CN107541478B - 高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物及其制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物及其制备方法、应用，属于微生物代谢产物应用技术领域。本发明的植物乳杆菌胞外代谢产物，在制备时所使用的培养基配方为1.5‑2.5％葡萄糖，0.5‑1.5％大豆蛋白，0.3‑0.7％酵母浸汁，余量为番茄汁。该配方简单不添加缓冲体系无机盐和表面活性剂，制得的代谢产物适合于人体服用。本发明通过离体细胞与活体生物实验的双重印证植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物对细胞氧化应激损伤具有保护作用，并能提高机体的免疫防御功能；并通过急性酒精肝损伤诱导实验发现，本申请的番茄汁培养基胞外代谢产物对动物体肝损伤具有很好的保护作用。

Description

高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物及其制备方 法、应用

技术领域

本发明涉及高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物及其制备方法、应用，属于微生物代谢产物应用技术领域。

背景技术

机体内正常生理活动过程中都有氧化活性物质参与的氧化反应，人体内自身存在自由基清除系统可维持氧自由基的动态平衡。自由基代谢的动态平衡是维系生命与健康的基本要素，当产生的新自由基超出自身的抗氧化能力，或外源性氧化物质的过量摄入，就会导致氧自由基在细胞内过量蓄积而引发氧化应激的状态；过量自由基所引发的氧化应激是导致身体中各组织器官损伤、病变的重要原因之一，自由基过多导致不饱和脂肪酸、蛋白质、核酸等生物大分子的损伤，是冠心病和动脉粥样硬化、肿瘤、神经性病变等多种疾病的原因之一。“抵御疾病和延缓衰老一直是医学工作者奋斗的目标，健康生活和永葆青春是人们永恒追求的生活模式”，随着人们对衰老机制认识的加深，如何延缓衰老的问题一直是人们所关注的热点，如何抵制过多自由基的产生、自由基体内沉积及氧化损伤是亟待解决的科学问题。

乳酸菌的代谢产物具有增强免疫、抗癌、延缓衰老等功效，但不同的乳酸菌功效差异很大，其作用机制与抗氧化和自由基代谢关系密切，乳酸菌的代谢产物可以广泛应用于功能食品、复合饲料、新型药物和精细化工等领域。另外，随着酒精、药物的摄入，乙醇等化学物对人们肝脏的损伤日益严重，预防肝脏损伤也与抗氧化和自由基代谢关系密切。乳杆菌是一类足量摄入后对宿主健康水平产生有益影响的活微生物，乳酸菌绝大多数对动物和人无毒、无害、无副作用，目前学者认为乳杆菌代谢产物具有改善粘膜表面微生物群或酶的平衡，刺激机体特异性或非特异性免疫机制等改善消化道微生态环境的功能。因此对乳酸菌的代谢产物的开发尤为重要。

但是目前市场上，乳酸菌(植物乳杆菌)食品(乳酸菌培养基)加入不同含量的无机盐、表面活性剂，以促进其生长和避免结块沉淀，并加入防腐剂以延长保存期但是会降低菌的活性。两株乳酸菌对小鼠血清和肝组织抗氧化性的影响(食品研究与开发，2010年10月，第31卷第10期，黄珊珊等)发现乳杆菌代谢产物对小鼠血清和肝组织抗氧化性的影响，但是其采用的是MRS培养基，其代谢产物中具有较高浓度的的无机盐、表面活性剂，不适合于人体食用，并且其代谢产物对于抗氧化的效果也并不理想。

发明内容

本发明的目的是提供一种植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，该胞外代谢产物中不含有无机盐及表面活性剂，动物体在食用该代谢产物时副作用小。

本发明还提供了上述胞外代谢产物的制备方法。

本发明还提供了上述胞外代谢产物的应用。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，所述番茄汁培养基的配方为：1.5-2.5％葡萄糖，0.5-1.5％大豆蛋白，0.3-0.7％酵母浸汁，余量为番茄汁。本申请的番茄汁培养基无需调pH。

所述植物乳杆菌为STIII菌。

优选的，所述番茄汁培养基的配方为：2％葡萄糖，1％大豆蛋白，0.5％酵母浸汁，余量为番茄汁。

上述的胞外代谢产物，由包括如下步骤的方法制得：制备植物乳杆菌种子液，将制得的植物乳杆菌种子液以0.5-1.5％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于40-42℃培养16-20h后置于2-6℃中12-16h，然后将得到的混合物离心后取上清，即为胞外代谢产物。

本申请所用的植物乳杆菌在在番茄汁培养基中，于42℃培养10h，即可进入对数生长期，16h达稳定期。

本发明的胞外代谢产物，植物乳杆菌培养物经过置低温(4℃左右)过夜(12-16h)，因为在试验中发现大部分抗氧化物质是菌悬液置冰箱后培养过程所产生的，未在4℃搁置的胞外代谢产物与本申请的胞外代谢产物抗氧化的效果是相差很多的。乳杆菌产生的具抗氧化活性的短链脂肪酸如丁二酸、甲酸、乙酸、乳酸等多在培养10-16h对数生长期后，进入稳定期在低温下分泌产生，本发明中试验例中活性物质的抗菌效应实验和溶钙实验可以证明这一点。

所述离心为在3500rpm/min离心10min。

上述的胞外代谢产物，由包括如下步骤的方法制得：

1)制得细菌数为10⁷-10⁹/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养18-24h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养16-18h后置于4℃中12-16h，将得到的混合物于3000-4000r/min离心8-12min，取上清即为胞外代谢产物。

上述的胞外代谢产物的制备方法：包括：制备植物乳杆菌种子液，将制得的植物乳杆菌种子液以0.5-1.5％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于40-42℃培养16-18h后置于2-6℃中12-16h，然后将得到的混合物离心后取上清，即为胞外代谢产物。

上述的胞外代谢产物的制备方法：由包括如下步骤的方法制得：

1)制得细菌数为10⁷-10⁹/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养18-24h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养16-18h后置于4℃中12-16h，将得到的混合物于3000-4000r/min离心8-12min，取上清即为胞外代谢产物。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤抗氧化保护方面、急性肠道损伤保护方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中降低血浆中ALT、AST酶活方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中提高肝脏中ALT、AST酶活方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中降低肝脏中MDA含量，提高肝脏中CAT酶活及SOD酶活方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中提高肝细胞存活率(降低肝细胞凋亡)方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中提高肝脏甘油三酯方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肝损伤中降低TNF-α、IL-6含量方面的应用。

上述的胞外代谢产物在急性肠道损伤中提高肠道绒毛结构、肠道细胞结构整齐度以及增加肠壁厚度方面的应用。

上述的胞外代谢产物在在急性肠道损伤中提高肠道紧密连接蛋白Occludin-1、Occludin、ZO-1及MDR1表达方面的应用。

上述的胞外代谢产物在在急性肠道损伤中降低内质网应激相关蛋白CHOP、GRP78、PDI和XBPI的表达方面的应用。

所述急性肝损伤为酒精性急性肝损伤。

在上述应用时，动物体直接服用胞外代谢产物。

在上述应用中，动物体需连续服用细胞代谢产物10-21d。

本发明的胞外代谢产物，所使用的番茄汁培养基配方简单不添加缓冲体系无机盐和表面活性剂，一定浓度比例的番茄汁富含多种生物活性物质，加入一定糖分和大豆胨生长良好。本发明通过离体细胞(in vitro)与活体生物(in vivo)实验的双重印证植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物对细胞氧化应激损伤的保护作用和机体的免疫防御功能，使小鼠在连续服用本申请的番茄汁培养基胞外代谢产物10-21d后，对小鼠进行CC1₄和酒精诱导的肝损伤，结果发现，服用本申请的番茄汁培养基胞外代谢产物的实验组小鼠的肝损伤远远小于对照组，表明本申请的番茄汁培养基胞外代谢产物对动物体肝损伤及肠道损伤具有很好的保护作用。本发明具有以下有益效果：

(1)在细胞水平上，拟将分别选取NCTC1649小鼠正常胚胎肝细胞为实验材料，分别研究乳酸菌的有益代谢物作用下对肝细胞氧化应激损伤的保护作用及肝细胞的抗氧化防御机能的增强作用；

(2)另一方面，在活体实验中，以小鼠作为实验对象，通过严格控制实验条件，建立小鼠肝损伤模型，以食品级配方培养基乳酸菌发酵代谢产物喂养诱导下的肝氧化损伤保护模型，证实其作用的治疗效果。

(3)该研究的实施为进一步的临床应用提供理论依据，也为食品级配方培养基乳酸菌发酵代谢产物综合开发提供了新的思路。

附图说明

图1为试验例1中不同浓度CCl₄、时间对肝细胞作用的影响示意图；

图2为试验例1中各处理组肝细胞存活率示意图；

图3为试验例2中第1、2、4组的肝脏外观图；

图4为试验例2中各处理组血浆中ALT和AST值比较示意图；

图5为试验例2中各处理组肝匀浆中ALT和AST值比较示意图；

图6为试验例2中各处理组肝匀浆中MAD含量、SOD活力值比较示意图；

图7为试验例2中各处理组全血中CAT活力值比较示意图

图8为饲喂不同液体的小鼠经酒精诱导肝损伤后各组的肝脏脂肪展示图；

图9为饲喂不同液体的小鼠经酒精诱导肝损伤后各组的肝脏甘油三酯的含量图；

图10为饲喂不同液体的小鼠经酒精诱导肝损伤后各组的肝脏ALT、TNF-α、IL-6的含量图；

图11为饲喂不同液体的小鼠经酒精诱导肝损伤后各组的肝细胞凋亡的展示图；

图12为酒精诱导肠道损伤肠道组织HE染色图；

图13为酒精诱导肠道损伤肠道组织紧密连接蛋白Occludin-1、Occludin、ZO-1及MDR1免疫染色图；

图14为酒精诱导肠道损伤肠道组织CHOP、GRP78、PDI和XBPI蛋白免疫染色图；

图15为不同温度下产生的胞外产物抑菌效果比较图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的详细说明。

以下实施例及试验例中所用菌购自广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心，植物乳杆菌STIII株，编号CGMCC No.0847；德氏乳杆菌保加利亚亚种，编号CICC No.6045；干酪乳杆菌干酪亚种编号ATCC No.25302，大肠杆菌(ATCC25922)，奇异变形杆菌(ATCC49005)购自中国生物制品检定所。小鼠正常胚胎肝细胞NCTC1649，由本校细胞中心提供。ICR小鼠由本校实验动物中心提供。本申请采用的普通培养基为MRS培养基，配方为：蛋白胨10g，酵母粉5g，牛肉膏10g，葡萄糖20g，乙酸钠5g，柠檬酸氢二铵2g，吐温-80 1mL，MgS0₄·7H₂00.58g，MnSO₄·4H₂O 0.25g，K₂HP0₄ 2g，蒸馏水1000mL调pH6.0～6.4。115℃灭菌20min待用。

以下实施例及对比例中如未说明，则番茄汁培养基的配方为：500g番茄去皮，加水1000ml调理机榨汁，160目过滤得到新鲜番茄汁，按以下比例加入2％葡萄糖，1％大豆蛋白，0.5％酵母浸汁，115℃灭菌20min待用。

实施例1

本实施例中的番茄汁培养基的制备为：500g番茄去皮，加水1000ml调理机榨汁，160目过滤得到新鲜番茄汁，按以下比例加入2％葡萄糖，1％大豆蛋白，0.5％酵母浸汁，115℃灭菌20min待用。

本实施例中的植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，由包括如下步骤的方法制得：

1)用番茄汁培养基制得细菌数为10⁸/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养20h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取上清即为胞外代谢产物。

使用该实施例溶液的为番茄汁培养基细胞外液组。

实施例2

本实施例中的番茄汁培养基的制备为：500g番茄去皮，加水1000ml调理机榨汁，160目过滤得到新鲜番茄汁，按以下比例加入1.5％葡萄糖，1.5％大豆蛋白，0.7％酵母浸汁，115℃灭菌20min待用。

本实施例中的植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，由包括如下步骤的方法制得：

1)用番茄汁培养基制得细菌数为10⁷/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养18h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养18h，置2℃冰箱16h，然后将得到的混合物于3000r/min离心12min，取上清即为胞外代谢产物。

实施例3

本实施例中的番茄汁培养基的制备为：500g番茄去皮，加水1000ml调理机榨汁，160目过滤得到新鲜番茄汁，按以下比例加入2.5％葡萄糖，0.5％大豆蛋白，0.3％酵母浸汁，115℃灭菌20min待用。

本实施例中的植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，由包括如下步骤的方法制得：

1)用番茄汁培养基制得细菌数为10⁹/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养24h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养16h，置6℃冰箱12h，然后将得到的混合物于4000r/min离心8min，取上清即为胞外代谢产物。

对比例1

维生素E水溶液(25mg/mL)。

使用该对比例溶液的为阳性对照组。

对比例2

普通培养基培养制得的植物乳杆菌胞内代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述MRS培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取沉淀的菌体，用生理盐水洗涤三次，加入无菌水补至离心前体积后直接超声波冷冻破碎后，4000r/min离心10分钟，取上清用滤菌器过滤，制成植物乳杆菌胞内代谢产物。

对比例3

普通培养基培养制得植物乳杆菌胞外代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述MRS培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取上清即为胞外代谢产物。

对比例4

普通培养基，培养制得的保加利亚乳杆菌胞内代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的保加利亚乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得菌种子液；

2)将步骤1)的保加利亚乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述MRS培养基中于42℃培养16h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取沉淀的菌体，用生理盐水洗涤三次，加入无菌水补至离心前体积后直接超声波冷冻破碎后，4000r/min离心10分钟，取上清用滤菌器过滤，制成保加利亚乳杆菌胞内代谢产物。

对比例5

普通培养基培养制得保加利亚乳杆菌胞外代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的保加利亚乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得保加利亚乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的保加利亚乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述MRS培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取上清即为胞外代谢产物。

对比例6

番茄汁培养基培养制得植物乳杆菌胞内代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取沉淀的菌体，用生理盐水洗涤三次，加入无菌水补至离心前体积后直接超声波冷冻破碎后，4000r/min离心10分钟，取上清用滤菌器过滤，制成植物乳杆菌胞内代谢产物。

对比例7

番茄汁培养基培养制得的保加利亚乳杆菌胞内代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的保加利亚乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得菌种子液；

2)将步骤1)的保加利亚乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述番茄汁培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取沉淀的菌体，用生理盐水洗涤三次，加入无菌水补至离心前体积后直接超声波冷冻破碎后，4000r/min离心10分钟，取上清用滤菌器过滤，制成保加利亚乳杆菌胞内代谢产物。

对比例8

番茄汁培养基培养制得保加利亚乳杆菌胞外代谢产物：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的保加利亚乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得保加利亚乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的保加利亚乳杆菌种子液以1％的接种量接种至番茄汁培养基中于42℃培养20h，置4℃冰箱14h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取上清即为胞外代谢产物。

对比例9

无菌水溶液。

对比例10

番茄汁培养基，制备方法同实施例1。

对比例11

本对比例中胞外代谢产物由包括如下步骤的方法制得：

1)用MRS制得细菌数为10⁸/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1％的接种量接种至MRS培养基于42℃培养20h，得植物乳杆菌种子液；

2)将步骤1)的植物乳杆菌种子液以1％的接种量接种至所述MRS培养基中于42℃培养20h，然后将得到的混合物于3500r/min离心10min，取上清即为胞外代谢产物。

试验例1

实施例及对比例中的产物在细胞水平上抗氧化作用。

肝细胞损伤模型的建立：肝细胞NCTC1649设置正常对照组(无CCl₄处理)、低浓度CCl₄模型组(10mmol/L CCl₄)、中浓度CCl₄模型组(20mmol/L CCl₄)、高浓度CCl₄模型组(30mmol/L CCl₄)四组进行CCl₄急性肝细胞损伤模型实验，处理不同的时间(2、4、6h)，探明合适的CCl₄浓度及处理时间以建立肝细胞损伤模型。实验结果如图1所示，结果表明表明当CCl₄作用浓度为10mmol/L时，见存活率呈直线明显下降。6h内存活率为间隔相同时间内CCl₄的损伤程度最大，存活率为60％。10mmol/L的CCl₄适合于建立肝细胞损伤模型，因此后续实验采用10mmol/L的CCl₄建立肝细胞损伤模型。

1、取对数生长期肝细胞NCTC1649，使用D-Hanks溶液洗一遍，然后用0.25％胰酶消化，再用含10％血清的DMEM培养液制成单细胞悬液，肝细胞数约为10⁵个/ml，接种于96孔细胞培养板中，每孔100μl，置于37℃、5％CO₂培养箱中培养24h。

2、设置10个组别，A组和K组加入对比例9的无菌水，B-J组分别将对比例1-6、实施例1、对比例7-8的产物分别加入到各个孔中，每孔100μl，每组三个复孔，于37℃、5％CO₂条件下继续培养48h。

3、培养后，将上清吸出，在A-J组中各加入100μl的CCl₄浓度为10mmol/L的细胞培养基，第K组加入100μl无CCl₄的细胞培养培养，继续培养6h，。培养后每孔加入CCK-8溶液10μl，反应1h后用酶标仪在450nm下测定各孔吸光度，计算细胞存活率。

存活率(％)＝(A-J处理组吸光度—空白对照吸光度)/(第K组吸光度-空白对照组吸光度)，空白对照为无肝细胞的培养液，存活率结果如图2所示，从图中可以看出普通培养基的植物乳杆菌的胞外代谢产物比胞内代谢产物的细胞存活率高；改良番茄汁培养的植物乳杆菌的胞外代谢产物比传统MRS的存活率明显提高，且高于阳性对照组维生素E组；本发明植物乳杆菌番茄汁培养基的胞外代谢产物比普通培养基胞外代谢产物、保加利亚乳杆菌番茄汁培养基的胞外代谢产物的存活率都要高。因此本发明植物乳杆菌番茄汁培养基的胞外代谢产物对于肝细胞的保护效果更好。

试验例2

实施例及对比例中的产物对CC1₄诱导的小鼠急性肝损伤的保护及免疫抗氧化作用。

CCl₄肝损伤模型建立：选择24只小鼠，随机分成正常对照组(无CCl₄处理)、低浓度CCl₄模型组(0.10％CCl₄)、中浓度CCl₄模型组(0.20％CCl₄)、高浓度CCl₄模型组(0.30％CCl₄)共4组，每组6只，分别编号1、2、3、4、5、6。各组均先自由进食，同条件适应性喂养三天。三天后，正常对照组腹腔注射花生油(0.1ml/10g)，模型组分别注射对应浓度的CCl₄花生油溶液(0.1ml/10g)，禁食不禁水，24h后经摘取眼球取血，肝素钠抗凝。将抗凝全血1500r/min离心l0min，取上清液4℃储存，备用。检测血浆中ALT、AST活性和肝脏指数，对比检测结果后确定采用0.10％CCl₄的花生油注射24h后造模成功。

将80只ICR小鼠随机分成10组，每组8只。按表1设定剂量每日进行一次灌胃，各组连续灌胃给药21d，均自由进食。

表1实验分组及灌胃给药情况

组别	给药类型	给药剂量
			1、正常对照组	0.9％氯化钠水溶液	0.1ml/10g
2、模型对照组	0.9％氯化钠水溶液	0.1ml/10g
			3、阳性对照组	对比例1的维生素E溶液	0.05mg/10g
4、植物乳杆菌+MRS(胞外)	对比例3的产物	0.1ml/10g
			5、植物乳杆菌+MRS(胞内)	对比例2的产物	0.1ml/10g
6、植物乳杆菌+改良番茄汁(胞外)	实施例1的产物	0.1ml/10g
			7、植物乳杆菌+改良番茄汁(胞内)	对比例6的产物	0.1ml/10g
8、保加利亚乳杆菌+改良番茄汁(胞外)	对比例8的产物	0.1ml/10g
			9、保加利亚乳杆菌+MRS(胞外)	对比例5的产物	0.1ml/10g
10、番茄汁培养基	对比例10的基础培养基对照	0.1ml/10g

于末次给药后2h，第2-10组分别进行腹腔注射0.10％CCl₄的花生油溶液0.1ml/10g，第1组腹腔注射同剂量的花生油，禁食不禁水，24h后经摘取眼球取血，肝素钠抗凝。同时破腹取肝脏、脾脏和胸腺，用4℃预冷的0.9％生理盐水冲尽残血，滤纸拭干，称质量，计算肝脏、脾脏和胸腺指数。其中：肝脏指数＝肝脏质量/小鼠体质量；脾脏指数＝脾脏质量/小鼠体质量；胸腺指数＝胸腺质量/小鼠体质量。

用4℃0.9％氯化钠制成10％的肝匀浆，4000r/min离心10min，取上清液待用；将抗凝全血1500r/min离心l0min，取上清液，均参照试剂盒说明书，测定总超氧化物歧化酶(T-SOD)、过氧化氢酶(CAT)、丙氨酸转氨酶(ALT)、天门冬氨酸转氨酶(AST)活性，丙二醛(MDA)含量。

组间比较应用单因素方差(One-way ANOVA)分析，采用SPSS17.0软件进行统计学处理，数据以均数±标准差表示。

1、实验结果显示(见表2)，实验组肝脏指数显著增高，而维生素E组、番茄汁细胞外液和普通培养基外液组则可显著地降低肝脏指数(P<0.01)，其中番茄汁胞外代谢产物组降低肝脏指数作用最为明显(P<0.001)。番茄汁细胞外液、普通培养基外液组实验组小鼠的脾脏指数与模型对照组相比都有升高的趋势，差异显著(P<0.05)；在胸腺指数方面，番茄汁细胞外液组均有显著差异(P<0.05)，这说明番茄汁细胞外液可以促进小鼠免疫器官脾脏、胸腺的生长，有利于机体免疫功能的提高。

第1、2、4组的肝脏外观如图3所示，从图中可以看出，第四组的肝脏受损害较小，与正常对照组差异较小。

表2各组小鼠肝脏指数、脾脏指数、胸腺指数比较

组别	肝脏指数	脾脏指数	胸腺指数
				1正常对照组	0.0427±0.0046*	0.00398±0.0056*	0.00283±0.00039*
2模型对照组	0.0500±0.0037	0.00298±0.00046	0.00166±0.00020
				3阳性对照组	0.0422±0.0074*	0.00410±0.00038*	0.00278±0.00068*
4植物乳杆菌+MRS(胞外)	0.0445±0.0043*	0.00436±0.00083*	0.00270±0.00045
				5植物乳杆菌+MRS(胞内)	0.0478±0.0076	0.00393±0.00064	0.002056±0.00018
6植物乳杆菌+改良番茄汁(胞外)	0.0412±0.0052**	0.004313±0.00064*	0.00334±0.0011*
				7植物乳杆菌+改良番茄汁(胞内)	0.0461±0.0050	0.00477±0.00110	0.00280±0.0017
8保加利亚乳杆菌+改良番茄汁(胞外)	0.0492±0.0068	0.00410±0.000882	0.00171±0.00025
				9保加利亚乳杆菌+MRS(胞外)	0.0532±0.0071	0.00416±0.00057	0.00181±0.00033
10番茄汁培养基	0.05100±0.0045	0.00379±0.00050	0.002036±0.00031

2、CCl₄引起肝细胞损伤时破坏了膜结构，肝细胞内多种酶可透过肝细胞膜到肝窦状隙进入血液，使血中的多种酶活性增高，而肝内酶活性下降。其中转氨酶是肝细胞损伤最敏感的指标之一，转氨酶变化情况在一定程度上反映了肝细胞损害的程度。ALT及AST主要存在于肝细胞中，当肝细胞损伤时，ALT首先进入血中，当肝细胞严重损伤、危及线粒体时，AST也会进入血中。可见，ALT对肝细胞损伤更为敏感。实验测定了血浆和肝匀浆中的转氨酶活性，结果显示(见表3和图4、图5所示，图中组别分别与表中相对应)，模型组小鼠血浆内ALT、AST较正常对照组升高极显著(P<0.001)，肝匀浆内ALT、AST较正常对照组也显著升高(P<0.05)，说明肝损伤模型复制成功。番茄汁细胞外液组均能显著降低肝损伤小鼠血中转氨酶活性，保持肝脏中转氨酶活性，说明能降低CCl₄对肝细胞的损伤作用，保加利亚乳酸杆菌代谢产物、番茄汁对照组保护作用与模型组比较均无显著性差异(均P>0.05)。

表3血浆及肝匀浆中ALT、AST活性

3、CCl₄引起细胞膜的脂质过氧化，形成MDA等过氧化脂质，MDA可严重破坏膜结构，通过脂氢过氧化物的分解，其产物可引起细胞损伤。因而MDA的常常可反应机体内脂质过氧化的程度，间接的反应出细胞损伤的程度。肝损伤模型组小鼠MDA极显著增高(P<0.001)，而普通培养基外液组和番茄汁细胞外液均能显著降低肝匀浆中MDA含量，改善过氧化损伤，且番茄汁细胞外液组的作用更明显(P<0.01)。

氧化和抗氧化的平衡是决定细胞生存的条件，正常机体内有一套有效的抗氧化防御体系来防止氧自由基对机体的损伤，如SOD把机体内有害的超氧自由基分解为H₂O₂，CAT会继续将其分解为水和氧气，与SOD组成抗氧化链条。实验数据显示，CCl₄作用于小鼠体内，造成CAT、SOD活力极显著降低，植物乳杆菌改良番茄汁培养物胞外代谢产物能显著提高能显著提高CAT、SOD活力(P<0.05)，显著改善肝损伤，提高抗氧化能力(如表4和图6、图7所示)。

表4肝匀浆中MDA含量、SOD活力和全血CAT活力

注：与模型对照组比较，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001

上述实验中，通过CCK-8法对肝细胞的存活率进行检测，证实了植物乳杆菌代谢产物具有保护肝细胞损伤、抗氧化的作用，并且有良好的量效关系，且番茄汁培养基细胞外液对CCl₄损伤肝细胞保护效果最好。0.10％CC1₄诱导急性化学性肝损伤小鼠模型实验中，通过测定MDA含量、ALT、AST、CAT、SOD等酶活指标综合分析，乳杆菌代谢产物饲喂小鼠，能显著保护小鼠受损的肝脏，抵抗氧化作用。从MDA含量、全血CAT活力、肝匀浆中ALT、AST活性等指标上可以看出，番茄汁培养基细胞外液的护肝、抗过氧化脂质作用更显著。

氧化代谢和应激过程产生的自由基等造成细胞与组织损伤是导致机体衰老的原因之一。通过体外、体内等方面的大量实验，有研究结果表明，乳杆菌代谢产物提高SOD、CAT活性，增强机体抗氧化及抗自由基损伤的能力，并促进益生菌的成长；本研究将细胞试验与整体试验有机结合，从不同角度分析干预机体氧化应激作用的机理，有助于揭示乳杆菌代谢产物在系统氧化还原调节和排毒的作用。随着研究的进一步深入，必将为抗衰老保健和临床肿瘤化疗用药提供一个无公害的“绿色”选择。

试验例3

实施例1及对比例的产物急性酒精肝损伤抗氧化的快速验证实验

1、植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液对酒精诱导肝脏脂肪堆积的保护作用。20g左右雄性ICR小鼠随机分为3组(Control组，EtOH组和L-P+EtOH组)，每组8只。Control组和EtOH组每日给予普通饲料和含番茄汁培养液(1:20)自来水，L-P+EtOH组每日给予普通饲料和含植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液(1:20)的自来水。10天后对EtOH和L-P+EtOH组进行急性酒精灌胃(6g/kg酒精灌胃)，6小时后处死各组小鼠。收集肝脏组织，H&E染色结果显示酒精处理组小鼠肝脏脂肪堆积显著，经植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液喂养的小鼠肝脏脂肪堆积显著减少(如图8所示)。同时，我们也检测了肝脏甘油三脂的含量，结果如图9所示，发现酒精处理组小鼠肝脏甘油三脂的含量显著增加，经植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液喂养的小鼠，肝脏甘油三脂的含量显著降低。(*P<0.05)

2、植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液对酒精诱导肝损伤的保护作用。20g左右雄性ICR小鼠随机分为3组(Control组，EtOH组和L-P+EtOH组)，每组8只。Control组和EtOH组每日给予普通饲料和含番茄汁培养液(1:20)自来水，L-P+EtOH组每日给予普通饲料和含植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液(1:20)的自来水。10天后对EtOH和L-P+EtOH组进行急性酒精灌胃(6g/kg酒精灌胃)，6小时后处死各组小鼠。收集外周血和肝脏组织，试剂盒检测外周血中ALT的含量，结果显示酒精处理组外周血中ALT的含量显著增加，而植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液喂养组外周血中的ALT水平较单独酒精处理组显著降低。我们同时检测了肝脏组织TNF-α和IL-6的含量，结果如图10所示，发现酒精处理组小鼠肝脏TNF-α和IL-6的含量显著增加，经植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液喂养的小鼠，肝脏TNF-α和IL-6的含量显著降低。(*P<0.05)

3、植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液对酒精诱导肝细胞凋亡的保护作用。20g左右雄性ICR小鼠随机分为3组(Control组，EtOH组和L-P+EtOH组)，每组8只。Control组和EtOH组每日给予普通饲料和含番茄汁培养液(1:20)的自来水，L-P+EtOH组每日给予普通饲料和含植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液(1:20)的自来水。10天后对EtOH和L-P+EtOH组进行急性酒精灌胃(6g/kg酒精灌胃)，6小时后处死各组小鼠。收集肝脏组织进行TUNEL染色，结果如图11所示，表明酒精处理组肝组织中肝细胞凋亡显著增加，而植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液喂养组肝细胞凋亡程度较单独酒精处理组显著降低。

试验例4

植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液对酒精诱导的肠道损伤的保护作用。

1、20g左右雄性ICR小鼠随机分为3组(Control组，EtOH组和L-P+EtOH组)，每组8只。Control组和EtOH组每日给予普通饲料和含番茄汁培养液(1:20)的自来水，L-P+EtOH组每日给予普通饲料和含植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液(1:20)的自来水。10天后对EtOH和L-P+EtOH组进行急性酒精灌胃(6g/kg酒精灌胃)，6小时后处死各组小鼠。收集肠道组织进行H&E染色，染色结果如图12所示，结果显示酒精处理组肠道绒毛空泡增加，肠道细胞结构紊乱，肠壁变薄。而经植物乳杆菌细胞外液喂养组较单独酒精喂养组肠道绒毛结构完整，肠道细胞结构整齐，肠壁增厚。(*P<0.05)

2、20g左右雄性ICR小鼠随机分为3组(Control组，EtOH组和L-P+EtOH组)，每组8只。Control组和EtOH组每日给予普通饲料和含番茄汁培养液(1:20)的自来水，L-P+EtOH组每日给予普通饲料和含植物乳杆菌番茄汁培养基细胞外液(1:20)的自来水。10天后对EtOH和L-P+EtOH组进行急性酒精灌胃(6g/kg酒精灌胃)，6小时后处死各组小鼠，收集肠道组织进行免疫荧光染色。我们检测了三种紧密连接蛋白Claudin-1,Occludin和ZO-1的表达，结果如图13所示，与正常组相比，酒精显著降低Claudin-1,Occludin和ZO-1的表达，而经植物乳杆菌细胞外液喂养小鼠的肠道Claudin-1,Occludin和ZO-1的表达较单独酒精喂养小鼠的肠道显著增加。我们同时也检测了肠道MDR1(P-gp)蛋白的表达情况，MDR1广泛分布和表达在肠上皮细胞，具有防御有害物质进入肠道的功能。图13中免疫荧光结果显示，与正常组相比，酒精显著降低MDR1的表达，而经植物乳杆菌细胞外液喂养小鼠肠道的MDR1的表达显著增加。

3、我们检测了内质网应激相关蛋白CHOP,GRP78,PDI和XBPI的表达，结果如图14所示，与正常组相比，酒精显著增加CHOP,GRP78,PDI和XBPI的表达，而经植物乳杆菌细胞外液喂养小鼠肝脏CHOP,GRP78,PDI和XBPI的表达较单独酒精喂养小鼠的肠道显著降低。表明植物乳杆菌细胞外液可以抑制酒精诱导的肝脏内质网应激。

试验例5

乳杆菌在低温下产生更多活性物质的证实试验。

采用双层琼脂平板扩散法检测，即在灭菌平皿内倒入10ml 2％的灭菌水琼脂，待琼脂冷却凝固后放入灭菌的牛津杯，将0.1ml含菌约10⁶cfu/ml的奇异变形杆菌、大肠埃希菌悬液加入到20ml 50℃的指示菌软琼脂培养基中，混匀后倾注灭菌的平皿内。待培养基凝固后，用无菌镊子取出牛津杯，在孔中分别加对比例3及对比例11中的胞外代谢产物各0.2ml，将平皿置室温扩散24h，然后在指示菌最适生长温度37℃中培养24h，结果如图15所示。图15-a中的A、B、C、D是对比例11的胞外产物对奇异变形杆菌的抑菌效果，图15-b中的A、B、C、D是对比例11的胞外产物对大肠埃希菌的抑菌效果，图15-c中的E、F、G、H是对比例3中胞外代谢产物对奇异变形杆菌的抑菌效果，图15-d中E、F、G、H是对比例3中胞外代谢产物对的大肠埃希菌的抑菌效果，可以看出经过低温放置的对比例11与对比例3的胞外代谢产物抑菌效果明显不同。

试验例6

各菌株在低温静置培养后与不经低温培养的胞外代谢产物的溶钙效果比较。

利用短链脂肪酸具溶解不溶钙盐的作用，选择保加利亚乳杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、大肠杆菌的胞外代谢产物在经过低温静置培养后(42℃培养20h，4℃静置培养14h)与不经低温培养(42℃培养20h)的溶钙效果比较。我们设置含0.5％碳酸钙MRS双层培养基，用打孔器打孔，无菌针头挑出孔内琼脂。用加样枪吸取乳杆菌胞外代谢产物15uL滴于孔内，静置。每种菌接种9个孔。同时接种大肠杆菌作为对照，操作步骤同上。静置待菌液被部分吸收，将培养基倒置于隔水式培养箱中42℃、18-24h培养后用测微器测量其溶钙圈大小，后置冰箱4℃低温保存隔日再观察测量。结果如表5、表6所示，各种乳杆菌菌株冷藏后的溶钙圈直径明显大于未低温静置的，大肠埃希菌胞外代谢产物不具有溶钙能力。

表5乳酸菌42℃培养20h对0.5％碳酸钙溶钙作用比较

表6乳酸菌培养物4℃冷藏后对0.5％碳酸钙溶解作用比较

Claims (9)

1.高活性植物乳杆菌番茄汁培养基胞外代谢产物，其特征在于：由包括如下步骤的方法制得：制得细菌数为10⁷-10⁹/ml的植物乳杆菌菌悬液，以1%的接种量接种至番茄汁培养基于42℃培养18-24h，得植物乳杆菌种子液；将制得的植物乳杆菌种子液以0.5-1.5%的接种量接种至所述番茄汁培养基中于40-42℃培养16-20h后置于2-6℃中12-16h，然后将得到的混合物离心后取上清，即为胞外代谢产物；所述番茄汁培养基的配方为：500g番茄去皮，加水1000ml调理机榨汁，160目过滤得到新鲜番茄汁，按以下比例加入1.5-2.5%葡萄糖，0.5-1.5%大豆蛋白，0.3-0.7%酵母浸汁，115℃灭菌20min待用。

2.根据权利要求1所述的胞外代谢产物的制备方法：其特征在于：包括：制备植物乳杆菌种子液，将制得的植物乳杆菌种子液以0.5-1.5%的接种量接种至所述番茄汁培养基中于40-42℃培养16-18h后置于2-6℃中12-16h，然后将得到的混合物离心后取上清，即为胞外代谢产物。

3.根据权利要求1所述的胞外代谢产物在制备急性肝损伤抗氧化保护药物、急性肠道损伤保护药物方面的应用。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肝损伤中提高肝脏中ALT、AST酶活药物方面的应用。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肝损伤中降低肝脏中MDA含量，提高肝脏中CAT酶活及SOD酶活药物方面的应用。

6.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肝损伤中提高肝细胞存活率药物方面的应用。

7.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肝损伤中提高肝脏甘油三酯药物方面的应用。

8.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肝损伤中降低TNF-α、IL-6含量药物方面的应用。

9.根据权利要求3所述的应用，其特征在于：在制备急性肠道损伤中提高肠道绒毛结构、肠道细胞结构整齐度以及增加肠壁厚度药物方面的应用。

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