KR20180119979A - 풍미 향상을 위한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 고활성 균주와 이를 이용한 식품 조성물의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 명세서에는, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주, 이를 이용한 감마 글루타밀펩타이드 생산방법 및 이를 이용한 식품 제조방법이 개시된다. 본 발명의 균주는 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가지며, 따라서 감마-글루타밀펩타이드의 대량 생산에 유리하다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 용혈현상을 일으키지 않고, 인체에 해로운 물질을 생성하지 않기 때문에, 식품 분야 또는 제약분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
Description
본 명세서에는, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 높은 균주, 이를 이용한 감마-글루타밀펩타이드 생산방법 및 식품 제조방법이 개시된다.
최근 미생물은 고부가가치 경제적 이윤을 창출할 수 있는 핵심 생물소재로 점점 각광을 받고 있다. 순수한 미생물 및 관련 분야의 세계 시장규모는 연간 약 100억불(약 10조원)로 추정되고 있고, 미생물이 생산 하는 항생제 등의 의약품을 합치면 미생물은 세계 바이오시장의 30%를 차지한다. 현재 바이오산업에서 가장 각광을 받고 있는 바이오시밀러(Biosimilar)로 대부분 미생물을 통해 의약 물질을 생산하고 있고, 이 중 신장병 환자에게 투여되는 적혈구 생산 촉진물질인 EPO(Erythropoietin)만 하더라도 2008년, 세계 매출이 100.5억불(약 1조원)에 달하여 미생물 관련 시장의 산업적 규모를 짐작할 수 있다. 한편 획기적으로 밝혀지는 미생물 유전체 해독은 현재 완전히 해독된 것이 1,250개, 해독 중인 것이 현재 4200개로 알려졌다. 이러한 미생물의 유전체 연구결과는 미생물이 갖는 공장, 농장, 발전소 기능을 완벽하게 알게 하여 차세대 정밀화학 소재, 식품소재, 에너지소재, 환경소재 및 의약소재 등을 발굴하여 효율적으로 산업화에 적용할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 게다가 배양하기 어렵거나 해양 또는 극한 환경에서 살아가는 미생물의 99% 이상이 아직 발견되지 않았는데, 이러한 미생물과 함께 해당 특정 환경의 다양한 유전체 자원(Metagenome)을 함께 확보하여 활용할 경우에는 생물의약품, 효소, 항생제 등의 다양한 분야에서의 활용도가 더욱 높아질 것이다. 뿐만 아니라 기존의 화학공정을 대체하는 환경 친화적인 녹색기술인 바이오리파이너리(Biorefinery)에 합성생물학(Synthetic biology)이 도입되어 이용된다면 더 막대한 경제적 가치를 창출할 수 있을 것으로 전망된다.
유전체 시대의 미생물 산업, Biosafety Vol.11 No.1, 오태광, 2010.06.09. 22-29pages
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성이 높은 균주를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 저비용으로 감마-글루타밀펩타이드(gamma-glutamylpeptide)를 대량 생산하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 풍미, 예컨대 감칠맛, 입안에 꽉찬 느낌, 맛의 두께감, 맛의 지속성이 향상된 식품을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드 생산방법이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 속 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드 생산방법이다.
본 발명의 일 관점인 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주는, 우수한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가지며, 감마-글루타밀펩타이드의 대량 생산에 유리하다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 용혈현상을 일으키지 않고, 인체에 해로운 물질을 생성하지 않기 때문에, 식품 분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) SMB-538 균주의 기탁증이다.
도 2는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주와 다른 균주의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 비교한 도이다.
도 3는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주의 용혈성 테스트 결과를 보이는 도이다.
도 4은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주의 16s rDNA의 서열을 보이는 도이다.
도 2는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주와 다른 균주의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 비교한 도이다.
도 3는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주의 용혈성 테스트 결과를 보이는 도이다.
도 4은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주의 16s rDNA의 서열을 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 일 관점에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주이다.
본 명세서에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase, GGT, gamma-GT) 또는 감마-글루타밀 전이효소는, 감마-글루타밀 트랜스펩티다아제(gamma-glutamyl transpeptidase, GGTP)라고도 불리우는 효소를 의미할 수 있다. 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈는, 감마-글루타밀 화합물의 글루타밀기를 다른 수용체로 전이시키는 효소를 의미할 수 있다. 구체적으로, 글루타민에 특이적으로 작용하여 글루타민의 감마-글루타밀기를 히드록실아민으로 전이하는 효소를 의미할 수 있고, 그 결과 글루탐산을 생산하는 효소를 의미할 수 있다. 또한, 글루타밀펩타이드의 글루탐산을 다른 아미노산으로 전이시킨 결과 감마-글루타밀펩타이드를 생산하는 효소를 의미할 수 있다.
본 명세서에서, 효소 활성은, 단위시간당 기질을 최종산물로 전환하는 효소의 양을 의미할 수 있다.
본 명에서에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는다는 것은, 실질적으로 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 촉매 작용에 의하여 기질이 반응함으로써 생명체 내부에서 생명현상에 필요한 정도의 화학반응을 진행시킬 수 있는 것을 의미한다. 구체적으로, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 분석 킷트(Biovision, cat. K-784-100)를 이용하여 활성을 측정한 결과, 그 값이 700 mU/ml 이상, 800 mU/ml 이상, 900 mU/ml 이상 또는 1000 mU/ml 이상인 것을 말한다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주는, 45℃ 이하의 온도에서 24시간 이상 배양한 경우, 2000 mU/ml 이상, 3000 mU/ml 이상, 4000 mU/ml 이상, 또는 5000 mU/ml 이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주는, 포도당 2%, 효모추출물 2%, K2HPO4 1.25%, KH2PO4 0.39%, (NH4)2SO4 0.4%, MgSO4·7H2O 0.12%를 포함하는 배지에서, 상기 균주를 106 CFU/ml로 접종하고 37 ℃에서 72시간 동안 배양한 경우, 4000 mU/ml이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것일 수 있다. 또한, 구체적으로 상기 균주는 서열번호 1의 서열을 포함하는 16s rDNA를 포함하는 균주일 수 있다.
또한, 상기 조건에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성은 4000 mU/ml 이상일 수 있고, 4500 mU/ml 이상, 5000 mU/ml 이상, 5500 mU/ml이상, 6000 mU/ml이상, 6500 mU/ml이상, 또는 7000 mU/ml이상일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) DSM7 균주와 비교하였을 때, 50배 이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가질 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주에 있어서, 상기 균주는 용혈성이 없는 균주일 수 있다. 본 명세서에서 용혈성이란, 균주가 적혈구를 파괴하는 현상을 의미할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 용혈성이 없다는 것은, 인체에 해를 끼칠 정도의 용혈 현상이 없는 것을 의미한다.
본 발명의 일 관점인, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주에 있어서, 상기 균주는 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않는 균주일 수 있다. 본 명세서에서 바이오제닉 아민이란, 미생물의 대사과정 중에 생성될 수 있는데, 알러지 유발 물질, 발암물질 또는 식중독 등의 인체에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 질소화합물을 의미할 수 있다. 본 명세서에서 바이오제닉 아민을 생산하지 않는 것은, 인체에 해를 끼칠 정도의 양의 바이오제닉 아민을 생산하지 않는다는 것을 의미하며, 그 생산량이 0인 것에 제한되지 않는다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주는 용혈성이 없고 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으므로 인체에 무해할 수 있다.
본 발명의 일 관점인, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC13187BP의 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주일 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다. 본 명세서에서 상기 조성물은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 균주, 상기 균주의 파쇄물, 상기 균주의 배양물로서, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물일 수 있으며, 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있고, 상기 파쇄물 또는 배양물의 추출물을 포함할 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 조성물은 식품 조성물일 수 있다. 또한, 식품 조성물은 발효식품일 수 있다. 본 명세서에서 발효식품은 상기 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주에 의하여 발효된 식품, 발효가 진행중인 식품, 또는 발효를 촉진하는 식품을 의미할 수 있으며, 예컨대, 식초, 간장, 된장, 고추장과 같은 콩 발효식품, 발효유제품, 김치, 젓갈과 같은 소금절임류 또는 조미료와 같은 풍미제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 일 관점에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 조성물은 약학적 조성물일 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 통상의 방법에 의해 경구 투여를 위한 제형 또는 비경구 투여를 위한 제형으로 제제화될 수 있고, 제제화할 경우 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제될 수 있다. 경구 투여를 위한 고형 제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형 제제는 유효성분에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(Calcium carbonate), 수크로스(Sucrose), 락토오스(Lactose) 또는 젤라틴 등을 섞어 조제될 수 있다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용될 수 있다. 경구 투여를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제 및 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함될 수 있다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(Propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다. 더 나아가 당 분야의 적정한 방법으로 또는 Remington's Pharmaceutical Science(최근판), Mack Publishing Company, Easton PA에 개시되어 있는 방법을 이용하여 각 질환에 따라 또는 성분에 따라 바람직하게 제제화할 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 목적하는 방법에 따라 인간을 포함한 포유류에 경구 투여되거나 비경구 투여될 수 있으며, 비경구 투여 방식으로는 피부 외용, 복강내주사, 직장내주사, 피하주사, 정맥주사, 근육내 주사 또는 흉부내 주사 주입방식 등이 있다. 본 발명의 약학 조성물의 투여량은 약학적으로 유효한 양이라면 크게 제한되지 않으며, 환자의 체중, 연령, 성별, 건강상태, 식이, 투여시간, 투여방법, 배설율 및 질환의 중증도에 따라 그 범위가 다양하다. 본 발명의 약학 조성물의 통상적인 1일 투여량은 크게 제한되지 않으나 바람직하게는 유효성분을 기준으로 할 때 0.1 내지 3000 ㎎/㎏이고, 더 바람직하게는 1 내지 2000 ㎎/㎏이며, 하루 1회 또는 수회로 나누어 투여될 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드(gamma-glutamylpeptide) 생산방법이다. 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주는 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가지고 있어, 글루타밀펩타이드의 글루탐산을 다른 아미노산으로 전이시킨 결과 감마-글루타밀펩타이드를 생산할 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주 배양은 옥수수침지액(corn steep liquor) 0.5 내지 1.5 %를 포함하는 배지에서 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 옥수수침지액을 0.5% 이상, 0.6% 이상, 0.7% 이상, 0.8% 이상, 0.9% 이상 또는 1.0% 이상 포함할 수 있으며, 1.5% 이하, 1.4% 이하, 1.3% 이하, 1.2% 이하, 1.1% 이하 또는 1.0% 이하 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 1.0% 포함할 수 있다.
또한, 상기 배지는 효모 추출물 1.1 내지 1.9%, MgSO4·7H2O 0.01 내지 0.1% 및 K2HPO4·3H2O 0.01 내지 1%를 추가로 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지는 상기 효모 추출물을 1.1% 이상, 1.2% 이상, 1.3% 이상, 1.4% 이상 또는 1.5% 이상 포함할 수 있으며, 1.9% 이하, 1.8% 이하, 1.7% 이하, 1.6% 이하 또는 1.5% 이하 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 1.5% 포함할 수 있다. 또한, 구체적으로, 상기 배지는 MgSO4·7H2O를 0.01% 이상, 0.02% 이상, 0.03% 이상, 0.04% 이상 또는 0.05% 이상 포함할 수 있으며, 0.1% 이하, 0.09% 이하, 0.08% 이하, 0.07% 이하, 0.06% 이하 또는 0.05% 이하 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 0.05% 포함할 수 있다. 또한, 구체적으로, 상기 배지는 K2HPO4·3H2O를 0.01% 이상, 0.02% 이상, 0.04% 이상, 0.06% 이상, 0.08% 이상 또는 0.1% 이상 포함할 수 있으며, 1% 이하, 0.9% 이하, 0.8% 이하, 0.7% 이하, 0.6% 이하, 0.5% 이하, 0.4% 이하, 0.3% 이하, 0.2% 이하, 0.15% 이하 또는 0.1% 이하 포함할 수 있으며, 보다 구체적으로 0.1% 포함할 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주 배양은 30 내지 40℃의 온도에서 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 온도는 30℃ 이상, 31℃ 이상, 32℃ 이상, 33℃ 이상, 34℃ 이상, 34.5℃ 이상, 35℃ 이상, 35.5℃ 이상, 36℃ 이상, 36.5℃ 이상 또는 37℃ 이상일 수 있으며, 40℃ 이하, 39.5℃ 이하, 39℃ 이하, 38.5℃ 이하, 38℃ 이하, 37.5℃ 이하 또는 37℃ 이하일 수 있으며, 보다 구체적으로 37℃일 수 있다.
상기와 같은 관점에서, 상기 균주 배양은 24 내지 168 시간 동안 배양하는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배양 시간은 24 시간 이상, 30 시간 이상, 36 시간 이상, 42 시간 이상, 48 시간 이상, 54 시간 이상, 60 시간 이상, 66 시간 이상, 72 시간 이상, 78 시간 이상, 84 시간 이상, 90 시간 이상 또는 96시간 이상일 수 있으며, 168시간 이하, 162시간 이하, 156시간 이하, 150시간 이하, 144시간 이하, 138시간 이하, 132시간 이하, 126시간 이하, 120시간 이하, 114시간 이하, 108시간 이하, 102시간 이하 또는 96시간 이하일 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, 상기 균주는 상기 포도당 2 %, 효모 추출물 1.5 %, 옥수수침지액(corn steep liquor) 1 %, MgSO4·7H2O 0.05% 및 K2HPO4·3H2O 0.1 %를 포함하는 배지에서, 30 내지 40℃의 온도에서 24 내지 168 시간 동안 배양한 것일 수 있으며, 이 경우 2000 mU/ml이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 배지에서 약 37℃에서 약 72시간 또는 약 168시간 동안 배양하는 경우 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 가장 우수할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또한, 상기 균주 배양은 풍부한 질소원이 주어지는 환경에서 수행될 수 있다. 질소원이 풍부할 때, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 활성이 우수할 수 있다. 본 명세서에서 질소원은, 균주 생장에 필요한 질소를 공급하는 물질을 의미하여, 공지의 것이라면, 제한되지 않고 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다. 상기와 같은 관점에서, 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 바실러스 아밀로리퀴파션스 균주, 상기 균주의 배양, 상기 균주의 파쇄물, 배양물, 추출물에 대한 설명은 상기 기재한 바와 같다.
본 발명의 일 관점인 식품 제조방법에 있어서, 상기 방법에 의하여 제조된 식품은 향상된 풍미를 가질 수 있다. 본 명세서에서 풍미란, 식품에서 사람이 느낄 수 있는 깊은 맛 또는 감칠맛을 의미할 수 있다. 풍미는 식품 내 글루탐산 또는 다양한 펩타이드 특히, 감마-글루타밀펩타이드의 함량 증가에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 방법에 의하여 제조된 식품은 풍미를 오랫동안 지속할 수 있어서 유리하다.
또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스(Bacillus) 속 균주를 옥수수침지액(corn steep liquor) 0.5 내지 1.5 %을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드 생산방법이다. 상기 바실러스 속 균주 의 배양에 대한 설명은 상기 기재한 바와 같다.
상기 바실러스(Bacillus) 속 균주는 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis), 바실러스 리체니포르미스(Bacillus licheniformis), 바실러스 메가테리움(Bacillus megateriums), 바실러스 나토(Bacillus natto), 바실러스 시트레우스(Bacillus citreus), 바실러스 시르쿠란스(Bacillus circulans), 바실러스 메센트리커스(Bacillus mesentricus) 및 바실러스 푸미러스(Bacillus pumilus)로 구성된 군으로부터 선택되는 하나 이상의 균주를 포함할 수 있다. 구체적으로 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens), 바실러스 서브틸러스(Bacillus subtilis)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 배지는 효모 추출물 1.1 내지 1.9%, MgSO4·7H2O 0.01 내지 0.1% 및 K2HPO4·3H2O 0.01 내지 1%를 추가로 더 포함할 수 있다. 또한, 상기 균주는 30 내지 40℃의 온도에서 배양할 수 있으며, 24 내지 168 시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 또한, 상기 바실러스 속 균주는 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538, 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 또는 바실러스 서브틸리스 KCTC3135일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 실시예에서, 바실러스 속 균주로 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42, 바실러스 서브틸리스 KCTC3135를 포도당 2 %, 효모 추출물 1.5 %, 옥수수침지액(corn steep liquor) 1 %, MgSO4·7H2O 0.05% 및 K2HPO4·3H2O 0.1 %를 포함하는 배지에서 37℃에서 72시간 동안 배양한 경우, 상기 배지와는 다른 조성의 배지에서 배양한 때에 비하여 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 1.6 내지 2배 이상 증가하여, 1000 mU/ml 이상의 활성을 가짐으로써, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈가 실질적으로 활성을 가짐을 확인하였다(실시예 3).
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) SMB-538 균주의 동정
[실시예 1-1] 식품 미생물의 분리
시중의 된장, 고추장, 청국장 등의 발효식품을 구입하여 바실러스의 분리를 하였다. 구입한 발효식품을 분쇄하여 발효식품 1g을 생리식염수로 현탁하고 희석한 현탁액의 상등액 0.2ml을 TSA(Tryptone 1.5%, Soybeanmeal digest 0.5%, sodium chloride 0.5%, agar 1.5%) 배지에 접종하여 37℃ 에서 24시간 배양하여 분리하였다. 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별하였다.
[실시예 1-2] 유해 미생물의 선별 및 제거
식중독을 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 판별 배지인 MYP 배지(Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar)에 균주를 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배지는 육추출물 0.1%, 펩톤 1%, 만니톨(mannitol) 1%, 염화나트륨 1%, 페놀레드 0.0025%, 아가(agar) 1.2%, 폴리믹신 B 50000IU/L, 달걀노른자(egg yolk) 2.5%를 포함하였다. 분홍색을 나타내며 주변에 띠를 형성하는 균주를 바실러스 세레우스로 판단하여 선별 및 제거하였다.
[실시예 1-3] 균주의 동정
분리균주를 K 배지(포도당 2%, 효모추출물 2%, K2HPO4 1.25%, KH2PO4 0.39%, (NH4)2SO4 0.4%, MgSO4·7H2O 0.12%) 100 ml에 약 106 CFU/ml로 접종하여 37℃에서 72 시간 배양한 배양액의 상등액을 취하여 13000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(Gamma-glutamyltransferase) 분석 킷트(Biovision, cat. K-784-100)를 이용하여 그 활성을 측정하였고 그 중 효소활성이 높은 균주를 선별하였다.
그 후, 활성이 높은 균주의 DNA를 추출하고 27F, 1492R 프라이머를 이용(표 1)하여, 16s rRNA를 증폭시키고, 분석한 서열 정보를 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST를 이용하여 동정하였다. 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) SMB-538 균주를 동정할 수 있었다.
| 서열번호 2 | 27F | AGAGTTTGATCCTGGCTCAG |
| 서열번호 3 | 1492R | GGTTACCTTGTTACGACTT |
아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) SMB-538 균주의 16s rDNA 서열은 서열번호 1과 같다.
[실시예 2] 다른 균주와의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교
실시예 1-3에서와 동일한 방법으로, 효소 활성을 측정하였다. 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 균주와 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 균주(수탁번호: DSM 23117), 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) KCTC3135균주에서의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 측정하였다. 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 균주와 바실러스 서브틸리스 KCTC3135 균주는 한국 미생물자원센터에서 얻었고, 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 균주는 독일 미생물자원센터(DSMZ)로부터 얻었다. 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주는 약 4000mU/ml 이상의 효소 활성을 나타내어, 다른 균주보다 효소 활성이 우수함을 알 수 있었다(표 2).
| 균주 | 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml) |
| 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 | 4000~5000 |
| 표준균주 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 | 0 ~ 30 |
[실시예 3] 배양 배지에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교
배지로, K배지 대신 고영양 배지를 사용한 점만 제외하고, 실시예 1-3과 동일하게 효소 활성을 측정하고, 그 결과를 하기 표 3 및 도 2에 나타내었다. 고영양 배지의 조성은 다음과 같다: 포도당 2 %, 효모추출물 1.5 %, 옥수수침지액(corn steep liquor) 1 %, MgSO4·7H2O 0.05%, K2HPO4·3H2O 0.1 %.
| 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml) | ||
| 균주 / 배지의 종류 | K 배지 | 고영양 배지 |
| 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 | 4000 ~ 5000 | 5000 ~ 7000 |
| 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 | 0 ~ 30 | 0 ~ 100 |
| 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 | 0 ~ 500 | 1000 ~ 2000 |
| 바실러스 서브틸리스 KCTC3135 | 0 ~ 600 | 1000 ~ 2000 |
상기 표 3 및 도 2에 나타난 바와 같이, 본 발명의 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 나타내는 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주는 상기 고영양 배지에서 배양 시 5000mU/ml이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가짐을 알 수 있었다. 또한, 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 및 바실러스 서브틸리스 KCTC3135는 K배지에서 배양하였을 때보다 고영양 배지에서 배양 시 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 각각 약 2배, 약 1.6배 증가하여 실질적으로 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가짐을 알 수 있었다.
[실시예 4] 배양 시간에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교
배양시간이 효소 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시예3과 동일한 환경에서 배양 시간만 달리하여, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 24시간 내지 168시간 배양하였을 경우, 우수한 효소 활성을 나타내며, 특히 약 168시간 동안 배양 시 가장 우수한 효소 활성을 나타내며, 168시간 초과 배양 시 효소활성이 떨어지는 것을 알 수 있었다(표 4).
| 배양시간 | 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml) |
| 24 시간 미만 | 0 ~ 2000 |
| 24~168 시간 | 2000 ~ 7000 |
| 168 시간 초과 | 3000 ~ 4000 |
[실시예 5] 배양 온도에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교
온도가 효소 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시예 3과 동일한 환경에서, 배양 온도만 달리하여, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 약 37℃에서 효소 활성이 가장 우수하고, 약 40℃에서도 우수한 효소 활성을 확인할 수 있었으며, 약45℃ 이상의 온도에서는 효소활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(표 5).
| 배양온도 | 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml) |
| 37 ℃ | 5000 ~ 7000 |
| 40 ℃ | 4000 ~ 5000 |
| 45 ℃ | 1000 ~ 2000 |
[실시예 6] 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주의 용혈성 측정
알파용혈성(alpha hemolysis) 판별용 토끼 혈액(기산바이오텍)과 베타용혈성(beta hemolysis) 판별용 양 혈액 (한일komed)을 섬유소가 제거된 형태(Defibrinated blood)로 준비하였다. TSA 배지에 5%씩 혈액을 첨가하여 평판배지를 제조하고 배지에 멸균된 침으로 단일콜로니를 취해 찍어주었다. 알파용혈성의 경우 37℃에서 18 시간 배양 후 콜로니 주변을 관찰하고, 베타용혈성의 경우 37℃에서 18 시간 배양 후 4℃ 냉장고에 밤새 보관한 뒤 관찰하였다. 콜로니 주변의 혈액 분해 여부에 따라 용혈성 여부를 판별했다. 그 결과, 본 발명의 균주는 용혈성이 없어 인체에 무해함을 확인할 수 있었다(도 3).
[실시예 7] 바이오제닉 아민 생성능 확인
0.006% 지시약(Bromocresol Purple)을 함유한 LB (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%) 액체배지 3종을 제조하고 i) 아미노산 무첨가 ii) 0.1% histidine 첨가 iii) 0.1% tyrosine 첨가 균주를 접종하여 37 ℃에서 24시간동안 배양하였다. 상층액만을 분리한 뒤 pH, 590nm에서의 흡광도를 측정하여 i) 아미노산 무첨가 배지보다 ii), iii) 아미노산을 전구체로 넣어준 배지에서 pH와 흡광도값이 더 높은 경우, 바이오제닉 아민 생성능이 있는 것으로 판별하였다. 그 결과 본 발명 균주는 바이오제닉 아민을 생성하지 않아 인체에 무해함을 확인할 수 있었다(표 6).
| 시료 | 히스타민 (mg/kg) |
티라민 (mg/kg) |
바이오제닉 아민 생성능 |
| 배지 (미접종) | 2.615 | 0.800 | - |
| 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 배양액 | 1.160 | 0.670 | 음성 |
따라서, 본 발명의 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) SMB-538 균주는 감마-글루타밀펩타이드의 대량 생산에 유리하여, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있으며, 상기 균주는 용혈현상을 일으키지 않고, 인체에 해로운 물질을 생성하지 않기 때문에 식품 분야에서 유용하게 사용할 수 있음을 알 수 있었다.
본 발명의 일 관점에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 간장
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 균주 분말 | 2% |
| 탈지 대두 | 22.4% |
| 소맥밀 | 10% |
| 천일염 | 5% |
| 액상과당 | 5% |
| 합성보존료 | 1% |
| 정제수 | 60% |
| 질소 | 1.3% |
| 기타 | 잔량 |
[제형예 2] 된장
| 성분 | 함량(중량%) |
| 실시예 1의 균주 분말 | 2% |
| 탈지 대두 | 40% |
| 소맥분 | 10% |
| 정제소금 | 5% |
| 알파대두분 | 5% |
| 고춧가루 | 5% |
| 정제수 | 30% |
| 종국 | 1.3% |
| 기타 | 잔량 |
<110> SEMPIO FOODS COMPANY
<120> A STRAIN HAVING HIGH GAMMA-GLUTAMYLTRANSFERASE ACTIVITY FOR
FLAVOR AND TASTE, AND METHOD FOR MANUFACTURING FOOD COMPOSITION
USING THE SAME
<130> 17p105/ind
<160> 3
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 1170
<212> DNA
<213> Bacillus amyloliquefaciens
<400> 1
gctaataccg gatgnttgtt tgaaccgcat ggttcagaca taaaaggtgg cttcggctac 60
cacttacaga tggacccgcg gcgcattagc tagttggtga ggtaacggct caccaaggcn 120
acgatgcgta gccgacctga gagggtgatc ggccacactg ggactgagac acggcccaga 180
ctcctacggg aggcagcagt agggaatctt ccgcaatgga cgaaagtctg acggagcaac 240
gccgcgtgag tgatgaaggt tttcggatcg taaagctctg ttgttaggga agaacaagtg 300
ccgttcaaat agggcggcac cttgacggta cctaaccaga aagccacggc taactacgtg 360
ccagcagccg cggtaatacg taggtggcaa gcgttgtccg gaattattgg gcgtaaaggg 420
ctcgcaggcg gtttcttaag tctgatgtga aagcccccgg ctcaaccggg gagggtcatt 480
ggaaactggg gaacttgagt gcagaagagg agagtggaat tccacgtgta gcggtgaaat 540
gcgtagagat gtggaggaac accagtggcg aaggcgactc tctggtctgt aactgacgct 600
gaggagcgaa agcgtgggga gcgaacagga ttagataccc tggtagtcca cgccgtaaac 660
gatgagtgct aagtgttagg gggtttccgc cccttagtgc tgcagctaac gcattaagca 720
ctccgcctgg ggagtacggt cgcaagactg aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac 780
aagcggtgga gcatgtggtt taattcgaag caacgcgaag aaccttacca ggtcttgaca 840
tcctctgaca atcctagaga taggacgtcc ccttcggggg cagagtgaca ggtggtgcat 900
ggttgtcgtc agctcgtgtc gtgagatgtt gggttaagtc ccgcaacgag cgcaaccctt 960
gatcttagtt gccagcattc agttgggcac tctaaggtga ctgccggtga caaaccggag 1020
gaaggtgggg atgacgtcaa atcatcatgc cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac 1080
aatggacaga acaaagggca gcgaaaccgc gaggttaagc caatcccaca aatctgttct 1140
cagttcggat cgcagtctgc aactcgactg 1170
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 27F primer
<400> 2
agagtttgat cctggctcag 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 1492R primer
<400> 3
ggttaccttg ttacgactt 19
Claims (18)
- 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefaciens) 균주.
- 제1항에 있어서,
상기 균주는,
포도당 2%, 효모추출물 2%, K2HPO4 1.25%, KH2PO4 0.39%, (NH4)2SO4 0.4%, MgSO4·7H2O 0.12%를 포함하는 배지에서, 상기 균주를 106 CFU/ml로 접종하고 37 ℃에서 72시간 동안 배양한 경우,
4000mU/ml 이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것인, 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는, 용혈성이 없는 것인, 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는, 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않는 것인, 균주. - 제1항에 있어서,
상기 균주는, 기탁번호가 KCTC13187BP인 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-538 균주인, 균주. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
- 제7항에 있어서,
상기 식품은 발효식품인, 식품 조성물. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드(gamma-glutamylpeptide) 생산방법.
- 제8항에 있어서,
균주는,
옥수수침지액(corn steep liquor) 0.5 내지 1.5 %를 포함하는 배지에서, 상기 균주를 배양하는 것인, 생산방법. - 제9항에 있어서,
상기 배지는,
효모 추출물 1.1 내지 1.9%, MgSO4·7H2O 0.01 내지 0.1% 및 K2HPO4·3H2O 0.01 내지 1%를 추가로 포함하는 것인, 생산방법. - 제8항에 있어서,
균주는 30 내지 40℃의 온도에서 배양하는 것인, 생산방법. - 제8항에 있어서,
균주는 24 내지 168 시간 동안 배양하는 것인, 생산방법. - 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법.
- 제13항에 있어서,
균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 포함하는 식품 제조방법. - 바실러스(Bacillus) 속 균주를 옥수수침지액(corn steep liquor) 0.5 내지 1.5%을 포함하는 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀펩타이드(gamma-glutamylpeptide) 생산방법.
- 제15항에 있어서,
상기 배지는 효모 추출물 1.1 내지 1.9%, MgSO4·7H2O 0.01 내지 0.1% 및 K2HPO4·3H2O 0.01 내지 1%를 추가로 포함하는 것인, 생산방법. - 제15항에 있어서,
균주는 30 내지 40℃의 온도에서 배양하는 것인, 생산방법. - 제15항에 있어서, 균주는 24 내지 168 시간 동안 배양하는 것인, 생산방법.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020170053814A KR20180119979A (ko) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | 풍미 향상을 위한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 고활성 균주와 이를 이용한 식품 조성물의 제조방법 |
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| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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| KR1020170053814A KR20180119979A (ko) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | 풍미 향상을 위한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 고활성 균주와 이를 이용한 식품 조성물의 제조방법 |
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| Publication Number | Publication Date |
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| KR20180119979A true KR20180119979A (ko) | 2018-11-05 |
Family
ID=64329146
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| KR1020170053814A KR20180119979A (ko) | 2017-04-26 | 2017-04-26 | 풍미 향상을 위한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 고활성 균주와 이를 이용한 식품 조성물의 제조방법 |
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| KR (1) | KR20180119979A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR102110995B1 (ko) * | 2018-12-28 | 2020-05-15 | 샘표식품 주식회사 | 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 증진시키기 위한 바실러스 속 미생물 배양용 조성물 |
| CN115247141A (zh) * | 2022-07-15 | 2022-10-28 | 广西科学院 | 解淀粉芽孢杆菌菌株a9及其应用 |
-
2017
- 2017-04-26 KR KR1020170053814A patent/KR20180119979A/ko unknown
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