CN117511825B - 一种凝结魏茨曼氏菌iob502分段发酵菌剂在酒精性肝损伤方面的应用 - Google Patents
一种凝结魏茨曼氏菌iob502分段发酵菌剂在酒精性肝损伤方面的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌IOB502分段发酵菌剂在酒精性肝损伤方面的应用，通过两阶段发酵法获得的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502菌粉及制剂，具有菌活性高和耐酸耐胆盐等特性；同时凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502菌粉及制剂具有较高的安全性。发酵获得的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502制剂含有丰富的槐花黄酮苷元及异黄酮苷元组分，可增强肝脏ADH活力从而加快乙醇代谢，降低血液中乙醇浓度，起到较好的解酒作用；此外，还能够提高肝脏SOD活力，减轻乙醇对肝脏的损害，从而达到护肝的效果。
Description
技术领域
本发明涉及一种能够提高乙醇脱氢酶活力（ADH）和超氧化歧化酶（SOD）活性、加快乙醇代谢、降低血液中乙醇浓度、并对急性醉酒引起的肝损伤有一定预防作用的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌株、菌剂及其制备方法和进一步应用，以解决上述现有技术存在的问题。
背景技术
酒精滥用已成为日益严重公共健康问题，研究发现多种疾病与酒精滥用有关，给全社会造成巨大的经济负担。近年来，随着经济水平的不断提高，人们的生活节奏越来越快，生活和工作交际应酬越来越多，酒精消耗量增加，人体饮酒后，酒精通过胃肠道吸收，再通过肝脏代谢。肝脏是酒精代谢的主要场所，长期或过量饮酒会导致血压升高，消化不良，酒精性心肌病、胃肠道慢性炎症等疾病。长期饮酒，还会导致脂肪性肝硬化，损害神经系统，引起大脑功能失调，神经衰弱，精神涣散，记忆力下降，严重酒精中毒者，中枢神经系统发生深度抑制而昏迷，甚至死亡。
目前，市面上现有的解酒护肝产品大多数是化学合成药物、护肝类中药、蛋白肽类的药物，存在见效慢、治疗效果差，副作用明显或作用机理不明确等问题。然而，大量的动物实验和临床试验结果表明，一些益生菌已被报道可用于预防和治疗酒精性肝病，且简单、有效、无副作用，为利用益生菌预防和治疗酒精性肝病提供了新思路。
凝结魏茨曼氏菌(Weizmannia coagulans)是一种革兰氏阳性菌，兼性厌氧，非致病性，可以形成芽孢和产生乳酸，具有耐高温、耐酸、耐胆汁等工业特性。已广泛应用于医药、食品、化工等行业。已有研究报道凝结魏茨曼氏菌可通过调节微生物群组成、宿主免疫和代谢，对急性腹泻、肠易激综合征、抗生素相关腹泻、便秘和结肠炎等肠道疾病有治疗作用。
目前一些关于凝结魏茨曼氏菌在解酒护肝方面的应用研究主要涉及以下几个方面：CN 114107121A公开了一种凝结芽孢杆菌及其在酒精性肝病的治疗中的应用，主要是凝结芽孢杆菌FCYS01通过降低酒精肝小鼠血清中谷丙转氨酶、谷草转氨酶的表达，肝脏组织中促炎因子、甘油三酯的表达，减少脂质积累，提高酒精肝小鼠肝脏组织中抗炎因子、肠道连接蛋白的表达，修复肠道屏障，从而来预防和治疗由酒精诱发的酒精性肝病，但不能从源头上促进酒精的代谢；CN116731896A公开了一株可降解乙醇的凝结芽孢杆菌及其应用，主要通过将原始菌株活化、培养及发酵后经过紫外线、亚硝酸胍、常压室温等离子体诱变后得到的三种不同的诱变后的菌株，再将不同方法诱变后的菌株融合、发酵，通过传统方法诱变融合增加其降解酒精的能力，以使得酒精被人体吸收之前被ADH、ALDH降解，降低人体吸收酒精的量，但是上述经过过诱变的菌株安全性有待要论。
进一步地，上述专利公开的用于解酒护肝的凝结魏茨曼氏菌制备方法，是通过将原始菌株活化、培养及发酵、离心后制备成菌粉，此制备方法存在菌种含量低、发酵效果差、干燥后菌种活性差等缺陷，且容易将益生菌在发酵过程中产生的有机酸等有益物质损失，造成资源浪费；或者发酵后进行诱变、融合、发酵制备而成，该制备工艺操作繁琐，诱变融合效率低，过程不易控制。此外，大多是通过提高凝结魏茨曼氏菌在肠道壁的定殖率，促进酒精降解。
鉴于此，亟需一种能够高效代谢乙醇、活性更好的菌种以及一种高效的菌剂制备方法。
发明内容
本发明目的在于克服现有技术的不足之处，提供了一种能够提高乙醇脱氢酶活力（ADH）和超氧化歧化酶（SOD）活性、加快乙醇代谢、降低血液中乙醇浓度、并对急性醉酒引起的肝损伤有一定预防作用的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌株、菌剂及其制备方法和进一步应用，以解决上述现有技术存在的问题。
第一方面，本发明提供1一种凝结魏茨曼氏菌，其特征在于，所述凝结魏茨曼氏菌为凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502，已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.16025。
本发明使用的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502是自主筛选自天津市居民家中天然发酵大豆酱，此菌株已经进行了菌株保藏和理化指标的检测，已于2020年1月8日在中国食品发酵工业研究院有限公司进行了细菌鉴定检测，菌落为黄色，圆形，表面湿润，不透明，边缘整齐的菌落，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16025。
第二方面，本发明提供一种包含凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502的分段发酵菌剂。
第三方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502的分段发酵菌剂的制备方法，具体步骤为：
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:20~25接种于活化培养基中，36±2℃，密闭培养22±2h得到种子液；
（2）第一段发酵：按照体积比1:50~60的接种量将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，36±2℃，密闭培养30±2h，即得到发酵液。
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h。
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂。
优选地，步骤（3）中所述的第二段固态发酵培养基为：槐花粉和大豆粉混合，121℃灭菌25min后冷却备用。
优选地，步骤（1）中菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，步骤（2）中按照体积比1:60的接种量将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中。
第四方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌IOB502在制备用于解酒相关药物或保健品中的应用。
第五方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌IOB502在制备治疗酒精关联的肝损伤相关药物或保健品中的应用。
第六方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502分段发酵菌剂在制备用于解酒相关药物或保健品中的应用。
第七方面，本发明提供一种凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502分段发酵菌剂在制备治疗酒精关联的肝损伤相关药物或保健品中的应用
技术效果
本发明通过两阶段发酵法获得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂，具有菌活性高和耐酸耐胆盐等特性；同时凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂具有较高的安全性。发酵获得的凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂含有丰富的槐花黄酮苷元及异黄酮苷元组分，可增强肝脏ADH活力从而加快乙醇代谢，降低血液中乙醇浓度，起到较好的解酒作用；此外，还能够提高肝脏SOD活力，减轻乙醇对肝脏的损害，从而达到护肝的效果。
附图说明
图1：不同组别小鼠ADH活力的变化；
图2：不同组别小鼠SOD活力的变化；
图3：不同组别小鼠ALT活力的变化；
图4：不同组别小鼠AST活力的变化；
图5：不同组别小鼠TG的变化；
图6：不同组别小鼠TC的变化。
本发明使用的凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，其保藏编号为CGMCC No.16025。
具体实施方式
下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂普通发酵制备方法-1
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:20接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照体积比1:50的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭培养36±2h，即得到发酵液。发酵培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。
实施例2：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂普通发酵制备方法-2
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:20接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照体积比1:60的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
所述发酵培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。
实施例3：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂普通发酵制备方法-3
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照体积比1:50的接种量，将活化好的种子液接种到灭好菌的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
所述发酵培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。
实施例4：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂普通发酵制备方法-4
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）发酵：按照体积比1:60的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
所述发酵培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）菌粉：发酵液离心，收集菌泥；将菌泥冷冻干燥，即可获得凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉。
实施例5：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂分段发酵制备方法-1
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:20接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）第一段发酵：按照体积比1:50的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
第一段发酵液培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h。
所述第二段固态发酵培养基：槐花粉和大豆粉，将上述组分混合，121℃灭菌25min，并冷却至37℃及以下备用。
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂。
实施例6：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂分段发酵制备方法-2
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:20接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）第一段发酵：按照体积比1:60的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
第一段发酵液培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h。
所述第二段固态发酵培养基：槐花粉和大豆粉，将上述组分混合，121℃灭菌25min，并冷却至37℃及以下备用。
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂。
实施例7：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂分段发酵制备方法-3
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）第一段发酵：按照体积比1:50的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
第一段发酵液培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h。
所述第二段固态发酵培养基：槐花粉和大豆粉，将上述组分混合，121℃灭菌25min，并冷却至37℃及以下备用。
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂。
实施例8：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌剂分段发酵制备方法-4
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，36℃，静置，密闭培养22±2h，即得到种子液；
活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（2）第一段发酵：按照体积比1:60的接种量，将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵液中，发酵罐搅拌转速100r/min，36℃，密闭分段培养36±2h，即得到发酵液。
第一段发酵液培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min。
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h。
所述第二段固态发酵培养基：槐花粉和大豆粉，将上述组分混合，121℃灭菌25min，并冷却至37℃及以下备用。
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂。
将实施例1-实施例8获得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂进行活性检测，检测方法采用GB 4789 .35-2016食品安全国家标准，食品微生物学检验，乳酸菌检验。检测结果如下所示：
表1 凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉活性检测结果（CFU/g）
将实施例1-实施例8获得的凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂进行营养成分检测，大豆肽的检测方法为GB/T22492-2008 大豆肽粉；异黄酮苷元的检测方法为GB/T23788-2009 保健食品中大豆异黄酮的测定方法 高效液相色谱法；大豆低聚糖检测方法为GB/T 22491-2008 大豆低聚糖。检测结果如下所示：
表2 凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂营养成分
实验例9：凝结魏茨曼氏菌IOB502提高ADH和SOD活性的动物实验研究
1 实验材料
实验动物：SPF级雄性小鼠
实验样品：凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂
2 饲养环境
12 h光照/12 h黑夜循环，温度 (22±2) ℃，湿度40%-60%，自由饮水饮食。
3 小鼠建模与分组
（1）小鼠酒精致醉剂量的选择：随机选取SPF级雄性小鼠40只，适应性饲养7d，根据体重分为4组，每10只一组，禁食不禁水12h后，各组分别按5mL/kg、7.5mL/kg、10mL/kg、12.5mL/kg和15mL/kg（给酒量/小鼠体重）的计量灌胃56°白酒，观察小鼠的醉酒状态，记录小鼠未醉的只数、死亡只数。选择小鼠未醉率最高和死亡率最低的灌酒剂量，建立急性醉酒模型。
（2）小鼠急性肝损伤模型的建立：40只健康小鼠在23±2℃鼠房中饲养，每日12h黑夜交替，自由摄食。适应性喂养7d后，每10只一组。随机分为4组，空白组、酒精肝损伤模型组、凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉组、凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂组。实验1组为未发酵的槐花粉和大豆粉混合物，灌胃剂量0.83mL/kg；实验2组为凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉组，灌胃剂量0.83mL/kg；实验3组凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂组，灌胃剂量为0.83mL/kg；酒精肝损伤模型组和空白组小鼠以10mL/kg纯净水代替，连续喂养30d。末次灌胃4h，空白组给予用体积生理盐水，其他组给予相同体积10mL/kg56°白酒。
4 数据监测
小鼠形态观察。在实验期间内，每天在灌胃之前观察小鼠的皮毛状态，精神活动反应、排便情况及粪便颜色等，并做记录。
小鼠体重的测定。试验开始后，每周同一时间对小鼠体重进行测定。
小鼠血液及组织采集。小鼠通过摘眼球获取血液，离心（3500r/min，10min）分离制备上层血清，脱臼处死后摘除小鼠肝组织，用0.9%生理盐水进行漂洗去除表面血液，虑纸吸干后称重，计算肝脏指数，并观察肝脏的大小、色泽等情况。肝脏系数按下式计算：肝脏系数=肝脏质量（mg）/体重（g）。
血清相关指标的测定。各组小鼠血清中超氧化物歧化酶（SOD）、乙醇脱氢酶（ADH）、谷草转氨酶（AST）、谷丙转氨酶（ALT）活力测定，甘油三酯（TG）、胆固醇（TC）浓度测定按试剂盒说明书操作测定。
小鼠实验结果
1 小鼠酒精致醉量的选择
不同剂量灌胃小鼠后的醉酒率和死亡率见表3。随着灌酒剂量的增大，小鼠醉酒率上升，当灌酒剂量为7.5mL/kg时，醉酒率达到100%，醉后死亡率较低，随着灌酒剂量持续增加，小鼠死亡率就逐渐升高。因此，选择7.5mL/kg的灌酒剂量为最佳灌酒剂量。
表3小鼠酒精致醉剂量的选择
2 小鼠乙醇脱氢酶（ADH）活力
如图1所示，与模型组相比，经槐花粉和大豆粉混合物干预后，酒精性肝损伤小鼠ADH活力提升不明显，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂灌胃酒精性肝损伤小鼠后，ADH活力显著提高，说明凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂均能够明显加快乙醇分解为乙醛的速度，有利于肝脏中乙醇的分解代谢，具有较好的解酒作用，且凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂对肝脏ADH活力升高效果较为明显，参见图1。
3 小鼠超氧化歧化酶（SOD）活力
如图2所示，与模型组相比，经槐花粉和大豆粉混合物干预后，酒精性肝损伤小鼠肝脏SOD活力提升不明显，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂灌胃酒精性肝损伤小鼠后，小鼠肝脏SOD活力明显升高，说明凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂均能提高小鼠肝脏SOD活力，清除因乙醇代谢产生的自由基，减少乙醇代谢产生的自由基对肝脏的损害，具有护肝功效，且凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂对提升肝脏SOD活力效果较为显著，参见图2。
4 小鼠血清丙氨酸转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)
如图3和图4所示，与模型组相比，经槐花粉和大豆粉混合物干预后，酒精性肝损伤小鼠血清ALT、AST活力均降低，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂灌胃酒精性肝损伤小鼠后，小鼠血清中ALT、AST活力明显降低，说明凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂均能有效降低血液中ALT、AST活力，对急性醉酒小鼠肝细胞具有较好的保护作用，且凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂对酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活力降低较显著，参见图3、4。
5 小鼠血脂指标
大量饮酒后，乙醇会在乙醇脱氢酶的催化下被氧化，导致三羧酸循环发生障碍，脂肪酸氧化减弱，从而影响脂肪的代谢，而且乙醇可导致磷酸甘油增多而促进甘油三酯（TG）的合成，致使脂肪在肝细胞内沉积，TG含量增多。由于脂类和酒精都是从肝脏代谢，大量的酒精就会导致肝细胞损伤，影响肝细胞的代谢，肝脏代谢脂类的路径就会受到影响，致使血脂升高、纤维化，胆固醇含量升高。如图5和图6所示，与模型组相比，经凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂灌胃酒精性肝损伤小鼠后，急性醉酒小鼠血清中的TG、TC的含量明显降低。说明凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂均能有效降低肝脏中血脂的积累，且凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂对TG、TC含量降低效果较明显，参见图5、图6。
综上所述，本实验研究了凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂对急性酒精肝损伤小鼠的影响。结果表明，凝结魏茨曼氏菌IOB502菌粉及制剂均可增强急性酒精肝损伤小鼠肝脏ADH活力，促进乙醇代谢，有较好的解酒效果，同时能提高急性酒精肝损伤小鼠肝脏SOD活力，减轻乙醇对肝脏的损害，还能有效降低酒精性肝损伤小鼠血清中ALT、AST活力，对小鼠肝细胞具有较好的保护作用。此外，还能够有效降低肝脏中血脂的积累，为解酒、减轻乙醇对肝脏损害和辅助治疗急性酒精肝损伤提供了一定的药理学依据，同时为开发凝结魏茨曼氏菌IOB502活菌药物提供了思路。
本发明可用其他的不违背本发明的精神或主要特征的具体形式来概述。因此，无论从哪一点来看，本发明的上述实施方案都只能认为是对本发明的说明而不能限制本发明，权利要求书指出了本发明的范围，而上述的说明并未指出本发明的范围，因此，在与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在本发明的权利要求书的范围。
Claims (1)
1. 一种凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502分段发酵菌剂在制备治疗酒精肝损伤药物中的应用，所述凝结魏茨曼氏菌（Weizmannia coagulans）IOB502已保藏于CGMCC，保藏编号为CGMCC No.16025，其分段发酵菌剂的制备方法的具体步骤为：
（1）菌株活化：将菌株按体积比1:25接种于活化培养基中，36±2℃，密闭培养22±2h得到种子液；所述活化培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min；
（2）第一段发酵：按照体积比1:60的接种量将活化好的种子液接种到灭菌后的发酵培养基中，发酵罐搅拌转速100r/min，36±2℃，密闭培养30±2h，即得到发酵液；所述发酵培养基：胰酪胨15.0g，大豆木瓜蛋白酶水解物5.0g，氯化钠5.0g，琼脂15.0g，加水量为1L，将上述组分混合，并调节溶液pH为7.0±0.2，然后121℃灭菌25min；
（3）第二段发酵：按照料液比1:1.75接种量，将获得的第一段发酵液接种到灭菌后的固态发酵培养基中，36±2℃，密闭培养36±2h；所述固态发酵培养基为：槐花粉和大豆粉混合，121℃灭菌25min后冷却备用；
（4）菌粉及制剂：将发酵后菌及代谢产物进行冷冻干燥，即可获得高活性凝结魏茨曼氏菌IOB502制剂。
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