CN114480230B

CN114480230B - 一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌及其应用

Info

Publication number: CN114480230B
Application number: CN202210400942.3A
Authority: CN
Inventors: 李芳柏; 方利平; 陈冠虹
Original assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Current assignee: Institute of Eco Environmental and Soil Sciences of Guangdong Academy of Sciens
Priority date: 2022-04-18
Filing date: 2022-04-18
Publication date: 2022-06-24
Anticipated expiration: 2042-04-18
Also published as: CN114480230A

Abstract

本发明公开了一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌及其应用，属于微生物技术领域。本发明菌株名称为生孢梭菌（Clostridium sporogenes）LHA6，其于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62212。生孢梭菌LHA6可以在外源添加甲硫氨酸条件下明显的降低剧毒无机砷的含量，产生毒性较低的有机砷和挥发性的砷，并能同步高效生成清洁能源H₂，可有效补充土壤、污水或者污泥中砷污染修复过程的能耗及碳排放，在碳中和和砷污染修复方面具有应用潜力。

Description

一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌及其应用。

背景技术

高强度矿冶活动导致土壤、污水和污泥中亚砷酸根[As(III)]污染问题突出，当这些土壤或污水未经处理，用于种植或灌溉农作物，如水稻，则会导致其吸收和累积无机砷，对农产品质量安全以及人体健康构成严重威胁。而无机砷中，往往以存在的价态，毒性最强，而五价的砷酸根[As(V)]毒性相对较弱；于此同时，亚砷酸在土壤和污泥中铁氧化物上吸附位点的亲和力较弱，容易从固相中解吸。因此，氧化钝化As(III)被认为是一种有效的解毒和风险管控手段。近年来，砷的甲基化被认为是一种砷解毒和污染控制的新途径。根据世界粮农组织的规定，农产品中对砷的限值往往以无机总砷的含量为依据，而有机胂不作为控制目标物。这主要是因为二甲基砷和三甲基砷氧化物的毒性分别比亚砷酸小约100和1000倍，也远低于As(V)。因此，如何实现对亚砷酸的砷甲基化，从而通过挥发、降低生物有效性、解毒等方式，可有效的实现土壤和污水风险管控。于此同时，污染处理过程往往涉及高能耗，导致碳排放，如何能实现节能与治污的结合，也是本领域的难点。

稻田土壤、湖泊沉积物、污泥厌氧消化池等环境中，在还原性条件下发酵菌产生大量的氢气能源，而氢气燃烧后转化为水，属于“无碳”的清洁能源。受此启发，我们提出，如果可以结合氢气能源制备、砷甲基化转化的发酵协同。将可望破解上述难题。

发明内容

针对上述难点，本发明的第一个目的在于提供一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌。

本发明的第二个目的在于提供上述具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌的应用。

本发明的目的通过如下技术方案实现：

一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌，名称为生孢梭菌（Clostridium sporogenes）LHA6，其于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为：GDMCC No：62212。

所述的生孢梭菌LHA6的应用，将所述的生孢梭菌LHA6置于含有无机三价砷的环境中厌氧培养，同步实现发酵产氢和砷甲基化。

进一步地，所述的甲基化为一甲基化、二甲基化和/或三甲基化。

进一步地，所述的无机三价砷为亚砷酸和/或亚砷酸盐。

进一步地，所述的无机三价砷在环境中的浓度0～200μmol/L。

进一步地，所述的环境包括但不限于培养基、土壤和水体。

进一步地，所述的培养基为TSB培养基。

进一步地，所述的TSB培养基的配方为：胰蛋白胨16～18g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物2～4g/L，氯化钠4～6g/L，磷酸二氢钾2～3g/L，葡萄糖2～3g/L，余量为水，pH值7.3 ±0.2；优选为：胰蛋白胨17g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3g/L，氯化钠5g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5g/L，余量为水，pH值7.3 ± 0.2。

进一步地，当所述的环境为培养基时，所述的生孢梭菌LHA6的接种量按细菌细胞密度OD600=0.1计。

进一步地，所述的培养的条件为温度28～32℃、时间6～8天；优选为温度30℃、时间7天。

进一步地，所述的应用为将所述的生孢梭菌LHA6和甲硫氨酸同时置于含有无机三价砷的环境中厌氧培养，同步实现发酵产氢和砷甲基化。

更进一步地，所述的甲硫氨酸的添加量按其终浓度为0.001～10mmol/L计；优选为1～10mmol/L。

一种具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂，含有培养基和所述的生孢梭菌LHA6。

进一步地，所述的培养基为上述TSB培养基。

上述具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂的制备方法，在培养基中接种所述的生孢梭菌LHA6，厌氧恒温静置培养，得到具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂。

进一步地，所述的培养的条件为温度28～32℃、时间10～25 h；优选为温度30℃、时间15～20 h。

一种具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂，含上述微生物制剂和甲硫氨酸。

上述具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂，或上述具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂在砷污染环境修复中的应用。

进一步地，所述的环境包括但不限于水体和土壤。

进一步地，所述的应用的具体操作为：将所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂或所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂置于待修复的环境中培养即可。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

本发明提供的生孢梭菌LHA65对无机三价砷具有甲基化作用，甲基砷产物包括一甲基砷、二甲基砷和三甲基砷。

本发明提供的生孢梭菌LHA6在外源添加甲硫氨酸条件下对无机三价砷具有明显的甲基化作用，在0.001mM-10mM外源甲硫氨酸浓度范围内，砷甲基化效率随甲硫氨酸浓度升高而增加，并在浓度大于1mM时砷甲基化效率显著提高，甲硫氨酸浓度为10mM条件下效率达到54.6%，相比无甲硫氨酸处理中效率提高2.6倍。同时，产氢量也随甲硫氨酸添加量增加而增加，并在浓度大于1mM时产氢量显著提高，甲硫氨酸10mM时产氢量比无甲硫氨酸处理中提高2.8倍。以上结果表明，外源甲硫氨酸能同时促进菌株LHA6发酵产氢和厌氧砷甲基化反应。

可见，生孢梭菌LHA6可以在外源添加甲硫氨酸条件下明显的降低剧毒无机砷的含量，产生毒性较低的有机砷和挥发性的砷，并能同步高效生成清洁能源H₂，可有效补充土壤、污水或者污泥中砷污染修复过程的能耗及碳排放，在碳中和和砷污染修复方面具有应用潜力。

附图说明

图1为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在含砷TSB固体培养基滚管后生长的菌落形态图；

图2为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6的扫描电镜图；

图3为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6的预测ArsM蛋白系统发育树图；

图4为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同甲硫氨酸浓度下砷甲基化效率和产氢效果分析结果图；

图5为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同甲硫氨酸浓度下细胞ATP浓度和生物量分析结果图；

图6为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同甲硫氨酸浓度下挥发性甲基砷产量分析结果图；

图7为产氢同步厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在砷污染土壤厌氧反应器中的产氢和砷甲基试验结果图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1：产氢和厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6的分离和鉴定

样品采集自广东省汕头市莲花山砷污染稻田土壤。称取经自然风干且过10目筛的土壤样品300g于500ml厌氧血清瓶，加入3g秸秆粉末和灭菌超纯水300ml，用0.22μm滤头过滤的高纯氮气曝气30分钟后，用已灭菌的丁基胶塞和铝制金属圈密封血清瓶。于30℃培养箱中静置培养40天对土壤厌氧微生物进行富集，期间用气体进样针取顶空气体产物200μl，利用高效气相色谱仪（Agilent 7820A，USA）检测顶空氢气浓度。将预培养40天后的30g土壤作为接种物，添加到含30μM亚砷酸的300ml TSB培养基中进行传代培养。TSB液体培养基配方为：胰蛋白胨17.0 g/L，大豆木瓜蛋白酶消化物3.0 g/L，氯化钠5.0 g/L，磷酸二氢钾2.5g/L，葡萄糖2.5 g/L，余量为水，pH值7.3 ± 0.2，分装300ml TSB培养基于500ml厌氧血清瓶中，用丁基胶塞和铝圈封口后，于121℃高温高压灭菌20min。接种后培养基于30℃培养箱中静置培养7天，再将30ml发酵产氢富集物接种至灭菌的300ml含砷TSB培养基中，经过6次传代培养，获得去除土壤矿物颗粒的发酵产氢富集菌群。

利用Hungate滚管技术分离发酵产氢同步厌氧砷转化菌，取上述0.2ml发酵产氢富集菌群接种至8ml的1.2%灭菌琼脂TSB培养基中，添加终浓度为30μM的亚砷酸，滚管后于30℃培养箱中培养2天。在厌氧手套箱中挑取单菌落至50ml含砷TSB液体培养基培养2天后，用高效液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪（HPLC-ICP-MS，PerkinElm）检测培养液中的一甲基砷、二甲基砷、三甲基砷氧化物、亚砷酸和砷酸含量。选择有甲基砷生成的菌液，并将其经过三次重复滚管和挑选单菌落后，获得具有产氢同步厌氧砷甲基化功能的菌株。

形态特征、生理生化特征分析：该菌株为革兰氏阳性菌，严格厌氧，产芽孢，以侧生鞭毛运动。如图1所示，该菌株在TSB固体培养基上30℃好氧生长2天，菌落表面无光泽，边缘为钝齿形，菌落为乳白色。如图2所示，扫描电镜（SEM）显示该菌株整体形貌呈棒状，长2-3μm，分裂后形成连接，细胞表面光滑，无菌毛等表面附着物。

该菌株可发酵葡萄糖和麦芽糖，发酵葡萄糖生成乙酸、丁酸、二氧化碳和氢气，不能利用乳糖、蔗糖和水杨苷。菌株具有强蛋白水解的能力，使蛋白质脱氨，使培养基质碱性增加。可氧化丙氨酸、缬氨酸、脯氨酸、甘氨酸，有还原亮氨酸和异亮氨酸的能力。

基因组和arsM基因序列分析：采用细菌DNA提取试剂盒（DNeasy Blood & TissueKit, Qiagen, Valencia, CA）提取该菌株的基因组DNA，并将其送至上海派森诺生物科技有限公司进行全基因组测序。将该菌株的16S rRNA基因片段序列（SEQ ID NO.1），利用Blast在Genbank中与已登录的序列进行核苷酸同源性比较，结果表明该好氧砷甲基化菌株LHA6为梭菌属，与Clostridium sporogenes的相似性达99.86%。该菌株基因组GC含量为28.55%，其与菌株Clostridium sporogenes DSM 795基因组的平均核苷酸一致性（ANI）为99.99%。

通过基因组完成图测序获得的砷甲基转移功能基因arsM序列长度为618bp，具体序列如SEQ ID NO.2所示。利用Blastx将其与Genbank的nr数据库中非冗余蛋白质序列进行同源性比较，结果显示该菌株arsM基因编码的蛋白序列与Clostridium botulinum的一致性为95.8%。将该菌株砷甲基转移酶ArsM的蛋白质序列与和其他Clostridium属及目前已鉴定的ArsM，在MEGA软件中通过MUSCLE算法进行多重比对，删除比对后序列前后空位，通过邻接法构建系统发育树。从图3中树的拓扑结构可以看出，该菌株砷甲基转移酶ArsM与Clostridium botulinum有显著同源关系，且与其他Clostridium属物种ArsM蛋白为不同分支类群。

16S rRNA基因序列（SEQ ID NO.1）：

ATTGAGAGTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATGAAGCTTCCTTCGGGAAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCAAAGTGGGGGATAGCCTTCCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAACATAAGAGAATCGCATGATTTTCTTATCAAAGATTTATTGCTTTGAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTAAGGTAACGGCTTACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGGGAAACCCTGACGCAGCAACGCCGCGTGGGTGATGAAGGTCTTCGGATTGTAAAGCCCTGTTTTCTGGGACGATAATGACGGTACCAGAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCGAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGTGCGTAGGCGGATGTTTAAGTGGGATGTGAAATCCCCGGGCTTAACCTGGGGGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGCGGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTTTCTGGACTGTAACTGACGCTGAGGCACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGGATACTAGGTGTAGGGGGTATCAACTCCCCCTGTGCCGCAGTTAACACAATAAGTATCCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGACTTGACATCCCTTGCATAGCCTAGAGATAGGTGAAGCCCTTCGGGGCAAGGAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTAGGTTAAGTCCTGCAACGAGCGCAACCCTTGTTATTAGTTGCTACCATTAAGTTGAGCACTCTAATGAGACTGCCTGGGTAACCAGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTAGGTACAATAAGACGCAAGACCGTGAGGTGGAGCAAAACTTATAAAACCTATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGCTGGTAACACCCGAAGTCCGTGAGGTAACCGTAAGGAGCCAGCGGCCGAAGGTGGGATTAGTGATTGGGGTGAAGTCGTAACAAGGTAGCCGTAGGAGAACCTGCGGCTGGATCACCTCCTTT。

arsM基因序列（SEQ ID NO.2）：

ATGAGTAATTTTAAAAAGGGCGATGTTAGAAATGCTGTTCGTAATAGTTATAGGAAGATAGCTATTGGAAATGCAAAAGAGGATGGCTGCTGTGGTGGAAGTATTAATCTTAAAAAATCTTCCATAGAGATATCACGTAAAATTGGATATTCTGATGAAGAAATATCAACAGTTCCAGAGGAAGCTAATATGGGGTTAGGTTGTGGAAATCCCCAATTAATAGCTGATCTTAAAGAAGGCGAAACTGTTATAGACCTTGGAAGTGGAGGAGGATTTGACTGTTTTTTAGCTTCAAAGAAAGTTGGAATTAAGGGATATATTATTGGAGTTGACATGACTCCAGAGATGATTAATAAATCAAGAGTTATGTCTAAGAAATATAGATATAGAAATGTAGACTTTAGATTAGGCGAAATTGAAAATCTTCCTGTAGCAGATAATACTGCGGATGTAATTATTTCAAATTGCGTTATAAATTTATCTCCTAATAAACAAAGGGTATATAATGAAGCTTATCGTGTATTAAAAAAAGGTGGTAGAATTGCTATTTCTGATATAGTTCTTATTAGGGAATTGACCAAGGAAATGAAGCAAGATGATAAGCTTTATTGTGGATGA。

综合形态特征、生理生化特征、基因序列分析结果，初步判断该菌株为生孢梭菌Clostridium，将该菌株命名为生孢梭菌（Clostridium sporogenes）LHA6，并于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心（GDMCC），保藏编号为：GDMCC No：62212。

实施例2：产氢和厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同甲硫氨酸浓度下的砷甲基化效率和产氢效果

为了考察含不同浓度甲硫氨酸厌氧反应器中的LHA6砷甲基化和产氢效率，对LHA6进行扩大培养后，分别接种至不同处理中。具体如下：配制灭菌TSB液体培养基100ml，将滚管后单菌落在厌氧手套箱中接种至培养基中，用已灭菌的丁基胶塞和铝圈封口，30℃静置培养15-20小时，其OD600为0.4-0.5，处于对数期中期。取0.5ml LHA6菌液分别接种在含30μM亚砷酸的8ml不同处理TSB液体培养基中，反应初始菌OD600为0.1，培养在15ml厌氧反应管中进行，于30℃恒温培养箱中静置培养7天。

实验处理包括：

无砷对照；

30μM亚砷酸盐；

30μM亚砷酸盐+0.001mM甲硫氨酸；

30μM亚砷酸盐+0.01mM甲硫氨酸；

30μM亚砷酸盐+0.1mM甲硫氨酸；

30μM亚砷酸盐+1mM甲硫氨酸；

30μM亚砷酸盐+10mM甲硫氨酸。培养7天后，取200μL顶空气体测定氢气浓度，且将1ml菌液样品经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用HPLC-ICP-MS定量不同形态砷组分。

如图4所示，菌株LHA6在含砷TSB培养基中有砷甲基化能力，无外源甲硫氨酸条件下LHA6的砷甲基化效率为21.4%。在0.001mM-10mM外源甲硫氨酸浓度范围内，砷甲基化效率随甲硫氨酸浓度升高而增加，并在浓度大于1mM时砷甲基化效率显著提高，甲硫氨酸浓度为10mM条件下效率达到54.6%，相比无甲硫氨酸处理中效率提高2.6倍。甲基砷产物主要形态为二甲基砷（58%-92%），其次为一甲基砷和三甲基砷氧化物。菌株LHA6在无砷处理中氢气生成量为1234Pa，在亚砷酸处理中产氢量随甲硫氨酸添加量增加而增加，并在浓度大于1mM时产氢量显著提高，甲硫氨酸10mM时产氢量比无甲硫氨酸处理中提高2.8倍。以上结果表明外源甲硫氨酸能同时促进菌株LHA6发酵产氢和厌氧砷甲基化反应。

实施例3：产氢和厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同砷浓度与甲硫氨酸浓度下的生物量生长评估

为了评估不同砷浓度和甲硫氨酸对功能菌株LHA6生物量的影响。参考实施例2的方法，在接种了LHA6的基础上，分别加入亚砷酸(0、30、60、100、200μM)和不同浓度的甲硫氨酸（即0、0.001、0.01、0.1、1、10mM）后，培养在15ml厌氧反应管中进行，于30℃恒温培养箱中静置培养7天。反应初始菌OD600为0.1，取不同处理下培养7天后的菌液1.0ml，加入光吸收标准酶标板中测定OD600值。

如图5所示，LHA6菌体的OD600在没有As(III)存在的情况下，7天后达到了0.8，而

30μMAs(III)处理组，OD600显著下降至0.59，但随着As(III)浓度的进一步增加至200μM，OD600的进一步下降不显著，处于0.59 – 0.49之间，证明了LHA6菌体对As(III)具有较好的耐受性。此外，30μMAs(III) +0.001mM甲硫氨酸处理组，OD600为0.58，随着甲硫氨酸的增加，OD600值有小幅的增加，但又逐步下降至0.49（30μMAs(III)+10mM甲硫氨酸处理组）。有意思的是，当甲硫氨酸与As(III)的摩尔比值为1:3时，OD600最大，说明该比例条件下，LHA6具有较好的活性和生物量。总体上，LHA6菌体能在较大的As(III)浓度条件下，能保持较好的生长，生物量较为稳定。

实施例4：产氢和厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在不同甲硫氨酸浓度下的挥发性甲基砷产量

考察同步产氢和厌氧砷甲基化功能菌株LHA6的甲基砷挥发能力及甲硫氨酸调控效果。将实施案例2中培养7天后的厌氧反应管利用高纯氮气鼓吹收集顶空挥发性砷。气体入口为0.4mm针头接入的高纯氮气，气体出口为1ml塑料注射器筒，注射器两端为石英棉，中部填充物为经1%AgNO₃浸泡过夜的35-60目高纯硅胶粒，氧化捕获挥发性砷，注射器由锡箔纸包裹，避免硝酸银见光分解。气体入口和出口皆插入在厌氧管橡胶塞上，实现密闭体系气体收集。为了完全收集顶空挥发性砷，吹气捕集挥发性砷时间为20分钟。回收注射器筒内的硅胶粒，在2ml 0.5（V/V）HNO₃中90℃回流消煮洗脱2小时，浸提后的溶液经HPLC-ICP-MS测定砷形态和含量。为了彻底氧化AgNO₃硅胶颗粒氧化捕获的气态砷，向1ml浸提液中加入10μl 30% H2O2，将挥发性甲基砷氧化后测定。

如图6所示，菌株LHA6在0-0.1mM甲硫氨酸处理下无明显挥发性砷生成，当甲硫氨酸浓度为1和10mM时，挥发性砷生产量分别为0.07和0.33μM，相对无甲硫氨酸处理分别提高24和118倍。甲基砷产物主要形态为毒性相对较低的二甲基砷，其次为一甲基砷。以上结果表明，菌株LHA6具有砷挥发能力，且挥发量随甲硫氨酸浓度增加而增加。

实施例5：产氢和厌氧砷甲基化功能生孢梭菌LHA6在砷污染土壤厌氧反应器中的产氢和砷甲基试验

采集湖南某地砷污染稻田土壤（土壤pH= 6.4），经自然风干且过10目筛，获得均匀土壤样品。其中，取部分土样样品，利用Co-γ辐照进行灭菌，获得灭菌土样。各称取4g原始土壤样品、以及4g灭菌土壤样品于不同的50ml西林瓶，并分别加入灭菌超纯水30ml，放置于厌氧手套箱，缓慢搅拌2天，确保体系内氧气去除。根据实施例1获得的LHA6菌株，加入一定量的菌液，使得反应体系中OD600=0.1，分别加入土壤灭菌组和土壤对照组；另准备两组土壤灭菌组和土壤对照组，同时加入LHA6菌株和1mM甲硫氨酸。并设置相应的对比组（即未接种LHA6菌株或只加甲硫氨酸处理组），西林瓶密闭后，放于室温下缓慢振荡培养14天反应后，取200μL顶空气体测定氢气浓度，且将1ml土壤悬浊液，5mL外加磷酸二氢铵，进一步脱附土壤颗粒上吸附态砷，样品经12000rpm离心2min，且0.22μm滤膜过滤上清液后，用HPLC-ICP-MS定量不同形态砷组分。

如图7可知，灭菌土壤组无甲基砷检出，而加入LAH6菌后，甲基砷总量产生量达到了90.9μM，而同时加入甲硫氨酸后，反应体系中的甲基砷显著增加到了184.1μM，其中二甲基砷的占比分别达到了77.4%，87.2%。相对于土壤灭菌组未检出，以及土壤对照组的9.4μM，LAH6处理以及LAH6+甲硫氨酸处理，对砷的甲基化程度大大提升，并且转化的甲基砷主要为毒性相对较低的二甲基砷。特别的是，土壤对照组中，由于其自身的微生物作用，产生的甲基砷主要以一甲基砷为主，占其总甲基砷比例的66.9%。同时，针对产氢，土壤灭菌组分别加入LHA6，以及LHA6+甲硫氨酸后，氢气的产量分别达到了4211Pa和6872Pa，显著高于土壤对照组的1321Pa，和土壤对照组+甲硫氨酸的1932Pa，证明了LHA6在土壤体系中具有很好的产氢效果。上述结果进一步在砷污染土壤体系证明，LHA6菌株结合甲硫氨酸可以同步实现产氢和砷的甲基化，将有助于实现土壤等环境中砷的解毒的低碳技术的应用。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受所述的实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东省科学院生态环境与土壤研究所

<120> 一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌及其应用

<160> 2

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1509

<212> DNA

<213> 生孢梭菌(Clostridium botulinum)

<220>

<223> 16S rRNA基因序列

<400> 1

attgagagtt tgatcctggc tcaggacgaa cgctggcggc gtgcttaaca catgcaagtc 60

gagcgatgaa gcttccttcg ggaagtggat tagcggcgga cgggtgagta acacgtgggt 120

aacctgcctc aaagtggggg atagccttcc gaaaggaaga ttaataccgc ataacataag 180

agaatcgcat gattttctta tcaaagattt attgctttga gatggacccg cggcgcatta 240

gctagttggt aaggtaacgg cttaccaagg caacgatgcg tagccgacct gagagggtga 300

tcggccacat tggaactgag acacggtcca gactcctacg ggaggcagca gtggggaata 360

ttgcgcaatg ggggaaaccc tgacgcagca acgccgcgtg ggtgatgaag gtcttcggat 420

tgtaaagccc tgttttctgg gacgataatg acggtaccag aggaggaagc cacggctaac 480

tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcgagcgt tgtccggatt tactgggcgt 540

aaagggtgcg taggcggatg tttaagtggg atgtgaaatc cccgggctta acctgggggc 600

tgcattccaa actggatatc tagagtgcag gagaggaaag cggaattcct agtgtagcgg 660

tgaaatgcgt agagattagg aagaacacca gtggcgaagg cggctttctg gactgtaact 720

gacgctgagg cacgaaagcg tgggtagcaa acaggattag ataccctggt agtccacgcc 780

gtaaacgatg gatactaggt gtagggggta tcaactcccc ctgtgccgca gttaacacaa 840

taagtatccc gcctggggag tacggtcgca agattaaaac tcaaaggaat tgacgggggc 900

ccgcacaagc agcggagcat gtggtttaat tcgaagcaac gcgaagaacc ttacctggac 960

ttgacatccc ttgcatagcc tagagatagg tgaagccctt cggggcaagg agacaggtgg 1020

tgcatggttg tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttaggtt aagtcctgca acgagcgcaa 1080

cccttgttat tagttgctac cattaagttg agcactctaa tgagactgcc tgggtaacca 1140

ggaggaaggt ggggatgacg tcaaatcatc atgcccctta tgtccagggc tacacacgtg 1200

ctacaatggt aggtacaata agacgcaaga ccgtgaggtg gagcaaaact tataaaacct 1260

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ggattagtga ttggggtgaa gtcgtaacaa ggtagccgta ggagaacctg cggctggatc 1500

acctccttt 1509

<210> 2

<211> 618

<212> DNA

<213> 生孢梭菌(Clostridium botulinum)

<220>

<223> arsM基因序列

<400> 2

atgagtaatt ttaaaaaggg cgatgttaga aatgctgttc gtaatagtta taggaagata 60

gctattggaa atgcaaaaga ggatggctgc tgtggtggaa gtattaatct taaaaaatct 120

tccatagaga tatcacgtaa aattggatat tctgatgaag aaatatcaac agttccagag 180

gaagctaata tggggttagg ttgtggaaat ccccaattaa tagctgatct taaagaaggc 240

gaaactgtta tagaccttgg aagtggagga ggatttgact gttttttagc ttcaaagaaa 300

gttggaatta agggatatat tattggagtt gacatgactc cagagatgat taataaatca 360

agagttatgt ctaagaaata tagatataga aatgtagact ttagattagg cgaaattgaa 420

aatcttcctg tagcagataa tactgcggat gtaattattt caaattgcgt tataaattta 480

tctcctaata aacaaagggt atataatgaa gcttatcgtg tattaaaaaa aggtggtaga 540

attgctattt ctgatatagt tcttattagg gaattgacca aggaaatgaa gcaagatgat 600

aagctttatt gtggatga 618

Claims

1.一株具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的生孢梭菌，其特征在于：名称为生孢梭菌（Clostridium sporogenes）LHA6，其于2022年1月14日保藏于广东省广州市越秀区先烈中路100号大院59号楼的广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为：GDMCC No：62212。

2.权利要求1中所述的生孢梭菌LHA6的应用，其特征在于：将所述的生孢梭菌LHA6置于含有无机三价砷的环境中厌氧培养，同步实现发酵产氢和砷甲基化。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

所述的甲基化为一甲基化、二甲基化和/或三甲基化；

所述的无机三价砷为亚砷酸和/或亚砷酸盐。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于：

所述的应用为将所述的生孢梭菌LHA6和甲硫氨酸同时置于含有无机三价砷的环境中厌氧培养，同步实现发酵产氢和砷甲基化。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于：

所述的无机三价砷在环境中的浓度为0～200μmol/L；

所述的甲硫氨酸的添加量按其终浓度为0.001～10mmol/L计；

所述的环境为培养基、土壤或水体；

所述的培养基为TSB培养基；

所述的培养的条件为温度28～32℃、时间6～8天。

6.一种具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂，其特征在于：含有培养基和权利要求1中所述的生孢梭菌LHA6。

7.权利要求6中所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂的制备方法，其特征在于：在培养基中接种所述的生孢梭菌LHA6，厌氧恒温静置培养，得到具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂；

所述的培养的条件为温度28～32℃、时间10～25 h。

8.一种具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂，其特征在于：含权利要求6中所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂和甲硫氨酸。

9.权利要求6中所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂或权利要求8中所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂在砷污染环境修复中的应用。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：

将所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的微生物制剂或所述的具有发酵产氢同步厌氧砷甲基化功能的复合制剂置于待修复的环境中培养即可。