증식을 OD600 6.5로 증가시키는 것으로 밝혀졌다(표 C). 이는 효모 추출물을 사용하여 증식을 지지할 수 있음을 가리키며 또한, 상기 단백질 공급원의 증가가 비-동물 유래된 배지상에서 에이 뮤시니필라의 증식을 더욱 증가시킬 수 있음을 가리킨다.
명백하게, 세균 세포를 증식시키기에 가장 비용 효과적인 방법은 합성 배지상에 있으며 따라서 대두 가수분해산물 중의 아미노산이 증식을 지지할 수 있는지를 시험하였다. 4개 아미노산, 알라닌, 글루타메이트, 프롤린 및 세린(각각 4 mM)의 혼합물이 글루코스 및 N-아세틸글루코스아민의 존재하에서 쓰레오닌과 별개로 다른 아미노산에 대한 필요 없이 에이 뮤시니필라의 증식을 지지할 수 있는 것으로 밝혀졌다(표 C). 상기 관찰된 증식은 점막 단독상에서의 증식을 초과하였으며(상기 참조) 따라서 이는 에이 뮤시니필라의 비용-효과적인 증식을 더욱 최적화하하는 방식을 연다. 실제로, 세린을 또한 쓰레오닌에 의해 대체할 수 있었으며 오직 쓰레오닌 및 프롤린의 조합만이 에이 뮤시니필라에 대한 질소원으로서 작용하기에 매우 유효한 것으로 밝혀졌다.
[표 C]
10 g/l의 다양한 기질 및 하이소이 및 효모 추출물(YE) 및 알라닌, 글루타메이트, 프롤린 및 세린(각각 4 mM)으로 이루어지는 4개 아미노산(AA)상에서 에이 뮤시니필라의 증식. 실험을 필수적으로 실시예 5에 기재된 바와 같이 수행하였다.
실시예 4: 에이 뮤시니필라의 산업적인 규모의 발효
에이 뮤시니필라를 대규모로 생산하는 능력을 예시하기 위해서, 상기를 pH 7.0에서 600 리터 발효기에서 ㎏당 하이소이 32 그램, 글루코스 25 그램, N-아세틸글루코스아민 4.4 그램, 쓰레오닌 4 그램, 시스테인 0.5 그램, 및 비타민 용액(상기 Derrien et al 2004를 참조하시오)을 함유하는 상술한 바와 같은 기본 배지상에서 증식시켰다. 상기 발효 후에 상기 배양물의 OD600은 7.2였으며, 이는 글루코스, N-아세틸-글루코스아민 및 비-동물 단백질 공급원이 있는 배지가 에이 뮤시니필라의 탁월한 증식을 산업적인 규모의 수준으로 지속시킬 수 있음을 가리킨다.
Claims (11)
- 아커만시아(Akkermansia) 속, 특히 아커만시아 뮤시니필라(Akkermansia muciniphila) 종의 세균을 배양하는 방법으로서,
- 모노사카라이드, 모노사카라이드의 질소-함유 유도체, 및 아미노산 공급원을 포함하는 조성물을 제공하는 단계;
- 상기 조성물에 상기 아커만시아 속의 세균을 접종하는 단계; 및
- 상기 아커만시아 속 세균을 증식시키는 단계
를 포함하는, 방법. - 제1항에 있어서,
모노사카라이드의 질소-함유 유도체가 N-아세틸-글루코스아민(Glc-NAc) 및 N-아세틸-갈락토스아민(Gal-Nac) 중에서 선택되고, 바람직하게는 N-아세틸-글루코스아민인, 방법. - 제2항에 있어서,
모노사카라이드의 질소-함유 유도체가 Glc-NAc인, 방법. - 제3항에 있어서,
Glc-NAc가 약 0.001 mM 내지 약 1 M 범위의 양으로 존재하는, 방법. - 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
모노사카라이드가 글루코스인, 방법. - 제5항에 있어서,
글루코스가 약 0.001 M 내지 약 1 M 범위의 양으로 존재하는, 방법. - 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서,
조성물이 쓰레오닌을 추가로 포함하는, 방법. - 제7항에 있어서,
쓰레오닌이 약 0.01 mM 내지 약 100 mM 범위의 양으로 존재하는, 방법. - 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 공급원이 식물계 아미노산 공급원, 미생물계 아미노산 공급원, 또는 알라닌, 글루타메이트, 프롤린 및 세린의 조합 중에서 선택되는, 방법. - 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
아미노산 공급원이 식물 단백질 가수분해산물인, 방법. - 제10항에 있어서,
식물 단백질 가수분해산물이 약 0.01 g/l 내지 약 1 ㎏/l, 예를 들어 약 0.05 내지 약 500 g/l, 약 0.1 내지 약 250 g/l, 약 0.5 내지 약 150 g/l, 약 1 내지 약 100 g/l, 또는 약 2 내지 약 80 g/l 범위의 양으로 존재하는, 방법.
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