CN114854623B - 德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用 - Google Patents

德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于微生物技术领域，具体涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用。所述德氏乳杆菌保加利亚亚种保藏编号为CGMCC No.21396。所述菌剂的制备方法，包括以下步骤：将德氏乳杆菌保加利亚亚种进行活化得到活化菌体，将活化菌体接种至发酵培养基中发酵，得到发酵液；将发酵液经固液分离I得到菌体，将所述菌体重悬后破碎提取，经固液分离II得到提取液。本发明还提供该德氏乳杆菌保加利亚亚种在制备改善肠道菌群的组成结构的食品和/或药品中的应用。该德氏乳杆菌保加利亚亚种具有良好的抗氧化能力，且能够调节肠道菌群，预防或缓解酒精性肝损伤。

Description

德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用。
背景技术
酒精性肝损伤(ALD)是由于大量的酒精摄入而导致的以肝脏炎性细胞浸润，脂肪变性，甚至纤维化为主要特征的中毒性肝脏疾病。在欧美国家，酒精性肝损伤及其引起并发症是导致死亡的重要病因之一，也是引起死亡的第三大病因。近年来，我国酒精性肝损伤的发病率也呈上升趋势，在很多地区已经成为继病毒性肝炎后引起肝损害的主要病因，己对我国人群健康造成系统性危害。ALD由轻到重包括酒精性脂肪肝、肝炎、肝纤维化、肝硬化和肝癌，会严重危害身体健康甚至生命。
肝脏是酒精代谢、降解的主要器官，酒精进入肝细胞后，经肝细胞内的乙醇脱氢酶(ADH)系统、过氧化氢酶(CAT)系统和肝微粒乙醇氧化酶系统(MEOS)代谢生成乙醛和乙酸。在这一过程中，乙醇及其代谢物会生成的大量活性氧(ROS)，导致肝脏内促氧化物增多和抗氧化酶减少，产生氧化应激，表现为血清、肝匀浆中丙二醛、还原性谷胱甘肽等酶活性发生改变；同时，乙醇能使肠上皮细胞通透性改变、机体内毒素的水平上升，从而导致内毒素血症。氧化应激和内毒素血症可进一步调控多种细胞因子，如TNF-α、IL-6、IL-1β等的释放，趋化中性粒细胞和淋巴细胞浸润，从而加重肝脏的损伤。
目前，针对ALD的发病机制，国内外学者开始关注乳酸菌对ALD的防治作用，能够在预防酒精性肝损伤的同时，发挥调节肠道菌群的作用，符合食用健康、安全的要求。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题，提供一种德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及它们的应用，该德氏乳杆菌保加利亚亚种具有良好的抗氧化能力，且能够调节肠道菌群。
为了实现上述目的，本发明第一方面提供一种德氏乳杆菌保加利亚亚种，该德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)保藏编号为CGMCCNo.21396。保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编：100101，保藏日期为2020年12月18日。
进一步地，上述德氏乳杆菌保加利亚亚种的16S rDNA的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO:1德氏乳杆菌保加利亚亚种的16S rDNA核苷酸序列
cggggggggctatacatgcagtcgagcgagctgaattcaaagatcccttcggggtgatttgttggacgctagcggcggatgggtgagtaacacgtgggcaatctgccctaaagactgggataccacttggaaacaggtgctaataccggataacaacatgaatcgcatgattcaagtttgaaaggcggcgtaagctgtcactttaggatgagcccgcggcgcattagctagttggtggggtaaaggcctaccaaggcaatgatgcgtagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtctgatggagcaacgccgcgtgagtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaggatagaggcagtaactggtctttatttgacggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgtaaagcgagcgcaggcggaatgataagtctgatgtgaaagcccacggctcaaccgtggaactgcatcggaaactgtcattcttgagtgcagaagaggagagtggaattccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagcgctaggtgttggggactttccggtcctcagtgccgcagcaaacgcattaagcgctccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctgcgctacacctagagataggtggttcccttcggggacgcagagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtctttagttgccatcattaagttgggcactctaaagagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgagaagcgaacccgcgagggtaagcggatctcttaaagctgttctcagttcggactgcaggctgcaactcgcctgcacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccatggaagtctgcaatgcccaaagtcggtgggataacctttataggagtcagccgcgtaagtcagtct
本发明第二方面提供一种菌剂，该菌剂含有上述的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
优选地，该菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种；优选为活菌体和/或发酵产物。
优选地，该菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体时，所述活菌体的浓度不低于1×106CFU/g。
优选地，该菌剂为固态菌剂或者液态菌剂。
本发明第三方面提供一种菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.21396的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行活化得到活化菌体，将所述活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)将所述发酵液经固液分离I得到菌体，将所述菌体重悬后进行破碎提取，经固液分离II得到提取液。
优选地，步骤(1)中所述活化的过程包括：将所述德氏乳杆菌保加利亚亚种进行固态培养后，挑取单菌落至液体活化培养基中进行至少一次液态培养。
优选地，所述固态培养采用的培养基为MRS固体培养基，所述液态培养采用的培养基和所述发酵培养基分别为MRS液体培养基。
优选地，所述固态培养的条件包括：温度为30-45℃，时间为24-48h。
优选地，所述液态培养的条件包括：温度为30-45℃，时间为15-20h。
优选地，所述活化菌体接种至发酵培养基的接种量为0.5-1.5体积％，所述发酵的条件包括：温度为30-45℃，时间为15-20h。
优选地，步骤(2)中所述菌体重悬的过程包括：将所述菌体利用生理盐水洗涤后，再与生理盐水混合得到重悬液。
优选地，所述重悬液中菌体的浓度为5×108-5×109CFU/mL。
优选地，所述破碎提取采用间歇式超声，所述间歇式超声的条件包括：温度为0-5℃，超声工作/间歇时间比为1:1-2，总时间为12-18min。
本发明第四方面提供上述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备抗氧化药品中的应用。
本发明第五方面提供上述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备改善肠道菌群的组成结构的食品和/或药品中的应用。
优选地，所述肠道菌群为卟啉单胞菌菌群和/或肠球菌菌群。
通过上述技术方案，本发明的有益效果为：
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4具有抗氧化能力和良好的耐受性，在酸条件下稳定性高，能够有效调节肠道菌群，尤其是对卟啉单胞菌菌群和肠球菌菌群具有良好的调节作用；该德氏乳杆菌保加利亚亚种属于益生菌，安全性较高，长期使用不会产生并发症及副作用，在功能性食品或药品方面具有广阔的应用前景。
本发明的其它特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
生物保藏
本发明提供的菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckiisubsp.bulgaricus)，并于2020年12月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏单位的缩写为CGMCC)，保藏编号为CGMCC No.21396。
附图说明
图1是实施例1中7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)的发酵乳与无细胞提取物的DPPH自由基清除能力测定结果，显著性水平为p<0.05；
图2是实施例1中7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)的发酵乳与无细胞提取物的还原能力测定结果，显著性水平为p<0.05；
图3是实施例1中7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)的发酵乳与无细胞提取物的总抗氧化能力测定结果，显著性水平为p<0.05；
图4是实施例1中7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)的发酵乳的发酵时间和pH值，显著性水平为p<0.05；
图5是实施例3中4个组的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性测定结果，显著性水平为p<0.05；
图6是实施例3中4个组的小鼠血清中脂多糖(LPS)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图7是实施例3中4个组的小鼠血清及肝脏中甘油三酯(TG)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图8是实施例3中4个组的小鼠肝匀浆液中谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图9是实施例3中4个组的小鼠肝匀浆液中丙二醛(MDA)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图10是实施例3中4个组的小鼠肝匀浆液中超氧化物歧化酶(SOD)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图11是实施例3中4个组的小鼠肝匀浆液中肿瘤坏死因子(TNF)和白细胞介素(IL)的含量测定结果，显著性水平为p<0.05；
图12是实施例3中4个组的小鼠肝脏组织的病理损伤情况，其中，A为正常组；B为模型组；C为阳性对照组；D为德氏乳杆菌保加利亚亚种发酵乳组；
图13是实施例3中4个组的小鼠肠道菌群组成的稀疏曲线；
图14是实施例3中4个组的小鼠肠道菌群组成的物种丰富度和主坐标分析图，其中A为物种丰富度、B为主坐标分析(PCoA)图；
图15是实施例3中4个组的小鼠肠道菌群组成的门水平物种分布差异图；
图16是实施例3中4个组的小鼠肠道菌群组成的科水平物种分布圈图；
图17是实施例3中发酵乳组与模型组之间OTUs差异的曼哈顿图；
图18是实施例3中正常组与模型组之间OTUs差异的曼哈顿图。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面，本发明提供一种德氏乳杆菌保加利亚亚种，该德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)的保藏编号为CGMCC No.21396，保藏日期为2020年12月18日。
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种分离自奶酪块(产自新疆)样本中。所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的分离可以采用本领域常规的用于新菌株分离的方法，例如可以采用液相富集法。
液相富集法具体可以包括：取泡菜汁用生理盐水进行梯度稀释，稀释浓度为10-1-10-7CFU/mL；固体状的奶疙瘩进行敲碎处理并且溶于生理盐水中制成溶液，震荡使样品充分打散混匀，然后吸取悬浮液用生理盐水稀释成浓度为10-1-10-7CFU/mL，将每个梯度稀释液经涡旋使得稀释悬浮液均匀，且每个梯度稀释液与固体MRS培养基(含溴甲酚紫)的平板上均匀涂布，然后将平板置于30-45℃的温度下培养24-48h，平板上挑选附近呈现黄色的单个菌落，初步判定有明显颜色区域的单菌落是乳酸菌；接着进行反复划线得到纯化后的菌株；对纯化后的菌株进行革兰氏染色和过氧化氢酶实验，选取革兰氏染色为阳性、过氧化氢酶为阴性的菌株，进行抗氧化的初筛、抗氧化的复筛；其中，抗氧化的筛选包括DPPH自由基清除能力、还原能力测定和总抗氧化能力。
具体地，DPPH自由基清除能力的测定过程可以为：将1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)粉末溶解于少量无水乙醇中，充分混匀后定容得到浓度为0.2mmol/L的DPPH自由基工作液；取菌株的胞内代谢物提取液与DPPH自由基工作液混合，暗室静置25-35min，对照组以无水乙醇代替DPPH自由基工作液，空白组以无水乙醇代替样品溶液，于波长517nm处测定吸光值并计算清除率，每组样品测量三次取平均值；DPPH自由基清除率计算公式如下：
清除率(％)＝(1–(Ai-Aj)/A0))×100％
其中，Ai为实验组吸光值，Aj为空白组吸光值，A0为对照组吸光值，菌株的胞内代谢物提取液可以采用本领域常规的胞内代谢物提取方法获得，也可以参见本发明下述的菌剂制备方法获得。
还原能力测定的测定过程可以为：向菌株的胞内代谢物提取液中加入浓度为0.5-1.5重量％的铁氰化钾溶液和浓度为0.1-0.3mol/L磷酸盐缓冲液，于45-55℃水浴15-25min，冷却后加入5-15重量％三氯乙酸溶液，混合离心后取上清液，加入蒸馏水和0.1重量％三氯化铁溶液，室温反应后，测定其在700nm波长处的吸光度。
总抗氧化能力(ABTS法)测定过程可以为：根据总抗氧化活性试剂盒步骤进行测定，测定原理是：ABTS在有氧化性物质存在的条件下生成ABTS+，测定405nm吸光值可计算出样品的总抗氧化活性；其中Trolox(水溶性维生素E)是VE(维生素E)的一种类似物，具有相近的抗氧化能力，将其抗氧化活性视为1，结果表示为Trolox当量。
本发明的发明人从筛选出的菌株中选取了一株抗氧化较好，且革兰氏染色为阳性的菌株GYX-4，进行了DNA提取与鉴定，鉴定结果显示，该菌株的16S rDNA全序列与NCBI注册的德氏乳杆菌保加利亚亚种的16Sr DNA的基因序列比较，同源性为99.9％，可以确定该菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)，并于2020年12月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNo.21396。
另外，本发明的发明人在研究过程中发现，本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4具有抗氧化能力和良好的耐受性，在酸条件下稳定性高，不仅能够抑制血清中ALT和AST水平增加以及降低血清中LPS含量，降低肝脏和血清中TG的含量，改善肝脏中氧化应激水平，降低肝脏中TNF-α和IL-6炎症，能够有效调节肠道菌群的组成结构，尤其是对卟啉单胞菌菌群和肠球菌菌群具有良好的调节作用。
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种可以采用本领域常规的保藏方法进行保存，例如，以1-3体积％的接种量接到MRS液体培养基中，30-45℃静置培养10-15h，并连续培养活化2-4代，将活化好的菌液用甘油保藏法，放到-80℃超低温冰箱保藏。
本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种经过培养能够产生大量的德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体和/或发酵产物。本发明对培养方法没有特别的限制，只要通过该培养方法可以使所述德氏乳杆菌保加利亚亚种大量增殖即可，例如，可以将德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体接种至培养基中，在温度为30-45℃的温度下培养24-48h后，得到培养液。其中，所述培养基可以为本领域常规使用的培养基，例如，可以为MRS液体培养基(含有蛋白胨8-12g/L、牛肉浸粉6-10g/L、酵母浸粉3-5g/L、葡萄糖15-25g/L、磷酸氢二钾1-3g/L、柠檬酸氢二铵1-3g/L、乙酸钠3-7g/L、硫酸镁0.1-0.3g/L、硫酸锰0.02-0.06g/L、吐温80 0.5-1.5g/L，pH为5.7±0.2)，优选为MRS培养基。
本发明可以进一步分离上述培养液中的德氏乳杆菌保加利亚亚种的菌体，对所述分离的方法没有特别的限制，只要能够从培养液中富集菌体即可，例如可以通过离心和/或过滤的方法实现，所述离心和所述过滤的条件可以为本领域的常规条件，此为本领域技术人员所熟知，在此不再赘述。
第二方面，本发明提供一种菌剂，该菌剂含有根据权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
根据本发明，所述菌剂优选含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种，更优选为含有活菌体和/发酵产物。本发明中，术语“发酵产物”指的是德氏乳杆菌保加利亚亚种在发酵或培养过程中产生的代谢产物，包括胞内代谢产物和/或胞外代谢产物。本发明中所述发酵产物优选为胞内代谢产物。
在本发明中，对所述菌剂中德氏乳杆菌保加利亚亚种的浓度可以根据具体的情况进行具体的选择。优选情况下，该菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体时，所述活菌体的浓度不低于1×106CFU/g。
根据本发明，对所述菌剂的剂型没有特别的限制，可以根据预定用途的不同，将其制备成不同的剂型，并添加相应的赋形剂等成分，例如所述菌剂可以为液态菌剂(例如可以为胞内代谢物的提取液)和/或固态菌剂(例如可以为冻干后的菌体)，优选为液态菌剂。其中，在何种剂型的菌剂中添加何种赋形剂为本领域技术人员所熟知，在此不再详细赘述。
第三方面，本发明提供一种菌剂的制备方法，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.21396的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行活化得到活化菌体，将所述活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)将所述发酵液经固液分离I得到菌体，将所述菌体重悬后进行破碎提取，经固液分离II得到提取液。
本发明中，固液分离I和固液分离II可以采用过滤、离心等本领域常规的分离方式，优选情况下，固液分离I和固液分离II均采用离心方式，固液分离I的条件包括：转速为5000-7000rpm，时间为8-12min；固液分离I的条件包括：温度为0-8℃，转速为5000-7000rpm，时间为8-12min。
根据本发明，德氏乳杆菌保加利亚亚种可以采用本领域常规的活化方法。优选地，步骤(1)中所述活化的过程包括：将所述德氏乳杆菌保加利亚亚种进行固态培养后，挑取单菌落至液体活化培养基中进行至少一次液态培养。
根据本发明，优选地，所述固态培养采用的培养基为MRS固体培养基，所述液态培养采用的培养基和所述发酵培养基分别为MRS液体培养基。MRS固体培养基为在MRS液体培养基的基础上加入15-25g/L的琼脂获得。
根据本发明，优选地，所述固态培养的条件包括：温度为30-45℃，具体可以为30℃、35℃、40℃、45℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为24-48h，具体可以为24h、30h、36h、42h、48h，或者上述两个值之间的任意值。
根据本发明，优选地，所述液态培养的条件包括：温度为30-45℃，具体可以为30℃、35℃、40℃、45℃，或者上述两个值之间的任意值；时间为15-20h，具体可以为15h、16h、17h、18h、19h、20h，或者上述两个值之间的任意值。
根据本发明，优选地，所述活化菌体接种至发酵培养基的接种量为0.5-1.5体积％，所述发酵的条件包括：温度为30-45℃，时间为15-20h。
根据本发明，优选地，步骤(2)中所述菌体重悬的过程包括：将所述菌体利用生理盐水洗涤后，再与生理盐水混合得到重悬液。本发明中，生理盐水为NaCl浓度为0.9重量％的水溶液，所述洗涤的次数可以为2-5次，以能够有效去除德氏乳杆菌保加利亚亚种表面残留的培养基。
根据本发明，优选地，所述重悬液中菌体的浓度为5×108-5×109CFU/mL。
根据本发明，优选地，所述破碎提取采用间歇式超声，所述间歇式超声的条件包括：温度为0-5℃，超声工作/间歇时间比为1:1-2，总时间为12-18min。
基于上述本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种抗氧化效果较好，能够预防或缓解酒精性肝损伤的功效，本发明第四方面提供上述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备抗氧化药品中的应用。
基于上述本发明提供的德氏乳杆菌保加利亚亚种能够调节肠道菌群的功效，第五方面，本发明提供上述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、上述的菌剂、上述的制备方法制得的菌剂在制备改善肠道菌群的组成结构的食品和/或药品中的应用。
根据本发明，优选地，所述肠道菌群为卟啉单胞菌菌群(Porphyromonas sp.)和/或肠球菌菌群(Enterococcus sp.)。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
以下实施例中，SPF级8周龄雄性C57BL/6小鼠采购自江苏省艾菱菲实验动物有限公司；其余所用的实验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到。
脱脂乳的成分为：2重量％能量、6重量％蛋白质、2重量％碳水化合物、3重量％钠、15重量％钙；
MRS固体培养基的组分为：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L、琼脂20g/L，pH为5.7±0.2；
MRS液体培养基的组分为：蛋白胨10g/L、牛肉浸粉8g/L、酵母浸粉4g/L、葡萄糖20g/L、磷酸氢二钾2g/L、柠檬酸氢二铵2g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温80 1g/L，pH为5.7±0.2。
实施例1
1、乳酸菌的分离纯化
(1-1)取泡菜汁用生理盐水进行梯度稀释，稀释浓度为10-1-10-7CFU/mL；固体状的奶疙瘩进行敲碎处理并且溶于生理盐水中制成溶液，震荡使样品充分打散混匀，然后吸取1mL悬浮液用生理盐水进行10倍配比稀释成浓度为10-1-10-7CFU/mL，将每个梯度稀释液都涡旋30s使得稀释悬浮液均匀，且每个梯度稀释液吸取100μL与固体MRS培养基(含溴甲酚紫0.04g/L)平板上均匀涂布，然后将平板置于37℃恒温生化培养箱中培养24-48h，平板上挑选附近呈现黄色的单个菌落，初步判定有明显颜色区域的单菌落是乳酸菌，接着进行反复划线得到纯化后的菌株；
(1-2)在显微镜下观察纯化后的菌株革兰氏染色后的颜色与形态，并观察过氧化氢滴加在菌体上是否有气泡产生；选取革兰氏染色为阳性(紫色)、过氧化氢酶为阴性(无气泡)的菌株，随后再经MRS液体培养基培养后，以2体积％的接种量接到装有50mL的MRS液体培养基的锥形瓶中，37℃静置培养约12h，并连续培养活化3代，将活化好的菌液用甘油保藏法，放到-80℃超低温冰箱保藏。
2、抗氧化乳酸菌的初筛
(2-1)菌株培养
将步骤(1-2)筛选得到的乳酸菌菌株经分离纯化后，分别在灭菌MRS固体平板上划线，并于37℃在恒温培养箱中培养24-48h，挑取单菌落至液体MRS中活化两次，将活化好的乳酸菌发酵液按1体积％的比例接入新鲜的MRS液体培养基，37℃条件下培养18h，得到发酵液；
(2-2)样品制备
将发酵液在转速为6000rpm条件下离心10min，分别收集发酵液和菌体，将菌体使用0.9％生理盐水洗涤三次，重悬于0.9％生理盐水中得到菌体的浓度为109CFU/mL的重悬液，将重悬液在冰浴中进行超声波破碎(破碎2s间歇3s，总时间为15min)，破碎完毕后在温度为4℃、转速为12000rpm的条件下离心30min，收集上清即为胞内代谢物的提取液。
(2-3)指标检测
①DPPH自由基清除能力
将0.0079g的DPPH粉末溶解于少量无水乙醇中，充分混匀后定容至100mL棕色容量瓶中，得到浓度为0.2mmol/L的DPPH自由基工作液，取0.2mL步骤(2-2)得到的提取液，与2.8mL的DPPH自由基工作液混合后，暗室静置30min，对照组以无水乙醇代替DPPH自由基工作液，空白组以无水乙醇代替样品溶液，于波长517nm处测定吸光值并计算清除率，每组样品测量三次取平均值；DPPH自由基清除率计算公式如下：
清除率(％)＝(1–(Ai-Aj)/A0)×100％
其中，Ai为实验组吸光值，Aj为空白组吸光值，A0为对照组吸光值。
②还原能力测定
向1mL步骤(2-2)得到的提取液中，加入浓度为1重量％的铁氰化钾溶液和浓度为0.2mol/L的磷酸盐缓冲液(pH为6.6)各1mL，于50℃水浴20min，冷却后加入浓度为10重量％的三氯乙酸溶液1mL，在搅拌速率为4000rpm的条件下混合离心10min后，取上清液1mL加入1mL蒸馏水和1mL浓度为0.1重量％的三氯化铁溶液，室温反应10min后，测定其在700nm波长处的吸光度A700。
③总抗氧化能力(ABTS法)测定
根据总抗氧化活性试剂盒步骤进行测定，测定原理是：ABTS在有氧化性物质存在的条件下生成ABTS+，测定波长为405nm处的吸光值，可计算出样品的总抗氧化活性(TEAC)。其中Trolox是VE的一种类似物，具有相近的抗氧化能力，将其抗氧化活性视为1，结果表示为Trolox当量。
根据DPPH自由基清除能力、还原能力和总抗氧化能力测定的结果，选取抗氧化能力较好的7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)进行下一步实验。
3、抗氧化乳酸菌的复筛
取步骤(2-3)得到的7株乳酸菌菌株(编号为L1-L7)分别在灭菌后的MRS固体培养基的平板上划线，并于37℃在恒温培养箱中培养24-48h，挑取单菌落至液体MRS中活化三次，各菌株按照5体积％的接种量加入到灭菌脱脂牛奶中，在42℃的培养箱中发酵直至凝乳，记录发酵时间和pH值，结果见图4，并对发酵乳的抗氧化活性(DPPH自由基清除能力、还原能力和总抗氧化能力，具体步骤参见步骤(2-3)中所述)进行测定，结果见图1至图3。
图1至图2表明，菌株L2的发酵乳在7个分离菌株中显示出最强的DPPH自由基清除和还原能力，其次是菌株L7，与未发酵乳(Control)及其相应的无细胞提取物相比，所有菌株的发酵乳都显示出显着增强的DPPH自由基清除和还原能力；图3表明在总抗氧化能力测定中，菌株L2的发酵乳在所有7个分离菌株中表现出最强的抗氧化活性，然而，从图4可以看出，与其他菌株，特别是菌株L6和L7相比，菌株L2在用牛奶发酵时表现出显着降低的生长适应性，同时，菌株L7发酵乳的pH值在7株菌中最低。因此，我们选择菌株L7进行后续实验研究。
4、菌株鉴定
提取菌株L7的基因组，将其16S rDNA进行扩增和测序(由上海生工生物工程股份有限公司完成)，经测序分析，该菌株的16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示，将该序列在GenBank中进行比对，与NCBI注册的德氏乳杆菌保加利亚亚种的16Sr DNA的基因序列比较，同源性为99.9％，结果显示菌株为德氏乳杆菌保加利亚亚种，命名为德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)GYX-4，并于2020年12月18日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.21396。
德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)是益生菌的一种，目前已被纳入卫生部下发的《可用于食品的菌种名单》，可见，实施例获得的德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4以及有效成分的安全性较高，长期使用不会导致患者产生并发症以及副作用。
实施例2德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4的培养
将德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4接入MRS固体培养基中于37℃培养48h后，观察其菌落并在显微镜下对其菌体进行观察，发现其菌落呈乳白色雪花状，直径大小为1mm左右，表面光滑有褶皱，菌体呈杆状或聚集成链状；经革兰氏染色呈阳性。
将德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4接入MRS液体培养基中，于37℃培养24h，培养过程中，间隔一段时间通过pH计测量培养液的pH，发现德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4在培养过程中产酸。
将德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4接入MRS液体培养基中，分别于10-50℃下培养24h，培养过程中，间隔一段时间通过酶标仪测量培养液的OD600，发现德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4在37℃，培养16h达到生长稳定期。
实施例3德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4发酵乳对急性酒精性肝损伤的影响
1、发酵乳的制备
取德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4菌株在灭菌MRS固体培养基平板上划线，并于37℃在恒温培养箱中培养24-48h，挑取单菌落至MRS液体培养基中活化三次得到活化菌液，再分别以5体积％的接种量将上述活化菌液接种于20mL脱脂牛奶中，放置42℃培养，直至凝乳得到发酵乳。
2、实验方法
健康的C57BL/6小鼠40只(雄性，7-8周龄，体重20-23g)将小鼠圈养在22±2℃的受控环境中，湿度为40-60％，光/暗周期为12h，小鼠适应性喂养期间自由饮水和标准饲料，并对其体重和总体健康状况进行密切监测；经过1周的适应期后，将小鼠随机分为4个组：正常组(Control)、模型组(alcohol)、阳性对照组(alcohol+GSH)、发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)；
实验共24天，第一周为小鼠适应期，适应期小鼠圈养在22±2℃的受控环境中，湿度为40-60％，光/暗周期为12h，小鼠适应性喂养期间自由饮水和标准饲料，并对其体重和总体健康状况进行密切监测，经过1周的适应期后开始实验，正常喂饲料，同时模型组灌胃生理盐水(1.5mL/100g)，阳性对照组灌胃谷胱甘肽(1.5mL/100g，20mg/kg)，发酵乳组灌胃发酵乳(1.5mL/100g，108CFU/mL)，记录灌胃时间，连续喂养14天，第22天在灌胃发酵乳后4h，灌胃12mg/kg 56°酒精(alcohol)，连续3天；灌胃结束后，收集小鼠新鲜粪便样品，对灌胃结束的小鼠禁食12h后，麻醉小鼠迅速摘眼球取血，辅以颈椎脱臼法处死；收集处死后小鼠的盲肠内容物和血液样本，将血液样本于4℃静置1h，3000rpm离心15min，小心收集上层血清。对处死后小鼠进行解剖，将解剖得到的小鼠肝脏在冰冷的生理盐水中漂洗拭干，拍照观察后称重，并取左叶完整切片用；另取0.1g肝组织匀浆用，加入9倍组织块重量的预冷的生理盐水充分研磨，使肝组织匀浆化，4℃下6000rpm离心15min，弃脂肪和沉淀，小心收集上清即为肝匀浆液，所有样品均于-80℃冰箱超低温保存。
3、实验结果
3.1德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性的影响
酒精性肝损伤的早期阶段主要表现为肝细胞膜通透性增加，而释放入血的谷丙转氨酶(Alanine aminotransferase，ALT)和谷草转氨酶(Aspartate aminotransferase，AST)活性会显著提高。因此，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)是评价肝功能最常用的生化指标，可通过分析小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性来评价药物对酒精造模小鼠的影响。
利用试剂盒测定4个组的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT；索莱宝BC1555)和谷草转氨酶(AST；索莱宝BC1565)的活性，检测结果见图5。由图5可知，与正常组(Control)的小鼠(15.55U/L和19.15U/L)相比，模型组(alcohol)的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性显著升高(44.26U/L和33.89U/L)；与模型组小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)的小鼠血清中谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性显著降低(19.63U/L和20.05U/L)，谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)的活性接近于正常组小鼠，说明德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效抑制急性酒精导致的小鼠肝脏损伤。
3.2德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠血清中脂多糖(LPS)含量的影响
脂多糖(LPS)是指来自肠道中的革兰氏阴性菌细胞壁外膜的脂多糖成分，具有广泛的生物活性，过量时会引起严重的炎症反应；酒精及其代谢物乙醛和一氧化氮可破坏肠上皮屏障功能，增加肠道对内毒素(如脂多糖)的通透性，导致内毒素从肠道转移到门静脉，然后进入肝脏和血液循环，进一步促进肝脏炎症和内毒素血症，因此，可通过分析小鼠血清中脂多糖(LPS)的含量来评价药物对酒精造模小鼠的影响。
采用脂多糖(LPS)检测试剂盒(索莱宝BC2345)测定4个组的小鼠血清中脂多糖的含量，检测结果见图6。由图6可知，与正常组(Control)的小鼠(119.64U/L)相比，模型组(alcohol)的小鼠血清中脂多糖(LPS)的含量显著升高(220.14U/L)；与模型组的小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)的小鼠血清中脂多糖(LPS)的含量显著降低(152.66U/L)，脂多糖(LPS)水平接近正常组小鼠，德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效抑制急性酒精引起的肠道通透性和内毒素血症。
3.3德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠肝脏中甘油三酯(TG)含量的影响
大量饮酒会抑制脂蛋白酶的活性，使肝脏增加极低密度脂蛋白(Very low-density lipoprotein cholesterol，VLDL)的合成，VLDL在血液中消除的速度较慢，进而增加甘油三酯(Triglyceride，TG)的合成，加速动脉粥样硬化，因此，甘油三酯的含量也可以评价发酵乳对酒精造模小鼠的影响。
利用酶标仪(Thermo Fresco17/17R)测定4个组的小鼠血清及肝脏中的甘油三酯含量(TG；试剂盒采用索莱宝BC0625)，检测结果见图7。由图7可知，与正常组(Control)的小鼠(33.22mmol/L和3.55mmol/g)相比，模型组(alcohol)的小鼠血清和肝脏中甘油三酯(TG)的含量显著升高(56.39mmol/L和6.49mmol/g)；与模型组小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)的小鼠血清和肝脏中甘油三酯(TG)的含量显著降低(45.18mmol/L和4.61mmol/g)，甘油三酯(TG)含量接近正常组小鼠，德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效抑制急性酒精引起的甘油三酯堆积。
3.4德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠肝脏中氧化应激水平的影响
超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)是体内重要的抗氧化物质，它们含量的减少会导致机体线粒体功能受损；丙二醛(MDA)是脂质过氧化的产物之一，其含量也反应了机体的脂质过氧化和氧化应激损伤程度。
采用试剂盒测定4个组的小鼠肝匀浆液中GPx(索莱宝BC1195)、MDA(索莱宝BC0025)和SOD(索莱宝BC0175)含量的测定，检测结果见图8至图10。由图8至图10可知，与正常组(Control)的小鼠肝脏中GPx、MDA和SOD活性(52.74U/mg蛋白、23.53mmol/g蛋白和339.55U/g蛋白)相比，模型组(alcohol)的小鼠肝脏中GPx和SOD活性显著降低(29.58U/mg蛋白和146.13U/g蛋白)，相应的MDA浓度明显升高(63.61mmol/g蛋白)；而与模型组小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)处理可以有效地恢复GPx和SOD活性(47.84U/mg蛋白和287.79U/g蛋白)，并显著降低MDA浓度(38.54mmol/g蛋白)；恢复程度接近正常组小鼠。这一结果表明德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效抑制急性酒精引起的氧化损伤。
3.5德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠肝脏中炎症因子的影响
随着脂肪中甘油三酯含量的增加以及脂肪细胞变大，脂连素分泌随之减少，并且产生了炎性脂肪因子，例如，肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor，TNF)和白细胞介素(Interleukin，IL)，酒精还会增加肠道通透性，导致肠内毒素如脂多糖(Lipopolysaccharides，LPS)的产生，这也激活了炎症途径，导致肝脏中的Kupffer细胞释放TNF-α，它不仅使肝细胞敏感性增强，诱导细胞凋亡，而且可以反过来导致更多的氧化应激。
采用ELISA试剂盒测定4个组的小鼠肝匀浆液中TNF-α(索莱宝SEKM-0034)和IL-6(索莱宝SEKM-0007)含量，检测结果见图11。由图11可知，与正常组(Control)的小鼠(3042.56pg/g蛋白和790.796pg/g蛋白)相比，模型组(alcohol)的小鼠肝脏中TNF-α和IL-6显著升高(5365.73pg/g蛋白和1114.89pg/g蛋白)，而与模型组小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)处理可以有效地降低肝脏中TNF-α和IL-6水平(3876.64pg/g蛋白和826.81pg/g蛋白)；恢复程度接近正常组的小鼠。这一结果表明德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效抑制急性酒精引起的炎症损伤。
3.6德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠肝脏组织病理损伤的影响
取4个组的小鼠肝脏左叶同一位置的组织，用10％多聚甲醛溶液固定后，经过石蜡包埋、切片，用苏木精和伊红染料进行染色，在显微镜下观察拍照，观察见图12。由图12可知，正常组(Control)的细胞形态正常，肝小叶结构完整，肝索结构以中央静脉为中心呈放射状排列，边界清晰，汇管区未见明显炎症浸润；模型组(alcohol)肝脏组织间可见大量脂滴，且肝窦间可见大量炎症细胞浸润及点灶状坏死，可见，与正常组的小鼠相比，模型组小鼠的肝脏出现了严重的病理损伤；与模型组小鼠相比，发酵乳组(alcohol+德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4)的小鼠肝脏组织的病理损伤出现了明显的减轻，主要表现为脂肪泡减少，脂肪变性减轻。可见，德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4能够有效缓解急性酒精导致的小鼠肝脏病理损伤。
3.7德氏乳杆菌保加利亚亚种GYX-4对酒精造模小鼠肠道菌群的影响
肠道菌群被认为是身体的另一个器官，与宿主的新陈代谢和健康密切相关。随着肠道菌群研究的不断深入，肠道菌群在酒精性肝病的发病机制中起着至关重要的作用，并可能决定肝脏炎症的严重程度。因此，为了进一步探究德氏乳杆菌保加利亚乳杆菌发酵乳GYX-4对急性酒精肝损伤的作用机制，利用16S rDNA测序联合PCR技术分析了4个组处理后的小鼠肠道中微生物的组成。
微生物组总DNA提取：小鼠盲肠内容物中的总微生物按照DNA提取试剂盒(OmegaBio-tek，Norcross，GA，USA)说明书进行提取，同时采用分光光度计(Nanodrop)对DNA进行定量，并通过1.2％琼脂糖凝胶电泳检测DNA提取质量；细菌16S rRNA基因高变区V3-V4被扩增用于高通量扩增子测序；PCR产物用Qiagen Gel Extraction Kit(Germantown，MD，USA)纯化，并通过Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay Kit和酶标仪(BioTek,FLx800)进行定量；使用Illumina(美国加利福尼亚州圣地亚哥)TruSeq Nano DNALT Library Prep Kit制备测序文库，并在Qubit荧光计和Agilent Bioanalyzer 2100系统上评估文库质量。
首先，对高通量测序的原始下机数据根据序列质量进行初步筛查；通过质量初筛的原始序列按照index和Barcode信息，进行文库和样本划分，并去除barcode序列；按照QIIME2 dada2分析流程或Vsearch软件的分析流程进行序列去噪或OTU聚类；对各样本在不同物种分类学水平的具体组成进行展示；根据ASV/OTU在不同样本中的分布，评估每个样本的Alpha多样性水平，并通过稀疏曲线反映测序深度是否合适；通过聚类，结合相应统计学检验方法，衡量不同样本(组)间的物种丰度组成差异，结果见图13-图16。
由图13可知，稀疏曲线表明测序深度足以代表不同组中每个样本的盲肠微生物多样性；由图14A可知，以α多样性为代表的平均物种多样性在所有组之间没有显示出显著的差异。由图14B可知，基于ASV的bray-curtis分析显示，所有4个组的小鼠肠道微生物群的组成都显著不同，而与模型组相比，正常组和发酵乳组之间的相似性更高。由图15可知，在门水平上基于分类学的分析表明，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门和放线菌门是盲肠微生物群落的优势，与其他三组相比，正常组中厚壁菌门/拟杆菌门的丰度比明显降低。由图16可知，梭菌、拟杆菌、芽孢杆菌和丹毒菌在盲肠微生物群落中占主导地位，与其他三组相比，模型组的拟杆菌和芽孢杆菌丰度分别明显增加和减少。
为了确定代表4个实验组之间微生物差异的关键特征，对微生物丰度进行了差异分析，并通过曼哈顿图进行了可视化，结果见图17和图18。图17和图18所示的结果进一步证实了图14B所示的结果，即发酵乳组和正常组在盲肠微生物群落的结构上更相似。与模型组相比，在发酵乳组和阳性对照组中观察到卟啉单胞菌菌群(Porphyromonas sp.)丰度显著降低；且肠球菌菌群(Enterococcus sp.)丰度在正常组和发酵乳组中显着降低此外，由图17可知，酒精喂养使Ligilactobacillus丰度显著降低，灌胃发酵乳和GSH并没有恢复其水平。
综上所述，实施例1获得的德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillusdelbrueckii subsp.bulgaricus)GYX-4具有良好的抗氧化能力，且无毒无害；可以较好预防小鼠急性酒精性肝损伤，能够有效改善肠道菌群的组成结构。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。
序列表
<110> 泸州老窖股份有限公司
南京师范大学
<120> 德氏乳杆菌保加利亚亚种、含有该菌的菌剂及应用
<130> A220086K(序)
<141> 2022-03-15
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1459
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cggggggggc tatacatgca gtcgagcgag ctgaattcaa agatcccttc ggggtgattt 60
gttggacgct agcggcggat gggtgagtaa cacgtgggca atctgcccta aagactggga 120
taccacttgg aaacaggtgc taataccgga taacaacatg aatcgcatga ttcaagtttg 180
aaaggcggcg taagctgtca ctttaggatg agcccgcggc gcattagcta gttggtgggg 240
taaaggccta ccaaggcaat gatgcgtagc cgagttgaga gactgatcgg ccacattggg 300
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caagtctgat ggagcaacgc cgcgtgagtg aagaaggttt tcggatcgta aagctctgtt 420
gttggtgaag aaggatagag gcagtaactg gtctttattt gacggtaatc aaccagaaag 480
tcacggctaa ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggat 540
ttattgggcg taaagcgagc gcaggcggaa tgataagtct gatgtgaaag cccacggctc 600
aaccgtggaa ctgcatcgga aactgtcatt cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc 660
atgtgtagcg gtggaatgcg tagatatatg gaagaacacc agtggcgaag gcggctctct 720
ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta gataccctgg 780
tagtccatgc cgtaaacgat gagcgctagg tgttggggac tttccggtcc tcagtgccgc 840
agcaaacgca ttaagcgctc cgcctgggga gtacgaccgc aaggttgaaa ctcaaaggaa 900
ttgacggggg cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac 960
cttaccaggt cttgacatcc tgcgctacac ctagagatag gtggttccct tcggggacgc 1020
agagacaggt ggtgcatggc tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg 1080
caacgagcgc aacccttgtc tttagttgcc atcattaagt tgggcactct aaagagactg 1140
ccggtgacaa accggaggaa ggtggggatg acgtcaagtc atcatgcccc ttatgacctg 1200
ggctacacac gtgctacaat gggcagtaca acgagaagcg aacccgcgag ggtaagcgga 1260
tctcttaaag ctgttctcag ttcggactgc aggctgcaac tcgcctgcac gaagctggaa 1320
tcgctagtaa tcgcggatca gcacgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc 1380
gcccgtcaca ccatggaagt ctgcaatgcc caaagtcggt gggataacct ttataggagt 1440
cagccgcgta agtcagtct 1459

Claims (17)

1.德氏乳杆菌保加利亚亚种，其特征在于，该德氏乳杆菌保加利亚亚种(Lactobacillus delbrueckii subsp.bulgaricus)保藏编号为CGMCC No.21396。
2.一种菌剂，其特征在于，该菌剂含有权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，该菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体、死菌体和发酵产物中的至少一种。
4.根据权利要求3所述的菌剂，其特征在于，所述菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体和/或发酵产物。
5.根据权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于，该菌剂含有所述德氏乳杆菌保加利亚亚种的活菌体时，所述活菌体的浓度不低于1×106CFU/g。
6.根据权利要求3或4所述的菌剂，其特征在于，该菌剂为固态菌剂或者液态菌剂。
7.一种菌剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将保藏编号为CGMCC No.21396的德氏乳杆菌保加利亚亚种进行活化得到活化菌体，将所述活化菌体接种至发酵培养基中进行发酵，得到发酵液；
(2)将所述发酵液经固液分离I得到菌体，将所述菌体重悬后进行破碎提取，经固液分离II得到提取液。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述活化的过程包括：将所述德氏乳杆菌保加利亚亚种进行固态培养后，挑取单菌落至液体活化培养基中进行至少一次液态培养。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述固态培养采用的培养基为MRS固体培养基，所述液态培养采用的培养基和所述发酵培养基均为MRS液体培养基。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述固态培养的条件包括：温度为30-45℃，时间为24-48h；
所述液态培养的条件包括：温度为30-45℃，时间为15-20h。
11.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述活化菌体接种至发酵培养基的接种量为0.5-1.5体积％，所述发酵的条件包括：温度为30-45℃，时间为15-20h。
12.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述菌体重悬的过程包括：将所述菌体利用生理盐水洗涤后，再与生理盐水混合得到重悬液。
13.根据权利要求12所述的制备方法，其特征在于，所述重悬液中菌体的浓度为5×108-5×109CFU/mL。
14.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，所述破碎提取采用间歇式超声，所述间歇式超声的条件包括：温度为0-5℃，超声工作/间歇时间比为1:1-2，总时间为12-18min。
15.权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、权利要求2-6中任意一项所述的菌剂、权利要求7-14中任意一项所述的制备方法制得的菌剂在制备抗氧化药品中的应用。
16.权利要求1所述的德氏乳杆菌保加利亚亚种、权利要求2-6中任意一项所述的菌剂、权利要求7-14中任意一项所述的制备方法制得的菌剂在制备改善肠道菌群的组成结构的食品和/或药品中的应用。
17.根据权利要求16所述的应用，其特征在于，所述肠道菌群为卟啉单胞菌菌群和/或肠球菌菌群。
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