KR101749991B1

KR101749991B1 - 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 높은 균주와 이를 이용한 식품 및 약학조성물의 제조 방법

Info

Publication number: KR101749991B1
Application number: KR1020150093763A
Authority: KR
Inventors: 이재중; 이소원; 최용호; 허병석
Original assignee: 샘표식품 주식회사
Priority date: 2015-06-30
Filing date: 2015-06-30
Publication date: 2017-06-23
Also published as: KR20170003289A

Abstract

본 명세서에는, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주, 이를 이용한 감마 글루타밀트랜스퍼레이즈 생산 방법 및 이를 이용한 식품 제조방법이 개시된다. 본 발명의 일 관점인 균주는 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가지며, 따라서 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 대량 생산에 유리하다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 용혈현상을 일으키지 않고, 인체에 해로운 물질을 생성하지 않기 때문에, 식품 분야 또는 제약분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 높은 균주와 이를 이용한 식품 및 약학조성물의 제조 방법{Strains having high gamma-glutamyltransferase activity, and method for manufacturing food composition and pharmaceutical composition using the same}

본 명세서에는, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성이 높은 균주, 이를 이용한 감마 글루타밀트랜스퍼레이즈 생산 방법 및 이를 이용한 발효방법이 개시된다.

최근 미생물은 고부가가치 경제적 이윤을 창출할 수 있는 핵심 생물소재로 점점 각광을 받고 있다. 순수한 미생물 및 관련 분야의 세계 시장규모는 연간 약 100억불(약 10조원)로 추정되고 있고, 미생물이 생산 하는 항생제 등의 의약품을 합치면 미생물은 세계 바이오시장의 30%를 차지한다. 현재 바이오산업에서 가장 각광을 받고 있는 바이오시밀러(Biosimilar)로 대부분 미생물을 통해 의약 물질을 생산하고 있고, 이 중 신장병 환자에게 투여되는 적혈구 생산 촉진물질인 EPO(Erythropoietin)만 하더라도 2008년, 세계 매출이 100.5억불(약 1조원)에 달하여 미생물 관련 시장의 산업적 규모를 짐작할 수 있다. 한편 획기적으로 밝혀지는 미생물 유전체 해독은 현재 완전히 해독된 것이 1,250개, 해독 중인 것이 현재 4200개로 알려졌다. 이러한 미생물의 유전체 연구결과는 미생물이 갖는 공장, 농장, 발전소 기능을 완벽하게 알게 하여 차세대 정밀화학 소재, 식품소재, 에너지소재, 환경소재 및 의약소재 등을 발굴하여 효율적으로 산업화에 적용할 수 있을 것으로 기대되고 있다. 게다가 배양하기 어렵거나 해양 또는 극한 환경에서 살아가는 미생물의 99% 이상이 아직 발견되지 않았는데, 이러한 미생물과 함께 해당 특정 환경의 다양한 유전체 자원(Metagenome)을 함께 확보하여 활용할 경우에는 생물의약품, 효소, 항생제 등의 다양한 분야에서의 활용도가 더욱 높아질 것이다. 뿐만 아니라 기존의 화학공정을 대체하는 환경 친화적인 녹색기술인 바이오리파이너리(Biorefinery)에 합성생물학(Synthetic biology)이 도입되어 이용된다면 더 막대한 경제적 가치를 창출할 수 있을 것으로 전망된다.

유전체 시대의 미생물 산업, Biosafety Vol.11 No.1, 오태광, 2010.06.09. 22-29pages

일 측면에서, 본 발명의 목적은, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성이 높은 균주를 제공하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 저비용으로 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈를 대량 생산하는 것이다.

다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 풍미, 예컨대, 감칠맛, 입안에 꽉찬 느낌, 맛의 두께감, 맛의 지속성이 향상된 식품을 제공하는 것이다.

일 측면에서, 본 발명은, 높은 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주이다.

다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물이다.

다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 생산방법이다.

다른 측면에서, 본 발명은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다.

본 발명의 일 관점인 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주는, 우수한 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가지며, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 대량 생산에 유리하다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 용혈현상을 일으키지 않고, 인체에 해로운 물질을 생성하지 않기 때문에, 식품 분야 또는 제약분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

도 1은, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주의 기탁증이다.
도 2는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주(오른쪽)와 바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주(왼쪽)의 형태를 비교한 도이다.
도 3은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주와 다른 균주의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 비교한 도이다.
도 4는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 용혈성 테스트 결과를 보이는 도이다.
도 5는, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 바이오제닉 아민 생성능 테스트 결과를 보이는 도이다.
도 6은, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 16s rDNA의 서열을 보이는 도이다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다.

본 발명은 일 관점에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주이다.

본 명세서에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase, GGT, gamma-GT) 또는 감마-글루타밀 전이효소는, 감마-글루타밀 트랜스펩티다아제(gamma-glutamyl transpeptidase, GGTP)라고도 불리우는 효소를 의미할 수 있다. 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈는, 감마-글루타밀 화합물의 글루타밀기를 다른 수용체로 전이시키는 효소를 의미할 수 있다. 구체적으로, 글루타민에 특이적으로 작용하여 글루타민의 감마-글루타밀기를 히드록실아민으로 전이하는 효소를 의미할 수 있고, 그 결과 글루탐산을 생산하는 효소를 의미할 수 있다. 또한, 글루타밀펩타이드의 글루탐산을 다른 아미노산으로 전이시킨 결과 감마-글루타밀펩타이드를 생산하는 효소를 의미할 수 있다.

상기와 같은 관점에서, 상기 균주는, 포도당 2 %, 효모 추출물1.5 %, 옥수수침지액(corn steep) liquor 1 %, MgSO₄ _·7H₂O 0.05% 및 K₂HPO₄ _·3H₂O 0.1 %를 포함하는 배지에서, 상기 균주를 10⁶CFU/ml로 접종하고, 37℃의 온도에서 72시간 배양한 경우, 5000mU/ml이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것일 수 있다.

또한, 상기 조건에서, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성은 4000mU/ml 이상일 수 있고, 5000mU/ml 이상, 5500mU/ml이상, 6000mU/ml이상, 6500mU/ml이상, 또는 7000mU/ml이상일 수 있다.

상기와 같은 관점에서, 상기 균주는 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) DSM7 균주와 비교하였을 때, 50배 이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 가질 수 있다.

본 명세서에서 효소 활성은, 단위시간당 기질을 최종산물로 전환하는 효소의 양을 의미할 수 있다.

본 발명의 일 관점인, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주에 있어서, 상기 균주는 기탁번호 KCTC12822BP의 균주일 수 있다.

상기와 같은 관점에서, 상기 균주는 용혈성이 없고 바이오제닉 아민(biogenic amine)을 생산하지 않으므로 인체에 무해할 수 있다. 본 명세서에서 용혈성이란, 균주가 적혈구를 파괴하는 현상을 의미할 수 있다.

또한, 상기와 같은 관점에서, 상기 균주는 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것일 수 있다. 본 명세서에서 바이오제닉 아민이란, 미생물의 대사과정 중에 생성될 수 있는데, 알러지 유발 물질, 발암물질 또는 식중독 등의 인체에 유해한 작용을 일으킬 수 있는 질소화합물을 의미할 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 조성물일 수 있다.

본 명세서에서 배양물이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.

상기와 같은 관점에서, 상기 조성물은 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 또한, 식품 조성물은 발효식품일 수 있다. 본 명세서에서 발효식품은 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주에 의하여 발효된 식품, 발효가 진행중인 식품, 또는 발효를 촉진하는 식품을 의미할 수 있으며, 예컨대, 식초, 간장, 된장, 고추장과 같은 콩 발효식품, 발효유제품, 김치, 젓갈과 같은 소금절임류 또는 조미료와 같은 풍미제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 일 관점에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.

본 발명의 일 관점인 약학적 조성물에 있어서, 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 있어서, 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명의 일 관점에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주를 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 생산방법이다.

또한, 본 발명은 다른 관점에서, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다. 상기와 같은 관점에서, 균주 또는 그 배양물을 식품에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 일 관점인 식품 제조방법에 있어서, 상기 방법에 의하여 제조된 식품은 향상된 풍미를 가질 수 있다. 본 명세서에서 풍미란, 식품에서 사람이 느낄 수 있는 깊은 맛 또는 감칠맛을 의미할 수 있다. 풍미는 식품 내 글루탐산 또는 다양한 펩타이드 특히, 감마-글루타밀펩타이드의 함량 증가에 의한 것일 수 있다. 또한, 상기 방법에 의하여 제조된 식품은 풍미를 오랫동안 지속할 수 있어서 유리하다.

상기와 같은 관점에서, 상기 균주 배양은 45℃이하의 온도에서 수행하는 것일 수 있다. 구체적으로, 배양 온도는 10℃ 이상 45℃이하, 15℃ 이상 45℃이하, 20℃ 이상 45℃이하, 25℃ 이상 45℃이하, 30℃ 이상 45℃이하, 35℃ 이상 45℃이하, 10℃ 이상 40℃이하, 10℃ 이상 35℃이하, 10℃ 이상 30℃이하, 10℃ 이상 25℃이하 또는 10℃ 이상 20℃이하일 수 있고, 약 37℃ 내외에서 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 활성이 가장 우수할 수 있다.

또한, 상기 균주 배양은 풍부한 질소원이 주어지는 환경에서 수행될 수 있다. 질소원이 풍부할 때, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈의 활성이 우수할 수 있다. 본 명세서에서 질소원은, 균주 생장에 필요한 질소를 공급하는 물질을 의미하여, 공지의 것이라면, 제한되지 않고 포함할 수 있다.

또한, 상기 균주 배양은, 상기 환경에서 20시간 이상 170 시간 이하의 시간동안 수행하는 것일 수 있다. 1시간 내지 200시간, 10시간 내지 190시간, 15시간 내지 185시간, 20시간 내지 180시간, 20시간 내지 175시간 또는 24시간 내지 170시간 동안 배양할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.

[실시예 1] 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주의 동정

[실시예 1-1] 식품 미생물의 분리

시중의 된장, 고추장, 청국장 등의 발효식품을 구입하여 바실러스의 분리를 하였다. 구입한 발효식품을 분쇄하여 발효식품 1g을 생리식염수로 현탁하고 희석한 현탁액의 상등액 0.2ml을 TSA( Tryptone 1.5%, Soybeanmeal digest 0.5%, sodium chloride 0.5%, agar 1.5%) 배지에 접종하여 37도에서 24시간 배양하여 분리하였다. 배양된 미생물의 형태적 차이를 이용하여 1차 선별하였다.

[실시예 1-2] 유해 미생물의 선별 및 제거

식중독을 유발하는 바실러스 세레우스(Bacillus cereus)의 판별 배지인 MYP 배지(Mannitol Egg Yolk Polymyxin Agar)에 균주를 접종하고 37℃에서 18시간 동안 배양하였다. 상기 배지는 육추출물0.1%, 펩톤 1%, 만니톨(mannitol) 1%, 염화나트륨 1%, 페놀레드 0.0025%, 아가(agar) 1.2%, 폴리믹신 B 50000IU/L, 달걀노른자(egg yolk) 2.5%를 포함하였다. 분홍 색을 나타내며 주변에 띠를 형성하는 균주를 바실러스 세레우스로 판단하여 선별 및 제거하였다.

[실시예 1-3] 균주의 동정

분리균주를 K 배지(포도당 2%, 효모추출물 2%, K₂HPO₄ 1.25%, KH₂PO₄ 0.39%, (NH₄)₂SO₄ 0.4%, MgSO₄ _·7H₂O 0.12%) 100 ml에 약 10⁶ CFU/ml로 접종하여 37℃에서 72 시간 배양한 배양액의 상등액을 취하여 13000 rpm으로 10분간 원심분리한 후, 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(Gamma-glutamyltransferase) 분석 킷트(Biovision, cat. K-784-100)를 이용하여 그 활성을 측정하였고 그 중 효소활성이 높은 균주를 선별하였다.

그 후, 활성이 높은 균주의 DNA를 추출하고 27F, 1492R 프라이머를 이용(표 1)하여, 16s rRNA를 증폭시키고, 분석한 서열 정보를 NCBI(www.ncbi.nlm.nih.gov)의 BLAST를 이용하여 동정하였다. 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주를 동정할 수 있었다.

아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주의 16s rDNA 서열은 서열번호 1과 같다.

서열번호 2	27F	AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
서열번호 3	1492R	GGTTACCTTGTTACGACTT

[실시예 2] 다른 균주와의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교

실시예 1-3에서와 동일한 방법으로, 효소 활성을 측정하였다. 표준균주인 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 균주와 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 균주, 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 균주에서의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 측정하였다. 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7 균주와 바실러스 서브틸리스 균주는 한국 미생물자원센터에서 얻었고, 바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42 균주는 독일 미생물자원센터(DSMZ)로부터 얻었다. 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주는 약 4000mU/ml이상의 효소 활성을 나타내어, 다른 균주보다 효소 활성이 우수함을 알 수 있었다(표 2).

균주	감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml)
바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469	4000~5000
표준균주 바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7	0 ~ 30

[실시예 3] 배양 배지에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교

배지로, K배지 대신 고영양 배지를 사용한 점만 제외하고, 실시예 1-3과 동일하게 효소 활성을 측정하였다. 고영양 배지의 조성은 다음과 같다: 포도당 2 %, 효모추출물 1.5 %, 옥수수침지액(corn steep liquor) 1 %, MgSO₄·7H₂O 0.05%, K₂HPO_4·3H₂O 0.1 %.

그 결과는 표 3 및 도 3과 같다.

감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml)
균주 / 배지의 종류	K 배지	고영양 배지
바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469	4000 ~ 5000	5000 ~ 7000
바실러스 아밀로리퀴파션스 DSM7	0 ~ 30	0 ~ 100
바실러스 아밀로리퀴파션스 FZB42	0 ~ 500	1000 ~ 2000
바실러스 서브틸리스	0 ~ 600	1000 ~ 2000

[실시예 4] 배양 시간에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교

배양시간이 효소 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시예3과 동일한 환경에서 배양 시간만 달리하여, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 24시간 내지 168시간 배양하였을 경우, 가장 우수한 효소 활성을 나타냄을 알 수 있었다(표 4).

배양시간	감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml)
24 시간 미만	0 ~ 1000
24~168 시간	5000 ~ 7000
168 시간 이상	3000 ~ 4000

[실시예 5] 배양 온도에 따른 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성의 비교

온도가 효소 활성에 미치는 영향을 확인하기 위해, 실시예 1-3과 동일한 환경에서, 발효 온도만 달리하여, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과, 약 40℃에서 효소 활성이 우수하고 약45℃ 이상의 온도에서는 효소활성이 떨어지는 것을 확인할 수 있었다(표 5).

배양온도	감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성(mU/ml)
40 ℃	4000 ~ 5000
45 ℃	1000 ~ 2000

[실시예 6] 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 용혈성 측정

알파용혈성(alpha hemolysis) 판별용 토끼 혈액(기산바이오텍)과 베타용혈성(beta hemolysis) 판별용 양 혈액 (한일komed)을 섬유소가 제거된 형태(Defibrinated blood)로 준비하였다. TSA 배지에 5%씩 혈액을 첨가하여 평판배지를 제조하고 배지에 멸균된 침으로 단일콜로니를 취해 찍어주었다. 알파용혈성의 경우 37℃에서 18 시간 배양 후 콜로니 주변을 관찰하고, 베타용혈성의 경우 37℃에서 18 시간 배양 후 4℃ 냉장고에 밤새 보관한 뒤 관찰하였다. 콜로니 주변의 혈액 분해 여부에 따라 용혈성 여부를 판별했다. 그 결과, 본 발명의 균주는 용혈성이 없음을 확인할 수 있었다(도 4)

[실시예 7] 바이오제닉 아민 생성능 확인

0.006% 지시약(Bromocresol Purple)을 함유한 LB (tryptone 1%, yeast extract 0.5%, sodium chloride 1%) 액체배지 3종을 제조하고 i)아미노산 무첨가 ii)0.1% histidine 첨가 iii) 0.1% tyrosine 첨가) 균주를 접종하여 37 ℃에서 24시간동안 배양하였다. 상층액만을 분리한 뒤 pH, 590nm에서의 흡광도를 측정하여 i) 아미노산 무첨가 배지보다 ii), iii) 아미노산을 전구체로 넣어준 배지에서 pH와 흡광도값이 더 높은 경우, 바이오제닉 아민 생성능이 있는 것으로 판별하였다. 그 결과 본 발명 균주는 바이오제닉 아민을 생성하지 않는 것을 확인할 수 있었다(도 5).

[비교예] 바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주와의 특성 비교

[비교예 1] 형태학적 비교

한국특허출원번호 10-2012-0016591의 바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주(KCCM 11249BP)와 본 발명 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 형태학적 특성을 비교하였다. 그 결과 바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주는 불규칙한 모양이며, 주름이 있는 형태인 반면, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주는 주름이 없고 위로 봉긋하게 올라온 형태를 띄어 양자의 형태학적 차이를 확인할 수 있었다(도 2).

[비교예 2] 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성 비교

바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주와 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 비교하였다. 바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주는 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을410nm에서 측정한 흡광도가 약 0.9였고, 그 결과 본 발명의 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주의 효소 활성이 약 13배 이상 우수함을 알 수 있었다.

바실러스 아밀로리큐파시엔스 KC41 균주의 pNA생성량을, 410nm 에서의 흡광도와 pNA생성량의 관계를 나타내는 회귀식(흡광도=0.027 X pNA 생성량)과 흡광도값 0.9를 이용하여 pNA의 생성량을 구한 결과, 약 33nM의 pNA 생성을 확인할 수 있었다. 이 때의 효소 활성(mU/ml)은 pNA의 생성량(33nM)을 반응시간(10분) 및 효소 첨가량(0.01667ml)으로 나누어 구한 결과, 약 198mU/ml였다. 반면, 바실러스 아밀로리퀴파션스 SMB-469 균주는 30배 희석한 효소액으로 반응 했을 때, 418nm에서의 회귀식(흡광도= 0.0198 X pNA 생성량)과 흡광도 0.51을 이용하여 pNA의 생성량을 구한 결과 약 26nM 이었으며, 여기에 희석비율(30)을 곱하여 약 780nM의 pNA 생성함을 확인할 수 있었다. 이때의 효소 활성(mU/ml)은, pNA의 생성량(780nM)을 반응시간(30분) 및 효소 첨가량(0.01ml)으로 나누어 구한 결과, 약 2600mU/ml였다.

본 발명의 일 관점에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

[제형예 1] 간장

성분	함량(중량%)
실시예 1의 균주 분말	2%
탈지 대두	22.4%
소맥밀	10%
천일염	5%
액상과당	5%
합성보존료	1%
정제수	60%
질소	1.3%
기타	잔량

[제형예 2] 된장

성분	함량(중량%)
실시예 1의 균주 분말	2%
탈지 대두	40%
소맥분	10%
정제소금	5%
알파대두분	5%
고춧가루	5%
정제수	30%
종국	1.3%
기타	잔량

한국생명공학연구원

KCTC12822BP

20150529

<110> SAMPIO FOOD COMPANY <120> Strains having high gamma-glutamyltransferase activity and method <130> 15P312IND <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1059 <212> DNA <213> Bacillus amyloliquefacience SMB-469_16s rDNA <400> 1 ggctaccact tacagatgga cccgcggcgc attagctagt tggtgaggta acggctcacc 60 aaggcgacga tgcgtagccg acctgagagg gtgatcggcc acactgggac tgagacacgg 120 cccagactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccgc aatggacgaa agtctgacgg 180 agcaacgccg cgtgagtgat gaaggttttc ggatcgtaaa gctctgttgt tagggaagaa 240 caagtgccgt tcaaataggg cggcaccttg acggtaccta accagaaagc cacggctaac 300 tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt tgtccggaat tattgggcgt 360 aaagggctcg caggcggttt cttaagtctg atgtgaaagc ccccggctca accggggagg 420 gtcattggaa actggggaac ttgagtgcag aagaggagag tggaattcca cgtgtagcgg 480 tgaaatgcgt agagatgtgg aggaacacca gtggcgaagg cgactctctg gtctgtaact 540 gacgctgagg agcgaaagcg tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc 600 gtaaacgatg agtgctaagt gttagggggt ttccgcccct tagtgctgca gctaacgcat 660 taagcactcc gcctggggag tacggtcgca agactgaaac tcaaaggaaa ttgacggggg 720 cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 780 cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 840 ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 900 aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 960 accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1020 gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcga 1059 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_27F <400> 2 agagtttgat cctggctcag 20 <210> 3 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer_1492R <400> 3 ggttaccttg ttacgactt 19

Claims

감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 활성을 갖는, 기탁번호가 KCTC12822BP인, 바실러스 아밀로리퀴파션스(Bacillus amyloliquefacience) SMB-469 균주.
제1항에 있어서,
상기 균주는,
포도당 2 %, 효모 추출물1.5 %, 옥수수침지액(corn steep liquor) 1 %, MgSO₄ _·7H₂O 0.05% 및 K₂HPO₄ _·3H₂O 0.1 %를 포함하는 배지에서, 상기 균주를 10⁶CFU/ml로 접종하고, 37℃의 온도에서 72시간 배양한 경우,
5000mU/ml이상의 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈 활성을 갖는 것인, 균주.
삭제
제1항 또는 제2항의 균주 또는 그 배양물을 유효성분으로 포함하는 식품 조성물.
삭제
제4항에 있어서,
상기 식품 조성물은, 발효식품인, 조성물.
제1항 또는 제2항의 균주를 45℃이하의 온도에서 20 내지 170 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 감마-글루타밀트랜스퍼레이즈(gamma-glutamyltransferase) 생산방법.
삭제
삭제
제1항 또는 제2항의 균주를 45℃이하의 온도에서 20 내지 170 시간 동안 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법.
제10항에 있어서,
균주 또는 그 배양물을 식품에 첨가하는 단계를 포함하는 식품 제조방법.