CN103525743A

CN103525743A - 生孢梭菌及其用途

Info

Publication number: CN103525743A
Application number: CN201310532509.6A
Authority: CN
Inventors: 樊科权; 唐清兰; 徐姿静; 徐占成
Original assignee: SICHUAN MIANZHU JIANNANCHUN WINERY CO Ltd
Current assignee: SICHUAN MIANZHU JIANNANCHUN WINERY CO Ltd
Priority date: 2013-10-30
Filing date: 2013-10-30
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2033-10-30
Also published as: CN103525743B

Abstract

本发明属于酿酒技术领域，涉及一种生孢梭菌及其用途。本发明所要解决的技术问题是提供一株产己酸能力强的新菌株。本发明的技术方案是生孢梭菌Clostridium sporogense，该菌株已于2012年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.5741，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。本发明生孢梭菌产己酸能力可以达到9000mg/L，是一株高产己酸的新菌株。本发明为己酸生产提供了一种新选择。

Description

生孢梭菌及其用途

技术领域

本发明属于酿酒技术领域，涉及一种生孢梭菌及其用途。

背景技术

在浓香型大曲酒生产中，发酵窖池越老，产酒的质量越好，这是传统工艺的经验总结。为了揭示老窖出佳品的奥秘，我国自本世纪60年代起就开展了浓香型白酒与窖泥微生物关系的研究，发现老窖泥中富集了多种厌氧功能菌，主要为嫌气性梭状芽孢杆菌，它们参与浓香型白酒发酵的生香作用。己酸乙酯作为浓香型白酒的主体香成分，无疑，其中代谢生成己酸的菌株就是老窖发酵生香的一种主要功能菌。

70年代以后，白酒技术工作者在己酸菌的分离、培育和应用方面，作了不少的报道，但大部分侧重于生产性的实用技术，而有关微生物学方面的研究，尤其是菌种的鉴定和生理学的研究内容相对较少。

目前报道的从窖泥中分离得到的代谢己酸能力较强的并经微生物学鉴定定名的菌株只有克氏梭菌（Clostridium kluyveri）、耳蜗形梭菌（Clostridium cocleatum）。

发明内容

本发明所要解决的第一个技术问题是提供一株产己酸能力强的新菌株。本发明的技术方案是生孢梭菌Clostridium sporogense，该菌株已于2012年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.5741，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。

进一步的，所述生孢梭菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述的生孢梭菌在生产己酸中的用途。

本发明还提供了所述的生孢梭菌在酿酒生产中的用途。

本发明的菌株是从四川剑南春（集团）有限责任公司的剑南春老窖泥中分离获得。该菌株为生孢梭菌，特征如下：

（1）微生物形态特征

挑取新培养的菌苔少许，从一边开始均匀涂抹划线，重复数次，以划满平板(培养基：乙酸钠1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.01%、硫酸铵0.03%、硫酸亚铁0.02%、酵母膏0.5%、琼脂粉2%，灭菌后再加入2%碳酸钙，无水乙醇2%)为宜，倒置平板，于37℃厌氧培养3～5天，观察菌落形态。

培养后的形态特征:菌株不成链状、无荚膜,表面菌落呈圆形,扁平状，边缘扩散,半透明状,灰到白色,无光泽。该菌株经革兰氏染色鉴定为革兰氏阳性杆状菌、产芽孢。

（2）培养条件

乙酸钠1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.01%、硫酸铵0.03%、硫酸亚铁0.02%、酵母膏0.5%、琼脂粉2%，灭菌后再加入2%碳酸钙，无水乙醇2%。培养基在121℃下灭菌20分钟；培养温度35～37℃，厌氧培养。

本发明的有益效果：本发明首次发现一株产己酸的生孢梭菌。该菌株产己酸能力可以达到9000mg/L（实施例2），为浓香型白酒关键风味物质的形成提供了宝贵的菌株资源。本发明菌株可用于己酸生产。本发明的生孢梭菌是从剑南春老窖泥中分离出来的，应用于酿酒生产可有效提高浓香型白酒关键风味物质己酸乙酯含量及促进新窖老熟，大幅提高产品优级品率，具有极大的应用和推广价值。

本发明的生孢梭菌Clostridium sporogense已于2012年2月1日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏号为CGMCC No.5741，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：10010。

附图说明

图1菌株产己酸量对比分析图表

图2本发明菌株形态图

具体实施方式

本发明的生孢梭菌（Clostridium sporogense）于2012年2月1日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为CGMCC No.5741。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101。

进一步的，所述生孢梭菌的16S rDNA的序列如SEQ ID No.1所示。

本发明还提供了所述的生孢梭菌在生产己酸中的用途。

本发明还提供了所述的生孢梭菌在酿酒生产中的用途。

本发明的生孢梭菌菌株是从四川剑南春（集团）有限责任公司的剑南春老窖泥中分离获得。

本发明的生孢梭菌产己酸能力可以达到9000mg/L，是一株高产己酸的新菌株。本发明的生孢梭菌是从剑南春老窖泥中分离出来的，应用于酿酒生产可有效提高浓香型白酒关键风味物质己酸乙酯含量及促进新窖老熟，大幅提高产品优级品率，具有极大的应用和推广价值。

实施例1菌株筛选

1菌株的筛选

1.1菌株的初筛

1.1.1材料:剑南春老窖泥

1.1.2培养基:

乙酸钠8g,MgC ₂200mg,NH₄Cl500mg,MnSO₄2.5mg,CaSO₄10mg,FeSO₄5mg,钼酸钠2.5mg,生物素5ug,对氨基苯甲酸100ug，蒸馏水1000mL，自然pH，121℃灭菌20min，冷却后，无菌加入乙醇25mL。

培养基在121℃下灭菌20分钟；培养温度：35～37℃，培养条件：厌氧培养。

1.1.3实验方法

无菌条件下取10克剑南春老窖泥于装有90mL无菌水并放有玻珠的250mL三角瓶中，置揺床上室温振荡30分钟。在80度水浴中处理10min，取菌液按10倍梯度稀释到10^-6，取各稀释度菌液1mL放入无菌平皿中，倒入灭菌后冷却至50℃的培养基，混匀，待凝固后放入厌氧工作站于37℃培养7天，挑单菌落于液体培养中于37度培养至产气为止。取发酵液1mL于小试管中，加入0.5mL乙醚和2%硫酸铜溶液1mL，充分摇匀，静置分层后，在乙醚层呈现蓝色，即证明有己酸生成。颜色越深含量越高，共筛选到8株产己酸能力较高的单菌株，分别命名为F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7、F8。

实施例2菌株的产己酸条件优化实验

1.1菌株产己酸发酵条件优化

选取温度、发酵天数、醋酸钠和乙醇浓度四因素三水平设计正交实验，实验结果表1所示。

正交实验结果表明，乙醇浓度对菌株产己酸影响较大，其次为醋酸钠浓度，温度和发酵时间影响相对较小。产己酸的最适条件为：温度37℃，培养时间15天为宜，乙醇浓度2%，醋酸钠浓度1%。

采用优化后发酵培养条件对8株代谢己酸的单菌株进行产己酸试验，菌株发酵产己酸培养基：乙酸钠1%、磷酸氢二钾0.05%、硫酸镁0.01%、硫酸铵0.03%、硫酸亚铁0.02%、酵母膏0.5%、灭菌后再加入2%碳酸钙，无水乙醇2%。

产己酸对比分析结果见图1，从图1可得出F6产己酸能力最强，可达到9289mg/L。由此可以看出：在筛选的八株菌株中，F6菌株产己酸能力最强，并将该菌株命名为JNC-004。后续将对F6菌株进行16SrDNA基因的序列分析和全自动微生物鉴定仪分析。

表1不同条件对产己酸的影响

实施例3菌株的鉴定

1F6菌株16SrDNA序列分析方法

1.1DNA提取

离心收集菌体，溶于5mL提取缓冲液（100mMTris·Cl，100mM EDTA-Na₂，200mM NaCl，2%CTAB，pH8.0）中，37℃振荡45min。加入0.75mL20%SDS，65℃水浴1h。12,000rpm，10min离心，收集上清。上清用等体积的酚︰氯仿︰异戊醇（25︰24︰1）抽提2次，加入终浓度0.3M的NaAC（pH5.2）及2倍体积的无水乙醇，室温沉淀1h。4℃，12,000rpm，20min离心，收集沉淀，并用70%乙醇漂洗2次，晾干后溶于50μL TE中。

1.2PCR扩增

以总DNA为模板，细菌通用引物EU27F（AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）和1492R（GGTTACCTTGTTACGACTT）分别为正向引物和反向引物。PCR反应体系为50μL：10×Buffer 5μL，dNTP 1μL，Taq酶0.5μL，正反向引物各1μL，模板DNA 1μL，ddH₂O 40.5μL。PCR反应条件：94℃4min预变性；94℃0.5min，56℃1min，72℃0.5min，30个循环；72℃延伸7min。

1.316S rDNA基因序列分析

扩增后的片段测序（上海生工测序），通过美国国家生物技术信息中心的BLAST搜索程序，把试验中得到的序列信息与基因库中的基因序列进行比较而获得同源性分析结果（见表1）。

扩增片段测序结果SEQ ID No.1所示，如下：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTTCCTTCGGGAAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCAAAGTGGGGGATAGCCTTCCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAACATAAGAGAATCGCATGATNTTCTTATCAAAGATTTATTGCTTTGAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTNGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGNAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGGGAAACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGGGTGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCNNGTTTTCTGGGACGATAATGACGGTACCAGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCNAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCNGGGCTTAACCTGGGNNCTGCATTCCNAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTNAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGNNTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGCTATAAGGGATCCGGCTATTATCATATGCCCTGTAGAGGATACTGGTAGAAATTCCGTTATACCTTCTACTATTCCTATTATTATTGCTTTTAATATTAGTAGCATTGAACCTGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTNAACCCTTCGGGGCAAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGTNACCAGGNGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCNNNATGTCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAATAAGACGCAAGACCGTGAGGTGGAGCAAAACTTATAAAACCTNTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCNACTCGCCTNCATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCNGGCNTTGTACACACCGCCCGTCACNCCATGAGAGCTGGTAACACCCGAAGTCCGTGAGGTAACCGTAAGGAGCCAGCGGCCGTAAAAAGTTTTTAAGAGTACTCATAATTTTGTCCCAATATAAAACCACCACCGCTAATATAGCTCCTAATTGTATAACAACACTAAACATATCTGT

表1以16SrDNA序列为基础各菌株的同源性比对分析

相似菌株

同源性

Clostridium sporogense（生孢梭菌）	99%
		Clostridium aminophilum（嗜胺梭菌）	99%
Clostridium cochlearum(匙形梭菌)	99%
		Clostridium innocuum（无害梭菌）	99%

2全自动微生物鉴定仪（美国Biolog公司生产GNⅢ）鉴定

第一步：在Biolog推荐的培养基上培养微生物

将获得的纯培养菌种接种至Biolog推荐的培养基BUA上，37℃厌氧培养。培养时间应为12～16小时

第二步：准备接种物

使用未接种的含有接种液的干净接种管（擦去管壁污垢及指纹）调整浊度仪空白。准备预期浊度的接种物。用无菌棉签从琼脂平板中有细胞生长的地方沾取直径3mm的菌落。对于快速生长的细菌，沾取一个单菌落即可；对于中等速度生长的细菌，则沾取一小簇菌落；而对于缓慢生长的细菌，则沾取第一个菌落交汇生长的区域。将棉签的末端深入装有接种液的接种管的底端，并来回上下晃动，以便将细菌释放到接种液中。使用棉签将管子中的菌块在管壁上打散或者将其挑出。使用棉签将含有细菌的接种液搅拌均匀，以便得到均一的细胞悬液，并用浊度仪检测。调整细胞浓度到63%T。

第三步：接种微孔板

　将菌悬液倒入V型加样水槽中；使用8道移液器将菌悬液吸入移液器吸头中；按每孔100μL的量将菌悬液按顺序加入微孔板的所有孔中；盖好微孔板的盖子，弹出枪头。

第四步：孵育微孔板

将微孔板直接放入OmniLog的孵育、读数仪中，或者放入厌氧培养箱中培养20～24小时。培养温度37℃，或者如第一步中提到情况下在更适合微生物生长的其他温度下培养。结果读板，诠释结果（见表2）。

表2筛选的细菌鉴定结果

英文名	参考中文名	可能性	相似性	位距
					Clostridium sporogense	生孢梭菌	100%	0.715	5.456

经Biolog微生物鉴定仪鉴定，筛选得到高产己酸的菌株F6为生孢梭菌。因此，结合分子和Biolog微生物鉴定仪鉴定结果，确定菌株为生孢梭菌（Clostridium sporogense）。

实施例3本发明菌株的形态特征及碳源利用特性鉴定

1、菌体显微观察

将4℃保存的菌株用培养基活化5～7天，然后用接种针挑取斜面的菌体于显微镜下观察形态（见图2）。

2、碳源利用情况

碳源利用情况采用Biolog微生物鉴定仪进行测定。采用上述Biolog微生物鉴定仪鉴定时的接种方法，将菌液接种到微生物碳源鉴定板中；该鉴定板中含有各种碳源，以鉴定板的第一个小孔作为空白对照。在35℃条件下，培养72小时，然后用Biolog微生物鉴定仪，750nm处测吸光值，得出碳源利用情况见表3。

表3本发明生孢梭菌碳源利用情况

胸苷	+	蚁酸	-	N-乙酰基-D-葡萄糖胺	-
						己六醇	-	i-赤藻糖醇	-	a-甲基-D-半乳糖苷	-
甘油	+	m-纤维醇	-	N-乙酰基-D半乳糖胺	-
						D-果糖	+	L丝氨酸	+	D,L-a-丙三醇磷酸盐
L-苹果酸	-	杏苷	-	a-甲基D-葡萄糖苷	-
						松二糖	+	乙酸	-	β-甲基D-葡萄糖	-
D-甲酯乳酸	-	D-苹果酸	-	N-乙酰基-β-D-甘露糖胺	-
						丙胺酸胺	-	L-丙胺酸	-	L-丙氨酰-L-谷氨酸盐	+
L-甲硫氨酸	-	L苯基丙氨酸	-	D-半乳糖醛酸	-
						庶糖	-	苷露糖胺	-	L-丙氨酰-L-苏氨酸	+
L-海藻糖	-	D-半乳糖	+	β-甲基D-葡萄糖苷	+
						a-D-乳糖	-	乳果糖	-	甘氨酰-L-甲硫氨酸	-
麦芽糖	+	D-蜜三糖	-	胸苷-5’-一磷酸盐	-
						反丁烯二酸	-	乙醛酸	-	a-羟基丁酸	-
丙酸	-	丙酮腈酸	+	甲脂丙酮酸	+
						L谷氨酸	-	a-丁酮酸	+	L-丙氨基-组氨酸	+
L-苏氨酸	-	L-缬氨酸	-	L-缬氨酸+L-天门冬胺酸	-
						a-环式糊精	-	β-环式糊精	-	葡萄糖-1-磷酸盐	+
a-D-葡萄糖	+	L-乳酸	-	葡萄糖-6-磷酸盐	-
						D-松三糖	-	D-蜜二糖	-	3-甲基-D-葡萄糖	+
水苏四糖	-	L谷氨酸盐	-	D-海藻糖	+
						a-酮戊酸	-	D,L乳酸	-	D-阿拉伯糖醇	-
琥珀酸甲酯	-	m酒石酸	-	甘氨酰-L-谷氨酸	-

肌苷	+	糊精	+	甘氨酰脯氨酸	-
						尿苷	+	L尿刊酸	-	尿苷-5’-一磷酸盐	+
D-苷露糖	+	熊果苷	-	D-纤维二糖	+
						龙胆二糖	-	D-葡萄糖酸	-	D-氨基葡萄糖酸	-
麦芽三糖	+	D-甘露醇	-	D-山梨醇	-
						L-李鼠糖	-	水苷杨	-	2’-脱氧腺苷	+
β-羟基丁酸	-	衣康酸	-	a-琥珀酸	-
						D-葡糖二酸	-	琥珀酰胺酸	-	甘氨酰-L-胺	-

注：“＋”为阳性，“-”为阴性（阳性即为可以利用该碳源）。

3、生孢梭菌生理生化特征

3.1产硫化氢试验

将试验菌以穿刺法接种与含有柠檬酸铁铵的培养基上，然后于37℃培养48小时后，观察如有黑色沉淀生成则断定有硫化氢的产生。结果见表4。

3.2明胶穿刺

将蛋白胨明胶培养基分装试管，培养基高度约4～5cm，115℃灭菌20min。穿刺接入新活化的斜面菌种，25℃培养14天，观察生长情况和明胶是否液化。结果见表4。

3.3水解酪蛋白

以划线接种法将试验菌种接种于酪蛋白琼脂培养基上，然后于37℃培养48小时后，观察平板中菌落周围有透明圈为酪蛋白分解试验阳性，反之为阴性。结果见表4。

3.4尿酶利用

将试验菌种接种于尿素酶斜面培养基上，然后于37℃培养1天后进行观察，培养基变为红色者，表明试验菌有尿素水解酶，或称尿素酶试验阳性，反之为阴性。结果见表4。

3.5硝酸盐还原

将活化的培养物接种于硝酸盐液体培养基中，37℃培养5天，取培养液一滴，加入格里斯氏试剂一滴，如溶液变为红色，为硝酸盐还原阳性，如无红色出现，再加两滴二苯胺试剂，如不呈蓝色反应，仍为硝酸盐还原阳性，如呈蓝色反应，为硝酸盐还原阴性。结果见表4。

3.6乙酰甲基甲醇试验（V.P试验）

取4管葡萄糖蛋白胨液体培养基，编号。除1管作为空白对照外，其余3支各接1支菌种，然后于37℃培养4天。取部分培养液和40%NaOH在空试管中等量相混，然后加入少量肌酸（用接种环挑一环），加入后猛烈振荡，并在沸水浴中保温，以加快反应进行，数分钟后观察结果，出现红色者，即为V.P试验阳性反应。结果见表4。

3.7溶血性试验

以划线接种法将试验菌种接种于血琼脂平板上，然后于37℃培养48小时后，观察结果：在菌落周围的血红色褪去，出现透明圈者，为溶血性试验阳性；平板中菌落周围有透明圈为酪蛋白分解试验阳性，反之为阴性。菌落周围无透明圈者为阴性。结果见表4。

表4菌株的生理生化特征

名称	菌株F6
		产生H₂S	+
明胶穿刺	液化
		水解酪蛋白	+
尿酶利用	—
		硝酸盐还原	—
产生乙酰甲基甲醇	—
		溶血	+

注：“＋”为阳性，“-”为阴性。

Claims

1.生孢梭菌Clostridium sporogenes，其保藏号为CGMCC No.5741。

2.根据权利要求1所述的生孢梭菌，其特征在于：其16S rDNA序列如SEQ ID No.1所示。

3.权利要求1或2所述的生孢梭菌在生产己酸中的用途。

4.权利要求1或2所述的生孢梭菌在酿酒生产中的用途。