KR101829338B1 - 루이신 아미노펩티데이즈 활성이 높은 전통메주 유래 아스퍼질러스 오리제 smf 119 균주 - Google Patents

루이신 아미노펩티데이즈 활성이 높은 전통메주 유래 아스퍼질러스 오리제 smf 119 균주 Download PDF

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Abstract

본 명세서에는, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119 균주, 이를 이용한 루이신 아미노펩티데이즈 생산 방법 및 이를 이용한 식품 제조방법이 개시된다. 본 발명의 일 관점인 균주는 높은 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 가지므로 이를 배양하여 루이신 아미노펩티데이즈를 대량생산할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 식품의 쓴맛이 감소하고, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 독성물질을 생산하지 않기 때문에 식품 분야 또는 제약분야에서 유용하게 사용할 수 있다.

Description

루이신 아미노펩티데이즈 활성이 높은 전통메주 유래 아스퍼질러스 오리제 SMF 119 균주{Aspergillus oryzae SMF119 strain having high leucine aminopeptidase activity, derived from Korean traditional fermented dried soybean}
본 명세서에는, 루이신 아미노펩티데이즈 활성이 높은 균주, 이를 이용한 루이신 아미노펩티데이즈 생산 방법 및 이를 이용한 발효방법이 개시된다.
발효식품이란 젖산균이나 효모 등 미생물의 발효 작용을 이용하여 만든 식품을 의미한다. 발효식품 제조에 사용되는 식품의 재료뿐만 아니라 미생물의 종류에 따라 발효식품의 맛과 성분이 달라진다. 구체적으로, 콩류의 발효식품의 경우, 발효를 통해, 주요 향미 성분인 아미노산과 펩타이드를 얻을 수 있는데, 아미노산 20종은 각기 맛이 다른 것으로 알려져 있다. 글라이신, 알라닌, 프로린, 트레오닌, 세린은 단맛을 아르기닌, 히스티딘, 루이신, 발린, 라이신, 메티오닌, 페닐알라닌, 이소루이신은 쓴맛을, 글루탐산와 아스파트르산은 감칠맛을 보이는 성분으로 알려져 있다. 이중 글루탐산은 대표적인 감칠맛성분으로 식품산업에서 매우 중요하게 여겨지고 있다. 또한, 펩타이드도 다양한 맛 특성을 가지고 있으며 사슬의 길이에 따라 맛 특성이 다르다고 보고되고 있다. N-terminal에 소수성 아미노산이 위치하고 있는 펩타이드는 쓴맛을, 산성아미노산이 위치하고 있는 펩타이드는 감칠맛과 고꾸미(맛의 지속성, 무게감)을 나타낸다고 알려져 있다.
따라서, 발효식품의 향미를 증진시키기 위해서, 풍미를 향상시키는 아미노산의 함량은 증가시키면서 쓴맛을 내는 펩타이드의 함량을 감소시키는 방법이 요구된다. 이를 위해, 단백분해효소(protease)의 활성이 높은 균주를 이용하여 발효식품을 제조하는 방법이 알려져 있으나 발효식품의 향미 향상에 큰 도움이 되지 않아, 한계가 있다. 따라서, 발효식품의 풍미를 효과적으로 개선할 수 있는 방법과, 그에 사용할 수 있는 균주의 개발이 필요한 실정이다.
국무창, 전통발효식품으로부터 protease 활성을 보유한 유산균의 분리 및 동정, Food Engineering Progress, Vol.5, No.2, pp182-187, 2011.5.
일 측면에서, 본 발명의 목적은, 루이신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase) 활성이 높은 균주를 제공하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 생물자원을 이용하여 루이신 아미노펩티데이즈를 대량생산하는 것이다.
다른 측면에서, 본 발명의 목적은, 쓴맛이 감소하고, 풍미, 감칠맛 및 고꾸미(지속성, 무게감)가 우수한 발효 식품을 제공하는 것이다.
일 측면에서, 본 발명은, 루이신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase) 활성을 갖는, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119 균주이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주를 배양하는 단계를 포함하는 루이신 아미노펩티데이즈 생산방법이다.
다른 측면에서, 본 발명은, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다.
본 발명의 일 측면인 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주는, 높은 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 가지므로 이를 배양하여 루이신 아미노펩티데이즈를 대량생산할 수 있다. 또한, 상기 균주를 이용하여 식품을 발효시킬 경우, 식품의 쓴맛이 감소하고, 풍미가 우수한 식품을 얻을 수 있다. 또한, 본 발명의 일 관점인 균주는 독성물질을 생산하지 않기 때문에 식품 분야 또는 제약분야에서 유용하게 사용할 수 있다.
도 1은, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 콜로니 형태(도 1a)와 포자형태(도 1b)를 보이는 사진이다.
도 2a는, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 루이신아미노펩티데이즈 활성을 보이는 도이다.
도 2b는, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 프로테아제 활성을 보이는 도이다.
도 3은, 베타-튜블린 서열을 이용한 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 계통도이다.
도 4는, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주와 아스퍼질러스 오리제 RIB40 균주를 이용하여 제조한 간장에서의 유리아미노산(도 4a)과 총아미노산의 함량(도 4b)을 상대적으로 보이는 도이다.
도 5a는, 온도 조건에 따른 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 루이신아미노펩티데이즈 활성을 보이는 도이다.
도 5b는, 배지의 지방함량에 따른 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 루이신아미노펩티데이즈 활성을 보이는 도이다.
도 6은, 아스퍼질러스 오리제 SMF119의 베타 튜불린 서열을 보이는 도이다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은, 일 측면에서, 루이신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase) 활성을 갖는, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119 균주이다.
루이신 아미노펩티데이즈는 엑소펩티다아제 중 아미노펩티다아제의 일종으로, 펩티드 사슬의 N말단에서 차례로 아미노산을 유리시키는 효소이다. 루이신 아미노펩티데이즈는 루이신(leucine)에 대한 기질 특이성이 높지만, 다른 아미노산들도 유리시킬 수 있다. 루이신 아미노펩티데이즈는 루실 펩티다아제 또는 루실 아미노펩티다아제로도 불리고, 약어 LAPs로도 불린다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는, 대두, 물 및 황산아연을 포함하는 배지에서, 균주를105CFU/g으로 접종하고, 30℃의 온도에서 72시간 배양한 경우, 30unit/g이상의 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 갖는 것일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 대두는 대두 총중량을 기준으로40~50 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 상기 배지는, 예컨대, 대두의 수분이 40~50중량%가 되도록 대두 5kg에 물을 약 4.1kg 가하고 증자한 대두를 포함할 수 있다. 상기 대두는 탈지대두일 수 있다. 상기와 같은 측면에서, 상기 배지에는 상기 황산아연이 배지 중량 대비 750ppm(w/w)으로 포함될 수 있다.
상기 조건에서, 루이신 아미노펩티데이즈 활성은 30unit/g 이상일 수 있고, 35unit/g 이상, 40unit/g 이상, 45unit/g 이상 또는 50unit/g 이상일 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) RIB40 균주와 비교하였을 때, 4배 이상의 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 가질 수 있다.
본 명세서에서, 효소 활성은, 단위시간당 기질을 최종산물로 전환하는 효소의 양을 의미할 수 있다. 예컨대, 본 명세서에서 루이신 아미노펩티데이즈 활성은 기질인 L-루이신-p-니트로아닐라이드(L-Leucine-p-nitroanilide)의 L-루이신을 분해시키는 효소의 양을 의미할 수 있다. 본 명세서에서, 루이신 아미노펩티데이즈 활성 단위 1 유닛(unit)은, 50℃에서 분당 1.0μmole의 L-Leucine-p-nitroanilide을 p-Nitroanilline으로 분해하는 효소의 양을 의미할 수 있다.
상기와 같은 균주에서 상기 균주는, 아플라톡신을 생산하지 않는 것일 수 있다. 본 발명의 일 측면인 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주는, 아플라톡신을 생산하지 않으므로, 인체에 무해할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 균주는, 기탁번호 KCTC12947BP인, 균주일 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물이다.
본 명세서에서 균주 파쇄물이란, 균주 자체를 화학적 또는 물리적 힘에 의하여 파쇄하여 얻은 산물을 의미할 수 있다.
본 명세서에서 배양물이란, 균주를 배양한 배지 내에 포함되어 있는 모든 물질을 포함하는 물질을 의미할 수 있으며, 예컨대 균주 배양의 결과물인 대사물 또는 분비물을 포함하는 물질 또는 그 파쇄물을 의미할 수 있고 균주 자체도 배양물 내에 포함되어 있을 수 있다.
본 명세서에서, 추출물이란, 균주 자체, 균주의 파쇄물, 그 배양물 또는 이들의 혼합물을 추출용매를 이용하여 추출한 산물을 의미할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 조성물은, 식품 조성물 또는 약학적 조성물일 수 있다. 상기 식품 조성물은, 발효식품일 수 있고, 콩 발효식품일 수 있다. 상기와 같은 측면에서, 콩은, 완두콩, 대두, 장단콩, 강낭콩, 청태, 검은콩, 서리태, 서목태, 울타리콩, 까치콩, 밤콩 또는 줄콩을 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 콩은 대두일 수 있다.
본 명세서에서 발효식품은, 균주에 의하여 발효된 식품, 발효가 진행중인 식품, 또는 발효를 촉진하는 식품을 의미할 수 있으며, 예컨대, 간장, 어간장, 된장, 청국장, 고추장과 같은 콩 발효식품, 발효유제품, 김치, 젓갈, 액젓과 같은 소금절임류 또는 조미료와 같은 풍미제를 포함할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 균주를 사용하여 제조된 발효식품은, 쓴맛이 감소하고, 고꾸미와 감칠맛은 향상된다. 상기 균주는 아미노펩티데이즈 활성이 높기 때문에, 이를 이용하여 제조한 발효식품에는 유리 아미노산 및 총 아미노산이 다량 함유되어 있는 한편 쓴맛과 연관이 있는 소수성 펩타이드는 소량 함유되어 있기 때문일 수 있다. 본 명세서에서, 소수성 펩타이드는 소수성 아미노산으로 이루어진 펩타이드를 의미할 수 있다. 또한, 본 명세서에서 유리 아미노산은 단백질이나 펩타이드에 결합하지 않고 아미노산이 단독분자로 존재하는 것을 의미할 수 있고, 총 아미노산은, 결합상태 아미노산 및 유리아미노산을 포함하여 검출시료 내 존재하는 아미노산의 총합을 의미할 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 식품 조성물의 제형은 특별히 한정되지 않으나, 예를 들어, 정제, 과립제, 분말제, 드링크제와 같은 액제, 캐러멜, 겔, 바 등으로 제형화될 수 있다. 식품 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 증진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 포함할 수 있다. 각 제형의 식품 조성물은 유효 성분 이외에 해당 분야에서 통상적으로 사용되는 성분들을 제형 또는 사용 목적에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있으며, 다른 원료와 동시에 적용할 경우 상승 효과가 일어날 수 있다.
본 발명의 일 관점인 약학적 조성물에 있어서, 약학 조성물은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 연질 또는 경질 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 하나 이상의 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로오스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 스테아린산 마그네슘, 탈크 등과 같은 윤활제들도 사용된다. 경구투여를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁용제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 있어서, 조성물은 목적하는 바에 따라 비경구 투여하거나 경구 투여할 수 있으며, 하루에 체중 1 ㎏당 0.1~500 ㎎, 바람직하게는 1~100 ㎎의 양으로 투여되도록 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다. 특정 환자에 대한 투여용량은 환자의 체중, 연령, 성별, 건강 상태, 식이, 투여 시간, 투여 방법, 배설률, 질환의 중증도 등에 따라 변화될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 연질 또는 경질 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 주사제 및 멸균 주사용액 등을 비롯하여 약제학적 제제에 적합한 어떠한 형태로든 제형화하여 사용될 수 있다.
본 발명의 일 관점에 따른 조성물은, 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 비경구, 경구 등의 다양한 경로로 투여될 수 있으며, 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 경피(trandermally), 정맥, 근육, 피하주사에 의해 투여될 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 아스퍼질러스 오리제 SMF 119 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 루이신 아미노펩티데이즈 생산방법이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법은, 상기 균주를 28 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, 28 내지 32℃에서 18시간 이상, 24시간 이상, 30시간 이상, 40시간 이상, 50시간 이상, 60시간 이상, 70시간 이상, 80시간 이상, 90시간 이상, 100시간 이상, 110시간 이상, 120시간 이상 또는 130시간 이상 배양할 수 있다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법은 상기 균주를 28 내지 32℃에서 18 내지 30시간 동안 배양한 후, 22 내지 28℃에서 20 내지 120시간 동안 배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 구체적으로, 상기 균주를 28 내지 32℃, 28 내지 31℃, 29 내지 32℃,또는 29 내지 31℃에서, 18시간 이상, 20시간 이상, 22시간 이상, 23시간 이상, 24시간 이상, 26시간 이상, 28시간 이상 또는 30시간 이상 배양할 수 있고, 30시간 이하, 28시간 이하, 26시간 이하, 24시간 이하, 23시간 이하, 20시간 이하 또는 18시간 이하의 시간동안 배양 할 수 있다. 그 후, 배양 온도를 바꾸어, 예컨대, 22 내지 28℃, 23 내지 28℃, 24 내지 28℃, 22 내지 27℃, 22 내지 26℃ 또는24 내지 26℃에서, 20시간 이상, 30시간 이상, 40시간 이상, 50시간 이상, 60시간 이상, 70시간 이상, 80시간 이상, 90시간 이상, 100시간 이상, 110시간 이상 또는 120시간 이상 배양할 수 있고, 120시간 이하, 110시간 이하, 100시간 이하, 90시간 이하, 80시간 이하, 70시간 이하, 60시간 이하, 50시간 이하, 40시간 이하, 30시간 이하 또는 20시간 이하로 배양할 수 있다. 상기 균주를 30℃에서 24시간 동안 배양한 후, 25℃에서 2일 이상 배양했을 때, 루이신아미노펩티데이즈의 활성이 가장 우수할 수 있다.
일 구현예에서, 상기 균주는, 대두 및 물을 포함하는 배지에서 배양할 수 있다. 상기 대두는 대두 총중량을 기준으로40~50 중량%의 수분을 포함할 수 있다. 상기 배지는, 예컨대, 대두의 수분이 40~50중량%가 되도록 대두 5kg에 물을 약 4.1kg 가하고 증자한 대두를 포함할 수 있다. 일 구현예에서 상기 균주는 함유된 지방의 함량이 높은 대두를 이용하여 배양할 때, 우수한 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 가질 수 있다.
본 발명은 다른 측면에서, 상기 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법이다.
상기와 같은 측면에서, 상기 방법은, 상기 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119 균주는 2015년 11월 12일에 미생물자원센터(Korean Collection for Type Cultures, KCTC)에 미생물 기탁번호 KCTC12947BP로 기탁하였다.
이하, 하기의 실시예를 통하여 본 발명을 보다 구체적으로 설명한다. 그러나, 하기 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐, 본 발명의 범주 및 범위가 이에 한정되지 않는다.
[실시예 1] 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주의 분리
[실시예 1-1] 1차 선별
전국 시, 군, 구 총 69개 지역의 전통메주를 수집하여 곰팡이 균주를 분리하였다. 수집한 전통메주를 분쇄하여 1g을 생리식염수로 현탁하고 희석한 현탁액의 상등액 0.2ml을 DifcoTM 사의Potato Dextrose Agar(PDA; Potato Starch 0.4%, Dextrose 2.0%, Agar 1.5%), Dichloran-Glycerol Agar(DG18; Peptone 0.5%, glucose 1.0%, Monopotassium Phosphate 0.1%, Magnesium Sulfate 0.05%, Zinc Sulfate 0.001%, Copper Sulfate 0.0005%, Dichloran 0.0002%, Chloramphenicol 0.005%, Chlortetracycline 0.005%, Agar 1.5% ), DifcoTM 사의 Dichloran Rose Bengal Chloramphenicol Agar(DRBC agar; Proteose Peptone No.3 0.5%, Dextrose 1.0%, Monopotassium Phosphate 0.1%, Magnesium Sulfate 0.05%, Dichloran 0.0002%, Rose Bengal 0.0025%, Chloramphenicol 00.1%, Agar 1.5%)에 도말한 후, 30℃에서 72시간 배양하며 곰팡이 균주를 분리하였다. 분리된 균주들을 형태적 특성 및 포자 생성능의 차이를 이용하여, 아스퍼질러스 속 표준균주와 유사한 균주를 1차적으로 선별하였다(도 1a 및 도1b).
[실시예 1-2] 2차 선별
상기 실시예 1-1에서 1차적으로 선별된 균주들의 루이신아미노펩티데이즈(Leucine Aminopeptidase)와 프로테아제(Protease) 활성을 측정하여 효소활성이 우수한 균주를 2차 선별하였다.
증자한 탈지대두(수분 함량 40~50%)와 미네랄(ZnSO4, 750ppm)을 포함하는 고체 배지에 균주들을 105 cfu/g씩 접종하여, 30℃에서 72시간 동안 배양한 후, 효소를 2% NaCl용액에 추출하여 효소 활성을 측정하였다.
루이신아미노펩티데이즈(Leucine Aminopeptidase) 효소활성은 기질 L-루이신-p-니트로아닐라이드(L-Leucine-p-Nitroanilide)가 효소에 의해 L-루이신(L-Leucine)이 분해되면서 p-니트로아닐린(p-nitroaniline)이 노란색으로 발색하는 것을 Biochrom 社의 libra S70을 이용하여 405nm에서 흡광도를 검출함으로써 측정하였다.
한편, 프로테아제 활성은, Skim milk agar(ampicillin 5%, nystatin 0.2%, skim milk 2.0%, agar 2.0%) 중앙에 구멍을 뚫고 효소액 20㎕을 첨가 후 30℃에서 24시간동안 반응하고 투명대(clear zone)의 크기를 측정하였다.
그 결과, 루이신 아미노펩티데이즈 활성이 특히 우수한 균주(아스퍼질러스 오리제 SMF119)를 수득하였다.
한편, 상기 수득한 균주와, 당업자에게 잘 알려져 있는 아스퍼질러스 오리제 RIB40와 표준균주 아스퍼질러스 오리제 CBS100925의 효소활성을 비교해보았다(도 2). 그 결과, 본 발명의 신규한 균주인 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119가 갖는 루이신아미노펩티데이즈(Leucine Aminopeptidase) 활성이 47.6 unit/g으로 가장 높았다.
[실시예 2] 균주의 동정
실시예 1-2에서 선택된 균주의 동정을 위하여, 베타-투불린(β-tubulin) 서열(서열번호 1)을 분석하였다. 실시예 1-2에서 선택된 루이신아미노펩티데이즈 고활성을 갖는 균주의 DNA를 추출하여 Bt2a와 Bt2b 프라이머를 이용하여 베타-투불린유전자(서열번호 1)를 증폭시키고 분석한 서열을 blast search를 통해 상동성을 비교하고 계통수를 작성함으로써 균주를 동정하였다(도 3). 사용한 프라이머 서열(서열번호 2 및 3)은 표1에 명시하였다.
그 결과, 실시예 1-2에서 선택된 균주가 아스퍼질러스 오리제에 속함을 확인할 수 있었다.
프라이머 서열(5'-3') 온도(℃)
Bt2a(서열번호 2) GGTAACCAAATCGGTGCTGCTTTC 61.7
Bt2b(서열번호 3) ACCCTCAGTGTAGTGACCCTTGGC 56.4
[실시예 3] 균주 안전성 평가
균주의 안전성을 평가하기 위하여, 분자유전학적 방법인 아플라톡신 유전자 클러스터 분석을 통해 평가하였다. 이때 사용한 프라이머는 표2에 명시하였다.
아플라톡신을 생산하는 균주인 아스퍼질러스 플라버스(Aspergillus flavus)는 norB/cypA 유전자 증폭 결과가 800bp이며, 아플라톡신을 생산하지 않는 균주인 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 표준균주 CBS100925는 일부가 결여된 400bp 을 보였다. 실시예 1-2의 균주(아스퍼질러스 오리제 SMF119)는 상기 아스퍼질러스 오리제 표준균주와 유사한 결과를 보였는바, 독성이 있는 아플라톡신을 생산하지 않음을 확인할 수 있었다.
프라이머 서열(5'-3') 온도(℃)
AflT-Forward(서열번호 4) GCACCAAATGGGTCTTTCTCGT 68.2
AflT-Reverse(서열번호 5) ATCCACGGTGAAGAGGGTAAGG 67.1
norB / cypA- Forward(서열번호 6) GTGCCCAGCATCTTGGTCCA 62.5
norB / cypA-Reverse(서열번호 7) AGGACTTGATGATTCCTCGTC 59.4
omtA-Forward(서열번호 8) GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC 70.7
omtA-Reverse(서열번호 9) GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG 77.3
aflR-Forward(서열번호 10) TATCTCCCCCCGGGCATCTCCCGG 73.8
aflR-Reverse(서열번호 11) CCGTCAGACAGCCACTGGACACGG 72.1
ver -1-Forward(서열번호 12) GCCGCAGGCCGCGGAGAAAGTGGT 73.8
ver -1-Reverse(서열번호 13) GGGGATATACTCCCGCGACACAGAA 69.1
nor-1-Forward(서열번호 14) ACCGCTACGCCGGCACTCTCGGCAC 75.6
nor-1-Reverse(서열번호 15) GTTGGCCGCCAGCTTCGACACTCCG 74.0
한편, 아플라톡신 생성능이 없는 아스퍼질러스 오리제 표준균주 CBS100925 와의 비교 결과는 하기 표 3과 같다.
균주명 aflt aflR nor1 omtA ver1 norB/cypA
아스퍼질러스 오리제 CBS100925 P P P P P 400bp
아스퍼질러스 플라버스 NRRL3357 P P P P P 800bp
아스퍼질러스 오리제 SMF119 P P P P P 400bp
*표 3에서 P는 PCR 전기 영동시 밴드가 형성된 것을 의미한다(p=positive).
[실시예 4] 아스퍼질러스 오리제 SMF119를 이용하여 제조한 간장의 성분 분석
실시예 1-2에서 루이신아미노펩티데이즈 활성이 가장 높은 것으로 파악된 신규한 균주 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주와, 기존에 알려진 균주인 아스퍼질러스 오리제 RIB40 균주를 이용해 간장을 제조하여 성분을 비교하였다.
각 간장들의 성분비교를 위하여, 아미노산 함량을 분석하였다. 유리 아미노산은, 시료를 희석하여 0.2㎛ syringe filter로 여과한 후 아미노산 분석기(Biochrom 30)로 정량분석 하였다. 또한, 총 아미노산은, 시료를 6N HCl로 105℃에서 24시간 동안 분해한 후, 유리아미노산 분석과 동일한 방법을 통해 정량분석 하였다. 그 결과 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주로 제조한 간장에서 아미노산 함량이 더 높음을 확인할 수 있었다(도 4).
이는 루이신아미노펩티데이즈 효소의 높은 활성으로 콩단백질로부터 분해된 아미노산 및 저분자 펩타이드의 함량은 증가하고 쓴맛 성분인 소수성 펩타이드의 함량이 감소한 결과이다.
[실시예 5] 루이신아미노펩티데이즈 고활성을 얻기 위한 최적 조건 연구
[실시예 5-1] 온도 조건
본 발명의 신규한 균주인 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119의 고체배양을 실시하였다. 고체배양을 위해 배지로 대두를 사용하였으며. 배지의 수분을 40~50%로 맞춘 후 증자하였다. 증자한 대두를 냉각하여 105 cfu/g 수준으로 균주를 접종하여 3일간 배양하였다.
24시간까지는 30℃에서 동일한 조건으로 배양한 후, 24시간 이후 온도를 25℃, 30℃, 35℃로 조절하고 48 시간 동안 배양하고, 효소 활성을 측정하였다. 그 결과 24시간 이후 온도를 25℃로 조절한 실험군의 효소활성이 가장 높았다(도 5a).
[실시예 5-2] 배지의 지방함량 조건
지방함량이 가장 낮은 탈지대두와 지방함량이 가장 높은 대두의 비율을 달리하여 배지의 지방함량을 표4와 같이 조절하였다. 탈지대두와 대두는 시중에서 구입하여 사용하였다. 대두, 탈지대두 또는 이들의 혼합물을 사용하였으며, 배지의 수분을 40~50%로 맞춘 후 증자하였다. 그 후 증자한 대두 등을 냉각하여 105 cfu/g 수준으로 균주를 접종하여 30℃에서 24시간 배양한 후, 25℃에서 48시간 배양하고 효소의 활성을 측정하였다. 그 결과, 배지내 지방함량이 많을수록 효소활성이 높은 경향을 보였으며, 특히 대두만 사용하여 배양시 효소활성이 가장 높았다.
지방함량 1% 10% 15% 20%
탈지대두 1000g 500g 250g 0g
대두 0g 500g 750g 1000g
본 발명의 일 관점에 따른 조성물의 제형예를 아래에서 설명하나, 다른 여러 가지 제형으로도 응용 가능하며, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.
[제형예 1] 간장
성분 함량(중량%)
실시예 1의 아스퍼질러스 오리제 SMF119균주의 분말 2%
탈지 대두 22.4%
소맥밀 10%
천일염 15%
액상과당 5%
보존료 1%
정제수 44.6%
기타 잔량
[제형예 2] 된장
성분 함량(중량%)
실시예 1의 아스퍼질러스 오리제 SMF119균주의 분말 2%
대두 40%
소맥분 10%
정제소금 10%
보존료 3%
정제수 35%
기타 잔량
한국생명공학연구원 KCTC12947BP 20151112
<110> SAMPIO FOOD COMPANY <120> Strains having high leucine aminopeptidase activity, and method for manufacturing food composition and pharmaceutical composition using the same <130> 15P760IND <160> 15 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 516 <212> DNA <213> beta-tubulin <400> 1 gctgctttct ggtatgtctc aatgccttcg agttagtatg ctttggacca aggaactcct 60 caaaagcatg atctcggatg tgtcctgtta tatctgccac atgtttgcta acaactttgc 120 aggcaaacca tctctggcga gcacggcctt gacggctccg gtgtgtaagt acagcctgta 180 tacacctcga acgaacgacg accatatggc attagaagtt ggaatggatc tgacggcaag 240 gatagttaca atggctcctc cgatctccag ctggagcgta tgaacgtcta cttcaacgag 300 gtgcgtacct caaaatttca gcatctatga aaacgctttg caactcctga ccgcttctcc 360 aggccagcgg aaacaagtat gtccctcgtg ccgtcctcgt tgatcttgag cctggtacca 420 tggacgccgt ccgtgccggt cccttcggtc agctcttccg tcccgacaac ttcgttttcg 480 gccagtccgg tgctggtaac aactgggcca agggtc 516 <210> 2 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2a_primer <400> 2 ggtaaccaaa tcggtgctgc tttc 24 <210> 3 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Bt2b_primer <400> 3 accctcagtg tagtgaccct tggc 24 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_AflT-Forward <400> 4 gcaccaaatg ggtctttctc gt 22 <210> 5 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_AflT-Reverse <400> 5 atccacggtg aagagggtaa gg 22 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_norB/cypA- Forward <400> 6 gtgcccagca tcttggtcca 20 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_norB/cypA-Reverse <400> 7 aggacttgat gattcctcgt c 21 <210> 8 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_omtA-Forward <400> 8 gtggacggac ctagtccgac atcac 25 <210> 9 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_omtA-Reverse <400> 9 gtcggcgcca cgcactgggt tgggg 25 <210> 10 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_aflR-Forward <400> 10 tatctccccc cgggcatctc ccgg 24 <210> 11 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_aflR-Reverse <400> 11 ccgtcagaca gccactggac acgg 24 <210> 12 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_ver-1-Forward <400> 12 gccgcaggcc gcggagaaag tggt 24 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_ver-1-Reverse <400> 13 ggggatatac tcccgcgaca cagaa 25 <210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_nor-1-Forward <400> 14 accgctacgc cggcactctc ggcac 25 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer_nor-1-Reverse <400> 15 gttggccgcc agcttcgaca ctccg 25

Claims (14)

  1. 루이신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase) 활성을 갖는, 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) SMF119 균주.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 균주는, 대두, 물 및 황산아연을 포함하는 배지에서, 균주를 105CFU/g으로 접종하고, 30℃의 온도에서 72시간 배양한 경우, 30unit/g이상의 루이신 아미노펩티데이즈 활성을 갖는, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 아플라톡신을 생산하지 않는, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 균주는 기탁번호 KCTC12947BP인, 아스퍼질러스 오리제 SMF119 균주.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 유효성분으로 포함하는 조성물.
  6. 제5항에 있어서,
    상기 조성물은, 식품 조성물인, 조성물.
  7. 제6항에 있어서,
    상기 식품 조성물은, 발효식품인, 조성물.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 발효식품은, 콩 발효식품인, 조성물.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 콩은 대두인, 조성물.
  10. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는, 루이신 아미노펩티데이즈(leucine aminopeptidase) 생산방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 균주를 28 내지 32℃에서 배양하는 단계를 포함하는, 루이신 아미노펩티데이즈 생산방법.
  12. 제11항에 있어서,
    상기 균주를 28 내지 32℃에서 18 내지 30시간 동안 배양한 후,
    22 내지 28℃에서 20 내지 120시간 동안 배양하는 단계를 더 포함하는, 루이신 아미노펩티데이즈 생산방법.
  13. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 균주를 배양하는 단계를 포함하는 식품 제조방법.
  14. 제13항에 있어서,
    균주, 그 파쇄물, 그 배양물 또는 그 추출물을 식품에 첨가하는 단계를 포함하는 식품 제조방법.
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