CN110521784A - 一种解酒养肝的益生菌发酵功能性食品及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于微生物发酵生产功能性食品领域，涉及一种解酒养肝的益生菌发酵功能性食品及其制备方法。所述益生菌发酵功能食品，是将大豆、姜黄、枳椇子制粉后按比例混合，采用凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行分段固态发酵而得。在有效提高产品中各益生菌含量的同时，又能提高产品中有益物质的含量和种类，并能够将一些大分子物质转化为小分子物质，利于人体的吸收，增益本功能性食品在解酒养肝方面的功效，并使之兼有调节肠道健康的功效。此外，本产品中的益生菌发酵能产生大量乳酸，可有效抑制腐败微生物生长，有助于提高产品保质期，无需添加防腐剂，产品本身品质不受影响。

Description

一种解酒养肝的益生菌发酵功能性食品及其制备方法
技术领域：
本发明属于微生物发酵生产功能性食品领域，涉及一种利用多种益生菌分段固态发酵大豆、姜黄、枳椇子来获得功能性食品，以及功能性食品的制备方法，所述功能性食品主要用于解酒养肝，同时具有调节肠道健康的功效。
背景技术：
我国作为一个酒类消耗大国，过量饮酒的现象并不罕见，酒中的乙醇对肌体的组织器官有直接毒害作用，而对乙醇最敏感的器官是肝脏。有证据表明，短期内大量摄取酒精易导致急性酒精中毒，产生头晕、恶心、呕吐等不适症状，长期饮酒可引起消化、神经、循环等系统诸多病变。乙醇在体内有极少量直接经尿、汗或肺排出体外，绝大部分酒精主要在肝脏代谢，经乙醇脱氢酶将酒精转化为乙醛，再经肝乙醛脱氢酶氧化为乙酸，最后变成水和二氧化碳排出体外，对肝脏负担很重，极易造成肝损伤。长期过度饮酒则会引起慢性酒精中毒，导致酒精性肝病，使人体产生心肌乏力、筋膜损伤、血管变脆、肾功能衰竭等病理变化，还会引起机体生理功能紊乱，危害人体健康。此外，喝入体内的酒精直接进入消化系统，实验表明，过量饮酒能够造成肠道菌群紊乱，影响身体代谢平衡，有害菌群增多，进一步造成肝脏及其他器官损伤。因此开发一种具有解酒养肝功效，又能兼顾调节肠道菌群平衡的产品对当前现状具有重要意义。
目前市面上的国内外解酒护肝产品如利尿类化学合成药物，护肝养胃类中药，蛋白肽类药物等，多副作用明显，或见效慢、治疗效果不好，或作用机理不明确，存在安全隐患。当前用于解酒养肝的专利大多为中药组合物类以及极少的发酵产品专利：
公开号：CN103721155A的发明《一种用于解酒养肝的中药组合物》公开了一种用于解酒养肝的中药组合物，由以下组分按照重量份数组成：高良姜15-25份，草豆蔻15-25份，茯苓20-30份，人参15-25份，青皮10-20份，垂盆草10-20份，丹参5-15份，三七5-15份，枸杞子5-15份，鸡骨草10-20份，将以上组分加入500份水中，煮沸20分钟，即成汤剂。
公开号：CN104248736A的发明《一种解酒养肝的中药药剂》公开了一种解酒养肝的中药药剂，由以下组分按照重量份数组成：白茅根15-25份，高良姜15-25份，桑甚20-30份，丁香15-25份，当归10-20份，石菖蒲10-20份，车前子5-15份，川穹5-15份，褚实子5-15份，将上述组分加入300-500份水中，煮沸20分钟，即成汤剂。
公开号：CN105815647A的发明《一种解酒护肝固体饮料及其制备方法和应用》公开了一种解酒护肝固体饮料及其制备方法和应用，由葛花提取物、甘草提取物、枳椇子提取物、覆盆子提取物制备而成，其中葛花有提高肝脏乙醇脱氢酶的活性作用，有利于乙醇在体内的分解代谢甘草具有抗炎、抗病毒、保肝解毒及增强免疫功能等作用，养肝、护肝效果非常好积棋子含有大量的葡萄糖、苹果酸钙，有较强的利尿作用，能促进乙醇的分解和排出，从而减轻乙醇对肝组织的损伤，覆盆子具有养肝明目之功效。
公开号：CN106266105A的发明《一种解酒保肝的益生菌发酵中药组合物及其制备方法和应用》公开了一种解酒保肝的益生菌发酵中药组合物及其制备方法和应用，将中药复方葛根、青果、枳椇子、菊花、赤小豆、陈皮、甘草药材混合粉碎后浸泡、酶解，加入营养物和无机盐，高温高压灭菌，接入复合肠道益生菌带渣发酵后过滤，滤渣再提取，合并滤液，加入低聚果糖浆，定容、高压灭菌即得。
上述专利公开的解酒养肝的食品和药物，制备方法只是将原料简单的按比例混合或加工提取后按一定比例混合而成，而利用发酵来制备解酒养肝产品的专利皆为液态发酵，废料多，原料与成品须经酶解，萃取，浓缩，灭菌等步骤，发酵前期与后期工艺复杂且对益生菌个体及整体微环境的破坏大，益生菌数量与活性成分损失大，产品易受污染，且加入较多辅料，产品对不同人群的适应性和产品效果无法保证。而以药食同源原料为底物，利用多种益生菌进行分段固态发酵生产一种活菌数量高，各菌种生长水平平衡，有益活性成分损失小，生产过程易控，对环境无污染的益生菌发酵食品及其制备方法未见报道。
发明内容：
本发明针对现有技术不足，提供一种具有解酒养肝功效的功能性食品，并提供该食品的制备方法，特别是针对经常饮酒或饮酒过量的人群，并为相关产品的生产提供研究思路。
本发明通过益生菌分段固态发酵大豆、姜黄、枳椇子来生产功能性食品，针对以上底物，结合不同益生菌在其中的发酵规律，开发了一种适合以上底物的分段固态发酵方法，将不同益生菌按特点、分时段接入底物中，在不同的发酵参数下进行发酵，通过这种发酵方案，能够使得各益生菌种生长平衡，避免了单一菌种成为优势菌，其它菌种数量极低的情况，也提高各菌种代谢产物的含量，并有效的将一些大分子物质转化为小分子物质，利于人体的吸收，增益本功能性食品在解酒养肝方面的功效，并使之兼有调节肠道健康的功效。
为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
一种具有解酒养肝功能的益生菌发酵功能食品，是将大豆、姜黄、枳椇子制粉后按比例混合，采用凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行固态发酵而得。
所述大豆、姜黄、枳椇子制粉的细度较佳的为不低于100目。
其中，大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉的比例为60-80:10-25:5-25；
所述大豆、姜黄、枳椇子均为市售；
优选的，所述混合料：水＝1∶1.7(质量体积比)；
优选的，所述固态发酵中，真空冷冻干燥20h，至含水量不大于10％；
优选的，所述植物乳具体制备方法如下：
(1)将大豆、姜黄、枳椇子清洗后置于60℃烘箱烘干4-6小时，分别磨粉过100目筛，得大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉；
(2)配制活化培养基：每100ml水中添加12g大豆粉，得活化培养基；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，25min；
(3)配置发酵培养基：取大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉，按质量比60-80:10-25:5-25混合得混合料，将混合料与水按混合料∶水＝1∶1.5—1∶2.1(质量体积比)混匀，121℃，25min灭菌；
(4)菌种活化：乳酸片球菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化20h后，按5％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，37℃再活化20h后得二级种子液；
(5)益生菌发酵：
①将活化完成的凝结芽孢杆菌与乳酸片球菌接入固态发酵罐中，使每克发酵基质中凝结芽孢杆菌的接种量为106-107CFU/g，乳酸片球菌的接种量为106-107CFU/g，维持温度37℃，通气量0.1-0.2m3/min，发酵18-24h；
②待第①步发酵完成后，将活化好的动物双歧杆菌与植物乳杆菌接入，使每克发酵基质中动物双岐杆菌的接种量为106-107CFU/g，植物乳杆菌的接种量为105-106CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵24-36h；
③待第②步发酵完成后，将活化好的副干酪乳杆菌接入，使每克发酵基质中副干酪乳杆菌的接种量为107-108CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵12-24h；
④待第③步发酵完成后，将活化好的枯草芽孢杆菌通过接种管路接入，使每克发酵基质中枯草芽孢杆菌的接种量为107-108CFU/g，维持温度37℃，通气量0.3-0.5m3/min，发酵12-24h；
(6)发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内冻干16-24h，制得解酒养肝的益生菌发酵功能食品；
杆菌为植物乳杆菌IOB602(Lactobacillus plantarum)，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.16021；
优选的，所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌IOB402(Bifidobacteriumanimalis)，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCC No.16028；
优选的，所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌IOB413(Lactobacillus paracasei)，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.16022；
优选的，所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌IOB502(Bacillus coagulans)，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为：CGMCCNo.16025；
优选的，所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌IOB430(Bacillus subtilis)，已于2018年6月29日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.16024；
优选的，所述乳酸片球菌为乳酸片球菌IOB701(Pediococcusacidilactici)，已于2018年7月10日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101，保藏编号为CGMCCNo.16077。
有益效果：
大豆源于中国，中国很早便有食用大豆发酵制品的传统，包括豆豉、豆汁、黄酱及各种腐乳等，都是用大豆或大豆制品接种霉菌发酵后制成的。大豆的营养价值很高，含有丰富的蛋白质、钙、铁、磷、B族维生素、和少量脂肪，对肝脏修复非常有益，此外，大豆中还含有大豆异黄酮，植物固醇、大豆低聚糖、膳食纤维等，可增强机体免疫、防止血管硬化、具有降血糖、抗氧化、降低血浆胆固醇、调节胃肠功能及胰岛素水平、促进消化和排便等功能。
姜黄在传统中医中活血行气，通经止痛的作用。主治胸腹胀痛，肩臂痹痛，月经不调，闭经，跌打损伤。有研究发现，姜黄中的姜黄素对肝脏具有保护作用，对于肝脏损伤具有修复作用。现代药理研究表明，姜黄中的姜黄素具有抗肿瘤活性和抗癌作用；姜黄中含有的姜黄醇，挥发油及姜黄素具有降血脂作用，能减轻动脉粥样硬化症。此外，姜黄还具有抗凝作用与抗氧化作用。
枳椇子有止渴除烦，清湿热，解酒毒功能。用于中酒毒，烦渴呕逆，二便不利等症。现代药理研究发现，枳椇子具有显著的利尿作用，同时枳椇子皂苷具有降压作用，枳椇子匀浆液有抗脂质过氧化作用和增强耐寒和耐热功能。
益生菌能够调节机体胃肠道正常菌群、保持微生态平衡，提高食物消化率和生物价，降低血清胆固醇，控制内毒素，抑制肠道内腐败菌的生长繁殖和腐败产物的产生，制造营养物质，刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。
本发明将大豆姜黄与枳椇子作为底物，使用乳酸片球菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌对大豆、姜黄、枳椇子进行分段固态发酵，在有效提高产品中各益生菌含量的同时，又能提高产品中有益物质的含量和种类，并能够将一些大分子物质转化为小分子物质，利于人体的吸收，增益本功能性食品在解酒养肝方面的功效，并使之兼有调节肠道健康的功效。此外，本产品中的益生菌发酵能产生大量乳酸，可有效抑制腐败微生物生长，有助于提高产品保质期，无需添加防腐剂，产品本身品质不受影响。
具体实施方式：
下面结合实施例和实验例详细说明本发明的技术方案，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，但本发明并不限于以下具体实施例且保护范围不限于此。
实施例中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指质量百分比，溶液的百分比指100mL中含有溶质的克数，液体之间的百分比，是指在25℃时溶液的体积比例。
以下实施例将以植物乳杆菌IOB602(Lactobacillus plantarum)，保藏编号为CGMCC No.16021；动物双歧杆菌IOB402(Bifidobacterium animalis)，保藏编号为CGMCCNo.16028；副干酪乳杆菌IOB413(Lactobacillus paracasei)，保藏编号为CGMCCNo.16022；凝结芽孢杆菌IOB502(Bacillus coagulans)，CGMCC No.16025；枯草芽孢杆菌IOB430(Bacillus subtilis)，保藏编号为CGMCC No.16024；乳酸片球菌IOB701(Pediococcusacidilactici)，保藏编号为CGMCC No.16077为例对本发明进行解释说明。
以下实施例所采用的菌种活化方式如未特别说明，均如下：
(1)配制活化培养基：每100ml水中添加12g大豆粉，得活化培养基；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，25min；
(2)菌种活化：乳酸片球菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化20h后，按5％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，37℃再活化20h后得二级种子液。
实施例1：解酒养肝的益生菌发酵功能食品制备方法
1、大豆、姜黄、枳椇子比例的确定
(1)将大豆、姜黄、枳椇子清洗后置于60℃烘箱烘干4-6小时，磨粉过100目筛，得大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉；
(2)配制活化培养基：每100ml水中添加12g大豆粉，得活化培养基；对活化培养基进行灭菌，条件为，121℃，25min；
(3)配置发酵培养基：取大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉按一定比例混合得混合料，将混合料∶水＝1∶1.7(质量体积比)，混匀后置于6T固态发酵罐中灭菌制得固态发酵培养基备用；6T固态发酵罐灭菌条件为，121℃，25min；
(4)菌种活化：乳酸片球菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌、副干酪乳杆菌、凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的甘油管分别按1％(v/v活化培养基的体积比)接种于活化培养基进行活化，pH自然，控制温度为37℃；分别活化20h后，按5％(v/v)的接菌量再次转接活化培养基进行二次活化，37℃再活化20h后得二级种子液；
(5)益生菌发酵：
①将活化完成的凝结芽孢杆菌与乳酸片球菌通过接种管路接入6T固态发酵罐中，使每克发酵培养基中凝结芽孢杆菌的接种量为1×107CFU/g，乳酸片球菌的接种量为1×107CFU/g，维持温度37℃，通气量0.1m3/min，发酵18h；
②待第①步发酵完成后，将活化好的动物双歧杆菌与植物乳杆菌通过接种管路接入6T固态发酵罐中，使每克发酵培养基中动物双岐杆菌的接种量为1×107CFU/g，植物乳杆菌的接种量为1×106CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵24h；
③待第②步发酵完成后，将活化好的副干酪乳杆菌通过接种管路接入6T固态发酵罐中，使每克发酵培养基中副干酪乳杆菌的接种量为1×108CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵24h；
④待第③步发酵完成后，将活化好的枯草芽孢杆菌通过接种管路接入6T固态发酵罐中，使每克发酵培养基中枯草芽孢杆菌的接种量为1×108CFU/g，维持温度37℃，通气量0.3m3/min，发酵14h；
(6)发酵完成后进行益生活菌检测，结果见表1：
菌种标号：1号为植物乳杆菌单菌，2号为动物双歧杆菌单菌，3号为副干酪乳杆菌单菌，4号为凝结芽孢杆菌单菌，5号为乳酸片球菌单菌，6号为枯草芽孢杆菌单菌
大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉的比例分别如下：
组一：60∶15∶25；
组二：70∶25∶5；
组三：60∶25∶15
组四：60∶20∶20
组五：80∶15∶5；
表1不同原料比例下发酵后活菌数(CFU/g)
结果如表1所示：大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉的最佳比例为组合三：60∶25∶15，此时测得益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为5.65×109CFU/g。
2、益生菌接种量的确定
按上述大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉60∶25∶15配置培养基，其余条件同1进行发酵。接种量如下所示：凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌分批次按比例接入固态发酵基质中，其中凝结芽孢杆菌的接种量为5×107，凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌接种量之比为：
组合一：1∶0.1∶1∶0.1∶10∶10，
组合二：1∶1∶0.1∶0.1∶10∶1，
组合三：1∶1∶1∶0.1∶10∶10，
组合四：1∶1∶1∶0.1∶10∶10，
组合五：1∶1∶0.1∶0.1∶10∶10，
组合六：0.1∶1∶1∶0.1∶10∶10，
组合七：1∶1∶0.1∶0.1∶5∶10，
组合八：1∶1∶0.1∶0.1∶10∶10，
组合九：1∶1∶1∶0.1∶10∶5。
按上述所示进行发酵，发酵结束后进行活菌计数，结果见表2：
菌种标号：1号为植物乳杆菌单菌，2号为动物双歧杆菌单菌，3号为副干酪乳杆菌单菌，4号为凝结芽孢杆菌单菌，5号为乳酸片球菌单菌，6号为枯草芽孢杆菌单菌。
表2各菌种不同接种量固态发酵后益生菌活菌数(CFU/g)
组合一 组合二 组合三 组合四 组合五 组合六 组合七 组合八 组合九
1号 2.05×10<sup>9</sup> 5.23×10<sup>8</sup> 4.15×10<sup>8</sup> 3.19×10<sup>9</sup> 5.23×10<sup>8</sup> 1.05×10<sup>9</sup> 2.53×10<sup>9</sup> 2.64×10<sup>8</sup> 4.52×10<sup>8</sup>
2号 5.24×10<sup>7</sup> 7.31×10<sup>7</sup> 3.13×10<sup>7</sup> 1.28×10<sup>8</sup> 7.67×10<sup>8</sup> 6.78×10<sup>7</sup> 4.68×10<sup>8</sup> 7.47×10<sup>7</sup> 1.78×10<sup>8</sup>
3号 3.18×10<sup>8</sup> 5.12×10<sup>8</sup> 2.17×10<sup>9</sup> 3.32×10<sup>9</sup> 7.32×10<sup>8</sup> 5.34×10<sup>8</sup> 1.01×10<sup>9</sup> 2.17×10<sup>9</sup> 2.19×10<sup>9</sup>
4号 7.27×10<sup>7</sup> 8.14×10<sup>8</sup> 5.15×10<sup>7</sup> 6.45×10<sup>8</sup> 2.07×10<sup>9</sup> 4.02×10<sup>8</sup> 4.73×10<sup>8</sup> 6.65×10<sup>8</sup> 1.86×10<sup>8</sup>
5号 2.94×10<sup>8</sup> 6.56×10<sup>8</sup> 1.67×10<sup>9</sup> 3.13×10<sup>8</sup> 1.03×10<sup>9</sup> 8.27×10<sup>8</sup> 5.75×10<sup>8</sup> 7.88×10<sup>8</sup> 6.13×10<sup>8</sup>
6号 3.43×10<sup>9</sup> 1.57×10<sup>9</sup> 6.19×10<sup>7</sup> 1.18×10<sup>9</sup> 2.01×10<sup>7</sup> 4.25×10<sup>7</sup> 5.26×10<sup>8</sup> 7.38×10<sup>8</sup> 7.46×10<sup>7</sup>
总活菌数 5.91×10<sup>9</sup> 4.75×10<sup>9</sup> 4.06×10<sup>9</sup> 6.57×10<sup>9</sup> 4.67×10<sup>9</sup> 3.15×10<sup>9</sup> 5.13×10<sup>9</sup> 4.04×10<sup>9</sup> 3.02×10<sup>9</sup>
由表2可知得到的最优接种量之比为组合1∶1∶1∶0.1∶10∶10，此时总活菌数为6.57×109CFU/g。
3料水比的确定
按大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉60∶25∶15配置培养基，凝结芽孢杆菌的接种量为5×107，凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌接种量之比为：
1∶1∶1∶0.1∶10∶10，将固态发酵培养基中混合料和水的比例(质量体积比)分别配成1∶1.5，1∶1.7，1∶1.9，1∶2.1，其余条件同1进行发酵，发酵结束后，分别对发酵样品中的益生菌活菌数进行检测，结果见表3：
表3不同料水比的发酵基质发酵后的活菌数(CFU/g)
比例 1：1.5 1：1.7 1：1.9 1：2.1
植物乳杆菌单菌 2.15×10<sup>9</sup> 3.07×10<sup>9</sup> 3.50×10<sup>9</sup> 2.51×10<sup>9</sup>
动物双岐杆菌单菌 1.12×10<sup>8</sup> 1.51×10<sup>8</sup> 2.04×10<sup>8</sup> 1.23×10<sup>8</sup>
副干酪乳杆菌单菌 2.47×10<sup>9</sup> 2.24×10<sup>9</sup> 2.61×10<sup>9</sup> 1.78×10<sup>9</sup>
凝结芽孢杆菌单菌 5.45×10<sup>8</sup> 6.77×10<sup>8</sup> 6.71×10<sup>8</sup> 3.25×10<sup>8</sup>
乳酸片球菌单菌 1.23×10<sup>8</sup> 2.91×10<sup>8</sup> 3.27×10<sup>8</sup> 2.24×10<sup>8</sup>
枯草芽孢杆菌单菌 1.97×10<sup>9</sup> 1.22×10<sup>9</sup> 1.89×10<sup>9</sup> 1.12×10<sup>9</sup>
总活菌数 6.01×10<sup>9</sup> 6.78×10<sup>9</sup> 7.32×10<sup>9</sup> 5.39×10<sup>9</sup>
结果如表3所示：最佳料水比为1：1.9，即测得所得益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为7.32×109CFU/g。
4、发酵时间的确定
按大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉60∶25∶15配置培养基，凝结芽孢杆菌的接种量为5×107，凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌接种量之比为：
1∶1∶1∶0.1∶10∶10，将固态发酵培养基中混合料和水的比例(质量体积比)配成1∶1.9，其余条件同1进行发酵；
将益生菌发酵的各阶段时间分别确定为以下几组：
组1：18h、24h、24h、14h；
组2：20h、24h、20h、18h；
组3：18h、30h，12h、14h；
组4：24h、30h、20h、14h；
组5：18h、36h、12h、24h。
发酵完成后进行活菌计数，结果如表4：
表4不同发酵时间发酵后的活菌数(CFU/g)
结果如表4所示：益生菌发酵的各阶段最佳时间为组合4，分别为：24h、30h、20h、14h，此时测得益生菌发酵功能性食品中的总活菌数为1.73×1010CFU/g。
5、发酵前后培养基活性成分变化
按上述最佳配料比、最佳接种量、最佳料水比、最佳发酵时间确定发酵条件，其余同1进行固态发酵，发酵完成后进行活性成分检测，与发酵前进行对比。利用高效液相法测定金雀异黄酮、大豆异黄酮苷元、GABA、棉子糖含量；利用福林酚反应测定多肽和多酚含量；参考宋宏哲、赵勇等的文章《比色法测定大豆皂苷的解析》测定大豆皂苷的含量；参考刘鹏莉、张双灵等的文章《分光光度法测定大豆卵磷脂中磷脂酰胆碱含量》测定方法测定大豆卵磷脂含量；参考郑斌、王舒等的文章《蓝莓酵素中蛋白质和蛋白酶含量测定》中的方法测定蛋白酶含量；利用淀粉酶快速比色测定法来测定淀粉酶的活力；参考高贵、韩四平等的文章《脂肪酶活力检测方法的比较》中的方法测定脂肪酶活力；参考段雪芹和杨瑞武等人的文章《姜黄属药用植物姜黄素的提取、含量测定及抗氧化活性研究》中的测定方法测定姜黄素含量。
表5发酵前后培养基活性成分变化
检测项目 发酵前含量 发酵后含量
金雀异黄酮(mg/100g) 6.13 12.56
大豆异黄酮苷元(mg/100g) 7.03 14.01
多肽(mg/100g) 709.23 1096.91
多酚(mg/100g) 607 1191
棉子糖(mg/g) 5.32 15.21
大豆皂苷(g/100g) 3.04 9.45
大豆卵磷脂(g/100g) 2.34 6.81
蛋白酶(μg/mL) 5.71 21.47
脂肪酶(U/g) 0.31 2.94
淀粉酶(U/g) 0.76 5.13
姜黄素(g/100g) 3.21 8.75
GABA(mg/g) 1.23 4.63
由表5可知，经上述益生菌发酵过程后，固态发酵基质中的金雀异黄酮、大豆异黄酮苷元、多酚、多肽、棉子糖、大豆皂苷、大豆卵磷脂、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、姜黄素和GABA的含量或活性较发酵前均有明显提高。
研究表明，黄酮类合物能够明显抑制癌细胞，对肝癌、胃癌、乳腺癌等癌细胞具有抑制作用，异黄酮类成分可以抑制肝脏微粒体脂质过氧化，具有明显的护肝作用；多肽几乎涉及到人体的所有生理活动，对人体具有不可替代的调节作用，尤其是多肽能够与进入机体的有毒化合物、重金属和致癌物质相结合，并促使其排出体外，能够大大降低肝脏的负担；多酚是对人体非常重要的营养物质，研究显示，多酚类物质能够通过减少TGF-β/Smad通路的活性，减轻肝损伤、肝纤维化和炎症；棉子糖是大豆低聚糖的一种，其具有抑制体内内毒素产生，减轻肝脏负担，保护肝脏的作用；大豆皂苷具有多种生理活性，有证据表明，大豆皂苷具有护肝、防治心血管疾病、抗癌，调节免疫、抗病毒等功效；大豆卵磷脂中的胆碱对脂肪有亲和力，如果体内胆碱不足，会影响脂肪代谢，造成脂肪在肝脏处富集，造成脂肪肝，卵磷脂能够预防脂肪肝，同时还能促进肝细胞再生，防治肝硬化，促进肝功能恢复；蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等消化酶能够促进机体消化，提高脂肪等物质的降解速度，减轻肝脏负担；姜黄素在大量的研究中均表现出优良的护肝效果，姜黄素能够抑制肝炎不利因素，修复损伤的肝细胞，辅助肝脏解毒，促进脂肪代谢，而且对于酒精肝等化学性肝损伤具有保护功能；GABA在酒精降解过程中可以通过调节神经系统，消除脑水肿，缓解头痛，同时保证过氧脱氢酶和过氧脱醛酶的正常分泌，快速降解酒精，同时GABA能够活化肝功能，降低肝损伤。这说明经益生菌发酵后，本产品的解酒护肝作用得到了强化，保健效果更好。
6、冻干
按上述最优参数发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内冻干20h，制得解酒养肝的益生菌发酵功能食品。实施例2益生菌发酵食品动物解酒护肝实验
对按实施例1-5生产的益生菌发酵产品放入真空冷冻干燥机内冻干20h后作为样品进行动物实验，并与对照组灌服生理盐水进行对比。实验方法如下：
实验动物：离乳1个月的wistar大白鼠80只，雌雄各半，体重为150-180g。
实验方法：将80只大鼠随机分成4组，每组20只，每日灌服56°白酒2mL，将10g样品用100mL蒸馏水稀释，实验组1同时灌服本稀释液5mL；将10g样品用50mL蒸馏水稀释，实验组2同时灌服本稀释液5mL；将10g样品用10mL蒸馏水稀释，实验组3同时灌服本稀释液5mL；对照组同时灌服5mL生理盐水，每日一次，灌服六周后，禁食12h，断头取血，静置2h后，离心，分离血清，-80℃储存备用。血清天门冬氨酸氨基转移酶、丙氨酸氨基转移酶检测按试剂盒的说明书操作进行。具体结果见表6：
表6各组小鼠血清AST、ALT比较(X±S)
组别 AST(U/L) ALT(U/L)
实验组1 73.52±6.14 52.42±1.27
实验组2 71.67±7.22 50.67±1.58
实验组3 69.98±6.35 49.47±1.63
对照组 81.32±6.15 58.25±2.43
经动物小鼠实验，本发明所提供的益生菌发酵食品不论在低剂量、中剂量还是高剂量下，都能够明显的降低小鼠的血AST、ALT水平，具有明显的解酒、保护肝细胞，减轻酒精对肝细胞损伤的作用。
实施例3益生菌发酵产品预防醉酒和解酒的动物实验
对按实施例1-5生产的益生菌发酵产品放入真空冷冻干燥机内冻干20h后作为样品进行动物实验，并与对照组灌服生理盐水进行对比。实验方法如下：
实验动物：离乳1个月的wistar大白鼠40只，雌雄各半，体重为150-180g。
实验方法：将40只大鼠随机分成4组，每组10只，每组灌服56°白酒2mL。将10g样品用100mL蒸馏水稀释，实验组1同时灌服本稀释液5mL；将10g样品用50mL蒸馏水稀释，实验组2同时灌服本稀释液5mL；将10g样品用10mL蒸馏水稀释，实验组3同时灌服本稀释液5mL；对照组同时灌服5mL生理盐水；记录小鼠醉酒潜伏期、持续期，小鼠6h内醉酒率，结果见表7。
表7各组小鼠醉酒情况比较(X±S)
组别 动物数(只) 醉酒潜伏期(min) 醉酒持续期(min) 醉酒率(％)
对照组 10 20.21±1.46 341.21±18.75 100％
实验组1 10 84.21±5.43 129.32±15.12 85％
实验组2 10 106.32±7.84 99.21±14.32 60％
实验组3 10 150.35±6.31 84.61±10.23 40％
从表7数据可以看出不同服用剂量的实验组中的醉酒潜伏期和醉酒持续期均与对照组有显著性差异，说明本发明所涉及的益生菌发酵食品可延长醉酒潜伏期，并缩短醉酒持续期，有良好的解酒效果。
实施例4本解酒护肝产品临床应用情况
选取醉酒者60例，年龄25-35岁，将60人随机分为3组，分别在过量饮酒后服用本发明实施例1-5生产的益生菌发酵产品放入真空冷冻干燥机内冻干20h后获得的产品5g、10g、20g，治疗效果见表8。
疗效标准：
显效：酒醉患者服用该产品后，能显著改善头晕、口干、话多、恶心呕吐和意识模糊等症状，使用安全无任何毒副功效。
有效：酒醉患者服用该产品后，能改善头晕、口干、话多、恶心呕吐和意识模糊等症状，使用安全无任何毒副功效。
无效：酒醉患者服用该产品后，未能改善头晕、口干、话多、恶心呕吐和意识模糊等症状，使用安全无任何毒副功效。
表8本解酒护肝产品对醉酒患者治疗情况
服用剂量 显效 有效 无效 有效率
5g 18 2 0 100％
10g 19 1 0 100％
20g 20 0 0 100％
这说明本产品能够有效的解酒，显著改善醉酒后的头晕、口干、话多、恶心呕吐和意识模糊等症状，使用安全无任何毒副功效。
以上具体实施方式仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围，对以上实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，在阅读了本发明之后，本领域技术人员对本发明的各种等价形式的修改均落于本申请所附权利要求所限定的范围。

Claims (6)

1.一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，是将大豆、姜黄、枳椇子制粉后按比例混合，采用凝结芽孢杆菌、乳酸片球菌、动物双歧杆菌、植物乳杆菌、副干酪乳杆菌、枯草芽孢杆菌进行固态发酵而得。
2.如权利要求1所述的一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，固态发酵方法如下：
①将活化完成的凝结芽孢杆菌与乳酸片球菌接入发酵培养基中，使每克发酵基质中凝结芽孢杆菌的接种量为106-107CFU/g，乳酸片球菌的接种量为106-107CFU/g，维持温度37℃，通气量0.1-0.2m3/min，发酵18-24h；
②待第①步发酵完成后，将活化好的动物双歧杆菌与植物乳杆菌接入，使每克发酵基质中动物双岐杆菌的接种量为106-107CFU/g，植物乳杆菌的接种量为105-106CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵24-36h；
③待第②步发酵完成后，将活化好的副干酪乳杆菌接入，使每克发酵基质中副干酪乳杆菌的接种量为107-108CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵12-24h；
④待第③步发酵完成后，将活化好的枯草芽孢杆菌通过接种管路接入，使每克发酵基质中枯草芽孢杆菌的接种量为107-108CFU/g，维持温度37℃，通气量0.3-0.5m3/min，发酵12-24h。
3.如权利要求2所述的一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，发酵培养基是取大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉，按质量比60-80:10-25:5-25混合得混合料，将混合料与水按混合料∶水＝1∶1.5—1∶2.1混匀，121℃，25min灭菌所得。
4.如权利要求2所述的一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内冻干16-24h，制得解酒养肝的益生菌发酵功能食品。
5.如权利要求1或2所述的一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，
所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)IOB602，保藏编号为CGMCCNo.16021；
所述动物双歧杆菌为动物双歧杆菌(Bifidobacterium animalis)IOB402，保藏编号为CGMCC No.16028；
所述副干酪乳杆菌为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)IOB413，保藏编号为CGMCC No.16022；
所述凝结芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)IOB502，保藏编号为：CGMCCNo.16025；
所述枯草芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)IOB430，保藏编号为CGMCCNo.16024；
所述乳酸片球菌为乳酸片球菌(Pediococcus acidilactici)IOB701，保藏编号为CGMCC No.16077。
6.如权利要求1或2所述的一种解酒养肝益生菌发酵功能食品，其特征在于，
具体制备方法如下：
(1)配置发酵培养基：取大豆粉、姜黄粉、枳椇子粉，按质量比60:25:15混合得混合料，将混合料与水按混合料∶水＝1∶1.9混匀，121℃，25min灭菌；
(2)益生菌发酵：
①将活化完成的凝结芽孢杆菌与乳酸片球菌接入固态发酵罐中，使每克发酵基质中凝结芽孢杆菌的接种量为5×107CFU/g，乳酸片球菌的接种量为5×107CFU/g，维持温度37℃，通气量0.1-0.2m3/min，发酵24h；
②待第①步发酵完成后，将活化好的动物双歧杆菌与植物乳杆菌接入，使每克发酵基质中动物双岐杆菌的接种量为5×107CFU/g，植物乳杆菌的接种量为5×106CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵30h；
③待第②步发酵完成后，将活化好的副干酪乳杆菌接入，使每克发酵基质中副干酪乳杆菌的接种量为5×108CFU/g，维持温度37℃，密闭发酵20h；
④待第③步发酵完成后，将活化好的枯草芽孢杆菌通过接种管路接入，使每克发酵基质中枯草芽孢杆菌的接种量为5×108CFU/g，维持温度37℃，通气量0.3-0.5m3/min，发酵14h；
(3)发酵结束后，放入真空冷冻干燥机内冻干20h，制得解酒养肝的益生菌发酵功能食品。
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