CN115120683B - 原料组合物和中药发酵产品及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及中药领域,公开了一种原料组合物和中药发酵产品及其制备方法和应用。该原料组合物含有中药、发酵剂和酶制剂;其中,所述发酵剂选自乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌中的至少一种;所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和α‑淀粉酶中的至少一种;其中,相对于100重量份的中药,所述发酵剂的含量是0.003‑5重量份,所述酶制剂的含量是0.005‑50重量份,其中,发酵剂的含量以细胞干重计。采用上述原料组合物进行中药产品的制备,能够提高有效物质的溶出度,增加药材的有效利用率,提高中药药效并且降低中药毒副作用。
Description
技术领域
本发明涉及中药领域,具体涉及一种原料组合物和中药发酵产品及其制备方法和应用。
背景技术
中药技术是我国传统的医疗技术,历史悠久,注重整体性和系统性,在医疗保健体系中发挥着不可替代的作用。但是,中药领域也存在着较为明显的问题。例如,中药加工工艺中,往往是简单混合,加工程度低,中药有效物质未得到有效提取、释放,利用率低;部分中药,如人参中含有对人体神经系统有毒副作用的田七素,桃仁、苦杏仁、郁李仁中含有较高含量的苦杏仁苷,除了口感较苦外,苦杏仁苷在自身苦杏仁酶的作用下也会产生毒性更强的氢氰酸,使得中药在人体中发挥正面作用的同时,还会带来较为明显的副作用。
因此,需要开发能够提高有效物质的溶出度,增加药材的有效利用率,提高中药药效并且降低中药毒副作用的中药加工技术。
发明内容
本发明的目的是为了克服现有技术存在的上述问题,提供一种原料组合物和中药发酵产品及其制备方法和应用,采用原料组合物进行中药产品的制备,能够提高有效物质的溶出度,增加药材的有效利用率,提高中药药效并且降低中药毒副作用。
为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种原料组合物,该原料组合物含有中药、发酵剂和酶制剂;
其中,所述发酵剂选自乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌中的至少一种;
所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶中的至少一种;
其中,相对于100重量份的中药,所述发酵剂的含量是0.003-5重量份,所述酶制剂的含量是0.005-50重量份,其中,发酵剂的含量以细胞干重计。。
本发明第二方面提供如上所述的发酵剂和酶制剂在提高中药药效或降低中药毒性中的应用。
本发明第三方面提供一种采用如上所述的原料组合物制备中药发酵产品的方法,该方法包括:
(1)将中药进行粉碎,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液;
(2)将所述混合液与酶制剂接触,以进行酶解,得到酶解液;
(3)将所述酶解液进行活性成分的提取,得到提取清液;
(4)向所述提取清液中加入发酵剂进行发酵,得到发酵液;
可选的,该方法还包括往所述发酵液中加入加工辅料,并干燥得到中药发酵粉。
本发明第四方面提供如上所述的方法制备得到的中药发酵产品。
本发明第五方面提供如本发明第一方面所述的原料组合物或第四方面提供的中药发酵产品在中药中的应用。
通过上述技术方案,本发明可以取得如下的有益效果:
1、采用本发明提供的原料组合物进行中药产品的制备,能够提高有效物质的溶出度,增加药材的有效利用率。特别是采用本发明提供的具有特定含量的中药,各原料之间能够相互配合,协同增效。
2、本发明采用酶解技术和发酵技术,能够提高有效物质的溶出度,提高药材利用率。同时,还能够将部分生物活性较低的物质,转化为生物活性更强的物质,如将大分子的毛蕊异黄酮葡萄糖苷转化为生物活性更强的小分子苷元毛蕊异黄酮,能够极大提高中药材有效物质的活性,更有利于人体肠道吸收利用。
3、本发明提供的制备中药发酵产品,能够将对人体有毒副作用的物质,如田七素进行分解转化,从而使得产品更加安全,减少不良反应。
4、本发明提供的中药发酵产品,为天然植物性成分,作用温和,安全健康,并且本发明的制备方法工艺简单,周期较短,适合工业化生产。
具体实施方式
在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
第一方面,本发明提供了一种原料组合物,该原料组合物含有中药、发酵剂和酶制剂;
其中,所述发酵剂选自乳酸菌、酵母菌和芽孢杆菌中的至少一种;
所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和α-淀粉酶中的至少一种;
其中,相对于100重量份的中药,所述发酵剂的含量是0.003-5重量份,所述酶制剂的含量是0.005-50重量份,其中,发酵剂的含量以细胞干重计。
其中,原料组合物中的中药可以独立储藏,也可以混合在一起以方便包的形式储存。发酵剂和酶制剂分别独立储存。
根据本发明,所述原料组合物还可以包含pH调节剂。调节剂的用量不受特别的限制,可以根据产品制备过程中需要的pH值而定。
优选的,所述pH调节剂选自柠檬酸、维生素C、乳酸、苹果酸、乙酸、柠檬酸钠、葡萄酸、碳酸钠、碳酸氢钠、碳酸钾、碳酸氢钾、三聚磷酸钠和氢氧化钠中的至少一种。
传统的中药加工工艺,往往是将中药粉进行简单的混合和加热,加工程度低,使得使用时,中药的药效发挥慢,作用不太理想;此外,中药中含有的部分对人体有毒副作用的物质,保留了下来,使得中药在发挥正面作用的同时,还带来了较为明显的副作用。本发明的发明人在研究中发现,如果采用如上所述的原料组合物,可以采用酶制剂和发酵剂对中药进行酶解和发酵,从而能够将中药中的有效成分更好的提取和释放出来,提高中药利用率,并且将对人体有毒副作用的物质进行转化,不仅提高了中药的药效,还降低了中药的毒副作用。
根据本发明,为了进一步提高中药的药效和降低中药的毒副作用,优选的,所述发酵剂含有乳酸菌、任选的酵母菌和任选的芽孢杆菌,以细胞干重计,相对于每重量份的乳酸菌,所述酵母菌的含量是0-30重量份,所述芽孢杆菌的含量是0-60重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂含有纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和任选的α-淀粉酶,相对于每重量份的纤维素酶,所述果胶酶的含量是0.0125-50重量份,所述酸性蛋白酶的含量是0.0125-80重量份,所述α-淀粉酶的含量是0-80重量份。采用如上所述的酶制剂,能够进一步将中药中的有效物质溶出和将有毒成分进行分解转化,从而进一步提高中药的药效和降低中药的毒副作用。
根据本发明,为了进一步将有效物质溶出和将有毒成分分解转化,优选的,所述乳酸菌选自植物乳杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、发酵乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌、青春双歧杆菌、瑞士乳杆菌、乳双歧杆菌、副干酪乳杆菌、两歧双歧杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种、罗伊氏乳杆菌和短双歧杆菌中的至少一种。
为了进一步将有效物质溶出和将有毒成分分解转化,优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母中的至少一种。
为了进一步将有效物质溶出和将有毒成分分解转化,优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌中的至少一种。
优选实施方式1
根据本发明一种优选的实施方式,所述中药包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于润肠通便的五仁丸(桃仁、杏仁、松子仁、柏子仁、郁李仁和陈皮)能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,润肠通便作用更好。
根据本发明,尽管选用本发明的如上各原料,各原料之间即可相互配合协同增效。但为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的火麻仁,松子仁的含量是40-140重量份,桃仁的含量是20-100重量份,杏仁的含量是20-100重量份,陈皮的含量是15-90重量份,郁李仁的含量是5-60重量份,发酵剂的含量是0.05-2.7重量份,酶制剂的含量是1-20重量份。
更优选的,相对于100重量份的火麻仁,松子仁的含量是60-90重量份,桃仁的含量是55-100重量份,杏仁的含量是26-65重量份,陈皮的含量是20-40重量份,郁李仁的含量是10-50重量份,发酵剂的含量是0.05-1.1重量粉,酶制剂的含量是1-12重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,增加利用率,节省药用资源,更有效地将发酵体系中的苦杏仁苷进行分解转化,降低其含量并使得其分解转化成的氢氰酸在喷雾干燥的过程中挥发殆尽,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
其中,所述纤维素酶的含量可以在较宽的范围内改变,优选的,相对于100重量份的火麻仁,纤维素酶的含量是1-5重量份,优选是1-2.5重量份。其中,所述纤维素酶可以通过商购获得。
其中,所述果胶酶的含量可以在较宽的范围内改变,优选的,相对于100重量份的火麻仁,果胶酶的含量是1.5-5重量份,优选是1.5-3重量份。其中,所述果胶酶可以通过商购获得。
其中,所述酸性蛋白酶的含量可以在较宽的范围内改变,优选的,相对于100重量份的火麻仁,酸性蛋白酶的含量是3-10重量份,优选是3-6.5重量份。其中,所述酸性蛋白酶可以通过商购获得。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的火麻仁,所述酶制剂的含量是1-12重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,并对原有药材中的苦杏仁苷进行转化,降低其含量,减小毒性,优选的,所述发酵剂选自乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌。
其中,所述乳杆菌的含量可以在较宽的范围内改变,只要能够保障在接种后能够繁殖并起始发酵即可,优选的,相对于100重量份的火麻仁,所述乳杆菌的含量是0.05-1重量份,优选是0.2-0.34重量份。
其中,所述乳杆菌可以在常规的乳杆菌中进行选择,然而为了进一步提高本发明预制备的产品的性能,优选的,所述乳杆菌选自植物乳杆菌,干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述植物乳杆菌为CGMCC 1.9087,和/或所述干酪乳杆菌为CGMCC 1.3206,和/或所述嗜酸乳杆菌为CGMCC 1.3342。
其中,所述酵母菌的含量可以在较宽的范围内改变,只要能够保障在接种后能够繁殖并起始发酵即可,优选的,相对于100重量份的火麻仁,所述酵母菌的含量是0.05-1重量份,优选是0.07-0.23重量份。
其中,所述酵母菌可以在常规的酵母菌中进行选择,然而为了进一步提高本发明预制备的产品的性能,优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CGMCC 2.507,和/或所述酿酒酵母为CGMCC 2.1542。
其中,所述芽孢杆菌的含量可以在较宽的范围内改变,只要能够保障在接种后能够繁殖并起始发酵即可,优选的,相对于100重量份的火麻仁,所述芽孢杆菌的含量是0.05-0.7重量份,优选是0.05-0.47重量份。
其中,所述芽孢杆菌可以在常规的芽孢杆菌中进行选择,然而为了进一步提高本发明预制备的产品的性能,优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CGMCC 1.2407,和/或所述枯草芽孢杆菌为CGMCC 1.7764。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳杆菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份的火麻仁,所述发酵剂的含量为0.05-1.1重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、酿酒酵母和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.1:0.18-0.22:0.28-0.32:0.18-0.22:0.18-0.22。
优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.2:0.28-0.32:0.08-0.12:0.18-0.22:0.08-0.12.。
优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.4:0.28-0.32:0.18-0.22:0.28-0.32:0.28-0.32。
优选实施方式2
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括人参、黄精、枸杞子、当归、陈皮、西红花、茯苓和甘草。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于补血益气的八珍汤(川芎、当归、白芍、熟地黄、人参、茯苓、白术、甘草),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,补血益气作用更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的人参,黄精的含量是40-200重量份,枸杞子的含量是30-175重量份,当归的含量是20-150重量份,茯苓的含量是20-125重量份,西红花的含量是10-100重量份,陈皮的含量是10-100重量份,甘草的含量是5-75重量份,发酵剂的含量是0.05-6重量份,酶制剂的含量是1-44重量份。
更优选的,相对于100重量份的人参,黄精的含量是75-100重量份,枸杞子的含量是50-83.5重量份,当归的含量是50-83.5重量份,茯苓的含量是33-37.5重量份,西红花的含量是25-67重量份,陈皮的含量是37.5-50重量份,甘草的含量是12.5-25重量份,发酵剂的含量是0.15-2重量粉,酶制剂的含量是3.75-25重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高人参皂苷在肠道内的生物利用度,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
优选的,相对于100重量份的人参,纤维素酶的含量是1-12.5重量份,优选是3.75-5重量份。优选的,相对于100重量份的人参,果胶酶的含量是1-12.5重量份,优选是3.75-5重量份。优选的,相对于100重量份的人参,酸性蛋白酶的含量是2.5-19重量份,优选是3.75-12.5重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的人参,所述酶制剂的含量为11-22.5重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高人参皂苷在肠道内的生物利用度,优选的,所述发酵剂选自芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。
优选的,相对于100重量份的人参,所述芽孢杆菌的含量是0.05-1.2重量份;优选是0.15-0.6重量份。优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CICC 24625,和/或所述枯草芽孢杆菌为CICC 10167。
优选的,相对于100重量份的人参,所述乳酸菌的含量是0.05-3.2重量份,优选是0.6-0.85重量份。优选的,所述乳酸菌选自嗜热链球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌和发酵乳杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述嗜热链球菌为CICC20370,和/或所述植物乳杆菌为CICC 20330,和/或所述保加利亚乳杆菌为CICC 20254,和/或长双歧杆菌为CICC 6203,和/或发酵乳杆菌为CICC 22537。
优选的,相对于100重量份的人参,所述酵母菌的含量是0.05-1.4重量份,优选是0.25-0.42重量份。优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CICC 32015,和/或所述酿酒酵母为CICC1059。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份的人参,所述发酵剂的含量为1.0-1.9重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.5:0.18-0.22:0.48-0.52:0.38-0.42:0.48-0.52。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、发酵乳杆菌、马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、发酵乳杆菌、马克思克鲁维酵母和酿酒酵母的重量用量比为0.3:0.18-0.22:0.28-0.32:0.28-0.32:0.48-0.52:0.18-0.22:0.18-0.22。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.4:0.38-0.42:0.48-0.52:0.48-0.52:0.58-0.62。
优选实施方式3
根据本发明一种优选的实施方式,所述中药包括黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁和茯苓。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于补肾助阳的肾气丸(干地黄、山药、山茱萸、泽泻、茯苓、牡丹皮、肉桂、附子),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,补肾助阳作用更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的黄精,覆盆子的含量是40-135重量份,丁香的含量是20-100重量份,肉桂的含量是10-70重量份,决明子的含量是10-70重量份,山药的含量是5-50重量份,薏苡仁的含量是5-50重量份,茯苓的含量是5-50重量份,发酵剂的含量是0.05-3.5重量份,酶制剂的含量是1-20重量份。
更优选的,相对于100重量份的黄精,覆盆子的含量是65-71.5重量份,丁香的含量是32-36重量份,肉桂的含量是28-65重量份,决明子的含量是32.5-43重量份,山药的含量是7-17重量份,薏苡仁的含量是8-25重量份,茯苓的含量是8-17重量份,发酵剂的含量是0.08-1.7重量粉,酶制剂的含量是1.6-18.5重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高结合性蒽醌生物转化为游离性蒽醌,以及肉桂醛转化为肉桂酸的效率,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
优选的,相对于100重量份的黄精,纤维素酶的含量是1.0-5.0重量份,优选是1.6-5.0重量份。优选的,相对于100重量份的黄精,果胶酶的含量是1.0-5.0重量份,优选是1.6-5.0重量份。优选的,相对于100重量份的黄精,酸性蛋白酶的含量是2-10重量份,优选是4.3-8.2重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的黄精,所述酶制剂的含量为10-18重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高结合性蒽醌生物转化为游离性蒽醌,以及肉桂醛转化为肉桂酸的效率,优选的,所述发酵剂选自芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。
优选的,相对于100重量份的黄精,所述芽孢杆菌的含量是0.05-1.0重量份;优选是0.4-0.5重量份。
优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CICC 21736,和/或所述枯草芽孢杆菌为CICC20153。
优选的,相对于100重量份的黄精,所述乳酸菌的含量是0.05-1.6重量份,优选是0.4-0.5重量份。
优选的,所述乳酸菌选自鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和发酵乳杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述鼠李糖乳杆菌为CICC 6151,和/或所述乳酸乳球菌为CICC21028,和/或所述发酵乳杆菌为CICC21840。
优选的,相对于100重量份的黄精,所述酵母菌的含量是0.05-0.75重量份,优选是0.08-0.65重量份。
优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CICC 32015,和/或所述酿酒酵母为CICC 1209。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份的黄精,所述发酵剂的含量为0.9-1.65重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、乳酸乳球菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.3:0.18-0.22:0.18-0.22:0.28-0.32:0.08-0.12。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.6:0.58-0.62:0.58-0.62。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、乳酸乳球菌、发酵乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、乳酸乳球菌、发酵乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.6:0.18-0.22:0.28-0.32:0.28-0.32:0.58-0.62。
优选实施方式4
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括陈皮、炒黄芥子、生姜、茯苓、甘草和乌梅。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于改善痰湿肥胖的二陈汤(半夏、陈皮、茯苓、甘草、乌梅、生姜),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,改善痰湿肥胖作用更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的陈皮,炒黄芥子的含量是60-200重量份,生姜的含量是50-150重量份,茯苓的含量是40-150重量份,甘草的含量是20-100重量份,乌梅的含量是5-70重量份,发酵剂的含量是0.1-5重量份,酶制剂的含量是0.5-40重量份。
更优选的,相对于100重量份的陈皮,炒黄芥子的含量是60-90重量份,生姜的含量是60-80重量份,茯苓的含量是40-55重量份,甘草的含量是30-40重量份,乌梅的含量是10-20重量份,发酵剂的含量是0.1-1.48重量份,酶制剂的含量是1-25重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,将体系中橙皮苷转化为生物活性更高的橙皮素,进一步提升了二陈汤的药效,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
优选的,相对于100重量份的陈皮,所述纤维素酶的含量是0.5-10重量份,优选是1-7重量份。优选的,相对于100重量份陈皮,所述果胶酶的含量是0.5-10重量份,优选是1-7重量份。优选的,相对于100重量份陈皮,所述酸性蛋白酶的含量是1-17重量份,优选是3-11重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的陈皮,所述酶制剂的含量为1-25重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,将体系中橙皮苷转化为生物活性更高的橙皮素,进一步提升了二陈汤的药效,优选的,所述发酵剂选自芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。
优选的,相对于100重量份的陈皮,所述芽孢杆菌的含量是0.1-1重量份;优选是0.15-0.54重量份。优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CICC 23843,和/或所述枯草芽孢杆菌为CICC 10071。
优选的,相对于100重量份的陈皮,所述乳酸菌的含量是0.15-1.7重量份;优选是0.3-0.6重量份。优选的,所述乳酸菌选自植物乳杆菌、青春双歧杆菌和瑞士乳杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述植物乳杆菌为CICC 20261,和/或所述青春双歧杆菌为CICC 6180,和/或所述瑞士乳杆菌为CICC20357。
优选的,相对于100重量份的陈皮,所述酵母菌的含量是0.1-0.75重量份;优选是0.1-0.34重量份。优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CICC 32015,和/或所述酿酒酵母为CICC1001。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份陈皮,所述发酵剂的含量是0.1-1.48重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.44:0.48-0.52:0.38-0.42:0.28-0.32。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌,瑞士乳杆菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌,瑞士乳杆菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.3:0.38-0.42:0.18-0.22:0.58-0.62:0.18-0.22。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌,凝结芽孢杆菌,青春双歧杆菌,植物乳杆菌和酿酒酵母的用量比为0.5:0.28-0.32:0.18-0.22:0.28-0.32:0.48-0.52。
优选实施方式5
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括当归、阿胶、枸杞子、桃仁、红花和姜黄。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于活血调经和美容养颜的桃红四物汤(川芎、当归、白芍、熟地、桃仁和红花),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,活血调经和美容养颜效果更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的当归,阿胶的含量是40-135重量份,枸杞子的含量是30-100重量份,桃仁的含量是20-85重量份,红花的含量是20-70重量份,姜黄的含量是10-50重量份,发酵剂的含量是0.05-3.5重量份,酶制剂的含量是1-32.5重量份。
更优选的,相对于100重量份的当归,阿胶的含量是65-100重量份,枸杞子的含量是65-85重量份,桃仁的含量是33-67重量份,红花的含量是33-50重量份,姜黄的含量是10-35重量份,发酵剂的含量是0.2-1.8重量粉,酶制剂的含量是2-22重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,降低苦杏仁苷含量,提高红花苷的生物利用度,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
优选的,相对于100重量份的当归,纤维素酶的含量是1-10重量份,优选是2-4.5重量份。优选的,相对于100重量份的当归,果胶酶的含量是1-10重量份,优选是3-7重量份。优选的,相对于100重量份的当归,酸性蛋白酶的含量是2.5-12.5重量份,优选是6-10重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的当归,所述酶制剂的含量为10-22重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,降低苦杏仁苷含量,提高红花苷的生物利用度,优选的,所述发酵剂选自芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。
优选的,相对于100重量份的当归,所述芽孢杆菌的含量是0.05-0.85重量份;优选是0.3-0.4重量份。优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CICC 21735,和/或所述枯草芽孢杆菌为CICC 10023。
优选的,相对于100重量份的当归,所述乳酸菌的含量是0.05-1.8重量份,优选是0.6-0.9重量份。优选的,所述乳酸菌选自鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌和乳双歧杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述鼠李糖乳杆菌为CICC20259,和/或所述植物乳杆菌为CICC 20242,和/或所述瑞士乳杆菌为CICC 20357,和/或副干酪乳杆菌为CICC 20246,和/或乳双歧杆菌为CICC 21715。
优选的,相对于100重量份的当归,所述酵母菌的含量是0.05-0.85重量份,优选是0.2-0.5重量份。优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CICC 32017,和/或所述酿酒酵母为CICC33296。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份的当归,所述发酵剂的含量为1.1-1.8重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比为0.3:0.38-0.42:0.38-0.42:0.28-0.32:0.48-0.52:0.38-0.42。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。更优选的,凝结芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌、马克思克鲁维酵母和酿酒酵母的重量用量比为0.4:0.28-0.32:0.38-0.42:0.48-0.52:0.28-0.32:0.18-0.22:0.18-0.22:0.48-0.52:0.38-0.42。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、瑞士乳杆菌、副干酪乳杆菌、乳双歧杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.2:0.18-0.22:0.38-0.42;0.28-0.32:0.28-0.32:0.47-0.54。
优选实施方式6
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括黄芪、人参、茱萸、茯苓、生姜和甘草。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于益气健脾和消胖减肥的轻身散(川芎、当归、白芍、熟地、桃仁和红花),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,益气健脾和消胖减肥的效果更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的黄芪,人参的含量是20-100重量份,茱萸的含量是6-80重量份,茯苓的含量是6-80重量份,生姜的含量是3-45重量份,甘草的含量是3-45重量份,发酵剂的含量是0.06-2.5重量粉,酶制剂的含量0.5-18重量份。
更优选的,相对于100重量份的黄芪,人参的含量是33-40重量份,茱萸的含量是12-20重量份,茯苓的含量是8-13.5重量份,生姜的含量是16.5-20重量份,甘草的含量是6.5-14重量份,发酵剂的含量是0.1-1.5重量粉,酶制剂的含量是1-12.5重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高黄芪甲苷的含量,大分子的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的分解效果以及降低田七素的含量,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
优选的,相对于100重量份的黄芪,纤维素酶的含量是0.5-5.6重量份,优选是1-3.5重量份。优选的,相对于100重量份的黄芪,果胶酶的含量是0.5-5.6重量份,优选是1-3.5重量份。优选的,相对于100重量份的黄芪,酸性蛋白酶的含量是2-6.7重量份,优选是3-5.5重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。优选的,相对于100重量份的黄芪,所述酶制剂的含量为5-12.5重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,提高黄芪甲苷的含量,大分子的毛蕊异黄酮葡萄糖苷的分解效果以及降低田七素的含量,优选的,所述发酵剂选自芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。
优选的,相对于100重量份的黄芪,所述芽孢杆菌的含量是0.06-0.7重量份;优选是0.2-0.37重量份。优选的,所述芽孢杆菌选自凝结芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述凝结芽孢杆菌为CICC 23843,和/或所述枯草芽孢杆菌为CICC 10071。
优选的,相对于100重量份的黄芪,所述乳酸菌的含量是0.1-1.1重量份,优选是0.3-0.6重量份。优选的,所述乳酸菌选自植物乳杆菌、两歧双歧杆菌和肠膜明串珠菌。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述植物乳杆菌为CICC 20718,和/或所述两歧双歧杆菌为CICC 6166,和/或所述肠膜明串珠菌为CICC21859。
优选的,相对于100重量份的黄芪,所述酵母菌的含量是0.06-0.5重量份,优选是0.1-0.36重量份。优选的,所述酵母菌选自马克思克鲁维酵母和酿酒酵母。根据本发明更进一步优选的实施方式,所述马克思克鲁维酵母为CICC 32017,和/或所述酿酒酵母为CICC1048。
优选的,所述发酵剂为芽孢杆菌、乳酸菌和酵母菌。优选的,相对于100重量份的黄芪,所述发酵剂的含量为0.6-1.33重量份。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌和酿酒酵母的重量用量比为0.13:0.11-0.18:0.14-0.19:0.1-0.15:0.08-0.13。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、肠膜明串珠菌和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、肠膜明串珠菌和马克思克鲁维酵母的重量用量比0.2:0.18-0.22:0.18-0.22:0.15-0.2。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、酿酒酵母和马克思克鲁维酵母。更优选的,枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、两歧双歧杆菌、植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、酿酒酵母和马克思克鲁维酵母的重量用量比0.1:0.25-0.3:0.2-0.25:0.15-0.2:0.15-0.2:0.2-0.24:0.1-0.15。
优选实施方式7
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓。采用如上所述的原料组合物时,相对于传统的用于滋阴润肺、益气补脾,从而美容养颜的琼玉膏(人参、生地黄、茯苓、蜂蜜),能够使得药效明显增强,毒副作用明显减小,美容养颜作用更好。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的人参,余甘子的用量为40-160重量份,玉竹的用量为26-134重量份,橄榄果的用量为20-94重量份,鱼腥草的用量为20-94重量份,茯苓的用量为13-67重量份,发酵剂的含量是0.03-3.4重量份,酶制剂的含量是0.6-50重量份。
更优选的,相对于100重量份的人参,余甘子的用量为71-91重量份,玉竹的用量为64-82重量份,橄榄果的用量为46-60重量份,鱼腥草的用量为38-46重量份,茯苓的用量为23-37重量份,发酵剂的含量是0.2-1.2重量份,酶制剂的含量是2.8-24重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶中的至少一种。
根据本发明,优选的,相对于100重量份的人参,所述纤维素酶的用量为0.6-15重量份,更优选为3.5-5.7重量份。优选的,相对于100重量份的人参,所述果胶酶的用量为0.6-15重量份,更优选为2.8-7.3重量份。优选的,相对于100重量份的人参,所述酸性蛋白酶的用量为2-20重量份,更优选为5.7-11重量份。更优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
根据本发明,为了更有效的将有效物质溶出,将天然人参皂苷转化为吸收率高的稀有皂苷,并进一步降低田七素的含量,所述发酵剂选自芽孢杆菌和乳酸菌。
优选的,相对于100重量份的人参,所述芽孢杆菌的用量为0.03-1.4重量份,更优选为0.2-0.5重量份。优选的,所述芽孢杆菌选自解淀粉芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的人参,所述乳酸菌的用量为0.03-2重量份,更优选为0.4-0.7重量份。优选的,所述乳酸菌选自植物乳杆菌、嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种和短双歧杆菌中的至少一种。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌和乳酸乳球菌乳脂亚种。更优选的,枯草芽孢杆菌、解淀粉芽孢杆菌、嗜热链球菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌和乳酸乳球菌乳脂亚种的重量用量比为0.28:0.2-0.25:0.1-0.15:0.15-0.2:0.1-0.15:0.1-0.15。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、嗜热链球菌和植物乳杆菌。更优选的,枯草芽孢杆菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种、嗜热链球菌和植物乳杆菌的重量用量比为0.3:0.01-0.06:0.15-0.2:0.08-0.13:0.15-0.2:0.18-0.22。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为解淀粉芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种。优选的,相对于100重量份的人参,发酵剂的含量是0.2-1.2重量份。更优选的,解淀粉芽孢杆菌、干酪乳杆菌、嗜热链球菌和乳酸乳球菌乳脂亚种的重量用量比为0.2:0.08-0.12:0.2-0.25:0.05-0.07。
优选实施方式8
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括黄芪、人参、肉桂和甘草。采用如上所述的原料组合物时,各物质之间能够协同增效,能够明显补气、益脾、益肺、温补肾阳、兴奋中枢、纠正贫血、增强免疫功能、促进血液循环,强心,保肝,解痉,并具有较强的药效,毒副作用明显减小。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的黄芪,人参的含量是26-260重量份,肉桂的含量是20-200重量份,甘草的含量是16-160重量份,发酵剂的含量是0.03-7重量份,酶制剂的含量是0.3-70重量份。
更优选的,相对于100重量份的黄芪,人参的含量是80-90重量份,肉桂的含量是45-70重量份,甘草的含量是35-55重量份,发酵剂的含量是0.5-0.7重量份,酶制剂的含量是12-18重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,增加利用率,更有效地将发酵体系中的有毒副作用的肉桂醛分解转化为性质稳定且易代谢的肉桂酸,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的黄芪,纤维素酶的含量是3-6重量份。优选的,相对于100重量份的黄芪,果胶酶的含量是3-5重量份。优选的,相对于100重量份的黄芪,酸性蛋白酶的含量是4-7.5重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,并对原有药材中的肉桂醛分解转化,降低其含量,减小毒性,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌和芽孢杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的黄芪,所述乳酸菌的含量是0.4-0.5重量份。优选的,所述乳酸菌选自鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸片球菌、青春双歧杆菌和副干酪乳杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的黄芪,所述芽孢杆菌的含量是0.1-0.2重量份。优选的,所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为乳酸菌和芽孢杆菌。
优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌。更优选的,枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌的重量用量比为0.4:0.28-0.32:0.28-0.32:0.38-0.42:0.18-0.22。或者,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌。更优选的,枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、副干酪乳杆菌和鼠李糖乳杆菌的重量用量比为0.5:0.38-0.42:0.38-0.42:0.28-0.32。或者,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌;更优选的,枯草芽孢杆菌、青春双歧杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌和乳酸片球菌的重量用量比0.5:0.28-0.32:0.18-0.22:0.48-0.52:0.18-0.22。
优选实施方式9
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子和甘草。采用如上所述的原料组合物时,能够行气化滞、健脾消食、健脾和中,从而能够祛湿减肥,并具有明显较强的药效,毒副作用明显减小。
根据本发明,为了进一步提高各组分的协同配合效果,优选的,相对于100重量份的薏苡仁,人参的含量是37.5-150重量份,茯苓的含量是37.5-150重量份,鸡内金的含量是18.75-125重量份,桔梗的含量是18.75-125重量份,山药的含量是18.75-125重量份,白扁豆的含量是6.25-100重量份,砂仁的含量是6.25-100重量份,莲子的含量是6.25-100重量份,甘草的含量是6.25-100重量份,发酵剂的含量是0.0625-10重量份,酶制剂的含量是0.625-90重量份。
更优选的,相对于100重量份的薏苡仁,人参的含量是70-100重量份,茯苓的含量是50-70重量份,鸡内金的含量是50-70重量份,桔梗的含量是40-70重量份,山药的含量是30-60重量份,白扁豆的含量是30-60重量份,砂仁的含量是20-40重量份,莲子的含量是20-40重量份,甘草的含量是10-30重量份,发酵剂的含量是1-3重量份,酶制剂的含量是25-50重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,增加利用率,更有效地将发酵体系中的甘草酸转化生物活性高的甘草次酸,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和中温α-淀粉酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的薏苡仁,纤维素酶的含量是5-15重量份。优选的,相对于100重量份的薏苡仁,果胶酶的含量是4-12重量份。优选的,相对于100重量份的薏苡仁,酸性蛋白酶的含量是8-12重量份。优选的,相对于100重量份的薏苡仁,中温α-淀粉酶的含量是4-8重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和中温α-淀粉酶。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,并对原有药材中的甘草酸进行分解转化,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌。优选的,相对于100重量份的薏苡仁,所述乳酸菌的含量是1-3重量份。优选的,所述乳酸菌选自嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和鼠李糖乳杆菌中的至少一种。
优选的,所述发酵剂为嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和乳双歧杆菌;更优选的,嗜热链球菌、植物乳杆菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌和乳双歧杆菌的重量用量比为0.5:0.28-0.32:0.18-0.22:0.75-0.82:0.58-0.62。或者,优选的,所述发酵剂为嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌;更优选的,嗜热链球菌、干酪乳杆菌、保加利亚乳杆菌、乳双歧杆菌和鼠李糖乳杆菌的重量用量比为0.8:0.58-0.62:0.48-0.52:0.58-0.62:0.28-0.32。或者,优选的,所述发酵剂为嗜热链球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和鼠李糖乳杆菌;更优选的,嗜热链球菌、植物乳杆菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、乳双歧杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种和鼠李糖乳杆菌的重量用量比为0.3:0.38-0.42:0.58-0.62:0.48-0.52:0.18-0.22:0.68-0.73:0.28-0.33。
优选实施方式10
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻和黄芥子。采用如上所述的原料组合物时,能够温阳理气、散寒祛风、化痰除湿、活血通络和抗炎,从而能够有效治疗类风湿性关节炎,并具有明显较强的药效,毒副作用明显较小。
根据本发明,优选的,相对于100重量份的西红花,白芷的含量是42-234重量份,当归的含量是35-200重量份,桔梗的含量是35-200重量份,陈皮的含量是28-167重量份,干姜的含量是28-167重量份,佛手的含量是28-167重量份,枸杞子的含量是28-167重量份,香薷的含量是21-150重量份,肉桂的含量是21-150重量份,砂仁的含量是21-150重量份,茯苓的含量是7-100重量份,甘草的含量是7-100重量份,豆蔻的含量是7-100重量份,黄芥子的含量是7-100重量份,发酵剂的含量是0.07-8.5重量份,酶制剂的含量是1.4-117重量份。
更优选的,相对于100重量份的西红花,白芷的含量是80-100重量份,当归的含量是70-90重量份,桔梗的含量是70-90重量份,陈皮的含量是50-70重量份,干姜的含量是50-70重量份,佛手的含量是50-60重量份,枸杞子的含量是50-60重量份,香薷的含量是40-60重量份,肉桂的含量是40-60重量份,砂仁的含量是30-50重量份,茯苓的含量是20-40重量份,甘草的含量是20-30重量份,豆蔻的含量是20-40重量份,黄芥子的含量是20-40重量份,发酵剂的含量是1.2-3重量份,酶制剂的含量是20-40重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,增加利用率,更有效地将发酵体系中的有毒副作用的肉桂醛分解转化为生物活性较高的肉桂酸,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的西红花,纤维素酶的含量是6-13重量份。优选的,相对于100重量份的西红花,果胶酶的含量是8-11重量份。优选的,相对于100重量份的西红花,酸性蛋白酶的含量是11-16重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,并将原有药材中的肉桂醛分解转化,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌和芽孢杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的西红花,所述乳酸菌的含量是1-2重量份。优选的,所述乳酸菌选自嗜热链球菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌和保加利亚乳杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的西红花,所述芽孢杆菌的含量是0.2-1重量份。优选的,所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
根据本发明,优选的,所述发酵剂为乳酸菌和芽孢杆菌。
优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌;更优选的,枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和嗜热链球菌的重量用量为0.3:0.58-0.62:0.48-0.52:0.48-0.52:0.78-0.82。或者,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌;更优选的,枯草芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、植物乳杆菌和保加利亚乳杆菌的重量用量比为0.7:0.28-0.32:0.78-0.83:0.48-0.52。或者,优选的,所述发酵剂为枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌,更优选的,枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、嗜酸乳杆菌和植物乳杆菌的重量用量比为0.9:0.78-0.82:0.98-1.02:0.68-0.72。
优选实施方式11
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英和菊花。采用如上所述的原料组合物时,能够利水渗湿、清肝利胆、清热解毒、通经活络、消肿散结,可以抑制尿酸代谢相关酶黄嘌呤氧化酶和腺苷脱氨酶活性,降低尿酸,并具有明显较强的药效,毒副作用明显较小。
根据本发明,优选的,相对于100重量份的菊苣,栀子的含量是40-160重量份,葛根的含量是30-140重量份,桑叶的含量是15-90重量份,百合的含量是15-90重量份,鱼腥草的含量是10-60重量份,淡竹叶的含量是10-60重量份,薏苡仁的含量是5-40重量份,蒲公英的含量是5-40重量份,菊花的含量是5-40重量份,发酵剂的含量是0.05-6重量份,酶制剂的含量是0.5-60重量份。
更优选的,相对于100重量份的菊苣,栀子的含量是70-100重量份,葛根的含量是50-70重量份,桑叶的含量是40-60重量份,百合的含量是30-60重量份,鱼腥草的含量是20-40重量份,淡竹叶的含量是20-30重量份,薏苡仁的含量是10-30重量份,蒲公英的含量是10-20重量份,菊花的含量是10-20重量份,发酵剂的含量是0.5-2重量份,酶制剂的含量是15-34重量份。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,增加利用率,更有效地将发酵体系中的栀子苷转化为生物活性较强的京尼平,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的菊苣,所述纤维素酶的含量是6-14重量份。优选的,相对于100重量份的菊苣,所述果胶酶的含量是5-9重量份。优选的,相对于100重量份的菊苣,所述酸性蛋白酶的含量是6-11重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。
根据本发明,为了更为有效的将有效物质溶出,并将原有药材中的栀子苷进行转化,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌和芽孢杆菌中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的菊苣,所述乳酸菌的含量是0.8-1.5重量份。优选的,所述乳酸菌选自鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的菊苣,所述芽孢杆菌的含量是0-0.4重量份。优选的,所述芽孢杆菌为枯草芽孢杆菌。
优选的,所述发酵剂为鼠李糖乳杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种;更优选的,鼠李糖乳杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种的重量用量比为0.5:0.28-0.32:0.58-0.62:0.48-0.52:0.78-0.82:0.18-0.22。或者,优选的,所述发酵剂为凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种;更优选的,凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种的重量用量比0.6:0.68-0.72:0.78-0.82。或者,优选的,所述发酵剂为植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种;更优选的,植物乳杆菌、嗜酸乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种的重量用量比为0.5:0.58-0.62:0.28-0.32:0.28-0.32。
优选实施方式12
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括桑叶、黄精、葛根、淡竹叶、玉竹、人参、山药、乌梅和甘草。采用如上所述的原料组合物时,能够促进肝糖原合成代谢,促进糖降解,提高肝脏超氧化物歧化酶SOD的酶活力,提高机体的抗氧化性,清除体内多余自由基,降低丙二醛浓度,对受自由基侵害的胰岛β细胞起到一定的保护作用,使胰岛素分泌趋于正常,从而降低血糖浓度,并具有明显较强的药效,毒副作用明显较小。
根据本发明,优选的,相对于100重量份的桑叶,黄精的含量是60-167重量份,葛根的含量是40-150重量份,淡竹叶的含量是40-150重量份,玉竹的含量是30-125重量份,人参的含量是25-100重量份,山药的含量是20-84重量份,乌梅的含量是5-50重量份,甘草的含量是5-50重量份,发酵剂的含量是0.05-4.3重量份,酶制剂的含量是0.5-60重量份。
更优选的,相对于100重量份的桑叶,黄精的含量是70-100重量份,葛根的含量是70-90重量份,淡竹叶的含量是50-70重量份,玉竹的含量是50-70重量份,人参的含量是40-60重量份,山药的含量是30-50重量份,乌梅的含量是20-40重量份,甘草的含量是20-40重量份,发酵剂的含量是1-2重量份,酶制剂的含量是20-30重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和中温α-淀粉酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的桑叶,所述纤维素酶的含量是8-10重量份。优选的,相对于100重量份的桑叶,所述果胶酶的含量是6-10重量份。优选的,相对于100重量份的桑叶,所述酸性蛋白酶的含量是5-9重量份。优选的,相对于100重量份的桑叶,所述中温α-淀粉酶的含量是2-5重量份。
根据本发明,优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶、酸性蛋白酶和中温α-淀粉酶。
根据本发明,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌。优选的,所述乳酸菌选自瑞士乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌、乳双歧杆菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种中的至少一种。优选的,相对于100重量份的桑叶,所述乳酸菌的含量是1-2重量份。
优选的,所述发酵剂为瑞士乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌、乳双歧杆菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种,更优选的,瑞士乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌、乳双歧杆菌和肠膜明串珠菌肠膜亚种的重量用量比为0.6:0.58-0.62:0.28-0.32:0.48-0.52:0.48-0.52。或者,优选的,所述发酵剂为瑞士乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌和乳双歧杆菌;更优选的,瑞士乳杆菌、嗜热链球菌、发酵乳杆菌和乳双歧杆菌的重量用量比为0.3:0.78-0.82:0.58-0.62:0.78-0.82。或者,优选的,所述发酵剂为发酵乳杆菌、乳双歧杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种,更优选的,发酵乳杆菌、乳双歧杆菌、肠膜明串珠菌肠膜亚种的重量用量比为0.8:0.88-0.92:0.88-0.92。
优选实施方式13
根据本发明另一种优选的实施方式,所述中药包括葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁和甘草。采用如上所述的原料组合物时,有效延长醉酒潜伏时间,缩短醉酒恢复时间,降低血液中乙醇及其代谢产物乙醛的含量,提高乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶等解酒酶的活力,促进了乙醇体内代谢。同时,还能够增强SOD酶、GSH-Px等抗氧化酶的活力,降低了体内MDA等超氧化物的含量,降低ALT酶、AST酶活力,有效保护酒精性肝细胞损伤。
根据本发明,优选的,相对于100重量份的葛根,枳椇子的含量是40-134重量份,藤茶的含量是30-117重量份,陈皮的含量是25-100重量份,姜黄的含量是25-100重量份,人参的含量是15-67重量份,茯苓的含量是15-67重量份,决明子的含量是5-50重量份,砂仁的含量是5-50重量份,甘草是5-50重量份,发酵剂的含量是0.05-8.5重量份,酶制剂的含量是0.5-50重量份。
更优选的,相对于100重量份的葛根,枳椇子的含量是70-90重量份,藤茶的含量是60-90重量份,陈皮的含量是40-80重量份,姜黄的含量是40-70重量份,人参的含量是30-50重量份,茯苓的含量是20-45重量份,决明子的含量是20-45重量份,砂仁的含量是20-40重量份,甘草是10-30重量份,发酵剂的含量是1-4重量份,酶制剂的含量是20-30重量份。
优选的,所述酶制剂选自纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶中的至少一种。
优选的,相对于100重量份的葛根,所述纤维素酶的含量是5-12重量份。优选的,相对于100重量份的葛根,所述果胶酶的含量是6-9重量份。优选的,相对于100重量份的葛根,所述酸性蛋白酶的含量8-9重量份。
优选的,所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶。根据本发明,优选的,所述发酵剂选自乳酸菌和芽孢杆菌中的至少一种。
优选的,所述乳酸菌选自罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种中的至少一种。优选的,相对于100重量份的葛根,所述乳酸菌的含量是1-3.5重量份。
优选的,所述芽孢杆菌为凝结芽孢杆菌。优选的,相对于100重量份的葛根,所述凝结芽孢杆菌的含量是0-0.5重量份。
优选的,所述发酵剂为凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种;更优选的,所述凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种的重量用量比为0.8:0.58-0.62:0.58-0.62:0.18-0.22:0.28-0.32:0.18-0.22:0.58-0.62。或者,优选的,所述发酵剂为罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种;更优选的,罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、青春双歧杆菌、短双歧杆菌和乳酸乳球菌乳酸亚种的重量用量比为0.5:0.58-0.62:0.28-0.32:0.78-0.82:0.08-0.12:0.28-0.32:0.58-0.62。或者,优选的,所述发酵剂为罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和短双歧杆菌;更优选的,罗伊氏乳杆菌、植物乳杆菌、瑞士乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、青春双歧杆菌和短双歧杆菌的重量用量比为0.4:0.38-0.42:0.85-0.92:0.98-1.02:0.48-0.52:0.58-0.62:0.78-0.82重量份。
第二方面,本发明提供了第一方面所述的发酵剂和酶制剂在提高中药药效或降低中药毒性中的应用。
第三方面,本发明提供了一种采用第一所述的原料组合物制备中药发酵产品的方法,该方法包括:
(1)将中药进行粉碎,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液;
(2)将所述混合液与酶制剂接触,以进行酶解,得到酶解液;
(3)将所述酶解液进行活性成分的提取,得到提取清液;
(4)向所述提取清液中加入发酵剂进行发酵,得到发酵液;
可选的,该方法还包括往所述发酵液中加入加工辅料,并干燥得到中药发酵粉。
优选的,所述加工辅料选自环糊精、麦芽糊精、脱脂乳粉、乳清蛋白、海藻糖、乳糖、甘露糖、甘油和淀粉。
其中,所述加工辅料的用量不受特别限制,优选的,相对于100重量份的所述发酵液,所述加工辅料的用量为5-50重量份。
根据本发明,优选的,步骤(1)中,所述粉碎后的物料的粒径范围在0.0125-0.38mm。
根据本发明,优选的,步骤(2)中,所述酶解的条件包括:pH为4-6,温度为40-72℃,时间为30-180min。
根据本发明,优选的,步骤(3)中,所述提取的温度为85-105℃,提取的时间为5-180min。
根据本发明,当所述中药包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5.2,温度为50-70℃,时间为60-180min;优选的,所述提取的温度为88-100℃,提取的时间为30-90min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳杆菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为28-42℃,搅拌转速为20-300rpm,通风量为0.5-5v/v/min,发酵12-36h,pH下降至5.0-6.5时结束;所述第二发酵的条件包括:温度为20-37℃,搅拌转速为10-100rpm,发酵12-48h,pH下降至4-5时结束;所述第三发酵的条件包括:温度为18-32℃,搅拌转速为20-400rpm,发酵12-48h,pH下降至3-4时结束。
根据本发明,当所述中药包括人参、黄精、枸杞子、当归、陈皮、西红花、茯苓和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5,温度为45-65℃,时间为60-180min;优选的,所述提取的温度为85-102℃,提取的时间为30-90min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌和可选的芽孢杆菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为32-50℃,搅拌转速为100-500rpm,通风量为1-4v/v/min,发酵62-96h,pH下降至5.5-6时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为25-42℃,搅拌转速为20-200rpm,发酵24-96h,pH下降至4-5.2时结束;
所述第三发酵的条件包括:温度为18-32℃,搅拌转速为60-200rpm,发酵48-96h,pH下降至3.2-4时结束。
根据本发明,当所述中药包括黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁和茯苓时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5.5,温度为50-65℃,时间为60-180min;优选的,所述提取的温度为85-100℃,提取的时间为30-120min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为28-42℃,搅拌转速为20-400rpm,通风量为1-5v/v/min,发酵48-72h,pH下降至5-6时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为20-37℃,搅拌转速为20-120rpm,发酵24-48h,pH下降至4-5时结束;
所述第三发酵的条件包括:温度为18-28℃,搅拌转速为20-300rpm,发酵24-48h,pH下降至3-4时结束。
根据本发明,当所述中药包括陈皮、炒黄芥子、生姜、茯苓、甘草和乌梅时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5.2,温度为45-65℃,时间为60-180min;优选的,所述提取的温度为85-102℃,提取的时间为20-120min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为25-42℃,搅拌转速为60-400rpm,通风量为1-5.5v/v/min,发酵48-96h,pH下降至5-5.5时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为25-35℃,搅拌转速为20-200rpm,发酵24-72h,pH下降至4-5时结束;
所述第三发酵的条件包括:温度为18-30℃,搅拌转速为60-400rpm,发酵48-96h,pH下降至2.8-4时结束。
根据本发明,当所述中药包括当归、阿胶、枸杞子、桃仁、红花和姜黄时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4.5-5.5,温度为50-65℃,时间为60-180min;优选的,所述提取的温度为90-102℃,提取的时间为20-100min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌和可选的芽孢杆菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为32-45℃,搅拌转速为100-400rpm,通风量为2-5v/v/min,发酵72-96h,pH下降至5.5-6.5时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为25-45℃,搅拌转速为60-200rpm,发酵24-72h,pH下降至4.5-5时结束;
所述第三发酵的条件包括:温度为18-37℃,搅拌转速为60-300rpm,发酵60-96h,pH下降至3-4.2时结束。
根据本发明,当所述中药包括黄芪、人参、茱萸、茯苓、生姜和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5,温度为50-72℃,时间为90-180min;优选的,所述提取的温度为85-102℃,提取的时间为20-90min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为25-42℃,搅拌转速为60-400rpm,通风量为1-5v/v/min,发酵60-96h,pH下降至5-6时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为20-37℃,搅拌转速为20-200rpm,发酵24-48h,pH下降至4-5时结束;
所述第三发酵的条件包括:温度为18-28℃,搅拌转速为60-300rpm,发酵48-72h,pH下降至3-4时结束。
根据本发明,当所述中药包括人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4.5-6,温度为50-70℃,时间为30-180min;优选的,所述提取的条件包括:温度为90-102℃,时间为30-120min;优选的,所述发酵的方法包括:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液,进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;
优选的,所述第一发酵液的条件包括:温度为30-45℃,时间为72-168h,搅拌转速为100-650rpm,通风量为3-8v/v/min,pH下降至4.5-5.5时结束;
优选的,所述第二发酵液的条件包括:温度为18-45℃,时间为24-168h,搅拌转速为50-300rpm,pH下降至3-4.5时结束。
根据本发明,当所述中药包括黄芪、人参、肉桂和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5,温度为40-65℃,时间为30-180min;优选的,所述提取的条件包括:温度为90-105℃,时间为30-90min;优选的,所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液。
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为28-50℃,搅拌转速为100-600rpm,通风量为0.5-5.0v/v/min,发酵时间为72-168h,pH下降至4.0-4.5时结束;
所述第二发酵的条件包括:温度为22-42℃,搅拌转速为30-300rpm,通风量为零,发酵时间为为24-96h,pH下降至2.8-4.2时结束。
根据本发明,当所述中药包括薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4.6-6,温度为45-70℃,时间为30-180min;优选的,所述提取的条件包括:温度为90-102℃,时间为30-90min;优选的,发酵的条件包括:温度为20-45℃,搅拌转速为60-500rpm,通风量为零,发酵时间为24-168h,pH下降至3.2~4.2时结束。
根据本发明,当所述中药包括西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻和黄芥子时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4.5-5.5,温度为48-70℃,时间为30-180min;优选的,所述提取的条件包括:温度为88-100℃,时间为30-90min;优选的,所述发酵的方法包括:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液。
优选的,所述第一发酵的条件包括:温度为25-45℃,搅拌转速为100-800rpm,通风量为1-8v/v/min,发酵时间为72-192h,pH下降至4.8-5.4时结束。
优选的,所述第二发酵的条件包括:温度为25-35℃,搅拌转速为60-300rpm,通风量为零,发酵时间为24-120h,pH下降至3.0-4.2时结束。
根据本发明,当所述中药包括菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英和菊花时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4.2-5.2,温度为40-70℃,时间为30-180min;优选的,所述提取的条件包括:温度为90-98℃,时间为5-90min;优选的,发酵的条件包括:温度为18-42℃,搅拌转速为60-600rpm,发酵时间为12-168h,pH下降至2.8-4.2时结束。
根据本发明,当所述中药包括桑叶、黄精、葛根、淡竹叶、玉竹、人参、山药、乌梅和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5.5,温度为48-68℃,时间为30-210min;优选的,所述提取的条件包括:温度为88-98℃,时间为15-60min;优选的,发酵的条件包括:温度为18-50℃,搅拌转速为100-800rpm,发酵时间为18-240h,pH下降至3.0-4.3时结束,
根据本发明,当所述中药包括葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁和甘草时:
优选的,所述酶解的条件包括:pH为4-5.5,温度为45-65℃,时间为30-150min;优选的,所述提取的条件包括:温度为92-102℃,时间为30-120min;优选的,发酵的条件包括:温度为18-42℃,搅拌转速为60-600rpm,发酵时间为18-168h,pH下降至3.2-4.2时结束。
第四方面,本发明提供了如上所述的方法制备得到的中药发酵产品。
第五方面,本发明提供了第一方面所述的原料组合物或第四方面所述的中药发酵产品在中药中的应用。
以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
实施例1-3用于说明采用本发明提供的包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司,货号为2020112053;
果胶酶购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司,货号为2020102312;
酸性蛋白酶购自湖南新鸿鹰生物工程有限公司,货号为2020091822;
凝结芽孢杆菌购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 1.2407,
枯草芽孢杆菌购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 1.7764;
植物乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 1.9087;
干酪乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 1.3206;
嗜酸乳杆菌购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 1.3342;
马克思克鲁维酵母购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 2.507;
酿酒酵母购自中国微生物菌种保藏管理中心,编号为CGMCC 2.1542。
实施例1
(1)将火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、郁李仁、陈皮进行超微粉碎至120目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,火麻仁180重量份,松子仁120重量份,桃仁100重量份,杏仁90重量份,陈皮50重量份,郁李仁20重量份,水3000重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.8,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,酶解温度62℃,酶解180min得到酶解液。其中,纤维素酶3重量份,果胶酶3重量份,酸性蛋白酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度93℃,提取时间40min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.06MPa,得到浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量12.5%,相对密度1.03g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至6.2,进行灭菌处理,88℃灭菌,38min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.1重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度30℃,搅拌转速100rpm,通风量3.0v/v/min,发酵36h,pH下降至5.3,得到第一发酵液;将植物乳杆菌0.2重量份、干酪乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度26℃,搅拌转速15rpm,通风量为零,发酵18h,pH下降至4.4,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.2重量份、马克思克鲁维酵母0.2重量份接种至第二发酵液,温度25℃,搅拌转速400rpm,通风量为零,发酵46h,pH下降至3.6,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入加工辅料海藻糖、麦芽糊精(相对于100重量份的第三发酵液,海藻糖用量为10重量份,麦芽糊精用量为10重量份),进行干燥,进风温度115℃,出风温度75℃,得到润肠通便发酵粉,发酵粉中水分含量为8重量%。
实施例2
(1)将火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、郁李仁、陈皮进行超微粉碎至180目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,火麻仁130重量份,松子仁80重量份,桃仁120重量份,杏仁120重量份,陈皮40重量份,郁李仁60重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.7,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,酶解温度58℃,酶解160min得到酶解液。其中,纤维素酶3重量份,果胶酶3重量份,酸性蛋白酶8重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,提取时间37min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度58℃,相对真空度-0.07MPa,得到浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量13.8%,相对密度1.03g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至6.0,进行灭菌处理,105℃灭菌,35min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.2重量份枯草芽孢杆菌、0.3重量份凝结芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度33℃,搅拌转速90rpm,通风量2.3v/v/min,发酵32h,pH下降至5.2,得到第一发酵液;将干酪乳杆菌0.1重量份、嗜酸乳杆菌0.2重量份接种至第一发酵液,温度28℃,搅拌转速15rpm,通风量为零,发酵20h,pH下降至4.3,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.1重量份接种至第二发酵液,温度26.5℃,搅拌转速270rpm,通风量为零,发酵44h,pH下降至3.8,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入加工辅料海藻糖(相对于100重量份的第三发酵液,海藻糖用量为15重量份),进行干燥,进风温度110℃,出风温度78℃,得到润肠通便发酵粉,发酵粉水分含量为7重量%。
实施例3
(1)将火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、郁李仁、陈皮进行超微粉碎至200目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,火麻仁150重量份,松子仁130重量份,桃仁110重量份,杏仁40重量份,陈皮40重量份,郁李仁50重量份,水3400重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,酶解温度在55℃,酶解120min得到酶解液。其中,纤维素酶2重量份,果胶酶4重量份,酸性蛋白酶8重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,提取时间35min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度65℃,相对真空度-0.08MPa,得到浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量13.6%,相对密度1.04g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.2,进行灭菌处理,90℃灭菌,40min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.4重量份枯草芽孢杆菌、0.3重量份凝结芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度37℃,搅拌转速80rpm,通风量1.5v/v/min,发酵28h,pH下降至5.4,得到第一发酵液;将植物乳杆菌0.2重量份、嗜酸乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度30℃,搅拌转速20rpm,通风量为零,发酵22h,pH下降至4.2,得到第二发酵液;将马克思克鲁维酵母0.3重量份接种至第二发酵液,温度28℃,搅拌转速140rpm,通风量为零,发酵48h,pH下降至3.4,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入加工辅料麦芽糊精(相对于100重量份的第三发酵液,麦芽糊精用量为20重量份),进行干燥,进风温度112℃,出风温度75℃,得到润肠通便发酵粉,发酵粉水分含量为10重量%。
实施例4-6用于说明采用本发明提供的包括人参、黄精、枸杞子、当归、陈皮、西红花、茯苓和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,维素酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司,货号2020032218;
果胶酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司,货号2020062178;
酸性蛋白酶购自南宁东恒华道生物科技有限责任公司,货号2020051709;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 24625;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10167;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20330;
嗜热链球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20370
保加利亚乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20254
长双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6203;
发酵乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 22537;
马克思克鲁维酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 32015;
酿酒酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 1059。
实施例4
(1)将人参、黄精、当归、陈皮、西红花、茯苓、枸杞子、甘草进行超微粉碎至160目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,人参120重量份,黄精105重量份,当归100重量份,枸杞子100重量份,西红花80重量份,陈皮55重量份,茯苓40重量份,甘草20重量份,纯化水3200重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,170min,得到酶解液。其中,纤维素酶5重量份,果胶酶5重量份,酸性蛋白酶15重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度96℃,60min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度60℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量22.3%,相对密度1.10g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至6.8,进行灭菌处理,102℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.5重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度42℃,搅拌转速360rpm,通风量4.0v/v/min,发酵70h,pH下降至5.8,得到第一发酵液;将0.4重量份长双歧杆菌、0.5重量份植物乳杆菌、0.2重量份凝结芽孢杆菌接种至第一发酵液,温度32℃,搅拌转速100rpm,通风量为零,发酵72h,pH下降至4.4,得到第二发酵液;将马克思克鲁维酵母0.5重量份接种至第二发酵液,温度32℃,搅拌转速150rpm,通风量为零,发酵90h,pH下降至3.5,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入8重量%的海藻糖,进行喷雾干燥,进风温度118℃,出风温度78℃,得到中药发酵粉,水分含量为8重量%。
实施例5
(1)将人参、黄精、当归、陈皮、西红花、茯苓、枸杞子、甘草进行超微粉碎至200目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,人参160重量份,黄精120重量份,枸杞子100重量份,当归80重量份,陈皮80重量份,茯苓55重量份,西红花40重量份,甘草20重量份,纯化水3500重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.4,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,56℃,160min,得到酶解液。其中,纤维素酶6重量份,果胶酶6重量份,酸性蛋白酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度65℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量18.6%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,95℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.3重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度38℃,搅拌转速240rpm,通风量3.0v/v/min,发酵72h,pH下降至5.6,得到第一发酵液;将长双歧杆菌0.3重量份,发酵乳杆菌0.5重量份,嗜热链球菌0.2重量份、保加利亚乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度38℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵48h,pH下降至4.6,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.2重量份、马克思克鲁维酵母0.2重量份接种至第二发酵液,温度26℃,搅拌转速100rpm,通风量为零,发酵60h,pH下降至3.8,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入15重量%的脱脂乳粉,进行喷雾干燥,进风温度115℃,出风温度85℃,得到中药发酵粉,水分含量为8重量%。
实施例6
(1)将人参、黄精、当归、陈皮、西红花、茯苓、枸杞子、甘草进行超微粉碎至320目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,人参160重量份,黄精160重量份,当归100重量份,枸杞子80重量份,陈皮60重量份,茯苓60重量份,西红花70重量份,甘草40重量份,纯化水3800重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.2,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,52℃,180min,得到酶解液。其中,纤维素酶8重量份,果胶酶8重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度98℃,45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量20.5%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.6,进行灭菌处理,96℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.4重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度35℃,搅拌转速320rpm,通风量3.5v/v/min,发酵84h,pH下降至6.0,得到第一发酵液;将0.4重量份凝结芽孢杆菌、0.5重量份嗜热链球菌、0.5重量份保加利亚乳杆菌接种至第一发酵液,温度35℃,搅拌转速80rpm,通风量为零,发酵62h,pH下降至4.8,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.6重量份接种至第二发酵液,温度30℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵66h,pH下降至3.6,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入12重量%乳清蛋白,进行喷雾干燥,进风温度118℃,出风温度86℃,得到中药发酵粉,水分含量为10重量%。
实施例7-9用于说明采用本发明提供的包括黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁和茯苓的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020041103;
果胶酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020052218;
酸性蛋白酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020022303;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21736;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20153;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6151;
乳酸乳球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21028;
发酵乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21840;
马克思克鲁维酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 32015;
酿酒酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 1209。
实施例7
(1)将黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁、茯苓进行超微粉碎至180目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄精120重量份,覆盆子82份,肉桂60重量份,决明子45重量份,丁香40重量份,薏苡仁30重量份,山药20重量份,茯苓20重量份,水2800重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.5,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,120min,得到酶解液。其中,纤维素酶2重量份,果胶酶2重量份,酸性蛋白酶8重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,60min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度66℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量15.6%,相对密度1.05g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至6.5,进行灭菌处理,92℃,30min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.3重量份枯草芽孢杆菌、0.2重量份凝结芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度32℃,搅拌转速180rpm,通风量4.0v/v/min,发酵72h,pH下降至5.0,得到第一发酵液;将鼠李糖乳杆菌0.2重量份、乳酸乳球菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度26℃,搅拌转速30rpm,通风量为零,发酵24h,pH下降至4.2,得到第二发酵液;将马克思克鲁维酵母0.1重量份接种至第二发酵液,温度28℃,搅拌转速300rpm,通风量为零,发酵48h,pH下降至3.2,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入20重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度112℃,出风温度75℃,得到中药发酵粉,发酵粉水分含量为6重量%。
实施例8
(1)将黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁、茯苓进行超微粉碎至320目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄精140重量份,覆盆子100份,丁香50重量份,肉桂40重量份,决明子60重量份,山药10重量份,薏苡仁20重量份,茯苓18重量份,水3200重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.4,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,135min得到酶解液。其中,纤维素酶7重量份,果胶酶7重量份,酸性蛋白酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度90℃,提取时间35min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度63℃,相对真空度-0.06MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量12.8%,相对密度1.03g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.2,进行灭菌处理,90℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.6重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,37℃,搅拌转速320rpm,通风量3.5v/v/min,发酵68h,pH下降至5.2,得到第一发酵液;将鼠李糖乳杆菌0.6重量份接种至第一发酵液,温度28℃,搅拌转速45rpm,通风量为零,发酵34h,pH下降至4.0,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.6重量份接种至第二发酵液,温度25℃,搅拌转速260rpm,通风量为零,发酵40h,pH下降至3.5,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入10重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度73℃,得到中药发酵粉,发酵粉水分含量为7重量%。
实施例9
(1)将黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁、茯苓进行超微粉碎至240目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄精120重量份,覆盆子80份,肉桂80重量份,丁香40重量份,决明子40重量份,薏苡仁10重量份,茯苓10重量份,山药15重量份,水3500重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,55℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶6重量份,果胶酶6重量份,酸性蛋白酶10重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度98℃,80min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度72℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量18.2%,相对密度1.08g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,96℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法如下:将0.2重量份凝结芽孢杆菌、0.6重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度40℃,搅拌转速280rpm,通风量5.0v/v/min,发酵56h,pH下降至5.4,得到第一发酵液;将乳酸乳球菌0.3重量份、发酵乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,30℃,搅拌转速60rpm,通风量为零,发酵44h,pH下降至4.1,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.6重量份接种至第二发酵液,温度26℃,搅拌转速240rpm,通风量为零,发酵46h,pH下降至3.3,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入15重量%的麦芽糊精,进行干燥,进风温度106℃,出风温度68℃,得到中药发酵粉,发酵粉水分含量为5重量%。
实施例10-12用于说明采用本发明提供的包括陈皮、炒黄芥子、生姜、茯苓、甘草和乌梅的原料组合物制备中药发酵产品的方法,其中,纤维素酶购自河南仰韶生物科技有限公司,货号为2020091012;
果胶酶购自河南仰韶生物科技有限公司,货号为2020091518;
酸性蛋白酶购自河南仰韶生物科技有限公司,货号为2020050933;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 23843;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10071;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20261;
青春双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6180;
瑞士乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20357;
马克思克鲁维酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 32015
酿酒酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 1001。
实施例10
(1)将陈皮、乌梅、炒黄芥子、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至220目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,陈皮180重量份,炒黄芥子120份,生姜120重量份,茯苓80重量份,甘草60重量份,乌梅20重量份,纯化水2600重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.5,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,90min,得到酶解液。其中,纤维素酶3重量份,果胶酶3重量份,酸性蛋白酶9重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度91℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度66℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量22.4%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.4,进行灭菌处理,98℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.44重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度35℃,搅拌转速240rpm,通风量4.5v/v/min,发酵96h,pH下降至5.1,得到第一发酵液;将青春双歧杆菌0.5重量份、植物乳杆菌0.4重量份接种至第一发酵液,温度32℃,搅拌转速110rpm,通风量为零,发酵49h,pH下降至4.4,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.3重量份接种至第二发酵液,温度25℃,搅拌转速260rpm,通风量为零,发酵66h,pH下降至3.6,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入15重量%的脱脂乳粉,进行喷雾干燥,进风温度116℃,出风温度82℃,得到中药发酵粉,水分含量为10重量%。
实施例11
(1)将陈皮、炒黄芥子、乌梅、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至160目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,陈皮200重量份,炒黄芥子160份,生姜140重量份,茯苓100重量份,甘草60重量份,乌梅30重量份,纯化水3200重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,65℃,120min得到酶解液。其中,纤维素酶9重量份,果胶酶9重量份,酸性蛋白酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,提取时间50min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度70℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量24.2%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.4,进行灭菌处理,96℃,8min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将枯草芽孢杆菌0.3重量份接种至所述灭菌液中,温度40℃,搅拌转速320rpm,通风量4.2v/v/min,发酵92h,pH下降至5.0,得到第一发酵液;将青春双歧杆菌0.4重量份、植物乳杆菌0.2重量份、瑞士乳杆菌0.6重量份接种至第一发酵液,温度25℃,搅拌转速60rpm,通风量为零,发酵36h,pH下降至4.02,得到第二发酵液;将马克思克鲁维酵母0.2重量份接种至第二发酵液,温度20℃,搅拌转速150rpm,通风量为零,发酵60h,pH下降至3.4,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入15重量%的海藻糖,进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度72℃,得到中药发酵粉,水分含量为8重量%。
实施例12
(1)将陈皮、炒黄芥子、乌梅、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至240目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,陈皮150重量份,炒黄芥子130份,生姜120重量份,茯苓80重量份,甘草60重量份,乌梅30重量份,纯化水3000重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.2,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,54℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶10重量份,果胶酶10重量份,酸性蛋白酶16重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度90℃,提取时间60min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量23.6%,相对密度1.08g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,94℃,12min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将枯草芽孢杆菌0.5重量份接种至所述灭菌液中,温度38℃,搅拌转速180rpm,通风量5.0v/v/min,发酵78h,pH下降至5.2,得到第一发酵液;将凝结芽孢杆菌0.3重量份、青春双歧杆菌0.2重量份、植物乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度30℃,搅拌转速160rpm,通风量为零,发酵62h,pH下降至4.1,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.5重量份接种至第二发酵液,温度26℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵72h,pH下降至3.2,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入12重量%的乳清蛋白,进行喷雾干燥,进风温度103℃,出风温度68℃,得到中药发酵粉,水分含量为5重量%。
实施例13-15用于说明采用本发明提供的包括当归、阿胶、枸杞子、桃仁、红花和姜黄制备中药发酵产品的方法,其中,纤维素酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2020040623;
果胶酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2020050915;
酸性蛋白酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2020070310;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21735;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10023;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20259;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20242;
瑞士乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20357
副干酪乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20246;
乳双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21715;
马克思克鲁维酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 32017;
酿酒酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 33296;
实施例13
(1)将当归、西红花、枸杞子、桃仁、姜黄、阿胶进行超微粉碎至46μm,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,当归200重量份,阿胶160重量份,枸杞子100重量份,桃仁100重量份,西红花50重量份,姜黄20重量份,纯化水3000重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.3,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,56℃,120min,得到酶解液。其中,纤维素酶4重量份,果胶酶6重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度92℃,50min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度55℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量20.8%,相对密度1.06g/mL;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,95℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.3重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度34℃,搅拌转速350rpm,通风量3.0v/v/min,发酵90h,pH下降至6.4,得到第一发酵液;将0.5重量份乳双歧杆菌、0.4重量份鼠李糖乳杆菌、0.3重量份副干酪乳杆菌和0.4重量份凝结芽孢杆菌接种至第一发酵液,温度32℃,搅拌转速110rpm,通风量为零,发酵50h,pH下降至4.8,得到第二发酵液;将0.4重量份马克斯克鲁维酵母接种至第二发酵液,温度35℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵78h,pH下降至3.1,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入10重量%的乳糖,进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度82℃,得到发酵产品,水分含量为6重量%。
实施例14
(1)将当归、西红花、枸杞子、姜黄、阿胶、桃仁进行超微粉碎至160目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,当归180重量份,阿胶120重量份,枸杞子120重量份,桃仁60重量份,西红花60重量份,姜黄40重量份,纯化水3200重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.5,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,180min,得到酶解液。其中,纤维素酶8重量份,果胶酶8重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度94℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量21.8%,相对密度1.08g/mL;将所述浓缩液加入8重量份碳酸氢钠调节pH至7.4,进行灭菌处理,96℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.3重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度37℃,搅拌转速400rpm,通风量3.5v/v/min,发酵78h,pH下降至6.2,得到第一发酵液;将乳双歧杆菌0.2重量份,副干酪乳杆菌0.2重量份,鼠李糖乳杆菌0.4重量份、植物乳杆菌0.5重量份、瑞士乳杆菌0.3重量份、0.4重量份凝结芽孢杆菌接种至第一发酵液,温度30℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵68h,pH下降至4.6,得到第二发酵液;将酿0.4重量份酒酵母、0.5重量份马克思克鲁维酵母接种至第二发酵液,温度30℃,搅拌转速100rpm,通风量为零,发酵88h,pH下降至3.3,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入10重量%乳清蛋白粉,进行喷雾干燥,进风温度110℃,出风温度82℃,得到发酵产品,水分含量为12重量%。
实施例15
(1)将当归、阿胶、桃仁、西红花、姜黄、枸杞子进行超微粉碎至220目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,当归120重量份,阿胶120重量份,枸杞子100重量份,桃仁80重量份,西红花60重量份,姜黄40重量份,纯化水3500重量份。
(2)将混合液加入8重量份维生素C调节pH至4.4,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,150min,得到酶解液。其中,纤维素酶4重量份,果胶酶8重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,40min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度66℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量23.2%,相对密度1.11g/mL;将所述浓缩液加入7重量份碳酸氢钠调节pH至7.2,进行灭菌处理,96℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.2重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度32℃,搅拌转速280rpm,通风量2.5v/v/min,发酵84h,pH下降至6.0,得到第一发酵液;将乳双歧杆菌0.3重量份,副干酪乳杆菌0.3重量份,凝结芽孢杆菌0.2重量份、瑞士乳杆菌0.4重量份接种至第一发酵液,温度34℃,搅拌转速90rpm,通风量为零,发酵38h,pH下降至4.7,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.5重量份接种至第二发酵液,温度24℃,搅拌转速80rpm,通风量为零,发酵93h,pH下降至3.5,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入8重量%γ-环糊精,进行喷雾干燥,进风温度103℃,出风温度82℃,得到发酵产品,水分含量为9重量%。
实施例16-18用于说明采用本发明提供的包括黄芪、人参、茱萸、茯苓、生姜和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法,其中,纤维素酶购自潍坊康地恩生物科技有限公司,货号2019110573;
果胶酶购自潍坊康地恩生物科技有限公司,货号2019110825;
酸性蛋白酶购自潍坊康地恩生物科技有限公司,货号2019102351;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 23843;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10071;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20718;
两歧双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6166;
肠膜明串珠菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21859;
马克思克鲁维酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 32017;
酿酒酵母,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 1048。
实施例16
(1)将黄芪、人参、山茱萸、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至200目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪100重量份,人参40份,山茱萸20重量份,茯苓13.5重量份,生姜20重量份,甘草6.5重量份,纯化水1100重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.8,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,180min,得到酶解液。其中,纤维素酶2.5重量份,果胶酶2.5重量份,酸性蛋白酶3重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,20min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度68℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量20.4%,相对密度1.08g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.2,进行灭菌处理,95℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.13重量份枯草芽孢杆菌、0.15重量份凝结芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度39℃,搅拌转速240rpm,通风量4.5v/v/min,发酵96h,pH下降至5.0,得到第一发酵液;将两歧双歧杆菌0.17重量份、植物乳杆菌0.13重量份接种至第一发酵液,温度32℃,搅拌转速100rpm,通风量为零,发酵36h,pH下降至4.4,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.1重量份接种至第二发酵液,温度26.5℃,搅拌转速260rpm,通风量为零,发酵60h,pH下降至3.6,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入10重量%麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度115℃,出风温度78℃,得到中药发酵粉,水分含量为7重量%。
实施例17
(1)将黄芪、人参、山茱萸、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至180目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪100重量份,人参33.5份,生姜16.5重量份,山茱萸12.5重量份,甘草10.5重量份,茯苓8.5重量份,纯化水1500重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至5.0,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶3.5重量份,果胶酶3.5重量份,酸性蛋白酶4.2重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,提取时间60min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量18.6%,相对密度1.06g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,98℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.2重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,42℃,搅拌转速350rpm,通风量4.0v/v/min,发酵82h,pH下降至5.5,得到第一发酵液;将两歧双歧杆菌0.2重量份、肠膜明串珠菌0.2重量份接种至第一发酵液,温度28℃,搅拌转速80rpm,通风量为零,发酵48h,pH下降至4.2,得到第二发酵液;将马克思克鲁维酵母0.17重量份接种至第二发酵液,温度25℃,搅拌转速220rpm,通风量为零,发酵55h,pH下降至3.3,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入20重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度110℃,出风温度75℃,得到中药发酵粉,水分含量6重量%。
实施例18
(1)将黄芪、人参、山茱萸、茯苓、生姜、甘草进行超微粉碎至160目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪100重量份,人参36.5份,生姜18重量份,山茱萸16重量份,甘草13.5重量份,茯苓11.5重量份,纯化水1180重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,65℃,90min得到酶解液。其中,纤维素酶1.5重量份,果胶酶1.5重量份,酸性蛋白酶5.5重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度88℃,提取时间90min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度56℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量21.3%,相对密度1.07g/ml;将所述浓缩液加入碳酸氢钠调节pH至7.5,进行灭菌处理,96℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.27重量份凝结芽孢杆菌、0.1重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,39℃,搅拌转速300rpm,通风量3.5v/v/min,发酵92h,pH下降至5.3,得到第一发酵液;将植物乳杆菌0.18重量份、两歧双歧杆菌0.23重量份、肠膜明串珠菌0.18重量份接种至第一发酵液,温度24℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵42h,pH下降至4.0,得到第二发酵液;将酿酒酵母0.22重量份、马克思克鲁维酵母0.14重量份接种至第二发酵液,温度28℃,搅拌转速160rpm,通风量为零,发酵70h,pH下降至3.5,得到第三发酵液。
(6)将第三发酵液中加入10重量%麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度113℃,出风温度72℃,得到中药发酵粉,水分7重量%。
实施例19-21用于说明采用本发明提供的包括人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020061124;
果胶酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020102274;
酸性蛋白酶购自宁夏夏盛生物科技有限公司,货号2020092106;
解淀粉芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10074;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 22691;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 25034;
嗜热链球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20383;
短双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6182;
干酪乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 25035;
乳酸乳球菌乳脂亚种,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC24337。
实施例19
(1)将人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓粉碎至23μm,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液。
其中,相对于100重量份的人参,余甘子的用量为71重量份,玉竹的用量为64重量份,橄榄果的用量为50重量份,鱼腥草的用量为43重量份,茯苓的用量为28重量份,水的用量为1600重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.6,然后加入酶制剂,对混合液进行酶解,酶解的条件包括:温度为62℃,时间为1.5h,得到酶解液。
其中,相对于100重量份的人参,酶制剂中包含纤维素酶3.5重量份,果胶酶2.8重量份,酸性蛋白酶5.7重量份(相对于100重量份的人参,酶制剂的用量为12重量份)。
(3)将酶解液进行活性成分的加热提取,提取的条件包括:温度95℃,1h,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩的温度为65℃,相对真空度为-0.07MPa,浓缩使得浓缩液可溶性固形物含量为22.3%,相对密度为1.09g/mL。
浓缩后,将所述浓缩液加入柠檬酸钠调节pH至6.8,进行灭菌处理,灭菌的温度为92℃,时间为10min,得到灭菌液。
(5)取上述灭菌液,首先将枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,在温度为37℃,搅拌转速为500rpm,通风量为5.5/v/min的条件下进行第一发酵,第一发酵时间为144h,pH下降至4.8,得到第一发酵液。其中,相对于100重量份的人参,所述枯草芽孢杆菌的用量为0.28重量份,解淀粉芽孢杆菌的用量为0.22重量份(即相对于100重量份的人参,芽孢杆菌的用量为0.5重量份)。
将嗜热链球菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种接种至第一发酵液,在温度为30℃,搅拌转速为200rpm,通风量为零的条件下进行第二发酵,第二发酵的时间为120h,pH下降至3.5,得到第二发酵液。其中,相对于100重量份的人参,所述嗜热链球菌的用量为0.14重量份、短双歧杆菌的用量为0.18重量份、干酪乳杆菌的用量为0.14重量份、乳酸乳球菌乳脂亚种的用量为0.11重量份(即相对于100重量份的人参,乳酸菌的用量为0.57重量份)。
(6)将第二发酵液中加入20重量%的甘露糖,并进行喷雾干燥,进风温度110℃,出风温度90℃,得到中药发酵粉,其中水分的含量为7重量%。
实施例20
(1)将人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓粉碎至30μm,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液。
其中,相对于100重量份的人参,余甘子的用量为91重量份,玉竹的用量为82重量份,橄榄果的用量为60重量份,鱼腥草的用量为46重量份,茯苓的用量为37重量份,水的用量为1700重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至5,然后加入酶制剂,对混合液进行酶解,酶解的条件包括:温度为56℃,时间为2h,得到酶解液。
其中,相对于100重量份的人参,酶制剂中包含纤维素酶5.7重量份,果胶酶7.3重量份,酸性蛋白酶11重量份(相对于100重量份的人参,酶制剂的用量为24重量份)。
(3)将酶解液进行活性成分的加热提取,提取的条件包括:温度96℃,1.1h,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩的温度为58℃,相对真空度为-0.09MPa,浓缩使得浓缩液可溶性固形物含量为26.6%,相对密度为1.07g/mL。
浓缩后,将所述浓缩液加入碳酸钠调节pH至6.4,进行灭菌处理,灭菌的温度为93℃,时间为12min,得到灭菌液。
(5)取上述灭菌液,首先将枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,在温度为35℃,搅拌转速为400rpm,通风量为6.5v/v/min的条件下进行第一发酵,第一发酵时间为96h,pH下降至5,得到第一发酵液。其中,相对于100重量份的人参,所述枯草芽孢杆菌的用量为0.3重量份(即相对于100重量份的人参,芽孢杆菌的用量为0.3重量份)。
将嗜热链球菌、短双歧杆菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种和植物乳杆菌接种至第一发酵液,在温度为28℃,搅拌转速为80rpm,通风量为零的条件下进行第二发酵,第二发酵的时间为84h,pH下降至4.2,得到第二发酵液。其中,相对于100重量份的人参,所述嗜热链球菌的用量为0.18重量份、短双歧杆菌的用量为0.04重量份、干酪乳杆菌的用量为0.18重量份、乳酸乳球菌乳脂亚种的用量为0.1重量份、植物乳杆菌的用量为0.2重量份(即相对于100重量份的人参,乳酸菌的用量为0.7重量份)。
(6)将第二发酵液中加入18重量%的环糊精,并进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度85℃,得到中药发酵粉,其中水分的含量为6重量%。
实施例21
(1)将人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓粉碎至40μm,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液。
其中,相对于100重量份的人参,余甘子的用量为88重量份,玉竹的用量为73重量份,橄榄果的用量为46重量份,鱼腥草的用量为38重量份,茯苓的用量为23重量份,水的用量为2200重量份。
(2)将混合液加入乳酸调节pH至5.2,然后加入酶制剂,对混合液进行酶解,酶解的条件包括:温度为65℃,时间为1.7h,得到酶解液。
其中,相对于100重量份的人参,酶制剂中包含纤维素酶4重量份,果胶酶5重量份,酸性蛋白酶7重量份(相对于100重量份的人参,酶制剂的用量为16重量份)。
(3)将酶解液进行活性成分的加热提取,提取的条件包括:温度93℃,1.2h,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩的温度为66℃,相对真空度为-0.08MPa,浓缩使得浓缩液可溶性固形物含量为19.7%,相对密度为1.06g/mL。
浓缩后,将所述浓缩液加入三聚磷酸钠调节pH至6.6,进行灭菌处理,灭菌的温度为95℃,时间为15min,得到灭菌液。
(5)取上述灭菌液,首先将解淀粉芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,在温度为32℃,搅拌转速为620rpm,通风量为3.5v/v/min的条件下进行第一发酵,第一发酵时间为110h,pH下降至4.7,得到第一发酵液。其中,相对于100重量份的人参,解淀粉芽孢杆菌的用量为0.2重量份(即相对于100重量份的人参,芽孢杆菌的用量为0.2重量份)。
将嗜热链球菌、干酪乳杆菌、乳酸乳球菌乳脂亚种接种至第一发酵液,在温度为25℃,搅拌转速为120rpm,通风量为零的条件下进行第二发酵,第二发酵的时间为72h,pH下降至3.7,得到第二发酵液。其中,相对于100重量份的人参,所述嗜热链球菌的用量为0.23重量份、干酪乳杆菌的用量为0.1重量份、乳酸乳球菌乳脂亚种的用量为0.07重量份(即相对于100重量份的人参,乳酸菌的用量为0.4重量份)。
(6)将第二发酵液中加入25重量%的麦芽糊精,并进行喷雾干燥,进风温度110℃,出风温度86℃,得到中药发酵粉,其中水分的含量为9重量%。
实施例22-24用于说明本发明提供的包括黄芪、人参、肉桂和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法;其中,纤维素酶购自江苏奕农生物股份有限公司,货号2020120513;
果胶酶购自江苏奕农生物股份有限公司,货号2021112306;
酸性蛋白酶购自江苏奕农生物股份有限公司,货号2021062416
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10260;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6136;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20263;
乳酸片球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20720;
青春双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6175;
副干酪乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20273。
实施例22
(1)将人参、黄芪、肉桂、甘草进行超微粉碎至220目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪300重量份,人参240重量份,肉桂200重量份,甘草160重量份,水5000重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.2,然后加入酶制剂进行酶解处理,62℃,150min,得到酶解液。其中,纤维素酶10重量份,果胶酶15重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度102℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度65℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量24.0%,相对密度1.10g/mL;将所述浓缩液加入柠檬酸钠调节pH至6.2,进行灭菌处理,90℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.4重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,37℃,搅拌转速280rpm,通风量4.0v/v/min,发酵120h,pH下降至4.4,得到第一发酵液;将青春双歧杆菌0.3重量份,副干酪乳杆菌0.3重量份,植物乳杆菌0.4重量份、乳酸片球菌0.2重量份,温度28℃,搅拌转速120rpm,通风量为零,发酵70h,pH下降至3.6,得到第二发酵液。
(6)将第二发酵液中加入12重量%的脱脂乳粉,进行喷雾干燥,进风温度115℃,出风温度85℃,得到中药发酵粉,发酵粉水分含量为7.3重量%。
实施例23
(1)将人参、黄芪、肉桂、甘草进行超微粉碎至360目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪240重量份,人参200重量份,肉桂150重量份,甘草90重量份,纯化水4200重量份。
(2)将混合液加入3重量份乳酸调节pH至4.4,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,120min,得到酶解液。其中,纤维素酶12重量份,果胶酶9重量份,酸性蛋白酶15重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量21.3%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入6重量份碳酸氢钠调节pH至6.5,进行灭菌处理,90℃,20min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.5重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度43℃,搅拌转速500rpm,通风量4.0v/v/min,发酵108h,pH下降至4.5,得到第一发酵液;将青春双歧杆菌0.4重量份,副干酪乳杆菌0.4重量份,鼠李糖乳杆菌0.3重量份接种至第一发酵液,温度32℃,搅拌转速80rpm,通风量为零,发酵72h,pH下降至3.8,得到第二发酵液。
(6)将第二发酵液中加入20重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度112℃,出风温度78℃,得到中药发酵粉,水分含量为6.5重量%。
实施例24
(1)将人参、黄芪、肉桂、甘草进行超微粉碎至500目,并将中药粉与纯净水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,黄芪280重量份,人参250重量份,肉桂130重量份,甘草120重量份,纯化水5800重量份。
(2)将混合液加入苹果酸调节pH至4.3,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,66℃,150min,得到酶解液。其中,纤维素酶16重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶20重量份。
(3)将酶解液进行提取处理,提取温度92℃,35min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温55℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量23.5%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入3重量份三聚磷酸钠调节pH至6.2,进行灭菌处理,90℃,5min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.5重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度40℃,搅拌转速520rpm,通风量4.0v/v/min,发酵144h,pH下降至4.2,得到第一发酵液;将青春双歧杆菌0.3重量份,鼠李糖乳杆菌0.2重量份、植物乳杆菌0.5重量份、乳酸片球菌0.2重量份接种至第一发酵液,温度30℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵82h,pH下降至3.7,得到第二发酵液。
(6)将第二发酵液中加入16重量%的甘露糖,进行喷雾干燥,进风温度115℃,出风温度78℃,得到中药发酵粉,水分含量为5.8重量%。
实施例25-27用于说明本发明提供的包括薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自白银赛诺生物科技有限公司,货号2021081326;
果胶酶购自白银赛诺生物科技有限公司,货号2021091523;
酸性蛋白酶购自白银赛诺生物科技有限公司,货号2021120672;
中温α-淀粉酶购自白银赛诺生物科技有限公司,货号2021032081;
嗜热链球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20366;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 22176;
干酪乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6114;
保加利亚乳杆菌购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6097
嗜酸乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6094;
乳双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21716;
肠膜明串珠菌肠膜亚种,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC22184;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20258。
实施例25
(1)将薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子和甘草进行超微粉碎至500目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,薏苡仁140重量份,人参110重量份,茯苓80重量份,鸡内金80重量份,桔梗60重量份,山药50重量份,白扁豆50重量份,砂仁30重量份,莲子30重量份,甘草20重量份,水4800重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,60min,得到酶解液。其中,纤维素酶12重量份,果胶酶10重量份,酸性蛋白酶12重量份,中温α-淀粉酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,40min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度68℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量26.3%,相对密度1.08g/mL;将所述浓缩液加入7重量份三聚磷酸钠调节pH至6.2,进行灭菌处理,95℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:嗜热链球菌0.5重量份、植物乳杆菌0.3重量份、干酪乳杆菌0.2重量份、保加利亚乳杆菌0.8重量份、乳双歧杆菌0.6重量份,温度42℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵96h,pH下降至3.4,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入24重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度102℃,出风温度82℃,得到中药发酵组合物,水分为5.3重量%。
实施例26
(1)将薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子、甘草,进行超微粉碎至360目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,薏苡仁150重量份,人参120重量份,茯苓100重量份,鸡内金90重量份,桔梗80重量份,山药80重量份,白扁豆60重量份,砂仁40重量份,莲子40重量份,甘草40重量份,水5600重量份。
(2)将混合液加入苹果酸调节pH至5.2,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶8重量份,果胶酶6重量份,酸性蛋白酶15重量份,中温α-淀粉酶10重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,25min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度55℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量26.7%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入9重量份柠檬酸钠调节pH至6.4,进行灭菌处理,95℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:嗜热链球菌0.8重量份、干酪乳杆菌0.6重量份、保加利亚乳杆菌0.5重量份、乳双歧杆菌0.6重量份、鼠李糖乳杆菌0.3重量份,温度30℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵102h,pH下降至3.5,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入16重量%甘露糖,进行喷雾干燥,进风温度115℃,出风温度83℃,得到中药发酵粉,其中水分含量为6.4重量%。
实施例27
(1)将薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子、甘草,进行超微粉碎至820目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,薏苡仁100重量份,人参100重量份,茯苓70重量份,鸡内金70重量份,桔梗70重量份,山药60重量份,白扁豆60重量份,砂仁40重量份,莲子40重量份,甘草30重量份,水4700重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.8,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,120min得到酶解液。其中,纤维素酶15重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶12重量份,中温α-淀粉酶8重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,提取时间45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度64℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量28.5%,相对密度1.10g/mL;将所述浓缩液加入9重量份碳酸钠调节pH至6.0,进行灭菌处理,95℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:嗜热链球菌0.3重量份、植物乳杆菌0.4重量份、保加利亚乳杆菌0.6重量份、嗜酸乳杆菌0.5重量份、乳双歧杆菌0.2重量份、肠膜明串珠菌肠膜亚种0.7重量份、鼠李糖乳杆菌0.3重量份,温度28℃,搅拌转速100rpm,通风量为零,发酵120h,pH下降至3.8,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入18重量%甘油,进行喷雾干燥,进风温度101℃,出风温度75℃,得到中药发酵粉,水分含量为5.7重量%。
实施例28-30用于说明采用本发明提供的西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻和黄芥子的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自河南新仰韶生物科技有限公司,货号2020051938;
果胶酶购自河南新仰韶生物科技有限公司,货号2020112706;
酸性蛋白酶购自河南新仰韶生物科技有限公司,货号2021110324;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20522;
嗜热链球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21099;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 23180;
嗜酸乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6088;
保加利亚乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20358。
实施例28
(1)将西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻、黄芥子,进行超微粉碎至700目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,西红花140重量份,白芷120重量份,当归120重量份,桔梗120重量份,陈皮90重量份,干姜90重量份,佛手80重量份,枸杞子80重量份,香薷70重量份,肉桂70重量份,砂仁70重量份,茯苓50重量份,甘草40重量份,豆蔻40重量份,黄芥子40重量份,水4500重量份。
(2)将混合液加入乳酸调节pH至4.6,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,100min,得到酶解液。其中,纤维素酶9重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶16重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压浓缩处理,浓缩温度68℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量23.5%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入10重量份柠檬酸钠调节pH至6.6,进行灭菌处理,98℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将0.3重量份枯草芽孢杆菌接种至所述灭菌液中,温度37℃,搅拌转速500rpm,通风量6v/v/min,发酵168h,pH下降至5.2,得到发酵液a;将嗜酸乳杆菌0.6重量份、植物乳杆菌0.5重量份、嗜热链球菌0.8重量份,接种至发酵液a,温度32℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵120h,pH下降至3.8,得到发酵液b。
(6)将发酵液b中加入18重量%的甘露糖,进行喷雾干燥,进风温度103℃,出风温度87℃,得到发酵粉,水分含量为6.2重量%。
实施例29
(1)将西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻、黄芥子,进行超微粉碎至520目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,西红花130重量份,白芷130重量份,当归110重量份,桔梗100重量份,陈皮80重量份,干姜80重量份,佛手70重量份,枸杞子70重量份,香薷70重量份,肉桂70重量份,砂仁60重量份,豆蔻50重量份,黄芥子50重量份,茯苓30重量份,甘草30重量份,水4200重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.8,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,180min得到酶解液。其中,纤维素酶16重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶20重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,提取时间50min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度65℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量19.5%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入9重量份三聚磷酸钠调节pH至6.5,进行灭菌处理,98℃,3min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将枯草芽孢杆菌0.7重量份接种至所述灭菌液中,温度32℃,搅拌转速750rpm,通风量5v/v/min,发酵96h,pH下降至4.9,得到发酵液a;将嗜酸乳杆菌0.3重量份、植物乳杆菌0.8重量份、保加利亚乳杆菌0.5重量份接种至发酵液a,温度32℃,搅拌转速160rpm,通风量为零,发酵60h,pH下降至4.0,得到发酵液b。
(6)将发酵液b中加入25重量%环糊精,进行喷雾干燥,进风温度106℃,出风温度82℃,得到中药发酵粉,水分含量为5重量%。
实施例30
(1)将西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻、黄芥子,进行超微粉碎至380目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,西红花140重量份,白芷120重量份,当归100重量份,桔梗100重量份,陈皮80重量份,干姜80重量份,佛手80重量份,枸杞子80重量份,香薷60重量份,肉桂60重量份,砂仁50重量份,茯苓50重量份,甘草40重量份,豆蔻30重量份,黄芥子30重量份,水5800重量份。
(2)将混合液加入苹果酸调节pH至4.2,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,160min得到酶解液。其中,纤维素酶12重量份,果胶酶15重量份,酸性蛋白酶22重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度100℃,提取时间30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度63℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量28.5%,相对密度1.10g/mL;将所述浓缩液加入3重量份氢氧化钠调节pH至6.4,进行灭菌处理,98℃,10min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:首先将枯草芽孢杆菌0.9重量份接种至所述灭菌液中,温度40℃,搅拌转速480rpm,通风量6.5v/v/min,发酵108h,pH下降至5.0,得到发酵液a;将嗜热链球菌0.8重量份、嗜酸乳杆菌1重量份、植物乳杆菌0.7重量份接种至发酵液a,温度25℃,搅拌转速200rpm,通风量为零,发酵36h,pH下降至4.2,得到发酵液b。
(6)将发酵液b中加入15重量%的淀粉,进行喷雾干燥,进风温度103℃,出风温度68℃,得到中药发酵粉,水分含量为7重量%。
实施例31-33用于说明采用本发明提供的包括菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英和菊花的原料组合物制备中药发酵产品的制备方法;
其中,纤维素酶购自武汉新华扬生物股份有限公司,货号2020122365;
果胶酶购自武汉新华扬生物股份有限公司,货号2021081957;
酸性蛋白酶购自武汉新华扬生物股份有限公司,货号2020032644;
枯草芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 10263;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6152;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 22226;
嗜酸乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6089;
青春双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为;CICC 6176
乳酸乳球菌乳酸亚种,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC20404。
实施例31
(1)将菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英、菊花,进行超微粉碎至500目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,菊苣180重量份,栀子140重量份,葛根100重量份,桑叶80重量份,百合80重量份,鱼腥草50重量份,淡竹叶40重量份,薏苡仁40重量份,蒲公英30重量份,菊花30重量份,水5000重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.5,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,55℃,120min得到酶解液。其中,纤维素酶15重量份,果胶酶16重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度92℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度62℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量26.5%,相对密度1.09g/mL;将所述浓缩液加入7重量份柠檬酸钠调节pH至5.8,进行灭菌处理,95℃,12min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:鼠李糖乳杆菌0.5重量份、凝结芽孢杆菌0.3重量份、植物乳杆菌0.6重量份、嗜酸乳杆菌0.5重量份、青春双歧杆菌0.8重量份、乳酸乳球菌乳酸亚种0.2重量份,温度32℃,搅拌转速100rpm,发酵72h,pH下降至3.2,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入30重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度83℃,得到中药发酵粉,水分含量为8.3重量%。
实施例32
(1)将菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英、菊花,进行超微粉碎至200目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,菊苣150重量份,栀子140重量份,葛根100重量份,桑叶80重量份,百合80重量份,鱼腥草50重量份,淡竹叶40重量份,薏苡仁30重量份,蒲公英20重量份,菊花20重量份,水5200重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.0,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,180min,得到酶解液。其中,纤维素酶20重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶16重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,40min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度70℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量22.6%,相对密度1.08/mL;将所述浓缩液加入10重量份碳酸钠调节pH至6.0,进行灭菌处理,90℃,40min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:凝结芽孢杆菌0.6重量份、植物乳杆菌0.7重量份、乳酸乳球菌乳酸亚种0.8重量份,温度37℃,搅拌转速260rpm,发酵124h,pH下降至3.2,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入16重量%的脱脂乳粉,进行喷雾干燥,进风温度108℃,出风温度86℃,得到中药发酵组合物,水分含量6.4重量%。
实施例33
(1)将菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英、菊花,进行超微粉碎至400目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,菊苣200重量份,栀子150重量份,葛根120重量份,桑叶90重量份,百合60重量份,鱼腥草50重量份,淡竹叶50重量份,薏苡仁30重量份,蒲公英30重量份,菊花20重量份,水6000重量份。
(2)将混合液加入苹果酸调节pH至4.3,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,65℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶12重量份,果胶酶10重量份,酸性蛋白酶16重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度93℃,提取时间45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度64℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量20.6%,相对密度1.05g/mL;将所述浓缩液加入6重量份氢氧化钠调节pH至6.1,进行灭菌处理,98℃,35min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:植物乳杆菌0.5重量份、嗜酸乳杆菌0.6重量份、青春双歧杆菌0.3重量份、乳酸乳球菌乳酸亚种0.3重量份,温度37℃,搅拌转速400rpm,发酵120h,pH下降至3.6,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入16重量%的甘露糖,进行喷雾干燥,进风温度105℃,出风温度86℃,得到中药发酵粉,水分含量7.7重量%。
实施例34-36用于说明采用本发明提供的包括桑叶、黄精、葛根、淡竹叶、玉竹、人参、山药、乌梅和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自山东隆科特酶制剂有限公司,货号2021121977;
果胶酶购自山东隆科特酶制剂有限公司,货号2021081365;
酸性蛋白酶购自山东隆科特酶制剂有限公司,货号2020111903;
中温α-淀粉酶购自山东隆科特酶制剂有限公司,货号2021070633;
瑞士乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6024;
嗜热链球菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20366;
发酵乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21828;
乳双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 21717;
肠膜明串珠菌肠膜亚种,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC22184。
实施例34
(1)将葛根、淡竹叶、玉竹、黄精、乌梅、甘草、山药、人参、桑叶,进行超微粉碎至480目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,桑叶180重量份、黄精180重量份、葛根160重量份、淡竹叶100量份、玉竹100重量份、人参80重量份、山药60重量份、乌梅40重量份、甘草40重量份,水5600重量份。
(2)将混合液加入柠檬酸调节pH至4.33,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,58℃,100min得到酶解液。其中,纤维素酶18重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶14重量份,中温淀粉酶5重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,20min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度66℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量28.3%,相对密度1.08g/mL;将所述浓缩液加入7重量份碳酸钠调节pH至6.0,进行灭菌处理,95℃,30min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:瑞士乳杆菌0.6重量份、嗜热链球菌0.6重量份、发酵乳杆菌0.3重量份、乳双歧杆菌0.5重量份、肠膜明串珠菌肠膜亚种0.5重量份,温度37℃,搅拌转速300rpm,发酵96h,pH下降至3.4,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入25重量%的乳清蛋白粉,进行喷雾干燥,得到中药发酵粉,水分含量为8.3重量%。
实施例35
(1)将葛根、淡竹叶、玉竹、黄精、乌梅、甘草、山药、人参、桑叶,进行超微粉碎至300目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,桑叶200重量份、黄精140重量份、葛根140重量份、淡竹叶120重量份、玉竹120重量份、人参100重量份、山药80重量份、乌梅60重量份、甘草60重量份,水5500重量份。
(2)将混合液加入乳酸调节pH至4.29,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,120min,得到酶解液。其中,纤维素酶16重量份,果胶酶14重量份,酸性蛋白酶18重量份,中温淀粉酶10重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度95℃,30min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度72℃,相对真空度-0.09MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量26.0%,相对密度1.08/mL;将所述浓缩液加入10重量份三聚磷酸钠调节pH至6.35,进行灭菌处理,92℃,45min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:瑞士乳杆菌0.3重量份、嗜热链球菌0.8重量份、发酵乳杆菌0.6重量份、乳双歧杆菌0.8重量份,温度37℃,搅拌转速500rpm,发酵108h,pH下降至3.6,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入12重量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,得到中药发酵组合物,水分含量为7.3重量%。
实施例36
(1)将葛根、淡竹叶、玉竹、黄精、乌梅、甘草、山药、人参、桑叶,进行超微粉碎至260目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,桑叶150重量份、黄精150重量份、葛根120重量份、淡竹叶100重量份、玉竹100重量份、人参90重量份、山药70重量份、乌梅50重量份、甘草50重量份,水4800重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.52,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,120min得到酶解液。其中,纤维素酶14重量份,果胶酶14重量份,酸性蛋白酶8重量份,中温淀粉酶6重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度93℃,提取时间45min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度60℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量25.6%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入6重量份柠檬酸钠调节pH至6.06,进行灭菌处理,96℃,25min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:发酵乳杆菌0.8重量份、乳双歧杆菌0.9重量份、肠膜明串珠菌肠膜亚种0.9重量份,温度32℃,搅拌转速200rpm,发酵200h,pH下降至3.3,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入16重量%的环糊精,进行喷雾干燥,得到中药发酵粉,水分含量为7.3重量%。
实施例37-39用于说明采用本发明提供的包括葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁和甘草的原料组合物制备中药发酵产品的方法;
其中,纤维素酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2020092213;
果胶酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2020102644;
酸性蛋白酶购自希杰尤特尔(湖南)生物科技有限公司,货号2021022813;
凝结芽孢杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 24625;
罗伊氏乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6226;
鼠李糖乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 22173;
植物乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20659;
瑞士乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20275;
嗜酸乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6089;
干酪乳杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 20994;
青春双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6178;
短双歧杆菌,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC 6184;
乳酸乳球菌乳酸亚种,购自中国工业微生物菌种保藏管理中心,编号为CICC20402。
实施例37
(1)将葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁、甘草,进行超微粉碎至300目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,葛根200重量份,枳椇子150重量份,藤茶140重量份,陈皮120重量份,姜黄80重量份,人参80重量份,茯苓60重量份,决明子60重量份,砂仁50重量份,甘草30重量份,水5000重量份。
(2)将混合液加入乙酸调节pH至5.0,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,150min得到酶解液。其中,纤维素酶10重量份,果胶酶13重量份,酸性蛋白酶18重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度96℃,25min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度55℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量21.4%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入8重量份碳酸钠调节pH至6.2,进行灭菌处理,96℃,15min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:凝结芽孢杆菌0.8重量份、植物乳杆菌0.6重量份、瑞士乳杆菌0.6重量份、嗜酸乳杆菌0.2重量份、干酪乳杆菌0.3重量份、青春双歧杆菌0.2重量份、乳酸乳球菌乳酸亚种0.6重量份,温度28℃,搅拌转速200rpm,发酵120h,pH下降至3.8,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入22重量%的乳清蛋白,进行喷雾干燥,进风温度112℃,出风温度88℃,得到中药发酵粉,水分含量为5.5重量%。
实施例38
(1)将葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁、甘草,进行超微粉碎至600目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,葛根180重量份,枳椇子160重量份,藤茶120重量份,陈皮80重量份,姜黄80重量份,人参70重量份,茯苓50重量份,决明子50重量份,砂仁40重量份,甘草40重量份,水4200重量份。
(2)将混合液加入维生素C调节pH至4.5,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,60℃,120min,得到酶解液。其中,纤维素酶15重量份,果胶酶15重量份,酸性蛋白酶15重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度98℃,35min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度70℃,相对真空度-0.08MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量24.8%,相对密度1.07g/mL;将所述浓缩液加入5重量份柠檬酸钠调节pH至6.3,进行灭菌处理,93℃,20min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:罗伊氏乳杆菌0.5重量份、鼠李糖乳杆菌0.6重量份、凝结芽孢杆菌0.3重量份、植物乳杆菌0.8重量份、青春双歧杆菌0.1重量份、短双歧杆菌0.3重量份、乳酸乳球菌乳酸亚种0.6重量份,温度35℃,搅拌转速300rpm,发酵96h,pH下降至4.0,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入24重量%甘露糖,进行喷雾干燥,进风温度102℃,出风温度82℃,得到中药发酵组合物,水分含量为5.3重量%。。
实施例39
(1)将葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁、甘草,进行超微粉碎至500目,并将中药粉与水搅拌混合均匀,得到混合液。其中,葛根140重量份,枳椇子120重量份,藤茶120重量份,陈皮100重量份,姜黄90重量份,人参70重量份,茯苓60重量份,决明子60重量份,砂仁50重量份,甘草40重量份,水3800重量份。
(2)将混合液加入乳酸调节pH至4.4,然后加入酶制剂将混合液进行酶解处理,62℃,100min得到酶解液。其中,纤维素酶16重量份,果胶酶12重量份,酸性蛋白酶12重量份。
(3)将酶解液进行加热提取处理,提取温度98℃,提取时间35min,得到提取液;将提取液进行固液分离,得到提取清液。
(4)将提取清液进行减压低温浓缩处理,浓缩温度64℃,相对真空度-0.07MPa,得浓缩液,浓缩液可溶性固形物含量27.8%,相对密度1.08g/mL;将所述浓缩液加入6重量份氢氧化钠调节pH至6.4,进行灭菌处理,96℃,30min,得到灭菌液。
(5)将灭菌液加入发酵剂进行发酵处理,得到发酵液,具体方法是:罗伊氏乳杆菌0.4重量份、植物乳杆菌0.4重量份、瑞士乳杆菌0.9重量份、嗜酸乳杆菌1重量份、干酪乳杆菌0.5重量份、青春双歧杆菌0.6重量份、短双歧杆菌0.8重量份,温度30℃,搅拌转速80rpm,发酵144h,pH下降至3.6,得到发酵液。
(6)将发酵液中加入20质量%的麦芽糊精,进行喷雾干燥,进风温度103℃,出风温度84℃,得到中药发酵粉,水分含量为6.3重量%。
对比例1
按照实施例1的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例2
按照实施例4的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例3
按照实施例7所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例4
按照实施例10所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例5
按照实施例13所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例6
按照实施例16所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例7
按照实施例19所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例8
按照实施例22所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例9
按照实施例25所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例10
按照实施例28所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例11
按照实施例31所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例12
按照实施例34所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
对比例13
按照实施例39所述的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。
测试例1-3采用实施例1-3和对比例1的产品,用于说明本发明提供的包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁的原料组合物的润肠通便的效果。
测试例1
动物实验
本实验目的一是要本发明提供的包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁的原料组合物的润肠通便的效果;二是要证明上述发酵处理后原料组合物的润肠通便效果优于未发酵的产品。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
取实施例1-3和对比例1的润肠通便发酵粉按照粉剂常规工艺进行生产,分别按照总重量2%、6%、90%称取赤藓糖醇、蓝莓果粉、发酵粉,并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(30g/袋)。
1.1.2试剂
墨汁的配制:准确称取明胶100g,加蒸馏水800mL,煮沸至溶液透明,加入活性炭粉50g后,煮沸3次,待溶液冷却后加蒸馏水定容至1000mL,于4℃冰箱中保存,用前摇匀。
0.05%复方地芬诺酯混悬浮液的配制:取复方地芬诺酷片50mg,用研钵研碎成粉末后,加蒸馏水定容至100mL,临用前配制。
1.1.3实验对象
实验动物为18-24g健康雌性昆明种小鼠。
1.1.4统计方法
试验数据采用方差分析进行统计处理,采用SPSS软件进行数据分析。其中,P<0.05为显著差异,P<0.01为极显著差异,P<0.001为十分显著差异,均具有统计学意义。
1.2实验方法
1.2.1小鼠小肠推进实验
将小鼠随机分组,每组8只。设空白对照组和便秘模型组(复方地芬诺酯组),低、中、高剂量组分别为受试物2.5、5.0、10.0g/kg,空白对照组和便秘模型组灌予等量蒸馏水。受试物样品用蒸馏水配制,每日经口灌胃。受试物连续培养7d后,各组小鼠禁食24h(饮水自由),实验组和空白对照组分别给与受试物、蒸馏水1次。30分钟后各组经口灌予墨汁。给与墨汁30分钟后,脱颈椎处死动物,开腹取小肠,剪取上端自幽门,下端至回盲部的肠管,轻拉成直线,测量小肠全长和幽门至墨水运动前沿位移,计算小肠墨汁推进率,公式如下:
墨汁推进率(%)=墨汁移动距离(cm)/小肠总长度(cm)×100%
1.2.3小鼠排便实验
将小鼠随机分组,每组8只。设空白对照组和便秘模型组(即复方地芬诺酯组),对实施例3设置低、中、高剂量组,对其他实施例和对比例只设置高剂量组,低、中、高剂量组分别为受试物2.5、5.0、10.0g/kg,空白对照组和便秘模型组灌予等量蒸馏水。受试物样品用蒸馏水配制,每日经口灌胃。受试物连续培养7d后,各组小鼠禁食24h(饮水自由)。除空白对照组外,其余各组灌胃0.05%复方地芬诺酯悬液,1h后低、中、高剂量组最后给与1次受试物,空白对照组给与蒸馏水。30分钟口各组经口给与墨汁。观察记录每只小鼠第一次排便时间、第一次排黑便的时间、10h排便粒数及排便重量。
2.结果与分析
2.1小肠推进试验
各实施例和对比例产品对小鼠墨汁推进率的影响见表1。
表1各实施例和对比例产品对小鼠墨汁推进率的影响(n=8)
注:*,与便秘模型组相比差异显著,P<0.05;**,与便秘模型组相比差异极显著,P<0.01;***,与便秘模型组相比差异十分显著,P<0.001;+,相同剂量下实施例与对比例相比,差异显著,P<0.05;++,相同剂量下实施例与对比例相比,差异极显著,P<0.01。(实施例1与对比例1相比)。
由表1可见,便秘模型组小鼠的小肠墨汁推进率十分显著低于空白对照组(P<0.001),表明便秘模型建模成功。经统计分析,实施例3各低、中、高剂量组小鼠的墨汁推进率均高于便秘模型组,其中,低剂量组与便秘模型组的墨汁推进率有极显著差异(P<0.01),中、高剂量组与便秘模型组的差异十分显著(P<0.001)。表明本发明的润肠通便产品具有明显促进小鼠小肠运动的作用。
实施例1与对比例1对比,有极显著差异(P<0.01),均表明经过中药发酵技术之后,五仁丸发酵粉对小鼠小肠运动的作用要明显优于未发酵五仁丸。
2.2小鼠排便实验
各实施例和对比例药物对小鼠首次排便时间、10h粪便质量的影响的情况见表2。
表2各实施例和对比例药物对小鼠首次排便时间、10h粪便质量的影响
/>
注:*,与便秘模型组相比差异显著,P<0.05;**,与便秘模型组相比差异极显著,P<0.01;***,与便秘模型组相比差异十分显著,P<0.001。+,相同剂量下实施例与对比例相比,差异显著,P<0.05;++,相同剂量下实施例与对比例相比(实施例1与对比例1相比),差异极显著,P<0.01。
分析上表可以看出,与空白对照组相比,便秘模型组小鼠的首次排便时间、10h粪便质量均有十分显著差异(P<0.001),说明建模成功。实施例3低剂量组小鼠首次排便时间、粪便质量与便秘组有显著差异(P<0.05),中剂量组小鼠首次排便时间、粪便质量与便秘组有极显著差异(P<0.01),高剂量组小鼠首次排便时间、粪便质量与便秘组有十分显著差异(P<0.001),说明实施例3的产品能明显缩短便秘组小鼠的首次排便时间,排便粪量上也有明显增加,证明实施例3的产品有着明显的润肠通便作用,而且小鼠粪便正常,有一定软化粪便的作用,同时未见腹泻情况发生。
在实验过程中,对比例1的药物也表现出了一定的润肠通便效果,但在相同剂量下实施例1-3通便效果要明显优于对比例1,其中高剂量组实施例1和对比例1在小鼠的首次排便时间、排便粪量有着十分显著的差异(P<0.001),再次验证经过发酵转化之后,排便效果得到了明显提升。
测试例2
本发明的发明人通过对便秘人群进行了本发明的包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁的原料组合物的发酵粉试服测试,实验目的一是要证明上述发酵粉润肠通便的效果;二是要证明上述发酵粉润肠通便效果优于未发酵的产品。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
采用实施例1-3和对比例1制成的润肠通便发酵粉,将发酵粉按照常规压片工艺进行生产,加入发酵粉量2%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒50℃烘干至水分10%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.1%的硬脂酸镁,混合,将总混合物压片制成片剂(0.8g/片)。
1.2实验设计
选择非器质性便秘人群,根据试服者的便秘现状随机分组,实施例组、对比例组与对照组,每组20人,并尽可能将其他会影响试验结果的干扰因素,例如性别、年龄、生活作息、日常饮食等因素考虑在内,最大程度的进行均衡性实验。
实验开始前3天,统一记录观测试服者的排便情况。试服开始后继续记录观测。试服开始后,实施例组分别服用实施例1-3的产品,每天6粒(0.8g/粒),连续服用7d,对比例组服用对比例1的产品,对照组服用安慰剂,整个试服过程进行盲试,未提前告知服用的是安慰剂或者还是实施例或者对比例的产品,从而保证实验结果的客观性。试服结束后比较各试服前后排便次数、排便状况、粪便性状等指标的变化。
1.3统计方法
1.3.1排便状况分析方法
对人群进行每日排便次数统计,同时记录有无不良反应,如恶心、腹泻、胀气、腹痛及粪便异常。对排便状况的统计根据排便困难程度(腹痛或肛门灼烧感、下坠感、不适感,是否便频但排便困难且量少)分为Ⅰ~Ⅰ级,统计积分值。
Ⅰ级(0分):排便正常
Ⅱ级(1分):仅有下坠感、不适感
Ⅲ级(2分):下坠感、不适感明显,或有便频但排便困难而量少,较少出现腹痛或肛门灼烧感
Ⅰ级(3分):经常出现腹痛或肛门灼烧感,影响排便
1.3.2粪便性状分析方法
对粪便性状的统计,根据Bristol粪便性状分类法将粪便性状分为Ⅰ~Ⅲ级。
Ⅰ级(0分):像香肠或蛇,平滑而软;像香肠,但表面有裂痕;软的团块,有明显的边缘,容易排出;
Ⅱ级(1分):香肠性状,但有团块;松散的块状,边缘粗糙,像泥浆状的粪便
Ⅲ级(2分):分离的硬团,像果核,不易排出
Ⅲ级(2分):分离的硬团,像果核,不易排出
1.3.3润肠通便有效率分析方法
对受试物样品润肠通便有效率进行统计分析,其中判断受试物有效的标准是,每2天排便至少1次,便质由干转润,排便通畅不费力,短期不复发;判断受试物无效的标准是,与试服前症状无改善,每3天排便1次,且大便干结,排便不畅且量少。
1.3.4数据分析方法
试验数据采用方差分析进行统计处理,采用SPSS软件进行数据分析。其中,P<0.05为差异显著,具有统计学意义。实验结果中,试服前后试服组自身组内比较排便次数增加,排便状况或粪便性状二项指标中一项指标积分明显下降,即可说明差异有显著性;试服组与对照组对比,排便次数、排便状况或粪便性状任一项有明显改善,差异有显著性,可判断受试物样品具有润肠通便的作用。
2.结果
2.1受试物对便秘人群
2.1.1排便次数结果
受试者试服前后每日排便次数对比情况见表3。
表3受试者试服前后每日排便次数对比
组别 | 试服前/次/d | 试服后/次/d |
对照组 | 0.49±0.18 | 0.53±0.22 |
实施例1 | 0.51±0.23 | 1.83±0.34**++## |
实施例2 | 0.53±0.24 | 1.86±0.31**++ |
实施例3 | 0.49±0.20 | 1.88±0.36**++ |
对比例1 | 0.55±0.18 | 0.82±0.25*+ |
注意:*,实验组与对照组对比,有显著差异(P<0.05);**,实验组与对照组对比,组间有极显著差异(P<0.01);+,与服用前对比,各实验组组内对比有显著差异(P<0.05);++,与服用前对比,各实验组组内对比有极显著差异(P<0.01)。#,实施例与对比例组间对比有显著差异(P<0.05);##,实施例与对比例组间对比有显著差异(P<0.01)(实施例1与对比例1相比)。
从上表可以看出,在每日排便次数上,实施例1-3无论是与对比例1组间对比,还是与组内对比,都有极显著差异(P<0.01),说明实施例1-3的产品有着显著的通便效果。
2.1.2排便状况对比
受试者试服前后排便状况、粪便性状对比情况见表4。
表4受试者试服前后排便状况、粪便性状对比
注意:**,实施例1-3与对照组对比,组间有极显著差异(P<0.01);+,各实施例试服前后对比有显著差异(P<0.05);++,各实施例试服前后对比有极显著差异(P<0.01)。##,实施例与对比例组间对比有极显著差异(P<0.01)。(实施例1与对比例1相比)。
分析上表数据可知,实施例1-3与对照组相比,排便状况改善有极显著差异性(P<0.01),组内试服前后对比排便状况,也同样具有极显著差异性(P<0.01)。
实施例1与对比例1相比,试服后有显著差异性(P<0.05),再次验证发酵粉润肠通便的效果明显优于未发酵的产品。
粪便性状相关显著性分析结果,与上述相同,不再赘述。
从上述对排便状况、粪便性状统计分析可以得知,本发明制备的发酵中药粉有着十分显著的润肠通便作用,与未发酵五仁丸粉对比,也有着显著差异。
2.1.3润肠通便有效率
各实施例和对比例产品润肠通便有效率汇总情况见表5。
表5各实施例和对比例产品通便有效率
组别 | 总例数 | 有效 | 无效 | 有效率/% |
对照组 | 20 | 4 | 16 | 20 |
实施例1 | 20 | 18 | 2 | 90 |
实施例2 | 20 | 17 | 3 | 85 |
实施例3 | 20 | 18 | 2 | 90 |
对比例1 | 20 | 6 | 14 | 30 |
在本次实验中,实施例1-3的润肠通便的有效率,高于对比例1的润肠通便的有效率,也再次验证发酵粉的润肠通便效果要明显优于未发酵的产品。另外,需要注意的是,在此次试服整个试验过程中,未出现恶心、腹泻、胀气、腹痛及粪便异常等不良现象。
本次人群试服实验证明,经过发酵转化后,原料组合物的润肠通便的效果得到了明显增强,便秘人群经过一定时间试服发酵粉后,90%以上便秘症状得到显著改善。
测试例3
传统的五仁丸部分中药组分中含有一定量的苦杏仁苷,在人体内最终代谢分解成氢氰酸和苯甲醛,其中微量的氢氰酸可以进入肺部发挥止咳平喘的作用,但过量的氢氰酸则对人体是有害的,人体内氰化物急性中毒剂量为0.5~3.5mg/kg,因此需要严格控制发酵粉中的苦杏仁苷及氢氰酸含量。
为了验证本发明采用的发酵中药技术所具备的减毒增效作用,现对利用包括火麻仁、松子仁、桃仁、杏仁、陈皮和郁李仁的原料组合物制备的发酵中药粉中苦杏仁苷含量、氢氰酸含量进行检测分析。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
取各实施例1-3和对比例1的各润肠通便粉,以及实施例2中各初始原药材粉的混合物,作为对照组样品。
1.2试验方法
1.2.1苦杏仁苷检测方法
按照《中国药典2015版》照高效液相色谱法(通则0512)测定。
1.2.1.1对照品及待测液制备
对照品溶液的制备:取苦杏仁苷对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含40μg的溶液,即得。
供试品溶液的制备:取如上各样品约0.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤,精密量取续滤液5ml,置50ml量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
1.2.1.2色谱条件
色谱条件与系统适用性试验:以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂;以乙腈-0.1%磷酸溶液(8:92)为流动相;检测波长为207nm。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7000。
1.2.1.3测定
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10~20μl,注入液相色谱仪,测定,即得。
1.2.2氢氰酸检测方法
采用气相色谱法对样品中的氢氰酸含量进行检测。
1.2.2.1试剂
(1)对照品储备液:精确称取10.00mg的氰化钠对照品放入10mL的容量瓶,用0.01mol/L的NaOH溶液定容,制得浓度为1mg/mL的NaCN对照品储备液,在0~4℃冰箱中保存。
(2)内标溶液配制:吸取7μL乙腈于10mL容量瓶中,用水定容,然后精密吸取200μL于50mL容量瓶,用水定容,得乙腈内标溶液。
(3)中药粉样品提取:称取各测试样品粉末各1g,置15mL离心管中,加入5mL水,超声提取30min后,4000r/min离心10min,移出提取液,残渣再加水5mL,超声30min,合并提取液,加入10mL容量瓶中,用水定容,即得供试样品液。
1.2.2.2气相色谱条件
顶空条件:平衡温度60℃,振摇5min,振摇速率500rpm,进样针温度为85℃,充样速度400μL/s,进样速度100μL/s,进样后氮气冲洗进样针2min。
气相条件:色谱柱为Agilent HP-PLOT Q柱(15m×0.32mm,20μm),载气为氮气,流速2.5mL/min;进样口温度为220℃,进样体积1000μL,不分流进样;色谱柱初始温度30℃,保持1.5min后,以35℃/min程序升温至190℃,保持1min;检测器温度为320℃。
1.2.2.3测定
取供试品溶液150μL加入10mL顶空瓶中,再分别加入50μL乙腈内标溶液,200μL磷酸溶液,密封,按气相条件进行进样分析,按内标法计算氢氰酸的浓度。本方法氢氰酸定量限为0.05mg/L,检测限为0.025mg/L。
2.结果与分析
2.1苦杏仁苷含量检测
各实施例和对比例样品中苦杏仁苷含量、氢氰酸含量检测结果见表6。
表6各实施例和对比例样品中苦杏仁苷含量、氢氰酸含量检测结果
苦杏仁苷含量/% | 氢氰酸含量/mg/kg | |
对照组 | 2.45±0.34 | 6.23±0.82 |
实施例1 | 0.42±0.16*** | 未检出 |
实施例2 | 0.46±0.12*** | 未检出 |
实施例3 | 0.37±0.13*** | 未检出 |
对比例1 | 1.95±0.27 | 未检出 |
注意:*,实施例组与对照组对比有显著差异(P<0.05),**,实施例组与对照组对比有极显著差异(P<0.01),***,实施例组与对照组对比有十分显著差异(P<0.001)。+++,实施例1与对比例1对比有极显著差异(P<0.001)。
从上表可以看出,与对照组相比,实施例1-3苦杏仁苷含量均有所下降,且分别具有显著差异(P<0.05)和极显著性差异(P<0.01)以及十分显著差异(P<0.001),这可能与实施例1-3制备工艺有关,首先是在步骤2保温酶解处理阶段,在此期间,依靠体系中自身的苦杏仁苷酶会分解苦杏仁苷,降低苦杏仁苷含量;其次是发酵培养阶段,微生物生长代谢可能有利于苦杏仁苷的分解转化。
与对比例1相比,实施例1均具有十分显著差异(P<0.001),经过酶解发酵转化后,体系中苦杏仁苷超过80%以上被分解转化。苦杏仁苷的分解主要是集中在酶解与发酵阶段,在保温酶解过程中,苦杏仁苷在自身苦杏仁苷酶的作用下进行分解,而在发酵过程中,苦杏仁苷可以被微生物产生β-葡萄糖苷酶分解。实验数据再次证明,微生物发酵技术对五仁丸中苦杏仁苷有明显的减毒分解作用。
对氢氰酸的检测结果表明,对照组含有氢氰酸6.23±0.82mg/kg,而在实施例1-3、对比例1中未检测到氢氰酸含量,这可能与实验组样品经过喷雾干燥处理后,氢氰酸全部挥发殆尽,未能测出。在此也可以看出,喷雾干燥工艺对本发明发酵粉减毒的重要性。
综合上述试验例可以验证,本发明提供的一种发酵粉的制备方法能够有效的减毒增效,经过中药发酵工艺,原有体系中的苦杏仁苷含量大幅降低,这样进入人体代谢时不易产生过量的氢氰酸而危害健康;同时,在发酵粉中并未检测到氢氰酸的含量,进一步保证了食品安全。
此外,本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例1-3中的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的润肠通便效果或者有效成分含量均不如实施例1-3中制备的产品。
测试例4-6采用实施例4-6和对比例2的产品,用于说明本发明提供的包括人参、黄精、枸杞子、当归、陈皮、西红花、茯苓和甘草的原料组合物的效果。
测试例4
人群试服实验
1.样品制备
分别按照总重量5重量%、15重量%称取赤藓糖醇、实施例4-6和对比例2制备的中药粉混合均匀,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度68℃,脱气相对真空度-0.025MPa,均质压力22MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,98℃,15min。
2.气血两虚辨证标准
参考《中医虚症辨证参考标准》,气血两虚证主要包括:①神疲乏力;②少气或懒言;③头晕目眩;④食欲不振;⑤面色苍白或萎黄;⑥舌质淡或舌淡胖;⑦脉虚(细、软、弱)。具备四项即可(其中,舌、脉象必具)。
3.试服人员纳入标准
①符合单纯性肥胖症诊断标准;②符合气血两虚证诊断标准;③年龄40-70岁;④近3个月内未进行相关治疗。
4.试服人群排除标准
①身体患有重大疾病者;②有孕妇、妊娠期或哺乳期妇女。
5.试服人群剔除标准
①符合症状标准但因各种原因未完成试服者,包括终止和退出试服;②试服期间使用其他药物影响实验结果判定者;
6.试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组20人,男女各10人,年龄35~70岁,并对该两组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该各组在年龄分布上具有可比性。
7.试服方法
服用方法为每日两次,每次2瓶,实验组服用实施例样品,对照组服用对比例样品,连续服用并观察14天,填写每日身体变化。服用期间停止一切药物,并要求作息规律,饮食正常。
8.效果标准
痊愈:症状消失,面部红润,精力充沛;
显效:症状明显缓解,精神状态良好;
有效:症状有所缓解,精神状态改善;
无效:临床症状无明显变化或有所加重。
9.试服结果与分析,结果如表7。
表7受试者总效果统计表
组别 | 治愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效率 |
实施例4 | 13 | 3 | 2 | 2 | 90.0% |
实施例5 | 11 | 5 | 3 | 1 | 95.0% |
实施例6 | 11 | 4 | 3 | 2 | 90.0% |
对比例2 | 3 | 2 | 4 | 11 | 45.0% |
对全体受试者试服有效率进行分析可以看出,实施例4-6试服效果较好,有效率均在85%以上。结果表明本发明提供的发酵粉具有显著的补血益气功效,能够明显改善试服人群气血两虚症状,包括面色苍白萎黄、气短懒言、舌淡脉细、神疲乏力、食欲不振、头晕目眩等。另外,对比例2也具有一定的效果,但整体有效率明显降低。
测试例5
动物实验
本测试例旨在考察本发明提供的发酵粉对气血两虚型小鼠造血功能的影响,主要从发酵粉对小鼠外周血红细胞数和血红蛋白浓度影响、对小鼠非特异性免疫功能影响、对小鼠免疫器官的影响三个方面进行实验。
1材料
1.1样品
分别按照总重量4重量%、6重量%、90重量%称取赤藓糖醇、红葡萄果粉、实施例4-6或对比例2的中药粉,并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(28g/袋)。
1.2实验动物
昆明种小鼠,体重18-22克,雌雄各半。
2实验方法与结果
2.1对小鼠外周血红细胞数(RBC)和血红蛋白(Hb)浓度影响
将小鼠随机分组:正常组、模型组、实施例4发酵粉低剂量组、中剂量、高剂量,其余实施例和对比例均设置高剂量组,每组小鼠10只。其中模型对照组小鼠建模方法如下:从小鼠眼眶取血,按0.4mL/10g体重精确控制取血量,并用棉球及时止血,每日1次,连续放血3次,并在第4d从每只小鼠尾静脉取血30μL,检测RBC和Hb浓度。失血后如果小鼠外周血RBC减少,Hb含量降低,在外观上小鼠出现毛耸无华,皮色萎黄苍白,食欲不振,活动减少等一系列血虚症状,表明血虚小鼠建模成功。
另外,低、中、高剂量实验组组分别按中药粉0.25g、0.5g、1.0g/10g体重灌胃,正常组、模型对照组灌胃等量的生理盐水,每日1次,连续10d。在最后一次给药1h后,每只小鼠尾静脉取血30μL,检测小鼠外周血RBC数和Hb浓度,结果如表8所示。
表8各实验组小鼠外周RBC数和Hb浓度(n=10)
组别 | RBC/(×1012/L) | Hb/(g/L) |
实施例4(低剂量组) | 10.48±0.55* | 98.80±8.89* |
实施例4(中剂量组) | 10.97±0.63** | 105.03±8.75** |
实施例4(高剂量组) | 11.30±0.58*** | 111.33±9.17*** |
实施例5 | 11.42±0.61*** | 112.08±9.32*** |
实施例6 | 11.36±0.55*** | 112.42±8.85*** |
对比例2 | 10.32±0.48* | 98.46±8.08* |
正常组 | 12.18±0.49*** | 120.63±11.23*** |
模型组 | 9.58±0.46 | 86.03±9.39 |
注:*,与模型对照组相比,P<0.05;**,与模型对照组相比,P<0.01;***,与模型对照组相比,P<0.001。
与模型组对比,正常组小鼠外周血红细胞和血红蛋白数有十分显著的差异(P<0.001),同时模型组小鼠出现了毛耸无华,皮色萎黄苍白,食欲不振,活动减少等一系列血虚症状,表明血虚小鼠建模成功。
以实施例4为例,发酵粉在给药10d时,与模型组相比,发酵粉低剂量组对失血性血虚小鼠红细胞和血红蛋白数有显著的提高(P<0.05),发酵粉高剂量组有极显著的提高(P<0.01),实施例4高剂量组有十分显著的提高(P<0.001)。因此,发酵粉具有改善血虚小鼠的血液情况,具有很好的补血益气的作用。
2.2对小鼠非特异性免疫功能、免疫器官的影响
将小鼠随机分组:正常对照组、实施例4发酵粉低剂量组、中剂量、高剂量,其余实施例和对比例均设置高剂量组,每组小鼠10只。低、中、高剂量实验组组分别按发酵粉0.25g、0.5g、1.0g/10g体重灌胃,正常对照组灌胃等量的生理盐水,每日1次,连续10d。
各组小鼠在末次给药前称取体质量,给药1h后,按0.1mL/10g经尾静脉注射经稀释后的墨汁。分别于注入墨汁后2min和10min从眼眶后静脉丛取血20μL加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中,摇匀以Na2CO3溶液为空白对照,测定光密度值。对小鼠采用颈椎脱位法处死,取胸腺、脾脏称湿重,计算胸腺指数、脾指数、网状内皮系统的吞噬指数(K),结果如表9所示。
表9各实验组小鼠胸腺指数、脾指数、吞噬系数结果(n=10)
组别 | 胸腺指数/(mg/10g) | 脾指数/(mg/10g) | 吞噬指数(×10-2) |
实施例4(低剂量组) | 32.58±3.16* | 69.95±5.47* | 2.32±0.17* |
实施例4(中剂量组) | 34.77±3.39** | 72.25±4.72** | 2.56±0.20* |
实施例4(高剂量组) | 37.83±3.58** | 76.02±5.14*** | 2.73±0.23** |
实施例5 | 37.45±3.80** | 76.33±4.87*** | 2.70±0.21** |
实施例6 | 37.76±3.24** | 76.57±5.23*** | 2.63±0.25** |
对比例2 | 31.16±3.08* | 69.22±4.40* | 2.18±0.13* |
正常组 | 26.23±2.88 | 62.55±4.91 | 1.68±0.14 |
注:*,与正常对照组相比,P<0.05;**,与正常对照组相比,P<0.01;***,与正常对照组相比,P<0.001。
以实施例4为例,与正常对照组相比,发酵粉低剂量组、中剂量组能使吞噬系数显著增加(P<0.05),发酵粉高剂量组能使吞噬系数极显著增加(P<0.01)。
与正常对照组相比,发酵粉低剂量组能使胸腺指数显著提高(P<0.05),发酵粉中剂量组、高剂量组能使胸腺指数极显著提高(P<0.01)。
与正常对照组相比,发酵粉低剂量组能使脾指数显著提高(P<0.05),发酵粉中剂量组能使脾指数极显著提高(P<0.01),高剂量组能使脾指数十分显著提高(P<0.001)。
实施例4与对比例2相比可以看出,采用本发明提供的发酵粉对于各指标的改善效果更优。
通过上述试验例来看,本发明提供的发酵粉能够显著提高小鼠非特异性免疫功能,同时能够显著提高胸腺指数、脾指数,改善小鼠的免疫器官,因此有助于提高机体免疫力。
上述人群试服试验和动物实验表明,本发明的发酵粉能明显改善气血两虚症候,增加血液中Hb、RBC含量,提高胸腺指数、脾指数,增强非特异性免疫功能,改善气血两虚型心肌供血状况。
测试例6
化学成分测定
为了验证本发明采用的微生物发酵技术能够提高中药溶出度、增强中药药效,对中药粉发酵前后体系中的中药成分的溶出率、人参皂苷及稀有皂苷含量进行测定。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
向实施例4-6和对比例2各发酵粉中加入1.5重量%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒60℃烘干至水分6%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.6%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(2.0g/片)。
1.1.2对照品及待测液制备
人参皂苷对照品溶液的制备:对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rg1对照品、人参皂苷Re对照品、人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg3对照品,加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液,摇匀,即得。
人参皂苷待测品溶液的制备:取各样品粉末约L.0g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷加热回流3小时,弃去三氯甲烷液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入100mL锥形瓶中,精密加水饱和正丁醇50mL,密塞,放置过夜,超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟,过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液25mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得人参皂苷待测液。
1.2检测方法
1.2.1人参皂苷液相色谱检测方法
采用C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按下表10中的规定进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min,柱温:35℃,检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rg1峰计算应不低于6000。
表10梯度洗脱程序
时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
0~35 | 19 | 81 |
35~55 | 19→29 | 81→71 |
55~70 | 29 | 71 |
70~100 | 29→40 | 71→60 |
分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10~20μL,注入液相色谱仪,测定。
2结果与分析
2.1中药溶出度对比
对各样品在各自步骤(3)得到的提取清液进行取样,检测溶出率,结果如表11所示。
表11样品在提取步骤中溶出度的对比
中药粉质量份 | 纯化水质量份 | 中药质量分数 | 固形物含量 | |
实施例4 | 620 | 3200 | 16.2% | 12.2% |
实施例5 | 655 | 3500 | 15.8% | 11.8% |
实施例6 | 730 | 3800 | 16.1% | 12.1% |
对比例2 | 620 | 3200 | 16.2% | 5.3% |
以实施例4和对比例2为例,在制备过程中的组分配比完全一致,中药粉在体系中的质量分数为16.2%,但实施例4中提取液中固形物含量是对比例2提取液的两倍多,则实施例4的溶出度也是对比例2的两倍多(溶出度=固形物含量/中药质量分数)说明中药粉的溶出率大大提高,有利于中药材有效物质的充分利用,节约药用资源。
2.2人参皂苷含量对比
人参的有效成分为天然型的人参皂苷,这类化合物通常在肠道内难以吸收利用,仅有很小一部分皂苷能够以原型的形式进入血液,因此天然型人参皂苷生物利用度极低,只有将这些天然皂苷转化为稀有皂苷,才能充分发挥人参的生物活性,各样品的检测结果如表12所示。
表12人参皂苷成分含量
Rb1/重量% | Rg1/重量% | Re/重量% | Rg3/重量% | |
实施例4 | 0.52±0.03 | 0.26±0.02 | 0.32±0.04 | 1.22±0.10 |
实施例5 | 0.57±0.04 | 0.30±0.03 | 0.38±0.02 | 1.30±0.11 |
实施例6 | 0.55±0.06 | 0.23±0.03 | 0.35±0.05 | 1.27±0.08 |
对比例2 | 1.33±0.09 | 0.80±0.04 | 0.72±0.07 | 0.05±0.02 |
可以发现,相对于对比例2,实施例1中普通型人参皂苷Rb1、Rg1、Re均有较高幅度的降低,而稀有型人参皂苷Rg3有显著的增加,从此可以看出,经过微生物的生物转化后,普通型人参皂苷转化为了稀有皂苷,更有利于人体吸收利用。可以得出,本发明采用的微生物发酵转化技术有利于提高中药材有效物质的溶出度,提高中药材的利用率,同时还可以将人参中天然人参皂苷转化为稀有皂苷,更有利于人参皂苷在肠道内的消化吸收,更好更快的进入血液,发挥药效。
因此,上述发酵粉具有显著的补血益气作用。同时,本发明提供的发酵粉的制备方法能够提升体系中药材有效物质的溶出度,同时又可以将天然人参皂苷转化为生物活性更高的稀有皂苷,提高了药效,补血益气效果更强。
此外,本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例4-6中的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的补血益气效果或者有效成分含量均不如实施例4-6中制备的产品。
测试例7-9采用实施例7-9和对比例3的产品,用于说明本发明提供的包括黄精、覆盆子、丁香、肉桂、决明子、山药、薏苡仁和茯苓的原料组合物的效果。
测试例7-9
测试例7
人群试服实验
样品制备
分别按照总重量0.4重量%、18重量%称取果胶、实施例7-9和对比例3制备的粉末混合均匀,加入78℃热水化胶,搅拌均匀后分别加入4重量%赤藓糖醇,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度63℃,脱气相对真空度-0.02MPa,均质压力20MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,92℃,10min。
试服人群筛选标准
根据中医辨证标准进行辨别。肾虚人群主要症状包括肾气不足,阳痿,早泄,遗精,主要表现为性功能降低,阳痿,遗精、滑精,尿频、尿等待、小便清长等。凡具有上述症状者,可诊断为肾阴阳虚症。
试服人群排除标准
①不符合本症状标准者;②手术切除或移植肝脏者;③有严重疾病患者或威胁其生存的重大疾病;④近期服用同类药物或激素者。
试服人群剔除标准
①符合症状标准但因各种原因未完成试服者,包括终止和退出试服;②试服期间使用其他药物影响实验结果判定者;试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组20人,均为男性志愿者,年龄35~65岁,并对各组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明各组在年龄分布上具有可比性。
试服方法
服用方法为每日两次,每次2瓶,实验组服用实施例制备的各样品,对照组服用对比例制备的各样品,连续服用并观察30天,填写每日身体变化。服用期间停止一切促进性激素相关的药物,并戒用烟酒和刺激辛辣食品。
效果观测
效果观测指标包括中医临床表现,具体有腰膝是否酸软、性欲是否底下、有无遗精滑精、阳痿或早泄有无改善,小便是否正常、肢体是否畏寒、是否仍神疲乏力等。
效果标准
参考中医药行业标准《中医病证诊断疗效标准》中的肾虚疗效评判标准:
痊愈:症状体征消失,停用后不复发;
显效:症状明显缓解,伴随症状基本消失或大部分减轻;
有效:症状减轻,但遇影响因素会加重;
无效:症状无改善或有加重趋向。
试服结果与分析,结果如表13和表14所示。
表13受试者试服前后中医临症表现统计表
从上表可以看出,实施例7-9的产品试服效果明显较好,对改善阳痿、早泄、腰膝酸软、神疲乏力有明显改善效果,且试服效果也明显优于对比例3的产品,由此可见,肾气丸具有显著的补肾助阳效果,并且优于未发酵组。
表14受试者总效果统计表
组别 | 治愈 | 显效 | 有效 | 无效 | 总有效率 |
实施例7 | 10 | 5 | 3 | 2 | 90% |
实施例8 | 12 | 4 | 3 | 1 | 95% |
实施例9 | 10 | 6 | 2 | 2 | 90% |
对比例3 | 4 | 3 | 2 | 11 | 45% |
对全体受试者有效率进行分析可以看出,实施例7、8、9试服组总有效率高达90%以上,再次验证肾气丸发酵粉具有显著的补肾助阳功效。另外,对比例3也具有一定的补肾助阳效果,但明显不如实施例7、8、9有效率高。
测试例8
为考察肾气丸发酵粉补肾助阳的作用,进行了动物实验,实验分为三部分,发酵粉对肾虚大鼠性机能影响、发酵粉对肾虚大鼠耐力影响、发酵粉对肾虚大鼠血清激素水平影响。
(二)动物实验
1材料
1.1样品
分别按照总重量4重量%、8重量%、88重量%称取果糖、草莓果粉、如上实施例和对比例的各中药粉,并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(30g/袋)。
1.2实验动物
Wist系大白鼠,体重180-220克,雄性。
2实验方法与结果
2.1对大鼠性机能的影响
选用体重在180~220g的雄性大鼠,将雄性大鼠分组,分别为正常对照组(生理盐水)、模型对照组(氢化可的松)、阳性药物组(甲基睾酮片,0.3g/kg)、实施例9肾气丸发酵粉低剂量组(2.5g/kg)、中剂量(5.0g/kg)、高剂量(10.0g/kg),其余实施例和对比例均设置高剂量组(10.0g/kg),每组15只。除正常组注射生理盐水外,其他各组大鼠每日按25mg/kg皮下注射氢化可的松,连续5d,建立肾虚大鼠模型,随后15d内给予氢化可的松,实施例组和阳性药物组同时给予对应的治疗药物,模型组不给予治疗药物:实验组肾气丸发酵粉低剂量、中剂量、高剂量;阳性药物。将各组药物以3‰的CMC水溶液配制为10mL/kg的给药剂量,灌胃给药,2次/d,连续灌胃15d。另取体重180-220g的雌性小鼠单独饲养。给药结束后,将雄性、雌性大鼠各一只分别同槽,观察并统计各组15分钟内出现性交行为的情况,性交行为以骑跨动作的出现为指标,同一大鼠出现性交行为一次以上者以一次计,结果如表15所示。
表15各组大鼠性交行为出现率对比
组别 | 性交发生率 |
实施例7 | 14/15 |
实施例8 | 13/15 |
实施例9(低剂量组) | 5/15 |
实施例9(中剂量组) | 10/15 |
实施例9(高剂量组) | 13/15 |
对比例3 | 3/15 |
正常组 | 15/15 |
模型组 | 0/15 |
阳性药物组 | 10/15 |
从上表可以看出,正常组各大鼠均出现性交行为,而模型对照组均未出现性交行为,表明建模成功。以实施例9为例,肾气丸发酵粉低剂量组对肾虚后性交行为的发生率有一定的改善,而中、高剂量组对肾虚后性交行为的发生率有显著改善作用,中剂量组效果与甲基睾酮片药物组相当,由此可见,肾气丸发酵粉对肾虚导致的性机能有明显改善作用。
2.2对大鼠耐力考察实验与结果
选用体重在180-220g的雄性大鼠,并在实验开始前进行1~2次游泳训练。将雄性大鼠分组,分别为正常对照组(生理盐水)、模型对照组(氢化可的松)、阳性药物组(甲基睾酮片,0.3g/kg)、实施例9肾气丸发酵粉低剂量组(2.5g/kg)、中剂量(5.0g/kg)、高剂量(10.0g/kg),其余实施例和对比例均设置高剂量组(10.0g/kg),每组10只。除正常组注射生理盐水外,其他各组大鼠每日按25mg/kg皮下注射氢化可的松,连续5d,建立肾虚大鼠模型,随后15d内给予氢化可的松,实施例组和阳性药物组同时给予对应的治疗药物,模型对照组不给予治疗药物:实验组肾气丸发酵粉低剂量、中剂量、高剂量、阳性药物。将各组药物以3‰的CMC水溶液配制为10mL/kg的给药剂量,灌胃给药,2次/d,连续给药15d。
分别在接受连续给药的第7天、第15天进行负重游泳,放入温度20-25℃,深度为40cm的恒温水槽中,尾部上三分之一处负其生物质量10%的铅线,记录大鼠负重游泳力竭时间,力竭标准为大鼠全部身体沉入水下5秒不能浮出水面,结果如表16所示。
表16各组大鼠强迫游泳时间统计表(n=10)
组别 | 第7天/s | 第15天/s |
实施例7 | 267±22***+ | 312±25***++ |
实施例8 | 270±24***+ | 308±23***++ |
实施例9(低剂量组) | 215±13* | 243±21** |
实施例9(中剂量组) | 240±25** | 267±23***+ |
实施例9(高剂量组) | 262±19***+ | 303±22***++ |
对比例3 | 221±16* | 241±20** |
正常组 | 338±26*** | 321±24*** |
模型组 | 187±18 | 174±22 |
阳性药物组 | 229±20* | 257±18** |
注:*P<0.05,与模型组对比,有显著差异;**P<0.01,与模型组对比,有极显著差异;***P<0.001,与模型组对比,有十分显著差异。+P<0.05,与阳性药物组对比,有显著差异;++P<0.01,与阳性药物组对比,有极显著差异。
与模型组对比,以实施例9为例,无论是低剂量组、中剂量组还是高剂量组,灌胃7天后大鼠强迫游泳时间均有明显延长,说明肾气丸发酵粉能明显改善肾虚大鼠耐力,能明显改善肾虚大鼠的身体机能。灌胃15d后,肾气丸发酵粉能进一步改善肾虚大鼠的身体机能,说明长期服用肾气丸发酵粉能更好的改善虚大鼠的身体机能。
与阳性药物组对比,以实施例9为例,发酵粉高剂量组给药7天,就有显著差异(P<0.05),发酵粉高剂量组给药15天,则有极显著差异(P<0.01),表明延长给药时间能进一步改善大鼠身体机能,而且改善效果要明显优于阳性药物组。
2.3对血清激素水平检测与分析
在第15d灌胃给药结束后,禁食12h。眼球取血,约4.0mL,采用SN-69全自动双探头放射免疫γ计数仪,按试剂盒操作说明检测大鼠血清E2、T含量水平,结果如表17所示。
表17各组大鼠血清激素水平检测表(n=10)
组别 | 雌二醇E2(pg/mL) | 睾酮T(pg/mL) |
实施例7 | 0.78±0.27***++ | 225.47±23.17***+ |
实施例8 | 0.75±0.24***++ | 226.75±26.40***+ |
实施例9(低剂量组) | 1.31±0.21* | 149.17±25.76* |
实施例9(中剂量组) | 1.15±0.19**+ | 172.33±22.13** |
实施例9(高剂量组) | 0.73±0.22***++ | 223.33±25.29***+ |
对比例3 | 1.53±0.21* | 144.40±25.52* |
正常组 | 0.65±0.17*** | 239.17±27.69*** |
模型组 | 1.62±0.14 | 115.17±21.96 |
阳性药物组 | 1.40±0.13* | 181.83±23.73*** |
注:*P<0.05,与模型组对比,有显著差异;**P<0.01,与模型组对比,有极显著差异;***P<0.001,与模型组对比,有十分显著差异;+P<0.05,与阳性药物组对比,有显著差异;++P<0.01,与阳性药物组对比,有极显著差异。
对比各组大鼠血清中睾酮T水平,与模型组对比,正常组、阳性药物组都有十分显著差异(P<0.001),表明建模成功的同时,阳性药物对提高睾酮水平有十分明显的促进作用。以实施例9为例,发酵粉低剂量组有显著差异(P<0.05),中剂量组有极显著差异(P<0.01),高剂量组有十分显著差异(P<0.001),表明发酵粉对改善肾虚大鼠睾酮水平有十分明显的改善效果。与阳性药物组对比,发酵粉高剂量组有显著差异(P<0.05),表明在一定范围内,高剂量发酵粉对提高血清睾酮水平的效果优于药物甲基睾酮片。
以实施例9为例,对比各组大鼠血清雌二醇E2水平,与模型组相比,发酵粉低剂量组有显著差异(P<0.05),中剂量组有极显著差异(P<0.01),高剂量组有十分显著差异(P<0.001),表明发酵粉对降低肾虚大鼠雌二醇水平有十分明显的作用。与阳性药物组对比,发酵粉中剂量组有显著差异(P<0.05),发酵粉高剂量组有极显著差异(P<0.01),表明在一定范围内,发酵粉中、高剂量组对降低肾虚大鼠血清雌二醇E2水平的作用优于药物甲基睾酮片。
3结论
肾虚动物往往会表现出一些未老先衰的症状,如性能力减弱、精神萎靡、反应迟钝、耐力下降等。通过上述各组实验可以得出,肾气丸发酵粉对改善肾虚大鼠性机能、体力、血清激素水平都具有显著效果。另一方面,随着给药剂量及给药时间的延长,补肾助阳的效果更加显著。本发明提供的发酵粉可调节机体激素水平,通过逆转抑制性激素雌二醇的水平,并刺激提升睾酮激素的水平,综合改善肾虚状态。
测试例9
化学成分测定
大鼠口服肉桂醛的LD50为2225mg/kg,口服肉桂酸的LD50为3570mg/kg。由此可见,肉桂醛的毒性要明显强于肉桂酸。另一方面,决明子中含有的结合性蒽醌对肠道的泄下作用较为峻烈,对肠道刺激要高于游离性蒽醌。游离性蒽醌化合物主要包括大黄酚、橙黄决明素、大黄素、大黄素甲醚、芦荟大黄素等,结合性蒽醌则是游离性蒽醌与糖苷的结合物。
为了验证本发明采用微生物发酵技术减毒增效的效果,对肾气丸中药粉发酵前后体系中的肉桂醛、肉桂酸、游离性蒽醌(主要是大黄酚、橙黄决明素)含量进行测定。
1.材料与方法
1.1材料
1.1.1样品
向实施例和对比例的各发酵粉中加入1.5重量%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒55℃烘干至水分10%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.2%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(1.0g/片)。
1.1.2待测液及对照品制备
肉桂醛/肉桂酸对照品溶液的制备:取肉桂醛、肉桂酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
肉桂醛/肉桂酸待测品溶液的制备:取待测样品粉末(样品M、样品N)约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率350W,频率35kHz)10分钟,放置过夜,同法超声处理一次,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液1ml,置25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
橙黄决明素/大黄酚对照品溶液的制备:取大黄酚对照品、橙黄决明素对照品适量,精密称定,加无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液制成每1ml含大黄酚30μg、橙黄决明素20μg的混合溶液,即得。
橙黄决明素/大黄酚待测品溶液的制备:取待测样品M、样品N约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇50ml,称定重量,加热回流2小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25ml,蒸干,加稀盐酸30ml置水浴中加热水解1小时,立即冷却,用三氯甲烷振摇提取4次,每次30ml,合并三氯甲烷液,回收溶剂至干,残渣用无水乙醇-乙酸乙酯(2:1)混合溶液使溶解,转移至25ml量瓶中,并稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
1.2方法
1.2.1肉桂醛、肉桂酸色谱检测方法
肉桂醛、肉桂酸检测采用高效液相法检测。色谱条件:C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相A:0.1%磷酸;流动相B:乙腈。
洗脱程序:0~3min,36%乙腈;3~9min,36%~46%乙腈;9~11min,46%~36%乙腈;检测波长:284nm;柱温:25℃;体积流量:1.0ml/min。在上述条件下,肉桂醛与肉桂酸得到了较好的分离,相邻峰间分离度均大于1.5。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
1.2.2游离性蒽醌(大黄酚、橙黄决明素)色谱检测方法
以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,按下表18中的规定进行梯度洗脱;检测波长:284nm;柱温:25℃;体积流量:1.0ml/min。各峰之间的分离度大于1.5,理论板数按橙黄决明素峰计算应不低于3000。
表18梯度洗脱程序
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~15 | 40 | 60 |
15~30 | 40→90 | 60→10 |
30~40 | 90 | 10 |
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
2结果与分析,结果如表19所示。
表19样品中各指标行成分含量(mg/g)
组别 | 肉桂醛 | 肉桂酸 | 大黄酚 | 橙黄决明素 |
实施例7 | 1.16±0.12 | 3.65±0.26 | 0.87±0.06 | 0.47±0.02 |
实施例8 | 1.27±0.15 | 3.32±0.24 | 0.82±0.09 | 0.48±0.04 |
实施例9 | 1.13±0.17 | 3.29±0.28 | 0.85±0.05 | 0.45±0.04 |
对比例3 | 6.23±0.53 | 0.27±0.06 | 0.43±0.03 | 0.15±0.02 |
经过液相色谱检测分析上述指标可以明显看出,实施例7、8、9肉桂醛含量明显降低,肉桂酸含量大幅提高,但肉桂醛减少量并未全部转化为肉桂酸,可能是在制备过程中,由于肉桂醛自身的挥发性而损失,也有可能是转化为其他的物质。经过三段发酵后,肉桂醛含量只有对比例的20%左右,而肉桂酸的含量则提高了10倍以上。由此,不但降低了肉桂醛的毒性,更有利于肉桂活性物质在人体内的分解代谢。
再来分析游离性蒽醌含量,实施例7、8、9大黄酚、橙黄决明素含量均有大幅提高,与对比例3相比,大黄酚含量提高了1倍以上,橙黄决明素含量提高了2倍左右,游离性蒽醌含量的增加必然是通过结合性蒽醌的分解转化而来。由此,不但提高了决明子的药理作用,更降低了结合性蒽醌对肠道的不良刺激。
此外,本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例7-9中的乳杆菌或芽孢杆菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的补肾助阳效果或者有效成分含量均不如实施例7-9中制备的产品。
测试例10-11采用实施例10-12和对比例4的产品,用于说明本发明提供的包括陈皮、炒黄芥子、生姜、茯苓、甘草和乌梅的原料组合物的效果。
测试例10
人群试服实验
为了验证本发明发酵粉的改善痰湿型肥胖的效果,现以下述人群试服实验为例进行说明。
1.样品制备
口服液的制备:分别按照总重量0.01%、30%称取黄原胶、如上各实施例和对比例的发酵粉混合均匀,加入85℃热水化胶,搅拌均匀后加入3%结晶果糖,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度62℃,脱气相对真空度-0.025MPa,均质压力22MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,93℃,15min。
2.诊断标准
首先根据中医辨证标准进行辨别痰湿体质人群。痰湿体质常见表现主要有体型肥胖、腹部肥满松软。面部皮肤油脂较多,面色淡黄而暗,身体易困倦,食欲不振,多汗且黏,大便不实,小便不利,胸闷,痰多,舌体胖大,舌苔白腻,口黏腻或甜,脉滑。
其次根据体重指数进行肥胖人群筛选,体重指数(Body Mass Index,BMI)也称为体质指数,是世界公认的一种评定肥胖程度的分级方法,目前世界卫生组织也以BMI来对肥胖或超重进行定义。其计算公式如下:体重指数(BMI)=体重(kg)/[身高(m)]2。
《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》中也提出判断成人超重和肥胖程度的BMI界限值,以及相关腰围数据。其中,BMI<18.5,体重过低,18.5≤BMI<24,体重正常;24.0≤BMI<28,超重;BMI≥28,肥胖。另外,男性腰围大于90厘米,女性大于85厘米,同样属于腹部肥胖。
3.试服人员纳入标准:
①符合痰湿诊断标准;②年龄25-60岁;③近3个月内未进行相关治疗。
4.试服人群排除标准
②有孕妇、妊娠期或哺乳期妇女;②合并高血压、糖尿病或其他代谢性疾病者;③伴有心、肝、肺、肾、免疫系统等严重功能障碍者。
5.试服人群剔除标准
①符合症状标准但因各种原因未完成试服者,包括终止和退出试服;
②试服期间使用其他药物影响实验结果判定者。
6.试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组30人,男女各15人,年龄25~60岁,平均BMI为29.56±1.32,并对该两组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该两组在年龄分布上具有可比性。
7.试服方法
服用方法为每日2次,每次2瓶,实施例组分别服用实施例产品,对比例组分别服用对比例产品,连续服用并观察30天,填写每日身体变化。服用期间停止一切药物,并戒用烟酒和刺激辛辣食品。
8.效果观测
效果观测指标主要包括服用前后人群的体重以及身高,并对比试服前后BMI变化,同时记录人群痰湿症状的改善情况。
9.效果标准
参考《中医内科病证诊断疗效标准》和《中医诊断学》,制定痰湿症状评分表以及效果判定标准,痰湿症状积分标准见表20,效果判定标准见表21。
表20痰湿症状积分表
表21效果判定标准
效果 | 痰湿症状积分变化 |
痊愈 | 服用前后积分减少80%以上 |
显效 | 服用前后积分减少60%以上 |
有效 | 服用前后积分减少30%以上 |
无效 | 服用前后积分减少小于30% |
10.试服结果与分析
受试者试服前后体重、BMI指标对比情况见表22。
表22受试者试服前后体重、BMI指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05;**,与服用前对比,P<0.01;#,与对比例对比,P<0.05。(实施例10与对比例4相比)。
从上表可以看出,服用实施例10-12产品前后,受试者体重、BMI指标均有极显著差异(P<0.01),表明实施例10-12产品对痰湿肥胖人群具有明显的减肥作用。服用对比例4产品前后,体重、BMI指标有显著差异(P<0.05),表明对比例4产品也具有一定的减肥效果。结果表明,本发明提供发酵的产品对痰湿肥胖人群的减肥作用要优于未发酵的产品。
测试例11化学成分测定
橙皮苷是陈皮的重要成分,然而由于橙皮苷水溶性较差,同时由于受胃酸环境易水解而导致作用不稳定,进入人体后生物利用度较低。而经过微生物发酵转化后,橙皮苷在酶的作用下转化为其苷元橙皮素,水溶性更好,且不易水解或降解,从而性质更为稳定,生物利用度更高。
黄芥子中的成分异硫氰酸丙烯酯具有一定的刺激性,本发明采用喷雾干燥技术,有利于刺激性成分的挥发,减少黄芥子油对肠道及胃黏膜的刺激,降低二陈汤发酵粉组合物的刺激性。
为了验证本发明采用微生物发酵技术减毒增效的效果,对二陈汤发酵前后体系中的橙皮苷、橙皮素、异硫氰酸丙烯酯含量进行测定。
1.材料与方法
材料
样品
采用上述实施例和对比例的所述的改善痰湿型肥胖发酵粉,分别按照总重量2%、8%、90%称取结晶果糖、蔓越莓果粉、发酵粉,并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(40g/袋)。
1.1.2橙皮苷、橙皮素对照品及待测液制备
橙皮苷、橙皮素对照品溶液的制备:取橙皮苷、橙皮素对照品适量,精密称定,加甲醇制成0.4mg/mL标准品溶液。
橙皮苷、橙皮素待测品溶液的制备:取本品粗粉约1g,精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(60~90℃)80mL,加热回流2~3小时,弃去石油醚,药渣挥干,加甲醇80mL,再加热回流至提取液无色,放冷,滤过,滤液置100mL量瓶中,用少量甲醇分数次洗涤容器,洗液滤入同一量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1.1.3异硫氰酸丙烯酯制备
按照《中国药典2015版》第四部挥发油检测方法,提取出供试样品中的挥发油,备用。
1.2检测方法
1.2.1异硫氰酸丙烯酯气相质谱(GC-MS)检测方法
采用GC-MS进行异硫氰酸丙烯酯含量检测。质谱条件:电子轰击源EI,电子能量1812V。进样口温度250℃,接口温度280℃;载气为氦气,流速1.0mL/min;柱前压50kPa;程序升温:初始60℃,保持5min,5℃/min升至140℃,保持20min,10℃/min升至250℃,保持1min;分流比200:1;进样量0.6μL。
按上述条件得到总离子流图,利用面积归一化法确定各组分在挥发油中的相对含量。每个组分的质谱图经质谱数据系统检索、人工谱图解析进行分子结构鉴定。
1.2.3橙皮苷、橙皮素液相色谱检测方法
采用C18色谱柱,以甲醇-醋酸-水(35:4:61)为流动相,检测波长为283nm。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各5μL,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
1结果与分析
1.1中药溶出度对比
对各实施例和对比例的样品得到的提取清液进行取样,检测二陈汤经过两种不同工艺提取后中药物质的溶出率,结果如表23所示。
表23各实施例和对比例样品在提取步骤中溶出度的对比
组别 | 中药粉质量 | 纯化水 | 中药粉质量分数 | 固形物含量 |
实施例10 | 580 | 2600 | 18.2% | 15.3% |
实施例11 | 690 | 3200 | 17.7% | 14.7% |
实施例12 | 570 | 3000 | 16.0% | 13.8% |
对比例4 | 580 | 2600 | 18.2% | 5.1% |
从上表可以看出,实施例10与对比例4在制备过程中的组分配比完全一致,中药粉质量分数均为18.2%,采用对比例4的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量仅有4.0%,;而采用实施例10的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量为16.0%,是对比例3提取效率的3倍有余,则溶出度也是对比例3的倍多。因此采用本专利的工艺,中药材成分溶出率大大提高,有利于中药材有效物质的充分利用,节约药用资源。
2.2异硫氰酸丙烯酯、橙皮苷、橙皮素含量对比
各实施例和对比例样品中的异硫氰酸丙烯酯、橙皮苷、橙皮素含量对比情况见表24。
表24各实施例和对比例样品中各指标行成分含量(mg/g)
异硫氰酸丙烯酯 | 橙皮苷 | 橙皮素 | |
实施例10 | 0.23±0.13 | 12.06±1.42 | 32.45±1.64 |
实施例11 | 0.18±0.16 | 12.87±1.29 | 32.39±1.55 |
实施例12 | 0.21±0.14 | 12.48±1.47 | 32.87±1.60 |
对比例4 | 1.82±0.13 | 82.24±2.86 | 1.66±0.57 |
实施例10与对比例4对比,经过发酵后异硫氰酸丙烯酯含量降低了87.4%,也可以降低二陈汤发酵粉对人体胃肠道的刺激。实施例11-12与对比例1相比,经过发酵后异硫氰酸丙烯酯含量也有明显降低。
再来分析二陈汤发酵前后活性成分橙皮苷、橙皮素含量的变化。实施例10与对比例4对比,经过发酵后橙皮苷含量分别降低了85.3%,转化为了生物活性更高的橙皮素,橙皮素含量提高了18.5倍之多。表明发酵工艺有利于将橙皮苷转化为生物活性更高的橙皮素,可以看出中药发酵技术在提高药效方面的明显优势。
综合上述两个试验例可以验证,本发明提供的一种二陈汤发酵粉具有显著的改善痰湿症状。同时,本发明还提供一种改善痰湿型肥胖二陈汤发酵粉的制备方法,其制备方法能够降低体系中刺激性成分异硫氰酸丙烯酯含量,同时还能将体系中的橙皮苷转化为生物活性更强的橙皮素,进一步提升二陈汤发酵粉改善痰湿型肥胖的效果。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例10-12中的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的改善痰湿肥胖的效果或者有效成分含量均不如实施例10-12中制备的产品。
测试例12-14采用本发明实施例13-15和对比例5的产品,用于说明本发明提供的包括当归、阿胶、枸杞子、桃仁、红花和姜黄的原料组合物的效果。
测试例12
人群试服实验--美白祛斑
样品制备
分别按照总重量4重量%、22重量%称取海藻糖、各实施例和对比例制备的中药粉混合均匀,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度66℃,脱气相对真空度-0.03MPa,均质压力25MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,95℃,5min。
试服人员纳入标准
年龄35~60岁的女性群体;面部有不同程度的黄褐斑、雀斑或老年斑;面色暗沉、脸上有粗创或毛孔粗大;近3个月内未进行相关治疗。
试服人群排除标准
身体患有重大疾病或有器质性病变者;有孕妇、妊娠期或哺乳期妇女。
试服人群剔除标准
符合症状标准但因各种原因未完成试服者,包括终止和退出试服;试服期间使用其他药物影响实验结果判定者;
试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组40人,年龄35~60岁,并对全部试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该两组在年龄分布上具有可比性。
试服方法
服用方法为每日2次,每次1瓶,实验组服用样品M1,对照组服用样品M2,连续服用并观察20天,填写每日身体变化。服用期间不化妆、不护肤,停止一切美白祛斑药物,并要求作息规律,饮食正常。服用10d后对试服人员取静脉血检测超氧化物歧化酶(SOD)和丙二醛(MDA)含量,结果如表25所示。
试服效果评定标准
痊愈:面部色斑基本消失,无新的黄褐斑、雀斑或老年斑出现,面部红润,皮肤发亮有光泽;
显效:色斑颜色明显变浅,消退60%以上,无新的黄褐斑、雀斑或老年斑出现,皮肤有光泽;
有效:色斑颜色变浅,消退30%以上,无新的黄褐斑、雀斑或老年斑出现,面部皮肤状况有好转;
无效:试服前后色斑无变化。
结果如表26所示。
试服结果与分析
表25试服前后血液中SOD和MDA含量
注:**,与试服前相比,P<0.01。
从上表25可以看出,与试服前相比,本发明提供的产品,试服后血液中超氧化物歧化酶SOD含量有极显著提高(P<0.01),丙二醛MDA含量有极显著降低(P<0.01)。实验结果表明,本发明实施例提供的发酵产品能够显著提高SOD活力,降低体内自由基的累积,有利于美白祛斑,防止色素堆积。
表26受试者总效果统计表
对全体受试者试服有效率进行分析可以看出,实施例13-15提供的发酵粉试服组总有效率高达87.5%以上,结果表明本发明提供的发酵粉具有显著的美容养颜功效,能够明显改善面部色斑、面部暗沉等皮肤状况等。另外,对比例5也具有一定的效果,但有效率在55%以下,明显不如实施例13-15的发酵粉高。
测试例13
动物实验--活血调经
本测试例在考察本发明提供的发酵粉对大鼠活血调经功能的影响,主要从本发明提供的发酵粉对大鼠血清雌二醇和促卵泡素水平影响进行实验。
1材料
1.1样品制备
分别按照总重量5%、6%、89%称取赤藓糖醇、木瓜果粉、实施例和对比例的各中药粉,并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(30g/袋)。
1.2实验动物
SD大鼠,体重180-220克,雌性。
2实验方法与结果
2.1对大鼠血清雌二醇和促卵泡素含量影响
取雌性SD大鼠,随机分组,每组10只,分别为正常对照组、模型对照组、发酵粉低剂量组、中剂量组和高剂量组(实施例14设置3个剂量组,其余仅设置高剂量组),除正常对照组外,对其他各组大鼠做双侧卵巢切除术,术后3个月,给各组大鼠灌胃给药,正常对照组和模型组灌胃等量的生理盐水,低剂量组、中剂量组和高剂量组灌胃相应的药物,每天一次,连续给药15天。具体的,发酵粉低、中、高剂量实验组组分别按发酵粉2.5g、5.0g、10.0g/kg体重灌胃,正常组、模型对照组灌胃等量的生理盐水。在最后一次给药2小时后,取腹动脉血制备血清,用试剂盒检测血清雌二醇和促卵泡素含量,结果如表27所示。
表27各实验组血清雌二醇和促卵泡素含量(n=10)
注:*,与模型对照组相比,P<0.05;**,与模型对照组相比,P<0.01;***,与模型对照组相比,P<0.001;
与模型对照组相比,正常组大鼠血清雌二醇和促卵泡素有十分显著的差异(P<0.001),表明小鼠建模成功。在给药15d时,与模型组相比,实施例14发酵粉低剂量组促卵泡素显著降低(P<0.05),发酵粉中剂量组有极显著的降低(P<0.01),发酵粉中剂量组有十分显著的降低(P<0.001),表明实施例14提供的发酵粉能够有效控制促卵泡素的水平。实施例13、15,采用高剂量组试验,实验组促卵泡素同样有十分显著的降低(P<0.001),表明能与实施例14达到相同的改善效果。
从雌二醇激素的水平来看,与模型对照组相比,实施例14提供的发酵粉低剂量组大鼠雌二醇水平有显著提高(P<0.05),中剂量组大鼠雌二醇水平有极显著提高(P<0.001),发酵粉高剂量组大鼠雌二醇水平有十分显著提高(P<0.001)。
由于雌性激素与月经是否正常有着紧密的联系,因此雌激素含量的水平至关重要。通过本试验例可以得知桃红四物汤发酵粉在控制雌性激素方面具有一定的作用,从而起到活血调经的功效。
因此,本发明提供的发酵粉对大鼠具有很好的活血调经的作用。
测试例14
化学成分测定
桃仁虽有活血化瘀的作用,但其中有效成分苦杏仁苷会对肠道带来刺激。西红花中的有效成分是以西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ为主的一类水溶性类胡萝卜素,西红花苷口服不能以原型吸收,而是必须在胃肠道经过水解成西红花苷元,即西红花酸,才能吸收进入血液循环,发挥其药理作用。同时,西红花酸在水中的溶解度较差,需要通过包埋技术提高西红花酸的水溶性,本发明中采用了γ-环糊精进行包埋,极大的提高了西红花酸的水溶性,有利于肠道更好的吸收,提高了其生物利用度。
为了验证本发明采用的微生物发酵技术能够提高中药溶出度、增强中药药效,对中药粉发酵前后中药成分的溶出率、苦杏仁苷、西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ、西红花酸等成分进行含量检测。
样品与方法
样品制备
分别在如上各实施例和对比例制备的中药粉中加入2.5重量%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒58℃烘干至水分8%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.4%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(2.5g/片)。
苦杏仁苷检测方法
采用高效液相色谱法测定。
苦杏仁苷对照品与样品制备
(1)苦杏仁苷对照品溶液的制备:取苦杏仁苷对照品适量,精密称定,加甲醇定容,即得。
(2)苦杏仁苷供试品溶液的制备:分别取各样品粉末约0.25g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25mL,密塞,称定重量,超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤,精密量取续滤液5mL,置50mL量瓶中,加50%甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
苦杏仁苷液相色谱条件
色谱柱采用C8柱(4.6mm×250mm,5μm),以乙腈-0.1%磷酸溶液(8:92)为流动相,检测波长为207nm。理论板数按苦杏仁苷峰计算应不低于7000。
分别精密吸取苦杏仁苷对照品溶液10μL与供试品溶液20μL,注入液相色谱仪,测定。
西红花苷、西红花酸检测方法
采用高效液相色谱法测定。
对照品与样品制备
(1)西红花苷、西红花酸对照品溶液的制备:取西红花苷-I对照品、西红花苷-Ⅱ、西红花酸对照品适量,精密称定,加稀乙醇定容,即得。
(2)西红花苷、西红花酸供试品溶液的制备:取样品S1、S2各0.1g,精密称定,置50mL棕色量瓶中,加稀乙醇适量,置冰浴中超声处理20分钟,放至室温,加稀乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得。
液相色谱条件
色谱柱采用C8柱(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-水(45:55)为流动相;检测波长为440nm。理论板数按西红花苷-I峰计算应不低于3500。
分别精密吸取西红花苷、西红花酸对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
结果与分析
中药溶出度对比
对各样品在各自制备步骤(3)得到的提取清液进行取样,检测溶出度,结果如表28所示。
表28样品在提取步骤中溶出度的对比
固形物含量(重量%) | |
实施例13 | 10.8 |
实施例14 | 10.6 |
实施例15 | 10.5 |
对比例5 | 5.7 |
采用对比例5的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量为5.7重量%,而采用实施例13的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量为10.8重量%,几乎是对比例5的两倍,因此中药粉的溶出率大大提高,有利于中药材有效物质的充分利用,节约药用资源。
2.2苦杏仁苷、西红花苷、西红花酸含量对比
对本发明发酵粉中苦杏仁苷、西红花苷、西红花酸含量进行了检测分析,结果如表29所示。
表29苦杏仁苷、西红花苷、西红花酸含量
苦杏仁苷/重量% | 西红花苷-Ⅰ/重量% | 西红花苷-Ⅱ/重量% | 西红花酸/重量% | |
实施例13 | 0.162 | 0.662 | 0.468 | 0.244 |
实施例14 | 0.155 | 0.653 | 0.472 | 0.248 |
实施例15 | 0.168 | 0.667 | 0.473 | 0.252 |
对比例5 | 0.418 | 1.417 | 0.802 | 0.014 |
通过分析液相检测数据可以得知,经过微生物发酵后,体系中的苦杏仁苷含量显著降低,从而可以减少苦杏仁苷对人体肠道的刺激作用,从而使药效更温和。通过液相色谱检测发酵前后西红花苷的转化情况,不难发现,经过微生物的发酵转化,发酵后西红花苷-Ⅰ、西红花苷-Ⅱ含量明显降低,具有更高生物活性的西红花酸的含量大幅提高,可以验证微生物发酵技术具有明显的减毒增效作用。
通过测试例14可以得出,本发明采用的微生物发酵转化技术,一方面可以提高中药材有效物质的溶出度,提高中药材的利用率,另一方面还可以降低发酵粉中的苦杏仁苷含量,降低其对肠道的不良刺激,同时还可以将西红花苷转化为生物活性更高的西红花酸,可以直接被血液吸收,极大的提高了西红花苷的生物利用度,增强了药效。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例13-15中的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的活血调经和美容养颜的效果或者有效成分含量均不如实施例13-15中制备的产品。
测试例16-18采用实施例16-18和对比例6的产品,用于说明本发明的包括黄芪、人参、茱萸、茯苓、生姜和甘草的原料组合物的效果。
测试例16
为了验证本发明发酵中药粉益气健脾的减肥效果,现以下述人群试服实验为例进行说明。
1、诊断标准
体重指数(Body Mass Index,BMI)也称为体质指数,是世界公认的一种评定肥胖程度的分级方法,目前世界卫生组织也以BMI来对肥胖或超重进行定义。其计算公式如下:体重指数(BMI)=体重(kg)/[身高(m)]2。
《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》中也提出对成人判断超重和肥胖程度的BMI界限值,以及相关腰围数据。其中,BMI<18.5,体重过低,18.5≤BMI<24,体重正常;24.0≤BMI<28,超重;BMI≥28,肥胖。另外,男性腰围大于90厘米,女性大于85厘米,同样属于腹部肥胖。
根据中医辨证标准进行辨别气虚症人群。气虚临床表现主要有神疲乏力、少气懒言、舌胖或有齿痕、自汗畏风、脉虚无力。凡具有上述三条症状者,可诊断为气虚症。
试服人员纳入标准:
符合单纯性肥胖症诊断标准;符合气虚证诊断标准;年龄18-70岁;近3个月内未进行相关治疗;签署知情协议。
试服人群排除标准
合并高血压、糖尿病或其他代谢性疾病者;伴有心、肝、肺、肾、免疫系统等严重功能障碍者;有孕妇、妊娠期或哺乳期妇女;合并肾上腺皮质功能亢进、甲状腺功能低下等内分泌失调疾病者。
试服人群剔除标准
符合症状标准但因各种原因未完成试服者,包括终止和退出试服;试服期间使用其他药物影响实验结果判定者;
试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组50人,男女各25人,年龄35~70岁,平均年龄在40-50岁。
试服方法
口服液的制备:分别按照总重量0.5%、25%称取果胶、如上各实施例和对比例的发酵粉混合均匀,加入82℃热水化胶,搅拌均匀后分别加入5%赤藓糖醇,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度65℃,脱气相对真空度-0.025MPa,均质压力18MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,95℃,25min。
服用方法为每日两次,每次2瓶,实验组分别服用本发明样品,对照组分别服用对比例样品,连续服用并观察60天,填写每日身体变化。服用期间停止一切减肥药物,并戒用烟酒和刺激辛辣食品。
效果观测
效果观测指标包括肥胖指标和血脂水平,肥胖指标主要包括服用前后人群的体重、腰围、臀围以及身高,计算BMI和体脂含量(FAT);血脂水平指标主要包括使用全自动生化分析仪测定试服者服用前后总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白水平(HDL)。
效果标准
参考《单纯性肥胖病的诊断及疗效评定标准》判定疗效评定标准:
痊愈:临床症状消失或基本消失,体重下降>5kg或BMI<24kg/m2;腰围下降≥8cm;
显效:临床症状基本消失或大部分消失,体重下降≥5kg或BMI下降≥3;腰围下降≥8cm;
有效:临床症状部分消失,体重下降2-5kg或BMI下降>2;腰围下降≥5.6cm;
无效:临床症状无明显变化,体重下降<2kg,腰围下降<5.6cm或BMI下降<2。
试服结果与分析
表30为受试者试服前后体重、BMI指标对比。
表31为受试者试服前后腰围、体脂肪指标对比。
表32为受试者试服前后总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)指标对比。
表33为受试者试服前后低密度脂蛋白(LDL)、高密度脂蛋白水平(HDL)对比。
表34为受试者总效果统计表。
表30受试者试服前后体重、BMI指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05;**,与服用前对比,P<0.01;#,与对比例对比,P<0.05(实施例16与对比例6相比)。
表31受试者试服前后腰围、体脂肪指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05;**,与服用前对比,P<0.01;#,与对比例对比,P<0.05(实施例16与对比例6相比)。
从上表可以看出,服用本发明产品前后,体重、腰围、BMI、FAT指标均有十分显著差异(P<0.01),表明本发明产品对单纯性肥胖人群降低体重指标具有明显的减肥作用;另一方面,服用对比例产品前后,体重、腰围、BMI、FAT指标有显著差异(P<0.05),表明对比例产品也具有一定的减肥效果。但在各项肥胖体征上,实施例的产品比对比例产品具有更优的减肥变化(P<0.05)。这也从侧面验证了轻身散发酵粉对单纯性肥胖人群的减肥作用要优于未发酵轻身散粉。
表32受试者试服前后总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05;**,与服用前对比,P<0.01;#,与对比例对比,P<0.05(实施例16与对比例6相比)。
表33受试者试服前后LDL、HDL对比
注:*,与服用前对比,P<0.05;**,与服用前对比,P<0.01;#,与对比例对比,P<0.05(实施例16与对比例6相比)。
从上表可以看出,本发明产品服用前后,受试人群血脂水平中的总胆固醇、三酰甘油、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白指标均有十分显著差异(P<0.01),表明本发明产品对降低单纯性肥胖人群血脂水平具有十分显著的作用;另一方面,服用对比例产品前后,血脂水平四项指标也有一定的显著差异(P<0.05),表明对比例产品也具有一定的减肥效果。但在降低各项血脂水平上,本发明产品比对比例产品具有明显的效果(P<0.05)。这也从侧面验证了轻身散发酵粉对降低单纯性肥胖人群血脂水平的效果要优于未发酵轻身散。
表34受试者总效果统计表
组别 | 例数 | 痊愈/例 | 显效/例 | 有效/例 | 无效/例 | 总有效率/% |
实施例16 | 50 | 17 | 18 | 9 | 6 | 88 |
实施例17 | 50 | 15 | 25 | 5 | 5 | 90 |
实施例18 | 50 | 14 | 24 | 4 | 8 | 84 |
对比例6 | 50 | 4 | 16 | 10 | 20 | 60 |
对全体受试者有效率进行分析可以看出,采用发酵轻身散粉试服组总有效率高达90%,再次验证轻身散发酵粉具有显著的减肥功效。另外,未发酵轻身散粉也具有一定的减肥效果,但整体有效率明显不如发酵粉高。
测试例17
化学成分测定
人参中含有的田七素对神经系统有一定的毒副作用,比如服用人参后可能会出现瘙痒、眩晕、头痛及鼻出血等症状,有研究证明,这些症状的出现与田七素有关。
为了验证本发明采用微生物发酵技术减毒增效的效果,对轻身散中药粉发酵前后体系中的田七素、黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮含量进行测定。
1样品的制备
取实施例和对比例的各发酵粉,分别加入发酵粉量2.0%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒55℃烘干至水分8%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.5%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(1.5g/片)。
2对照品及待测液制备
田七素对照品溶液的制备:取田七素对照品适量,精密称定,加入一定量超纯水,超声处理使其完全溶解,制成0.2mg/ml标准品溶液。
田七素待测品溶液的制备:称取如上各样品1.0克,放于具塞锥形瓶中,料液比为1:10(g:mL),加入蒸馏水10mL,在功率为750W,频率为25kHz,水浴温度为25℃的超声清洗器中超声15min连续提取2次,将滤液全部转移至离心管中,以3500r/min的转速离心15min,合并两次上清液于40℃的恒温水浴锅浓缩20min,再将其转移至25mL的容量瓶中,以蒸馏水定容至刻度线,得到田七素待测液。
黄芪甲苷对照品的制备:精密称取适量黄芪甲苷对照品,置于25mL容量瓶,加甲醇至刻度,制成浓度为0.5mg/mL的标准品溶液。
毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮对照品溶液的制备:分别精密称取适量毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮对照品,置于25mL容量瓶,加甲醇至刻度,制成浓度为0.5mg/mL的标准品溶液。
黄芪甲苷供试品溶液的制备:称取称取如上各样品各4g,置索氏提取器中,加甲醇40mL,冷浸过夜,再加甲醇适量,加热回流4小时,提取液回收溶剂并浓缩至干,残渣加水10mL,微热溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取4次,每次40mL,合并正丁醇液,用氨试液充分洗涤2次,每次40mL,弃去氨液,正丁醇液蒸干,残渣加水5mL使溶解,放冷,通过D101型大孔吸附树脂柱(内径为1.5cm,柱高为12cm),以水50mL洗脱,弃去水液,再用40%乙醇30mL洗脱,弃去洗脱液,继用70%乙醇80mL洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀过0.22μm微孔滤膜,备用。
毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮供试品溶液的制备:精密称取如上各样品各1.0g,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇50mL,称定重量,加热回流4小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25mL,回收溶剂至干,残渣加甲醇溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
3检测方法
3.1田七素液相色谱检测方法
采用C18(150mm×4.6mm,5um)色谱柱;流动相为:甲醇-(0.1%磷酸):水(85:15);等度洗脱15min;体积流量1mL/min;进样量2μL;柱温25℃;检测波长213nm。
3.2黄芪甲苷色谱检测方法
采用C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按A:B(32:68)比例进行洗脱,漂移管温度55℃,氮气压强350kpa,柱温30℃。
3.3毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮色谱检测方法
采用C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%的磷酸水溶液为流动相B,按以下表35洗脱顺序进行洗脱比例进行洗脱,柱温30℃。
表35梯度洗脱程序
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~20 | 20~40 | 80~60 |
20~30 | 40 | 60 |
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值,结果如表36所示。
表36中各指标行成分含量(mg/g)
田七素 | 黄芪甲苷 | 毛蕊异黄酮葡萄糖苷 | 毛蕊异黄酮 | |
实施例16 | 1.08±0.15 | 18.15±1.27 | 2.92±0.41 | 4.36±0.52 |
实施例17 | 1.12±0.20 | 18.47±1.43 | 3.05±0.46 | 4.31±0.53 |
实施例18 | 1.15±0.23 | 17.85±1.33 | 3.08±0.51 | 4.28±0.47 |
对比例6 | 2.44±0.21 | 12.41±1.35 | 8.46±0.73 | 0.52±0.16 |
首先来分析田七素的含量变化,可以看出,经过微生物发酵转化后,对人体神经系统有毒副作用的田七素含量有较高程度的降低,相对于未发酵的产品,发酵组田七素含量得到了有效降低,可以验证中药发酵技术在减毒方面的明显优势。再来分析三种活性成分黄芪甲苷、毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮含量的变化。相对于未发酵的产品,经过发酵处理后,黄芪甲苷提高,表明发酵工艺有利于增加黄芪有效成分黄芪甲苷的含量。由于微生物在发酵过程中的转化作用,使得毛蕊异黄酮葡萄糖苷转化为了生物活性更高的毛蕊异黄酮,毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量降低,但同时毛蕊异黄酮的含量大幅提高,其含量是未发酵粉的数倍之多。经过微生物发酵转化之后,一方面增加了发酵粉体系中黄芪甲苷的含量,另一方面将毛蕊异黄酮苷转化为生物活性更高的毛蕊异黄酮,从此可以看出中药发酵技术在提高药效方面的明显优势。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵、酵母菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌、酵母菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例16-18中的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌或酵母菌;以上方法得到的产品的益气健脾和消胖减肥的效果或者有效成分含量均不如实施例16-18中制备的产品。
测试例18-21采用实施例19-21和对比例7的产品,用于说明本发明提供的包括人参、余甘子、玉竹、橄榄果、鱼腥草和茯苓的原料组合物的效果。
测试例18
体外抗糖化、抗氧化实验
DPPH分析法是一种筛选自由基清除剂以及评价抗氧化活性的简单方法。原理是当有自由基清除剂存在时,由于其与DPPH电子配对,DPPH溶液逐渐褪色,褪色程度与配对电子数成化学计量关系,从而可用分光光度法进行分析。
AGEs是非酶糖基化反应(美拉德反应)的终末产物,是指蛋白质、脂质或核酸等大分子在没有酶参与的条件下,自发的与葡萄糖或其他还原单糖反应所生成的稳定的共价物。本实验用以牛血清白蛋白与葡萄糖模拟生理环境发生美德拉反应,而AGEs在370nm处有最大吸收峰,因此可采用荧光分光光度法检测其含量。
1样品和方法
1.1样品
按照实施例20的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。制备的产品记为样品P2。
采用如上实施例的发酵粉和样品P2,分别进行如下操作:
按照总重量5%、95%称取结晶果糖和发酵粉(或样品P2),并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(25g/袋),即为各实施例和对比例分别对应的样品。取上述样品,分别配制成浓度为0.15g/mL的待测液,待用。
1.2体外抗氧化检测方法:DPPH自由基清除率
0.1mmol/L DPPH溶液:精确称取DPPH粉末,加50ml甲醇溶解,定容至100ml。溶液现用现配。
取1ml待测液于5ml离心管中,并加入3mL DPPH溶液,室温下3500rpm离心20min,倒入比色皿中,立即在517nm波长处测吸光值测,吸光值记为A1。
取1ml待测液于5ml离心管中,并加入3mL甲醇溶液,按上述方法测吸光值,记为A2。
空白对照组为加1ml甲醇溶液于5ml离心管中,并加入3mL DPPH溶液,按上述方法,测其吸光值记为A0。按下式计算DPPH自由基清除率:
DPPH自由基清除率(%)=[1-(A1-A2)/A0]*100%
结果见表37。
1.3体外抗糖化检测方法:蛋白糖化终末产物(AGEs)抑制率
采用pH7.4磷酸盐缓冲液,配制牛血清白蛋白含量为4g/L、葡萄糖浓度为0.02mol/L的溶液。以上液体均用0.2μm滤膜除菌过滤,分装于1.5mL尖底离心管内。37℃恒温有氧避光条件下连续孵育28d。样品取出后-18℃冰箱冷冻保存。
分别配制各实施例和对比例制备得到的发酵粉溶液,其中发酵粉的浓度均为8g/L,牛血清白蛋白含量为4g/L、葡萄糖浓度为0.02mol/L,不含待测物的蛋白质高糖溶液为空白对照组。
AGEs由荧光分光光度计测定,激发波长370nm,发射波长440nm。AGEs生成抑制率计算公式如下:
抑制率=(对照组荧光强度-实验组荧光强度)/对照组荧光强度。
结果见表37。
2实验结果与分析
表37抗自由基、抗糖化效果检测
发酵粉 | DPPH自由基清除率 | AG Es生成抑制率 |
实施例19 | 83.1% | 72.4% |
实施例20 | 86.3% | 75.1% |
实施例21 | 82.7% | 71.3% |
样品P2 | 52.2% | 44.8% |
通过检测对比发现,相对于样品P2,实施例的DPPH自由基清除率较高,AGEs生成抑制率也较高由此可见,本发明制备得到的发酵粉的抗糖化、抗氧化效果明显更高。
为了验证本发明发酵组合物的抗糖抗衰、美白祛斑效果,现以下述人群试服实验(测试例19)和动物实验(测试例20)为例进行说明。
测试例19
人群试服实验--美白祛斑
1样品
采用实施例19-21和对比例7制备的产品,分别进行如下操作:
称取脱脂乳粉、发酵粉和水,按总重计,脱脂乳粉、发酵粉分别为6重量%、20重量%,余量为水,混合均匀并定容,然后依次通过62℃预热、相对真空度-0.03MPa下进行脱气、下进行高压均质(均质压力为22MPa,均质机频率30Hz),随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后在92℃下杀菌20min,然后保存,得到实施例19-21和对比例7分别对应的口服液。
2受试者标准
年龄20~70岁,面部有不同程度的黄褐斑、黑斑、雀斑或老年斑,面色暗沉,脸上有粗创或毛孔粗大,面部有明显皱纹,肤质较差者。受试者在试服期间不得服用其他影响皮肤的功能食品或药物,并暂时停用影响结果判定的化妆品。
3试服分组
将试服人群随机分组,每组60人,每组男性20人,女性40人,年龄20-70岁,并对该两组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该两组在年龄分布上具有可比性。
4试服方法
服用方法为每日2次,每次1瓶(50ml/瓶),服用时间一般是饭后1-2h,晚间不要服用。连续服用并观察42天,填写每日面部变化。服用期间停止一切美白祛斑药物,并要求作息规律,饮食正常。
5试服效果评定标准
痊愈:面部皱纹有明显减少,色斑消退60%以上,无新的黄褐斑、黑斑、雀斑或老年斑出现,面部红润,皮肤发亮有光泽;
显效:面部皱纹有好转,色斑颜色明显变浅,消退40%以上,无新的黄褐斑、黑斑、雀斑或老年斑出现,皮肤有光泽;
有效:色斑颜色变浅,消退20%以上,无新的黄褐斑、黑斑、雀斑或老年斑出现,面部皮肤状况有好转;
无效:试服前后皱纹、色斑、肤质无变化,或有加重的情况。
结果见表38。
6试服结果与分析
表38受试者总效果统计表
对全体受试者试服有效率进行分析可以看出,试服实施例的口服液的总有效率较高。表明实施例的发酵口服液具有显著的美容养颜功效,能够明显改善面部色斑、面部暗沉等皮肤状况等。另外,对比例7也具有一定的效果,但整体有效率只有54.9%,但相对于实施例19的口服液的总有效率77.8%,明显未发酵的产品不如发酵的产品效果好。
测试例20
动物实验--提高SOD酶、GSH-Px酶活力
本测试例旨在考察本发明制备的发酵产品对小鼠血液中抗氧化酶的影响,主要是对血液SOD酶、GSH-Px酶活力作用的评价。
1材料
1.1样品
采用如上实施例19-21制备的发酵粉和测试例18中制备的样品P2,分别进行如下操作:
称取脱脂乳粉、发酵粉和水,按总重计,脱脂乳粉、发酵粉分别为6重量%、20重量%,余量为水,混合均匀并定容,然后依次通过62℃预热、相对真空度-0.03MPa下进行脱气、下进行高压均质(均质压力为22MPa,均质机频率30Hz),随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后在92℃下杀菌20min,然后保存,得到实施例19-21和样品P2分别对应的口服液。
1.2实验动物
ICR小鼠,体质量(18±2)g,雌雄兼用。
1.3实验设计
采用皮下注射D-半乳糖(1g/kg)造小鼠衰老模型,D-半乳糖需现配现用。模型组每日进行皮下注射给药D-半乳糖,体积为0.1ml/10g,连续每日背部皮下注射35天,正常对照组注射同等体积的生理盐水。35天后,小鼠逐渐精神萎靡,嗜睡倦怠,毛色枯槁,无光泽,脱毛严重,皮肤弹性差,进食量减少,食欲不振,呈现出明显衰老体征,表明造模成功。
实验包括正常对照组、模型对照组、实验组。其中,实验组中,对于实施例20的发酵粉制备的样品,设置低剂量组、中剂量组、高剂量组;对其他实施例和样品P2只设置高剂量组。每组15只小鼠。
1.4实验方法
每日灌胃给药。低、中、高三个剂量组,分别按照2.5g、5g、10g/kg体重灌胃;正常对照组、模型对照组每日给予等量的生理盐水。35天后,摘眼球放血处死小鼠,取血进行检测超氧化物歧化酶(SOD酶)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px),参照试剂盒说明书中的方法测定SOD酶、GSH-Px酶活力。结果见表39。
表39各组小鼠血液SOD酶、GSH-Px酶活测定
注:*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01极显著差异。
与模型对照组相比,正常对照组小鼠血液SOD酶、GSH-Px酶活性有极显著差异(P<0.01),从侧面也表明小鼠衰老模型建模成功。
在给药35d后,与模型对照组相比,实施例20低剂量组酶活差异不显著,中剂量组血液SOD酶、GSH-Px酶活有显著提高(P<0.05),高剂量组有极显著增加(P<0.01),表明实施例20的发酵产品能够显著提高机体抗氧化能力,增强皮肤自由基防护功能。
与模型对照组相比,样品P2高剂量组也能一定程度提高血液SOD酶、GSH-Px酶活(P<0.05),但效果远不如实施例20由此可以判断,经过微生物发酵后,发酵产品的抗氧化性能大幅提高。
另外,与模型对照组相比,实施例19和实施例21的血液SOD酶、GSH-Px酶活也有极显著增加(P<0.01)。
测试例21
天然植物成分没食子酸、羟基酪醇、槲皮素具有很好的抗糖化、抗氧化作用,因此提高该类物质的含量,有利于增加组合物抗糖抗衰的作用。
有研究表明,人参中含有的田七素对人体神经系统有一定的毒副作用,比如服用人参后可能会出现瘙痒、眩晕、头痛及鼻出血等症状。同时,天然型人参皂苷Rb1在肝脏中不能分解,在人体肠道吸收率极低,不足2%,只有将天然人参皂苷转化为稀有皂苷Rg3才能进入血液,发挥药理活性。
为了验证本发明采用的微生物发酵技术能够提高中药有效成分含量、增强中药药效、降低毒副作用,对如上实施例和对比例制备的发酵粉中没食子酸、羟基酪醇、槲皮素、人参皂苷、田七素等成分进行含量检测。
1样品和方法
1.1样品
按照实施例21的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。制备的产品记为样品M2。
取实施例19-21制备的发酵粉和样品M2,分别进行如下操作:
加入发酵粉(或样品M2)重量的2%的微晶纤维素,混合均匀,喷水制粒,将制好的湿颗粒60℃烘干至水分10%,得到干颗粒,加入颗粒总量1.5%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(3g/片)。
1.2检测方法
1.2.1田七素液相色谱检测方法
采用C18(150mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为:甲醇:纯化水(体积比85:15);体积流量1mL/min;柱温25℃;进样量2μL;检测波长213nm。
田七素对照品溶液的制备:取田七素对照品适量,精密称定,加入甲醇超声处理使其完全溶解,制成93.28μg/mL标准品溶液。
1.2.2羟基酪醇液相色谱检测方法
采用C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;流动相为:甲醇:纯化水(体积比70:30);体积流量1mL/min;进样量2μL;柱温25℃;检测波长221nm。理论板数以羟基酪醇计算不低于4000。
羟基酪醇对照品溶液的制备:精密称取一定量的羟基酪醇对照品,置于10mL容量瓶中,加甲醇超声溶解,制成含羟基酪醇78.25μg/mL的对照品溶液。
1.2.3槲皮素含量检测方法
采用C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:0.4%磷酸缓冲液-甲醇(体积比为40:60);流速:0.8mL/min;检测波长:373nm。
槲皮素对照品溶液的制备:精密称取一定量槲皮素对照品,于10mL量瓶中加适量甲醇超声溶解,定容,配置成124.06μg/mL的溶液,备用。
1.2.4没食子酸含量检测
采用C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:0.5%磷酸缓冲液-甲醇(体积比为5:95);流速:1.0mL/min;检测波长:270nm。
没食子酸对照品溶液的制备:精密称取一定量没食子酸对照品,加甲醇超声溶解,配置成没食子酸含量为475.8μg/mL的溶液,备用。
1.2.5人参皂苷Rb1和Rg3含量检测
采用C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按下表中的规定进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min,柱温:35℃,检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算不低于6000。
人参皂苷对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg3对照品,加甲醇分别制成含236.28μg/mL、65.77μg/mL的混合溶液,备用。
1.2.6待测样品的制备及测定
分别取样品,过80目筛,各称取粉末0.5g,置于50mL的量瓶中,加20%甲醇使其稀释至刻度,称定重量,超声处理20min,称定重量,用20%甲醇补足使完全溶解并稀释至刻度,摇匀,过滤,精密量取10-20μL,注入液相色谱仪测量,每个样品测量5次。
2.1Rb1、Rg3、田七素含量对比
样品中Rb1、Rg3、田七素含量结果见表40。
表40 Rb1、Rg3、田七素含量
Rb1/(mg/g) | Rg3/(mg/g) | 田七素/(mg/g) | |
实施例19 | 3.34±0.30 | 4.72±0.31 | 0.35±0.04 |
实施例20 | 3.05±0.37 | 4.75±0.32 | 0.39±0.06 |
实施例21 | 3.12±0.36 | 4.66±0.27 | 0.41±0.05 |
样品M2 | 8.03±0.45 | 1.51±0.16 | 1.13±0.10 |
首先分析田七素的含量变化,从实施例21和样品M2可以看出,经过微生物发酵转化后,对人体神经系统有毒副作用的田七素含量有较高程度的降低,由此可以判断,中药发酵技术在中药减毒方面具有明显优势。并且,通过液相色谱检测发现,与样品M2相比,实施例21的产品的天然人参皂苷Rb1含量有较高幅度的降低,而稀有型人参皂苷Rg3有显著的增加,从此可以看出,经过微生物的生物转化后,天然人参皂苷Rb1转化为了生物活性更强的稀有皂苷Rg3,更有利于人体吸收利用。
2.2没食子酸、槲皮素、羟基酪醇含量对比
样品中没食子酸、槲皮素、羟基酪醇含量结果见表41。
表41没食子酸、槲皮素、羟基酪醇含量
通过液相色谱检测发现,相对样品M2,实施例21产品中有效物质没食子酸、槲皮素、羟基酪醇含量均有大幅的提升。由此可以看出,通过微生物发酵技术可以明显提高体系中有效物质的含量,提高药材利用率,增强产品功效。
综合上述测试例可以验证,本发明提供的发酵物具有显著的抗糖抗衰、美白祛斑作用。同时,本发明提供的该发酵物的制备方法,能够将天然植物成分没食子酸、槲皮素、羟基酪醇等抗氧化抗糖化作用物质的含量大幅提高,同时将人参中的天然人参皂苷转化为生物活性更强的稀有皂苷,极大的提高了人参皂苷在肠道中的生物利用度,可以能够更好更快的进入血液发挥药效,成分源于天然植物,安全健康;其次,可以对原有体系中人参所含的田七素进行分解,降低其含量,从而降低田七素对机体神经系统的毒副作用。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例19-21中的乳杆菌或芽孢杆菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌;以上方法得到的产品的美容养颜的效果或者有效成分含量均不如实施例19-21中制备的产品。
测试例22-24采用实施例22-24和对比例8的产品,用于说明本发明提供的包括黄芪、人参、肉桂和甘草的原料组合物的效果。
测试例22
人群试服实验
样品制备
按照实施例24的方法制备发酵粉,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。得到的发酵粉记为样品N。
采用实施例22-24的发酵粉和样品N,分别取发酵粉总重量的8%、20%的低聚异麦芽糖、发酵粉(或样品N),混合均匀,定容,然后依次通过预热、脱气、高压均质,预热温度65℃,脱气相对真空度-0.03MPa,均质压力20MPa,均质机频率30Hz,随后灌装,制成口服液剂型(50mL/瓶),最后进行杀菌保存,92℃,20min。得到实施例22-24和样品N对应的待测的口服液。
试服人员纳入标准
元气虚弱,精神倦怠,肌肉无力,不思饮食,面色苍白或枯黄,气色不足,心悸失眠人群。
试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组40人,男女各20人,年龄40~75岁,并对该两组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该两组在年龄分布上具有可比性。
试服方法
服用方法为每日2次,每次2瓶,实验组服用实施例22-24的口服液,对照组服用样品N的口服液,连续服用并观察10天,填写每日身体变化。服用期间停止一切药物或保健品,并无重大体力劳动,作息规律。
效果标准
痊愈:症状消失,元气饱满,精神振奋,体力充沛,脸色红润;
显效:症状明显缓解,元气恢复,精神状态良好,体力较好;
有效:症状有所缓解,气色有所改观,体力有所改善;
无效:临床症状无明显变化,或有所加重。
试服结果与分析见表43。
表43受试者总效果统计表
组别 | 例数 | 痊愈/例 | 显效/例 | 有效/例 | 无效/例 | 总有效率/% |
实施例22 | 40 | 13 | 16 | 5 | 6 | 85.0% |
实施例23 | 40 | 10 | 17 | 6 | 7 | 82.5% |
实施例24 | 40 | 12 | 14 | 9 | 5 | 87.5% |
样品N | 40 | 19 | 3 | 4 | 14 | 65.0% |
对全体受试者试服有效率进行分析可以看出,采用实施例22-24制备的发酵口服液试服组总有效率高达87.5%,结果表明保元汤发酵口服液具有显著的益气温阳功效,能够明显改善试服人群元气虚弱的症状,包括元气虚弱,精神倦怠,肌肉无力,不思饮食,面色苍白或枯黄,气色不足,心悸失眠等。另外,未发酵的样品N也具有一定的效果,但整体有效率只有65.0%,明显不如发酵的产品高。
试验例23
动物实验
1材料
1.1样品
采用本发明上述实施例22-24和对比例8制备的中药粉。
1.2实验动物
清洁级昆明种小鼠,体重18~22克,雌性。
2实验方法与结果
2.1实验分组
对小鼠灌胃生大黄煎液(生药含量1g/ml)1ml/d,连续7d,小鼠大便稀溏,体重下降,食量减少,不喜运动,毛色干燥,毛耸无华,表明建模成功。
将小鼠随机分为五组:正常组、模型组、实施例22设置低剂量组、中剂量组和高剂量组,其他实施例和对比例仅设置高剂量组,每组小鼠12只。发酵粉低、中、高剂量实验组分别按发酵粉0.25g、0.5g、1.0g/10g体重灌胃,正常组、模型对照组灌胃等量的生理盐水,每日1次,连续7d。在第7d灌胃结束后,分别进行负重游泳和吞噬细胞吞噬功能检测实验。
2.2实验方法
负重游泳实验:用深35cm、直径30cm的圆形容器盛满20℃左右的温水,在小鼠尾部系其自身体重10%的重物,放置在水中开始计时,当小鼠头部深入水中10s不能浮出水面时,即为小鼠的游泳时间。
巨噬细胞吞噬指数测定:各组小鼠在末次给药前称取体质量,给药1h后,经小鼠尾部静脉注射稀释的墨汁(0.1ml/10g),分别于注入墨汁2min和20min后,从眼眶取血20μL,加入到2mL 0.1%Na2CO3溶液中摇匀,以0.1%Na2CO3溶液为空白对照,测定光密度OD值,代入下列公式计算吞噬指数(K)。
K=(logOD1-logOD2)/(t2-t1)
2.3实验结果
表44各实验组小鼠负重游泳时间与吞噬指数检测结果(n=12)
注:*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01(极显著差异)。
与模型对照组相比,正常组小鼠负重游泳时间、巨噬细胞吞噬指数有极显著的差异(P<0.01),同时模型组小鼠出现了毛色干枯,毛耸无华,饮食减少,活动减少等一系列症状,表明建模成功。实施例22的发酵粉在给药7d时,与模型组相比,发酵粉中剂量组对小鼠负重游泳时间、吞噬指数有显著的提高(P<0.05),发酵粉高剂量组有极显著的提高(P<0.01)。因此,实施例的发酵粉具有改善具有很好的健脾益气,温阳补虚的作用。
试验例24化学成分测定
为了验证本发明采用的微生物发酵技术能够提高中药溶出度、增强中药药效,对保元汤中药粉发酵前后体系中的中药成分的溶出率、人参皂苷Rb1/Rg3、毛蕊异黄酮葡萄糖苷/毛蕊异黄酮、肉桂醛/肉桂酸含量进行测定。
材料与方法
材料
样品
按照实施例23的方法制备发酵粉,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。得到的发酵粉记为样品Q。
取实施例22-24的发酵粉和样品Q,分别加入喷干粉量2%的微晶纤维素,混合均匀,喷入纯化水制粒,将制好的湿颗粒60℃烘干至水分6%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量0.8%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(1.5g/片)。
1.1.2对照品制备
人参皂苷对照品溶液的制备:精密称取人参皂苷Rb1对照品、人参皂苷Rg3对照品,加甲醇制成每1mL各含0.2mg的混合溶液,摇匀,即得。
肉桂醛/肉桂酸对照品溶液的制备:取肉桂醛、肉桂酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮对照品溶液的制备:分别精密称取适量毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮对照品,置于25mL容量瓶,加甲醇至刻度,制成浓度为0.5mg/mL的标准品溶液。
1.1.3待测液制备
人参皂苷待测液的制备:取样品约1.0g,精密称定,置索氏提取器中,加三氯甲烷加热回流3小时,弃去三氯甲烷液,药渣挥干溶剂,连同滤纸筒移入100mL锥形瓶中,精密加水饱和正丁醇50mL,密塞,放置过夜,超声处理(功率250W,频率50kHz)30分钟,过滤,弃去初滤液,精密量取续滤液25mL,置蒸发皿中蒸干,残渣加甲醇溶解并转移至5mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取续滤液,即得人参皂苷待测液。
肉桂醛/肉桂酸待测液的制备:取待测样品粉末约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率350W,频率35kHz)10分钟,放置过夜,同法超声处理一次,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液1ml,置25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮待测液的制备:精密称取待测样品各1.0g,置圆底烧瓶中,精密加入甲醇50mL,称定重量,加热回流4小时,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过,精密量取续滤液25mL,回收溶剂至干,残渣加甲醇溶解,转移至5mL量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1.2检测方法
1.2.1人参皂苷液相色谱检测方法
采用C18(250mm×4.6mm,5μm)色谱柱;以乙腈为流动相A,以水为流动相B,按表45中的规定进行梯度洗脱;流速:1.0mL/min,柱温:35℃,检测波长为203nm。理论板数按人参皂苷Rb1峰计算应不低于6000。
表45梯度洗脱程序
时间/min | 流动相A/% | 流动相B/% |
0~35 | 19 | 81 |
35~55 | 19→29 | 81→71 |
55~70 | 29 | 71 |
70~100 | 29→40 | 71→60 |
分别精密吸取对照品溶液10μL与供试品溶液10~20μL,注入液相色谱仪,测定。
1.2.2毛蕊异黄酮葡萄糖苷、毛蕊异黄酮色谱检测方法
采用C18(4.6mm×250mm,5μm)色谱柱;流动相:以乙腈为流动相A,以0.2%的磷酸水溶液为流动相B,按以下洗脱顺序进行洗脱比例进行洗脱,检测波长260nm,柱温30℃。理论板数按毛蕊异黄酮葡萄糖苷峰计算应不低于3000。
表46梯度洗脱程序
时间(min) | 流动相A(%) | 流动相B(%) |
0~20 | 20~40 | 80~60 |
20~30 | 40 | 60 |
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
1.2.3肉桂醛、肉桂酸色谱检测方法
采用C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相A:0.1%磷酸;流动相B:乙腈。洗脱程序:0~3min,36%乙腈;3~9min,36%~46%乙腈;9~11min,46%~36%乙腈;检测波长:284nm;柱温:25℃;体积流量:1.0ml/min。在上述条件下,肉桂醛与肉桂酸得到了较好的分离,相邻峰间分离度均大于1.5。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
结果与分析
2.1中药溶出度对比
对样品在各自步骤(3)得到的提取清液进行取样,检测保元汤配方经过两种不同工艺提取后的溶出度。结果见表47。
表47溶出度的对比
中药粉质量分数 | 固形物含量 | |
实施例22 | 18% | 10.8% |
实施例23 | 16% | 10.4% |
实施例24 | 13% | 10.7% |
样品Q | 16% | 4.6% |
实施例23、Q在制备过程中的组分配比完全一致,中药粉在体系中的质量分数为16%,采用样品Q的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量为4.6%,而采用实施例23的制作工艺,提取液中可溶性固形物含量为10.4%,是Q提取液的2.26倍,因此中药粉的溶出率大大提高,有利于中药材有效物质的充分利用,节约药用资源。
2.2有效物质含量对比
人参的有效成分为天然型人参皂苷,这类化合物通常在肠道内难以吸收利用,仅有很小一部分皂苷能够以原型的形式进入血液,因此天然型人参皂苷生物利用度极低,只有将这些天然皂苷转化为稀有皂苷,才能充分发挥人参的生物活性。
黄芪的有效成分之一为毛蕊异黄酮葡萄糖苷,其在微生物的作用下可以转化成分子量更小的苷元毛蕊异黄酮,能更好的被人体肠道吸收,更快的进入血液发挥药效。
肉桂的有效成分为肉桂醛,肉桂醛具有一定的挥发性,且醛基对人体也有一定的毒副作用,通过微生物发酵之后,肉桂醛可以转化为性质更为稳定的肉桂酸,在体内肉桂醛需代谢成肉桂酸,方能进入血液,所以通过微生物转化之后,也可以加速肉桂醛在体内的代谢速度。各实施例和对比例发酵产品中成分含量见表48。
表48
通过液相色谱检测发现,与样品Q相比,实施例23中天然人参皂苷Rb1含量有较高幅度的降低,而稀有型人参皂苷Rg3有显著的增加,从此可以看出,经过微生物的生物转化后,天然人参皂苷Rb1转化为了稀有皂苷Rg3,更有利于人体吸收利用。与样品Q相比,实施例23中毛蕊异黄酮葡萄糖苷含量明显降低,毛蕊异黄酮含量明显提高,结果表明,在微生物的作用下,毛蕊异黄酮葡萄糖苷转化为分子量更小的毛蕊异黄酮,能更好更快的被肠道吸收。与样品Q相比,实施例23中肉桂醛含量明显降低,肉桂酸含量明显提高,结果表明,经过微生物发酵后,易挥发的肉桂醛转化为性质更为稳定的肉桂酸,同时也加速了肉桂醛在体内的代谢过程。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变乳杆菌发酵和芽孢杆菌发酵的发酵顺序;或者不同时采用乳杆菌和芽孢杆菌进行发酵;或者将实施例22-24中的乳杆菌或芽孢杆菌替换为其他的乳杆菌或芽孢杆菌;以上方法得到的产品的益气温阳效果或者有效成分含量均不如实施例22-24中制备的产品。
测试例25-26采用实施例25-27和对比例9的产品,用于说明本发明提供的包括薏苡仁、人参、茯苓、鸡内金、桔梗、山药、白扁豆、砂仁、莲子和甘草的原料组合物的效果。
测试例25
人群试服实验
样品制备
按照实施例27的方法制备产品,不同的,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵,制备的产品记为样品G。
取实施例25-27的发酵粉和样品G,分别按照总重量8%、92%称取低聚异麦芽糖粉和发酵粉(或样品G),并混合均匀,灌装,制成粉体条包剂型(25g/袋)。
试服人员筛选
筛选出具有明显痰湿体质的人员进行测试,痰湿体质常见表现主要有体型肥胖、腹部肥满松软、面部皮肤油脂较多、面色淡黄而暗,身体易困倦,食欲不振,多汗且黏,大便不实,小便不利,胸闷痰多,舌体胖大,舌苔白腻,口黏腻或甜。
同时,对所筛选出的试服人群计算其体质指数,体质指数(Body Mass Index,BMI),是世界公认的一种评定肥胖程度的分级方法。其计算公式如下:体重指数(BMI)=体重(kg)/[身高(m)]2。
《中国成人超重和肥胖症预防控制指南》中提出判断成人超重和肥胖程度的BMI界限值。其中,BMI<18.5,体重过低;18.5≤BMI<24,体重正常;24.0≤BMI<28,超重;BMI≥28,肥胖。
试服分组
将符合症状标准的人随机分组,每组30人,男女各15人,年龄40~65岁。由于不同年龄段人群的身体代谢速率不同,因此年龄段控制在较为集中的区间范围内。
试服方法
试服人员每日服用2次,每次1袋,用300ml左右的温水(40℃左右)冲服,实验组服用实施例25-27的发酵粉,对照组服用样品G,连续服用并观察6周,填写每周身体变化。
指标观测
效果观测指标主要包括服用前后人群的体重以及身高,并对比试服前后BMI变化,同时记录人群痰湿症状的改善情况。
效果标准
参考《中医内科病证诊断疗效标准》和《中医诊断学》,制定痰湿肥胖症状评分表以及效果判定标准,见表49-50。
表49痰湿肥胖症状积分表
表50效果判定标准
效果等级 | 痰湿症状积分变化 |
痊愈 | 服用前后积分减少80%以上 |
显效 | 服用前后积分减少60%以上 |
有效 | 服用前后积分减少30%以上 |
无效 | 服用前后积分减少30%以下 |
试服结果与分析,见表51。
表51受试者试服前后平均积分、BMI指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05(显著差异);**,与服用前对比,P<0.01(极显著差异);#,与样品G对比,P<0.05(显著差异)。
从上表可以看出,服用实施例27的产品前后,痰湿平均积分、BMI指标均有十分显著差异(P<0.01),表明实施例27的产品对痰湿肥胖人群具有明显的祛湿减肥作用;另一方面,服用样品G的产品前后,痰湿平均积分、BMI指标有显著差异(P<0.05),表明样品G也具有一定的减肥效果。但通过组间对比,实施例27比样品G具有更优的减肥效果(P<0.05)。结果表明,本发明提供的发酵后的产品对痰湿肥胖人群的减肥作用要优于未发酵的产品。
服用实施例25-27的产品和样品G后,有效率情况见表52。
表52有效率情况表
痊愈/人 | 显效/人 | 有效/人 | 无效/人 | 有效率 | |
实施例25 | 5 | 10 | 11 | 4 | 86.7% |
实施例26 | 3 | 11 | 10 | 6 | 80.0% |
实施例27 | 4 | 8 | 13 | 5 | 83.3% |
样品G | 0 | 5 | 9 | 16 | 46.7% |
再来对比两组样品祛湿减肥有效率情况,实验组27有效率为83.3%,要明显高于未发酵的样品G。说明,本发明提供的发酵后的产品的减肥祛湿效果要明显优于未发酵的产品。
测试例26
化学成分测定
甘草经微生物产生的β-葡萄糖醛酸酶水解后,甘草酸转化为甘草次酸,甘草次酸可被肠道直接吸收,短期内在血液中达到较高的药物浓度,迅速作用于靶部位。微生物发酵转化可以将甘草酸转化为生物活性更强的甘草次酸,能够大幅提高甘草酸的药效。
为了验证本发明微生物发酵技术提高药效的作用,对徽琼散发酵前后体系中功能物质甘油三油酸酯、桔梗皂苷D、甘草酸、甘草次酸等四种物质含量进行测定。
1材料与方法
1.1样品
采用实施例25-27和对比例9制备的产品,分别加入产品总量1.6%的微晶纤维素,混合均匀,喷水制粒,58℃烘干至水分7%,整粒,加入2%硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(1.0g/片)。得到实施例25-27和对比例9对应的片剂。
1.2检测方法
1.2.1甘油三油酸酯含量检测
1.2.1.1甘油三油酸酯液相色谱条件
色谱柱:C18色谱柱(250×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-二氯甲烷(70:30);柱温30℃;流速0.8 mL/min;检测器频率10Hz;检测器雾化温度35℃;进样量10μL;洗脱时间30min。
1.2.1.2甘油三油酸酯对照品溶液的制备
将15mg甘油三油酸酯标准品至于50mL容量瓶中,加入乙腈定容,得到浓度0.3mg/mL的标准溶液,备用。
1.2.1.3甘油三油酸酯标准曲线制作
取适量标准品溶液,用流动相配制成浓度为0.05、0.1、0.15、0.2和0.25mg/mL的系列标准溶液。以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=0.6378x+3.2613,相关系数R=0.9994。
1.2.1.4待测样品制备
准确称取粉碎过筛(60目筛)样品0.3g,置于磨口圆底烧瓶中,加入流动相50mL,称定重量,回流提取30min。冷却至室温,称重,用流动相补足损失的重量,摇匀,滤纸过滤。收集滤液过微孔滤膜(0.45μm),待用。
1.2.2桔梗皂苷D含量检测
1.2.2.1桔梗皂苷D色谱条件
色谱柱:C18柱(4.6×150mm,5μm),以乙腈-水(25:75)为流动相梯度洗脱,流速1.0mL/min,蒸发光检测器漂移管温度113℃,载气(N2)流速3.0L/min。
1.2.2.2桔梗皂苷对照品溶液的制备
取桔梗皂苷D对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.5mg的溶液,即得。
1.2.1.3桔梗皂苷D标准曲线制作
精密量取对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8mL于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样20μl。分别以峰面积的积分值为纵坐标,对照品的浓度(μg/mL)为横坐标,得到线性回归方程,y=2108.6x-3317.5,r=0.9992。
1.2.2.4待测样品制备
取待测样品粉末(过60目)约0.5g,精密称定,精密加入50%甲醇50ml,称定重量,超声处理30min,放冷,甲醇补足。精密量取滤液25ml,置水浴上蒸干,残渣加水20ml溶解,用水饱和的正丁醇振摇提取3次,每次20ml,合并正丁醇液,用氨试液50ml洗涤,弃去氨液,再用正丁醇饱和的水50ml洗涤,弃去水液,正丁醇液蒸干,残渣加甲醇3ml使溶解,加硅胶0.5g拌匀,置水浴上蒸干,加于硅胶柱上,以三氯甲烷-甲醇(9:1)混合溶液50ml洗脱,弃去洗脱液,再用三氯甲烷-甲醇-水(60:20:3)混合溶液100ml洗脱,弃去洗脱液,用三氯甲烷-甲醇-水(60:29:6)混合溶液100ml洗脱,收集洗脱液,蒸干,残渣加甲醇溶解,转移至5ml量瓶中,加甲醇至刻度,即得。
1.2.3甘草酸、甘草次酸含量检测
1.2.3.1甘草酸、甘草次酸色谱条件
色谱柱:C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.2mol/L乙酸铵溶液,流速:1.0ml/min,梯度洗脱40min;;检测波长:250nm;柱温:25℃;进样量:10μl。在上述色谱条件下,理论板数以甘草酸铵峰计不低于4 000,甘草酸铵、甘草次酸峰分离度均>1.5。
1.2.3.2甘草酸、甘草次酸对照品溶液的制备
取甘草酸铵对照品、甘草次酸对照品适量,精密称定,加70%乙醇分别制成每1ml含甘草次酸0.1mg、甘草酸铵0.2mg的溶液,即得(甘草酸含量=甘草酸铵含量/1.0207)。
1.2.3.3甘草酸、甘草次酸标准曲线制作
分别精密量取甘草酸、甘草次酸对照品溶液0.6、1.2、1.8、2.4、3、3.6mL于10mL量瓶中,加甲醇定容,摇匀,进样20μl。分别以峰面积的积分值为纵坐标,对照品的浓度为横坐标,进行线性回归,得到甘草酸回归方程,y=856.2x-1.2521,r=0.9994;甘草次酸回归方程,y=1238.4x-6.377,r=0.9989。
1.2.3.4待测样品制备
取待测物样品粉末(过80目筛)约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入70%乙醇100ml,密塞,称定重量,超声处理(功率250W,频率40kHz)30分钟,放冷,再称定重量,用70%乙醇补足,摇匀,滤过,即得。
2结果与分析
2.1甘油三油酸酯、桔梗皂苷D含量对比见表53。
表53甘油三油酸酯、桔梗皂苷D含量(mg/g)
甘油三油酸酯 | 桔梗皂苷D | |
实施例25 | 23.62±1.80 | 6.33±0.42 |
实施例26 | 24.04±1.83 | 6.48±0.50 |
实施例27 | 23.87±1.85 | 6.42±0.44 |
对比例9 | 5.25±0.74 | 1.72±0.29 |
首先来分析甘油三油酸酯、桔梗皂苷D的含量,从上表可以看出,实施例25中薏苡仁有效成分甘油三油酸酯的含量是对比例9的4.5倍,桔梗有效成分桔梗皂苷D是对比例9的3.68倍。从此可以看出,经过酶解+微生物发酵,有效物质甘油三油酸酯和桔梗皂苷D含量有了大幅提高。
2.2甘草酸、甘草次酸含量对比
实施例25-27和对比例9的产品中的甘草酸、甘草次酸含量见表54。
表54甘草酸、甘草次酸含量(mg/g)
甘草酸 | 甘草次酸 | |
实施例25 | 3.83±0.26 | 6.58±1.47 |
实施例26 | 3.90±0.31 | 6.72±1.55 |
实施例27 | 3.94±0.29 | 6.80±1.63 |
对比例9 | 12.16±0.52 | 0.82±0.07 |
经过微生物发酵处理后,实施例25比对比例9的甘草酸含量明显降低,但生物活性更高的甘草次酸含量比对比例9提高了7倍,表明微生物发酵工艺有利于将甘草酸转化为生物活性更高的甘草次酸,可以看出中药发酵技术在提高药效方面的明显优势。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者将实施例25-27中的乳杆菌替换为其他的乳杆菌;以上方法得到的产品的祛湿减肥的效果或者有效成分含量均不如实施例25-27中制备的产品。
测试例27-28采用了实施例28-30和对比例10的产品,用于说明本发明提供的包括西红花、白芷、当归、桔梗、陈皮、干姜、佛手、枸杞子、香薷、肉桂、砂仁、茯苓、甘草、豆蔻和黄芥子的原料组合物的效果。
测试例27人群试服实验
样品制备
按照实施例30的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵,得到的产品记为样品F2。
取实施例28-30的发酵粉和样品F2,分别按照总重量5%、95%称取低聚异麦芽糖粉和发酵粉(或样品F2),并混合均匀,灌装,制成粉体条包(25克/袋)。得到实施例28-30和样品F2分别对应的待测品。
试服人员筛选标准
根据发展程度不同,类风湿性关节炎可以分为3个阶段,早期患者出现高热、乏力疲劳、腰膝酸软、白细胞增高、关节肿胀和运动受限症状。中期患者出现肿胀加剧、局部有发热和有触痛感、手指由掌指关节向尺骨偏斜、近端指间关节呈典型的棱形肿大、关节周围肌肉萎缩、肌肉痉挛、肢体麻木等症状。后期患者出现关节强硬、关节变形、关节剧烈疼痛、皮下结节、血沉率增快等症状。
参照《实用内科学(下册)》(陈灏珠版)类风湿关节炎的诊断标准筛选受试人员,具体标准如下
(1)晨僵时间每天持续至少1小时,病程至少6周。
(2)有3个或3个以上的关节肿,至少6周。
(3)腕、掌指、近指关节肿,至少6周。
(4)对称性关节肿,至少6周。
(5)有类风湿皮下节结。
(6)手X线片改变,至少有骨质疏松和关节间隙的狭窄。
(7)类风湿因子阳性(RF)。
以上7项只要有4项符合,即可诊断为类风湿性关节炎。
试服分组
筛选出符合标准的人,随机分组,每组32人,男女各半,年龄40~75岁,并对该两组试服人员年龄分布进行统计学检验,结果证明,P>0.05,说明该两组在年龄分布上具有可比性。
试服方法
服用方法为每日2次,每次1袋(25克),实验组服用实施例28-30的待测品,对照组服用样品F2的待测品,连续服用并观察9周,填写每周身体变化。服用期间停止一切其他类风湿性关节炎药物,并作息规律。
效果观测
效果观测指标主要包括服用前后晨僵时间、关节疼痛数、血红细胞沉降率(ESR)、类风湿因子(U/ml)。
晨僵时间的计算,以患者清晨醒后出现僵硬感的时间为起点,至患者僵硬感明显减轻的时间为止点,将这一段时间称为晨僵时间.以分钟(min)计。
ESR计算:采用魏氏法(Westergren法),抽取静脉血,并加入抗凝剂,充分混匀,但避免剧烈振荡。将离体抗凝血液置于特制刻度测定管内,垂直立于室温中,1h红细胞层下沉距离,用毫米(mm)数值报告。
类风湿因子(U/ml)计算:使用AU5811自动生化分析仪进行测定类风湿因子浓度,具体参考上海科华生物工程股份有限公司试剂盒的操作方法。
效果标准
参考参照《实用内科学(下册)》(陈灏珠版),制定疗效评价标准,具体标准如下。
晨僵时间<15分钟;无乏力;无关节痛;活动时无关节痛;软组织或腱鞘无肿胀,血红细胞沉降率:女性<30mm/h,男性<20mm/h。
治愈:符合上述5项;
有效:符合上述2项或2项以上;
无效:症状无减轻,体征无变化,实验室检查无变化。
试服结果与分析见表55。
表55受试者试服前后各项指标对比
注:*,与服用前对比,P<0.05(显著差异);**,与服用前对比,P<0.01(极显著差异);#,治疗后,与样品F2组对比,P<0.05(显著差异)。
从上表可以看出,服用实施例27的产品前后,受试人员晨僵时间、疼痛关节数、类风湿因子、血沉速率等四个指标均有十分显著差异(P<0.01),表明实施例27的产品对类风湿关节炎人群具有明显的改善作用;另一方面,服用样品F2前后,四项指标有显著差异(P<0.05),表明样品F2也具有一定的治疗效果。通过组间对比,对比服用F2受试物组治疗后,实施例27的产品的四项指标具有显著差异(P<0.05),表明本发明提供的发酵后得到的产品对治疗类风湿性关节炎的效果要显著优于未发酵的产品。
服用实施例28-30的产品和样品F2后的治疗效果见表56。
表56治疗效果对比
组别 | 例数 | 治愈 | 有效 | 无效 | 中途退出 | 总有效率/% |
实施例28 | 32 | 9 | 12 | 4 | 7 | 84.0% |
实施例29 | 32 | 12 | 10 | 5 | 5 | 81.5% |
实施例30 | 32 | 11 | 13 | 4 | 4 | 85.7% |
样品F2 | 32 | 4 | 11 | 14 | 3 | 51.7% |
其中,总有效率=治愈数+有效数/(例数-中途退出数)。可见经过9周的治疗后,实施例30治疗类风湿关节炎的有效率达到了85.7%,明显高于样品F2组。再次验证,经过微生物发酵后的产品作用更优。
测试例28
化学成分测定
为了验证本发明采用微生物发酵技术减毒增效的效果,对发酵前后体系中的橙皮苷、橙皮素、肉桂醛、肉桂酸、西红花苷、西红花酸含量进行测定。
1.材料与方法
材料
样品
采用实施例28-30和对比例10制备的产品,分别加入中药粉量1.8%的微晶纤维素,混合均匀,喷入水制粒,将制好的湿颗粒65℃烘干至水分8%,整粒,得到干颗粒,加入干颗粒总量2.3%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(2.8g/片)。
1.1.2橙皮苷、橙皮素对照品及待测液制备
橙皮苷、橙皮素对照品溶液的制备:取橙皮苷、橙皮素对照品适量,精密称定,加甲醇制成0.4mg/mL标准品溶液。
橙皮苷、橙皮素待测品溶液的制备:取本品粗粉约1g,精密称定,置索氏提取器中,加石油醚(60~90℃)80mL,加热回流2~3小时,弃去石油醚,药渣挥干,加甲醇80mL,再加热回流至提取液无色,放冷,滤过,滤液置100mL量瓶中,用少量甲醇分数次洗涤容器,洗液滤入同一量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1.1.3肉桂醛、肉桂酸对照品及待测液制备
肉桂醛/肉桂酸对照品溶液的制备:取肉桂醛、肉桂酸对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含10μg的溶液,即得。
肉桂醛/肉桂酸待测液的制备:取待测样品粉末约0.5g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理(功率350W,频率35kHz)10分钟,放置过夜,同法超声处理一次,再称定重量,用甲醇补足重量,摇匀,滤过。精密量取滤液1ml,置25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1.1.4西红花苷、西红花酸对照品及待测液制备
(1)西红花苷、西红花酸对照品溶液的制备:取西红花苷-I对照品、西红花苷-Ⅱ、西红花酸对照品适量,精密称定,加稀乙醇定容,即得。
(2)西红花苷、西红花酸供试品溶液的制备:取样品P1、P2各0.1g,精密称定,置50mL棕色量瓶中,加稀乙醇适量,置冰浴中超声20分钟,放至室温,加稀乙醇稀释至刻度,摇匀,滤过,取滤液,即得。
1.2检测方法
1.2.1肉桂醛、肉桂酸色谱检测方法
采用C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm),流动相A:0.1%磷酸;流动相B:乙腈。洗脱程序:0~3min,36%乙腈;3~9min,36%~46%乙腈;9~11min,46%~36%乙腈;检测波长:284nm;柱温:25℃;体积流量:1.0ml/min。在上述条件下,肉桂醛与肉桂酸得到了较好的分离,相邻峰间分离度均大于1.5。
分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10μl,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
1.2.2橙皮苷、橙皮素液相色谱检测方法
采用C18色谱柱,以甲醇-醋酸-水(35:4:61)为流动相,检测波长为283nm。理论板数按橙皮苷峰计算应不低于2000。
分别精密吸取对照品溶液与供试品液各5μL,注入液相色谱仪,测定,即得。每个样品进样3次,测其平均值。
1.2.3西红花苷、西红花酸液相色谱检测方法
色谱柱采用C18柱(4.6mm×250mm,5μm),以甲醇-水(45:55)为流动相;检测波长为440nm。理论板数按西红花苷-I峰计算应不低于3500。
分别精密吸取西红花苷-I对照品、西红花苷-Ⅱ对照品、西红花酸对照品溶液与供试品溶液各10μL,注入液相色谱仪,测定,即得。
2结果与分析
2.1肉桂醛、肉桂酸、橙皮苷、橙皮素含量对比。
对比结果见表57。
表57肉桂醛、肉桂酸、橙皮苷、橙皮素含量对比
肉桂醛(mg/g) | 肉桂酸(mg/g) | 橙皮苷(mg/g) | 橙皮素(mg/g) | |
实施例28 | 6.47±1.33 | 7.18±0.83 | 12.59±1.71 | 18.07±1.93 |
实施例29 | 6.65±1.42 | 7.66±0.87 | 13.02±1.80 | 17.95±1.88 |
实施例30 | 6.70±1.48 | 7.81±0.92 | 13.35±1.85 | 18.54±12.03 |
对比例10 | 18.25±2.06 | 0.60±0.17 | 44.38±3.74 | 3.18±0.76 |
从实施例28和对比例10可以看出,经过发酵后肉桂醛含量明显降低,而活性更好的肉桂酸含量是发酵前的12倍,从而可以验证,微生物发酵技术对人体有一定副作用的肉桂醛含量大幅降低,转化为生物活性更高的肉桂酸,药效提高。并且,经过微生物发酵后橙皮苷含量明显降低,橙皮素含量是发酵前的5.7倍。由此可见,微生物发酵可以对橙皮苷进行生物转化,转化为活性更强的橙皮素,生物活性大幅提高。
2.2西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ、西红花酸含量对比
对比结果见表58。
表58西红花苷-I、西红花苷-Ⅱ、西红花酸含量对比
西红花苷-Ⅰ(mg/g) | 西红花苷-Ⅱ(mg/g) | 西红花酸(mg/g) | |
实施例28 | 35.03±2.88 | 22.94±1.83 | 33.26±3.92 |
实施例29 | 36.62±2.54 | 23.12±1.90 | 32.59±3.84 |
实施例30 | 36.35±2.60 | 22.47±1.96 | 31.16±4.12 |
对比例10 | 69.75±5.62 | 51.53±4.77 | 2.43±1.05 |
从实施例28和对比例10可以看出,经过微生物发酵处理后,西红花苷-I含量明显降低,西红花苷-Ⅱ含量也明显降低,西红花酸含量是发酵前的13.7倍。表明发酵工艺有利于将西红花苷转化为生物活性更高的西红花酸,可以看出中药发酵技术在提高药效方面的明显优势。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者改变芽孢杆菌发酵和乳酸菌发酵的顺序;或者将实施例28-30中的芽孢杆菌或乳杆菌替换为其他的芽孢杆菌或乳杆菌;以上方法得到的产品的治疗类风湿性关节炎的效果或者有效成分含量均不如实施例28-30中制备的产品。
测试例29-30采用实施例31-33和对比例11的产品,用于说明本发明提供的包括菊苣、栀子、葛根、桑叶、百合、鱼腥草、淡竹叶、薏苡仁、蒲公英和菊花的原料组合物的效果。
测试例29动物实验
本试验采用高尿酸血症小鼠模型,经口灌胃给予受试样品,检测小鼠血清尿酸(UA)、肌酐(CRE)、尿素氮(BUN)和肝脏黄嘌呤氧化酶活性(XOD)等指标,观察受试样品是否具有改善高尿酸血症的功能。
1材料与方法
1.1实验材料
1.1.1实验动物
SPF级雄性小鼠,体重18~22g。
1.1.2实验样品
采用实施例31-33和对比例11的产品,分别用生理盐水溶解成1230、2460、4920mg/mL的浓度,灌胃量均为10mL·kg-1。
1.2实验方法
1.2.1实验设计
采用250mg/kg·d氧嗪酸钾对小鼠连续灌胃21天,建立小鼠高尿酸血症动物模型,设为模型对照组,正常对照组小鼠灌胃同等剂量的生理盐水。在当天结束氧嗪酸钾灌胃1h后,向阳性对照组小鼠灌胃5mg·kg-1的别嘌呤醇溶液,其他实验组小鼠分别灌胃受试物样品,空白对照组与模型组灌胃等量的生理盐水。灌胃前1h对小鼠进行禁食处理。第20日灌胃结束后对小鼠12h禁食,以便第21天灌胃结束后进行检测样品的提取工作。
1.2.2实验分组
实验包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组、实施例31低剂量组、实施例31中剂量组、实施例31高剂量组,其余实施例和对比例设置高剂量组,每组小鼠各10只。
1.2.3血清样品的收集
最后1d灌胃给药后1h,摘取小鼠的眼球进行取血,血液经4℃低温离心(8000rpm,10min)后取血清,用于血液中尿酸(UA)、血清尿素氮(BUN)、肌酐(CRE)的测定。
1.2.4血清中尿酸、肌酐和尿素氮含量的测定
采用尿酸(UA)测试盒、尿素氮(BUN)测试盒及肌酐(CRE)测试盒来测定小鼠血清UA、BUN及Cr的含量。
1.2.5小鼠黄嘌呤氧化酶(XOD)活性的测定
黄嘌呤氧化酶是促进黄嘌呤转化成为尿酸的关键酶,抑制黄嘌呤氧化酶的活性可以抑制尿酸生成,降低血清尿酸含量。因此,测量黄嘌呤氧化酶的活性十分重要。
取各组小鼠的肝脏样本,加入4℃的生理盐水,按照质量比1:9的比例制成10%的肝脏组织匀浆,4℃,6000rpm离心10min,轻轻吸掉表面脂肪组织后,得到上清液,采用总蛋白(TP)测试盒测定肝脏组织匀浆中的总蛋白含量,然后采用黄嘌呤氧化酶(XOD)测试盒来测定小鼠肝脏组织匀浆中XOD活性。
2实验结果与分析
各实验组小鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮含量检测结果见表59。
表59各组小鼠血清中尿酸、肌酐和尿素氮含量检测结果(n=10)
注:##,与正常对照组相比,P<0.01(极显著差异);*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01(极显著差异)。
从上表可以看出,与正常对照组相比,模型对照组UA、BUN、CRE含量均有极显著差异(P<0.01),表明高尿酸血建模成功。与模型对照组相比,实施例31低剂量组UA含量显著降低(P<0.05),实施例31中剂量组尿酸含量明显降低(P<0.01),尿素氮显著降低(P<0.05),肌酐含量显著降低(P<0.05);实施例31高剂量组尿酸、尿素氮、肌酐含量均极显著降低(P<0.01)。实施例31高剂量组的效果与阳性嘌呤醇药物组效果相当。结果表明,采用本发明实施例31制备的发酵后的产品组合物能够有效降低高尿酸血小鼠血清中尿酸、尿素氮、肌酐含量。
与模型对照组相比,对比例11高剂量组能够在一定程度上降低血清中尿酸、尿素氮、肌酐含量(P<0.05),但降尿血酸效果远不如实施例31高剂量组。
各组小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性检测结见表60。
表60各组小鼠肝脏黄嘌呤氧化酶(XOD)活性检测结果(n=10)
注:##,与正常对照组相比,P<0.01(极显著差异);*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01(极显著差异)。
从上表可以看出,实施例31中剂量组能显著抑制黄嘌呤氧化酶活力(P<0.05),高剂量组能十分显著抑制黄嘌呤氧化酶活力(P<0.01)。对比例11高剂量组能限制黄嘌呤氧化酶活力,但效果远不如实施例31高剂量组。
测试例30有效成分含量测定
栀子苷能够降低血清中尿酸、肌酐和尿素氮水平,提高尿液尿酸、肌酐排泄量及尿酸排泄分数,抑制肾脏尿酸重吸收,并促进尿酸排泄。药代动力学研究发现,栀子的药理活性主要是通过肠道微生物分解代谢栀子苷为京尼平,从而发挥药效。生物活性更强的京尼平具有保肝利胆、显著抗炎、抗脂质过氧化、抗血管生成等生理作用。
绿原酸、菊苣酸为有机酸类物质,是咖啡酸的衍生物,均具有抗菌、抗病毒、提高免疫力、抗炎、抗氧化、清除自由基的作用。
为了验证本发明微生物发酵技术提高药效的作用,对治疗高尿酸血症组合物发酵前后体系中功能物质菊苣酸、栀子苷、京尼平、绿原酸等四种物质含量进行测定。
1材料与方法
1.1样品
按照实施例33的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。得到的产品记为样品P2。
取实施例31-33制备的发酵粉和样品P2,并分别按照总重量的15%、85%称取低聚异麦芽糖和发酵粉(或样品P2),混合均匀,灌装,制成粉体剂型(20g/袋)。
1.2检测方法
1.2.1菊苣酸含量检测
1.2.1.1菊苣酸液相色谱条件
色谱柱:C18色谱柱(250×4.6mm,5μm);流动相:以乙腈为流动相A,以0.1%磷酸溶液为流动相B,采用梯度洗脱。0~14min流动相A由13%上升到15%,流动相B由87%下降到85%;14~29min流动相A由15%上升到18%,流动相B由85%下降到82%;29~35min流动相A由18%上升到26%,流动相B由82%下降到74%;35~48min保持A为26%,B为74%;柱温35℃;流速1.0mL/min;检测器波长:323nm。理论塔板数按菊苣酸计不低于5000。
1.2.1.2菊苣酸对照品溶液的制备
精密称取10mg菊苣酸标准品至于50mL容量瓶中,加入50%甲醇定容,得到浓度0.2mg/mL的标准溶液,备用。
1.2.1.3菊苣酸标准曲线制作
精密称取标准品溶液0.08、0.16、0.32、0.64和1.28mL置于10ml容量瓶中,定容。精密称取各个梯度对照品溶液10μl,以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为Y=0.7254X-0.1083,R2=0.9994。
1.2.1.4待测样品制备
精密称取待测品约1g,置于具塞锥形瓶中,精密加入50%甲醇50mL,称定重量,超声(250W,40kHz)处理30min,取出,放冷,再称定重量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,用0.45μm的针式过滤器过滤,取续滤液,即得供试品溶液。
1.2.2栀子苷、京尼平含量检测
1.2.2.1栀子苷、京尼平色谱条件
采用C18色谱柱(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水(45:55);流速:1.0mL/min;检测波长:238nm,柱温为25℃。
1.2.2.2栀子苷、京尼平对照品溶液的制备
取栀子苷对照品25mg,精密称定,加50%甲醇定容至50ml,得到浓度0.5mg/mL的标准溶液,备用。
取京尼平对照品6mg,精密称定,加50%甲醇定容至50ml,得到浓度0.12mg/mL的标准溶液,备用。
1.2.1.3栀子苷、京尼平标准曲线制作
精密量取栀子苷对照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.5mL于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样20μl。分别以峰面积为纵坐标,进样浓度为横坐标,得到线性回归方程,y=2638.5x-56.312,R2=0.9937。
精密量取京尼平对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mL于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样20μl。分别以峰面积为纵坐标,进样浓度为横坐标,得到线性回归方程,y=3502.9x+27.236,R2=0.9914。
1.2.2.4待测样品制备
取待测物样品粉末(过60目筛)约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇25ml,称定重量,超声处理20分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,滤过。精密量取续滤液10ml,置25ml量瓶中,加甲醇至刻度,摇匀,即得。
1.2.3绿原酸含量检测
1.2.3.1绿原酸色谱条件
色谱柱:C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.4%磷酸水溶液(12:88),流速:1.0ml/min,紫外检测波长:327nm;柱温:室温;进样量:10μl。在上述色谱条件下,理论板数以绿原酸峰计不低于2500。
1.2.3.2绿原酸对照品溶液的制备
取绿原酸对照品14mg,精密称定,加甲醇溶解,定容至50ml,制成每1ml含绿原酸0.28mg的溶液。
1.2.3.3绿原酸标准曲线制作
精密量取京尼平对照品溶液0.3、0.6、0.9、1.2、1.5、1.8、2.1mL于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样10μl。分别以峰面积为纵坐标,进样浓度为横坐标,得到线性回归方程,y=18243.66x+1652.37,R2=0.9987。
1.2.3.4待测样品制备
取待测物样品粉末(过60目筛)约0.4g,精密称定,置烧瓶中,准确加入体积分数50%甲醇50ml,称重,加热回流2h,冷却,称取质量,用50%甲醇补足减失的重量,摇匀,过滤。精密量取滤液,用0.45μm微滤膜过滤,作为待测品溶液,备用。
3结果与分析
2.1绿原酸、菊苣酸、栀子苷、京尼平含量对比
结果见表61。
表61样品P1、P2菊苣酸、绿原酸、栀子苷、京尼平含量对比(mg/g)
菊苣酸 | 绿原酸 | 栀子苷 | 京尼平 | |
实施例31 | 8.35±0.58 | 6.77±0.46 | 24.12±3.80 | 12.57±2.60 |
实施例32 | 8.44±0.61 | 6.21±0.38 | 23.82±3.85 | 12.04±2.66 |
实施例33 | 8.26±0.53 | 6.38±0.41 | 23.01±3.62 | 12.28±2.53 |
样品P2 | 2.41±0.30 | 1.26±0.22 | 56.33±4.28 | 0.27±0.05 |
从上表可以看出,实施例33的产品中菊苣酸、绿原酸、京尼平等3种有效物质的含量均高于样品P2,其中,实施例33的产品比样品P2菊苣酸含量提高了2.43倍,绿原酸含量比样品P2提高了4.06倍。由于在发酵过程中,部分栀子苷转化为了其苷元物质--京尼平,因此实施例33的产品中栀子苷含量比样品P2明显减少,京尼平含量比样品P2增加了44.5倍。
从此可以看出,经过酶解+微生物发酵,体系中有效物质菊苣酸、绿原酸均有了大幅提高,生物活性更强的京尼平含量也大幅增加,为治疗高尿酸血症组合物提供了物质基础支持。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者将实施例31-33中的芽孢杆菌或乳杆菌替换为其他的芽孢杆菌或乳杆菌;以上方法得到的产品的降低尿酸的效果或者有效成分含量均不如实施例31-33中制备的产品。
测试例31-32采用实施例34-36和对比例12的产品,用于说明本发明提供的包括桑叶、黄精、葛根、淡竹叶、玉竹、人参、山药、乌梅和甘草的原料组合物的效果。
测试例31动物实验
采用四氧嘧啶诱导构建高血糖小鼠模型,经口灌胃给予受试样品,检测小鼠体质量、空腹血糖值、葡萄糖耐受量、肝脏肝糖原含量、肝匀浆超氧化物歧化酶酶活力、肝匀浆丙二醛含量,验证受试样品是否具有降低血糖的功能。
1材料与方法
1.2实验材料
1.2.1实验动物
SPF级雄性小鼠。
1.2.2受试物样品
采用本发明实施例34-36和对比例12的产品。
1.2实验方法
1.2.1高血糖小鼠模型建立
将雄性小鼠禁食16小时后,对实验小鼠腹腔注射1%四氧嘧啶200mg/kg/d,连续7天后,将小鼠禁食6小时,检测小鼠血糖值,当小鼠血糖值在15-30mmol/L时,认为造模成功。
1.2.2实验分组
选取10只正常小鼠作为空白对照组,选取高血糖模型成功的小鼠,按血糖值随机分组,每组10只,分别设置为模型对照组、阳性药物对照组(盐酸二甲双胍,200mg/kg)、实施例34高剂量组(3280mg/kg)、实施例35高剂量组(3280mg/kg)、实施例36低剂量组(820mg/kg)、实施例36中剂量组(1640mg/kg)、实施例36高剂量组(3280mg/kg),对比例12高剂量组(3280mg/kg),各组小鼠以标准饲料喂养,自由饮水,适应性喂养1周后进入实验。实验前记录小鼠的空腹血糖值和体重值,并对各组小鼠禁食不禁水10小时,正常组、模型组给予蒸馏水,实验组分别给予不同剂量的受试物,28天后,将各组小鼠禁食5小时后进行体质量检测、空腹血糖检测、葡萄糖耐量实验以及肝器系数、肝脏指标(肝糖原、SOD酶、丙二醛)测定。
1.2.3空腹血糖检测
对各组小鼠禁食5小时后,尾尖采血,用血糖仪测空腹血糖值,检测各小鼠的空腹血糖值并进行分析。此外,对各组实验前后空腹血糖下降百分率进行了统计学分析,观察实验各剂量组血糖下降百分率相对对照组是否表现出统计学差异。
血糖降低率=(实验前血糖值-实验后血糖值)/实验前血糖值×100%;
1.2.4葡萄糖耐量实验
葡萄糖耐量实验是一种葡萄糖负荷试验。当胰岛β细胞功能正常时,机体在进食糖类后,通过各种机制使血糖在2~3小时内迅速恢复到正常水平,这种现象称为耐糖现象。利用这一试验可了解胰岛β细胞功能和机体对糖的调节能力。
根据《保健食品检验与评价技术规范(2003)》相关要求,将各组实验小鼠禁食5小时后,经口给予葡萄糖2.0g/(kg.bw),测定给葡萄糖后0、30、60、90、120分钟时的血糖值,做出葡萄糖耐量曲线,并对各组小鼠给葡萄糖后各时间点血糖曲线下面积的变化进行分析,确定受试样品是否具有改善葡萄糖耐量的作用,血糖曲线下面积的计算公式如下:
血糖曲线下面积=0.25×(0小时血糖值+4×0.5小时血糖值+3×2小时血糖值)。
1.2.5脏器指数测定
小鼠称重取血后,开腹取胸腺和脾脏,用电子天平称重,并计算。
脏器指数%=(脏器湿质量/体质量)×100%
1.2.6肝糖原、SOD酶活、丙二醛含量检测
取出小鼠肝组织置于无菌生理盐水中制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液,按照试剂盒说明书分别测定超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)、肝糖原含量。SOD测试盒、MDA试剂盒、肝糖原ELISA试剂盒均采用上海晶抗生物工程有限公司。
2 实验结果与分析
2.1 对小鼠体质量的影响
结果见表62。
表62各组小鼠体质量变化记录
注:与模型对照组相比,*,P<0.05(显著差异);与模型对照组相比,**,P<0.01(极显著差异);与正常对照组相比,##,P<0.01(极显著差异)。
给予小鼠注射四氧嘧啶建立高血糖模型,建模后的小鼠血糖值达21.36±5.09mmol/L,正常对照组小鼠的血糖值为6.28±1.35mmol/L。另外,造模后除正常组外,其他组小鼠体质量均有下降。同时发现模型组小鼠有明显的多尿、多饮、多食、体型消瘦,毛发无光泽,蜷卧拱背,没有精神;而正常对照组精神状态良好,毛发光泽,生长发育正常,表明造模成功。
与正常对照组相比,模型对照组培养4周时体质量明显低于正常组(P<0.01)。与模型对照组相比,实施例36中剂量组小鼠体质量有明显增加(P<0.05),实施例36高剂量组、阳性对照组小鼠体质量有十分显著增加(P<0.01)。相对于对比例12高剂量组,实施例36高剂量组的高剂量组具有明显更好的效果。
2.2对小鼠空腹血糖的影响
各组小鼠空腹血糖数值变化见表63。
表63各组小鼠空腹血糖数值
从上表可以看出,与正常对照组相比,给药前模型对照组小鼠空腹血糖明显高于正常对照组,表明建模成功。模型对照组小鼠饲养28天后,血糖值增加了32.12%,正常组小鼠血糖较为平稳。实施例36低剂量组经给药28天后,血糖降低了16.64%,中剂量组血糖降低了38.06%,高剂量组血糖降低了46.97%,比对比例12的高剂量组效果明显。由此可见,本发明提供的发酵粉对高血糖小鼠的血糖升高具有一定的抑制作用。
2.3对小鼠葡萄糖耐受量的影响
结果见表64。
表64各组小鼠葡萄糖耐受量数值(mmol/L)
0小时 | 0.5小时 | 2小时 | 血糖曲线下面积 | |
正常对照组 | 9.13±1.66 | 13.05±1.83 | 6.25±1.23 | 20.02±1.55 |
模型对照组 | 28.65±4.12 | 31.33±4.54 | 28.81±4.37 | 60.10±4.28## |
阳性对照组 | 22.35±3.63 | 27.85±3.80 | 17.76±3.11 | 46.76±3.60** |
实施例34高剂量组 | 22.26±3.51 | 27.05±3.70 | 18.23±2.84 | 46.29±3.81** |
实施例35高剂量组 | 22.34±3.27 | 26.91±3.68 | 18.11±2.85 | 46.08±3.84** |
实施例36低剂量组 | 25.57±3.74 | 29.46±4.01 | 26.89±3.84 | 56.02±3.67 |
实施例36中剂量组 | 23.2±3.36 | 27.72±3.52 | 20.58±2.90 | 48.96±3.44* |
实施例36高剂量组 | 22.49±3.03 | 27.16±3.76 | 18.53±2.88 | 46.68±3.79** |
对比例12高剂量组 | 23.82±3.22 | 28.16±3.62 | 21.44±2.94 | 50.20±3.51* |
注:##,与正常对照组相比,P<0.01(极显著差异);*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01(极显著差异)。
由上表数据可知,正常对照组小鼠在灌胃葡萄糖之后0.5h内血糖值达到最大,2h后恢复到正常水平,表现为正常糖耐量。模型对照组小鼠在灌胃后0.5h血糖值达到最高,但2h后血糖值仅回落了8.04%。阳性药物对照组的血糖值在2h后回落了36.23%。实施例36各组2h后血糖值均有回落,回落最多的是实施例36高剂量组,回落了31.77%。实施例36中剂量组的血糖曲线下面积显著低于模型对照组(P<0.05),实施例36高剂量组的血糖曲线下面积极显著低于模型对照组(P<0.01)。并且,实施例36高剂量组的效果明显强于对比例12高剂量组。可见本发明提供的发酵粉可显著降低高血糖小鼠的血糖曲线下面积。
2.4对小鼠脏器系数的影响
各组小鼠脏器系数结果见表65。
表65各组小鼠脏器系数
注:与模型对照组相比,*,P<0.05(显著差异);与模型对照组相比,**,P<0.01(极显著差异);与正常对照组相比,##,P<0.01(极显著差异)。
持续高血糖会导致机体免疫系统失调,而脾脏和胸腺是重要的免疫器官。从上表可以看出,与正常对照组相比,模型对照组肝脏系数、脾脏系数、胸腺系数均有明显差异(P<0.01),表明脾脏和胸腺明显萎缩,免疫功能可能下降,四氧嘧啶可损伤小鼠胸腺、肝脏、脾脏等重要脏器。
实施例36中、高剂量组的脾脏和胸腺系数均高于模型组,说明一定剂量的发酵粉对脾脏和胸腺有一定的保护作用。肝脏是糖代谢的主要器官之一,它能够促进糖原的合成及储存,与正常组相比,模型组小鼠的肝脏系数明显较高(P<0.01),受试物中、高剂量组的肝脏系数均明显低于高血糖模型组(P<0.05)。可见一定剂量的本发明提供的发酵粉对由高血糖引起的脏器损伤具有一定的保护作用。
2.5对小鼠肝脏指标的影响
小鼠肝糖原、SOD酶、丙二醛含量情况见表66。
表66各组小鼠肝糖原、SOD酶、丙二醛含量数据
肝糖原/(mg/g) | 肝匀浆SOD酶活/((U/mg) | 丙二醛含量(nmol/mg) | |
正常对照组 | 20.86±3.55 | 243.6±28.3 | 12.06±2.11 |
模型对照组 | 8.79±2.03## | 141.7±15.4## | 21.18±2.76## |
阳性对照组 | 17.02±3.30** | 202.3±22.6** | 15.85±2.30** |
实施例34高剂量组 | 17.11±3.44** | 215.6±23.5** | 14.93±1.87** |
实施例35高剂量组 | 16.29±3.23** | 203.7±23.8** | 15.15±1.92** |
实施例36低剂量组 | 10.38±2.25 | 156.3±16.1 | 19.01±2.88 |
实施例36中剂量组 | 14.55±2.66* | 187.4±20.6* | 16.27±2.25* |
实施例36高剂量组 | 16.74±3.19** | 210.3±22.7** | 15.06±2.01** |
对比例12高剂量组 | 14.03±2.54* | 176.2±19.6* | 17.05±2.12* |
注:##,与正常对照组相比,P<0.01(极显著差异);*,与模型对照组相比,P<0.05(显著差异);**,与模型对照组相比,P<0.01(极显著差异)。
模型对照组小鼠肝糖原含量、肝匀浆SOD酶活极显著低于正常对照组小鼠(P<0.01),肝匀浆丙二醛含量极显著高于正常对照组小鼠(P<0.01),其中肝糖原含量较正常对照组减少57.86%,SOD酶活力减少41.83%,丙二醛含量比正常组增加75.62%。
与模型对照组相比,实施例36中剂量组有显著影响(P<0.05),实施例36高剂量组有极显著影响(P<0.01)。结果表明,四氧嘧啶诱导小鼠高血糖后,小鼠肝脏肝糖原合成能力严重受损,抗氧化能力受损,机体清除自由基能力减弱,产生的有害成分增多。而一定剂量的本发明提供的发酵粉可以显著改善小鼠肝糖原合成能力,提高肝脏SOD酶活力,减少体内有害物质丙二醛的含量。
测试例32有效成分含量测定
植物多糖类物质具有良好的降血糖功效,可以促进肝糖原合成代谢,促进糖降解,起到了类似于胰岛素的功能而降低血糖,同时可以促进胰岛素分泌、改善胰岛素抵抗,调节相关酶活性,增加胰岛素的敏感性,改善糖、蛋白质及脂肪代谢紊乱,抑制糖异生,从而使血糖降低。除了较好的降血糖功效,植物多糖还具有如免疫调节、抗肿瘤、降血脂、抗辐射、抗菌抗病毒、抗疲劳、保护肝脏、抵抗衰老等有多种生物活性。
植物黄酮类物质可以通过提高机体的抗氧化性,清除体内多余自由基,对受自由基侵害的胰岛β细胞起到一定的保护作用,使胰岛素分泌趋于正常,从而使血糖浓度降低。其中,葛根素可通过增加抗氧化酶的活性,改善胰岛素抵抗来发挥降血糖作用。葛根素能有效降低血糖浓度,减少血清胆固醇含量,明显对抗肾上腺素的升血糖作用。另外,葛根黄酮、桑叶黄酮可有效抑制α-葡萄糖苷酶活性,改善机体糖调节,有降血糖的功能。
本发明提供的发酵组合物中含有的多糖、黄酮类物质可以通过促进肝糖原合成,促进糖降解,同时提高机体抗氧化性,清除多余自由基而使血糖浓度降低。
为此,本测试例对降血糖组合物发酵前后体系中功能成分总多糖、总黄酮含量进行测定。
1材料与方法
1.1样品
按照实施例35的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。制备的产品记为样品P2。
取实施例34-36制备的产品和样品P2,分别加入发酵粉(或样品P2)重量的2.5%的微晶纤维素,喷水制粒,68℃烘干至水分6.2%,整粒,加入总量1.3%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片制成片剂(1.2g/片)。
蒽酮硫酸试剂:0.2g蒽酮溶于100ml浓H2SO4中,当日配制使用(浓度0.2%)。
葡萄糖标准液:称取100mg葡萄糖于烧杯内溶解,然后容量瓶定容,制成标准液浓度1mg/ml。
1.2多糖含量检测方法
1.2.1多糖标准曲线测定
取2.5ml各浓度葡萄糖标准液于试管中,加入6.5ml 0.2%蒽酮浓硫酸试剂,混匀,室温静置1h,于波长620nm处比色,读出吸光度OD值。以吸光度为横坐标,标准液浓度为纵坐标制作标准曲线,得到多糖标准方程如下:y=0.1037x+0.0153(r=0.9986)
1.2.2多糖含量的测定
采用蒽酮硫酸比色法检测多糖含量。首先将样品溶液8500rpm离心10min,取上清液加入无水乙醇,反复倾倒几次后,置于4℃冰箱过夜。6000rpm离心10min,去掉上清液,收集沉淀得到粗多糖,加水溶解,并定容,即为待测液。待测液于试管中加入0.2%蒽酮-浓硫酸试剂,混匀,室温静置1h,620nm处得出OD值,代入标准方程,可得粗多糖含量。
1.3总黄酮含量的测定
1.3.1总黄酮标准曲线制作
用葛根素标准品制作标准曲线,精密称定5mg葛根素,用乙醇定容至25mL容量瓶中,依次量取0.5、1、1.5、2、2.5mL,分别乙醇定容至10mL容量瓶中,于250nm处测得标准液吸光度,得到回归方程y=15.382x+0.3204,r=0.9992。
1.3.2总黄酮含量测定
吸取2ml样品溶液两份,分别置于25ml比色管中,补水至10ml,其中一份不加硝酸铝溶液,做样品空白组。另一组加入硝酸铝显色后用滤纸过滤,弃去初滤液,收集滤液备测。以试剂空白溶液调节零点,在波长250nm处测吸光度,测得样品吸光度减去样品空白吸光度,利用标准曲线计算出待测溶液中总黄酮含量。
2结果与分析
2.1总多糖、总黄酮含量对比
各产品中总多糖、总黄酮含量结果见表67。
表67总多糖、总黄酮含量
总多糖/% | 总黄酮/% | |
实施例34 | 37.28±3.49 | 12.60±1.41 |
实施例35 | 36.28±3.13 | 12.74±1.45 |
实施例36 | 36.33±3.80 | 13.03±1.52 |
样品P2 | 11.46±1.28 | 2.85±0.57 |
从上表可以看出,经过酶解、发酵工艺制备出的实施例35中总多糖、总黄酮含量明显较高,分别是样品P2的3.17倍、4.47倍。从此可以看出,经过酶解+微生物发酵,本发明提供的产品中有效物质总多糖、总黄酮含量均有了大幅提高,为组合物降血糖功效提供了物质基础支持。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者将实施例34-36中或乳杆菌替换为其他的乳杆菌;以上方法得到的产品的降低血糖的效果或者有效成分含量均不如实施例34-36中制备的产品。
测试例33-34采用实施例37-39和对比例13制备的产品,用于说明本发明提供的包括葛根、枳椇子、藤茶、陈皮、姜黄、人参、茯苓、决明子、砂仁和甘草的原料组合物的效果。
测试例33动物实验
1材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物:健康昆明种雄性小鼠,18~22g。
1.1.2试剂:56度红星二锅头白酒(北京红星股份有限公司)、阳性药物海王金樽(深圳海王健康科技有限公司)、ADH测定试剂盒、ALDH测定试剂盒、AST测定试剂盒、ALT测定试剂盒、GSH-Px测定试剂盒、SOD测定试剂盒、MDA试剂盒,试剂盒均采购自南京建成生物工程研究所。
1.1.3实验样品
按照实施例38的方法制备产品,不同的是,各酶在加入之前先在115℃下灭活60min,同时不进行发酵。得到的产品记为样品M1。
1.1.4
取实施例37-39的产品和样品M1,分别加入中药粉总量的2.5%的微晶纤维素,喷水制粒,62℃烘干至水分9.2%,整粒,加入总量1.8%的硬脂酸镁混合,将总混合物压片(1.2g/片),得到受试物。
1.2实验方法
1.2.1小鼠醉酒量确认
将小鼠随机分组,每组5只,禁食12h后,采取灌胃给酒的方式,设置5个灌酒梯度,12、15、18、21、24ml/kg。醉酒与否,以翻正反射是否消失为准,即小鼠灌酒后将其背向下,若小鼠背向下的姿势保持30秒以上,认为翻正反射消失,认定为醉酒。
1.2.2实验分组
将不同受试物与蒸馏水混合均匀,分别得到0.286g/ml、0.572g/ml、1.144g/ml受试物溶液。实验包括正常对照组、模型对照组、阳性对照组(海王金樽灌胃量3.65g/kg)、实施例37高剂量组(受试物灌胃量11.44g/kg)、实施例38低剂量组(2.86g/kg)、实施例38中剂量组(5.72g/kg)、实施例38高剂量组(11.44g/kg)、实施例39高剂量组(11.44g/kg)和样品M1高剂量组(11.44g/kg),每组8只。
1.2.2.1酒前给药,验证组合物延长醉酒潜伏时间
实验前各组小鼠禁食、不禁水12小时,各组按照0.1ml/10g灌胃相应的受试物溶液,正常对照组、模型对照组灌胃等量蒸馏水。
模型对照组、阳性对照组和各实施例组灌胃相应的受试物溶液30min后,按照18ml/kg灌胃56度红星二锅头白酒,正常组灌胃等量蒸馏水。监测各组小鼠翻正反射时间。
1.2.2.2酒后给药,验证组合物缩短醉酒恢复时间
正常组正常饮食饮水,模型对照组小鼠禁食、禁水12小时,按照18ml/kg灌胃56度红星二锅头白酒,正常组灌胃等量蒸馏水。
灌酒30min后,各组按照0.1ml/10g灌胃相应的受试物溶液,监测各组小鼠翻正反射时间。
1.2.3观察及监测指标及方法
1.2.3.1翻正反射时间测定
以小鼠翻正反射消失为观察指标,观察记录各组小鼠醉酒潜伏时间(从灌酒到翻正反射消失的时间)、醉酒恢复时间(翻正反射消失到恢复时间)。
1.2.3.2血液中乙醇、乙醛含量测定
对1.2.2.1各组小鼠,灌胃给酒后30min,对每组小鼠摘眼球取血,取0.5ml全血采用气相色谱测定血液乙醇、乙醛含量。
1.2.3.3生化指标测定
对1.2.2.1各组小鼠,灌胃给酒后30min,取出小鼠肝组织置于无菌生理盐水中制成10%肝组织匀浆,离心,取上清液,按照试剂盒说明书分别测定乙醇代谢相关酶ADH、ALDH和肝功能指标ALT、AST、SOD、GSH-Px活性以及MDA含量。
2实验结果与分析
2.1最佳灌酒量确认
最佳灌酒量实验结果见表68。
表68最佳灌酒量实验
灌酒剂量(ml/kg) | 醉倒/只 | 死亡/只 | 醉酒率 | 致死率 |
12 | 1 | 0 | 20% | 0% |
15 | 3 | 0 | 60% | 0% |
18 | 4 | 0 | 80% | 0% |
21 | 5 | 3 | 100% | 60% |
24 | 5 | 5 | 100% | 100% |
实验结果发现,灌酒量18ml/kg醉酒率最高,同时致死率最低,因此选定18ml/kg为本试验例给灌酒量。
2.2小鼠翻正反射时间结果
酒前和酒后给药小鼠翻正反射时间结果分别见表69-70。
表69酒前给药小鼠翻正反射时间结果
醉酒潜伏时间(min) | 醉酒恢复时间(min) | |
正常对照组 | 0 | 0 |
模型对照组 | 23.83±4.22 | 326.35±29.54 |
阳性对照组 | 42.38±6.02* | 249.22±23.02* |
实施例37高剂量组 | 67.03±10.12*** | 168.84±15.93*** |
实施例38低剂量组 | 36.65±5.17* | 261.83±25.22* |
实施例38中剂量组 | 53.88±8.60** | 213.75±20.64** |
实施例38高剂量组 | 65.29±9.57*** | 174.31±16.53*** |
实施例39高剂量组 | 66.32±9.66*** | 176.05±17.23*** |
样品M2高剂量组 | 57.14±8.33** | 205.49±21.18** |
注:与模型对照组相比,*,P<0.05(显著差异);与模型对照组相比,**,P<0.01(极显著差异);与模型对照组相比,***,P<0.001(十分显著差异)。
从上表分析可以得出,与模型对照组相比,酒前给药后,各实验组醉酒潜伏时间均明显延长(P<0.05),醉酒恢复时间均明显缩短(P<0.05),其中,实施例38中剂量组能够极显著延长醉酒潜伏时间(P<0.01),极显著缩短醉酒恢复时间(P<0.01),实施例38高剂量组能够十分显著延长醉酒潜伏时间(P<0.001),十分显著缩短醉酒恢复时间(P<0.001)。实施例38高剂量组效果要明显优于样品M2高剂量组以及阳性对照组。
表70酒后给药对小鼠翻正反射时间影响
醉酒潜伏时间(min) | 醉酒恢复时间(min) | |
正常对照组 | 0 | 0 |
模型对照组 | 22.65±4.84 | 340.14±31.35 |
阳性对照组 | 23.83±5.27 | 289.38±28.01* |
实施例37高剂量组 | 22.04±5.51 | 242.54±26.65** |
实施例38低剂量组 | 24.26±4.15 | 313.62±30.84 |
实施例38中剂量组 | 23.37±3.81 | 277.74±26.53* |
实施例38高剂量组 | 21.19±5.43 | 231.18±25.74** |
实施例39高剂量组 | 21.63±5.38 | 238.32±26.21** |
样品M2高剂量组 | 24.06±3.30 | 268.60±28.22** |
注:与模型对照组相比:*,P<0.05(显著差异);**,P<0.01(极显著差异);***,P<0.001(十分显著差异)。
从上表分析可以得出,由于是酒后给药,除正常组外,各组小鼠醉酒潜伏时间差异不大。醉酒恢复时间,与模型对照组相比,实施例38中剂量组醉酒恢复时间明显缩短(P<0.05),实施例38高剂量组醉酒恢复时间极显著缩短(P<0.01),效果要明显优于样品M2高剂量组以及阳性对照组。
从上述两个实验可以看出,酒前服用本发明解酒护肝组合物的效果要优于酒后服用,酒前服用更能有效延长醉酒潜伏时间,缩短恢复时间。
2.3小鼠血液中乙醇、乙醛含量、ADH酶活、ALDH酶活检测
乙醇进入人体后主要代谢途径是通过乙醇脱氢酶氧化成乙醛,乙醛再通过乙醛脱氢酶的作用变成乙酸,乙酸进入血液循环,代谢为二氧化碳、水和能量。因此乙醇脱氢酶与乙醛脱氢酶的活力至为重要。
各组小鼠中乙醇、乙醛含量、ADH酶活、ALDH酶活结果见表71。
表71小鼠血液中乙醇、乙醛含量、ADH酶活、ALDH酶活结果
注:与模型对照组相比:*,P<0.05(显著差异);**,P<0.01(极显著差异);***,P<0.001(十分显著差异)。与正常对照组相比,#,P<0.05。
从上面可以看出,与正常组相比,模型组ADH、ALDH酶活力明显较低(P<0.05),表明醉酒或过量饮酒会抑制肝组织ADH、ALDH酶活力。与模型组相比,各实验组ADH、ALDH酶活力均明显较高,其中实施例38中剂量组ADH、ALDH酶活力有极显著提高(P<0.01),实施例38高剂量组ADH、ALDH酶活力有十分显著提高(P<0.001),实施例38高剂量组效果也明显优于同剂量下样品M2组,也同样优于阳性对照组。
和模型组相比,各实验组小鼠血液中乙醇、乙醛含量均有显著降低,其中实施例38中剂量组血液中乙醇、乙醛含量有极显著降低(P<0.01),实施例38高剂量组血液中乙醇、乙醛含量有十分显著降低(P<0.001),实施例38高剂量组效果也明显优于同剂量下样品M2组,也同样优于阳性对照组。
2.4小鼠肝脏ALT、AST酶活检测
当醉酒或过量饮酒时,就会造成肝损伤,ALT、AST酶活就会增高,从而导致肝细胞膜通透性增加,血液中ALT、AST酶含量就会升高,因此ALT、AST酶含量是衡量肝细胞是否受损的重要指标。
各组小鼠肝脏ALT酶活、AST酶活力检测结果见表72。
表72小鼠肝脏ALT酶活、AST酶活力检测
ALT酶活(U/L) | AST酶活(U/L) | |
正常对照组 | 33.08±5.14 | 92.94±13.35 |
模型对照组 | 79.75±11.22 | 183.86±21.31 |
阳性对照组 | 58.46±9.20* | 138.29±16.60* |
实施例37高剂量组 | 41.16±7.86*** | 112.27±17.23*** |
实施例38低剂量组 | 63.18±9.48* | 149.75±17.61* |
实施例38中剂量组 | 49.53±7.85** | 122.10±16.25** |
实施例38高剂量组 | 40.46±7.70*** | 104.66±14.88*** |
实施例39高剂量组 | 40.68±7.81*** | 116.03±15.53*** |
样品M2高剂量组 | 51.10±8.33** | 130.85±17.74** |
注:与模型对照组相比:*,P<0.05(显著差异);**,P<0.01(极显著差异);***,P<0.001(十分显著差异)。
分析上表可以看出,在药物干预下,各组ALT、AST酶活均有明显下降,其中,实施例38中剂量组ALT、AST酶活有极显著降低(P<0.01),实施例38高剂量组ALT、AST酶活有十分显著降低(P<0.001)。同时,,实施例38高剂量组效果也明显优于同剂量下样品M2组,也同样优于阳性对照组。
2.4小鼠肝脏SOD、GSH-Px酶活及MDA(丙二醛)含量检测
乙醇进入人体后生成的代谢产物乙醛,会在黄嘌呤氧化酶的作用下转变成自由基和超氧化物,丙二醛就是其中一种脂质过氧化的产物,破坏机体的氧化应激平衡,SOD、GSH-Px等抗氧化酶活力降低,无法消除过量的自由基和超氧化物,从而导致肝细胞损伤。
各组小鼠小鼠肝脏SOD酶活、GSH-Px酶活力、MDA含量结果见表73。
表73小鼠肝脏SOD酶活、GSH-Px酶活力、MDA含量
SOD酶活(U/ml) | GSH-Px(U/mg) | MDA(nmol/mg) | |
正常对照组 | 124.40±11.29 | 523.28±45.37 | 3.26±0.54 |
模型对照组 | 64.85±8.93 | 265.73±30.03 | 6.30±1.14 |
阳性对照组 | 85.44±9.07* | 344.18±30.97* | 4.10±0.83* |
实施例37高剂量组 | 110.32±12.08*** | 459.63±40.83*** | 2.07±0.80*** |
实施例38低剂量组 | 80.17±9.20* | 330.72±33.21* | 4.52±0.91* |
实施例38中剂量组 | 94.43±10.57** | 389.33±35.53** | 3.07±0.84** |
实施例38高剂量组 | 115.56±12.30*** | 467.29±42.20*** | 2.12±0.89*** |
实施例39高剂量组 | 118.26±12.87*** | 478.55±44.63*** | 2.19±0.77*** |
样品M2高剂量组 | 91.55±11.18** | 376.25±32.02** | 3.46±0.92** |
注:与模型对照组相比:*,P<0.05(显著差异);**,P<0.01(极显著差异);***,P<0.001(十分显著差异)。
分析上表可以得出,与模型组相比,各组SOD、GSH-Px酶活力均有明显提高,同时MDA含量均有明显降低。其中,实施例38中剂量组SOD、GSH-Px酶活力有极显著提高(P<0.01),同时MDA含量极显著降低(P<0.01),实施例38高剂量组SOD、GSH-Px酶活力有十分显著提高(P<0.001),MDA含量十分显著降低(P<0.001),且呈明显的剂量依赖关系。另外,实施例38高剂量组各项指标均明显优于样品M2高剂量组及阳性对照组。
测试例34有效成分含量测定
葛根素能清除体内自由基,提高体内过氧化酶系(谷胱甘肽过氧化物酶、过氧化氢酶、SOD酶)的活性,能够有效拮抗酒精引起的肝组织脂质过氧化损害,能阻止酒精对大脑功能的抑制,促进血液酒精的代谢和排泄,从而减轻氧化应激反应对肝的损伤,达到解酒护肝的功效。
姜黄素可以改善肝功能,修复肝细胞损伤,抑制肝炎,帮助肝脏解酒毒,解宿醉。姜黄素能够激发肝脏加倍产生乙醛脱氢酶,加速分解乙醛,缓解酒后出现的不适症状。
槲皮素含有大量酚羟基,所以它有较强的清除活性氧和自由基的能力,槲皮素能够通过抗氧化应激、抑制炎性因子释放、促进抗氧化酶合成三个方面,直接或间接有效防治酒精性肝损伤。
二氢杨梅素能够清除自由基,提高肝细胞抗氧化能力,抑制乙醇引起的膜脂质过氧化,改善肝细胞损伤引起的血清乳酸脱氢酶活力增高,加速酒精代谢,能够延长醉酒的耐受时间,明显缩短醒酒时间。还能降低甘油三酯含量,减轻肝细胞脂肪变性,具有显著的乙醇性肝损伤保护作用。
为了验证本发明微生物发酵技术提高药效的作用,对解酒护肝组合物发酵前后体系中功能物质葛根素、姜黄素、槲皮素、二氢杨梅素等四种物质含量进行测定。
1材料与方法
1.1样品
采用实施例37-39和对比例13制备的中药粉,并分别按照总重量5%、95%称取赤藓糖醇、中药粉,混合均匀,灌装,制成粉体剂型(15g/袋),得到各个待测物。
1.2检测方法
1.2.1葛根素含量检测
1.2.1.1葛根素液相色谱条件
色谱柱:C18色谱柱(250×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-水(25:75);柱温25℃;流速1.0mL/min;检测器波长:250nm。
1.2.1.2葛根素对照品溶液的制备
精密称取1.2mg葛根素标准品至于10mL容量瓶中,加入30%甲醇定容,得到浓度0.12mg/mL的标准溶液,备用。
1.2.1.3葛根素标准曲线制作
精密称取标准品溶液0.05、0.1、0.2、0.4和0.8mL置于10ml容量瓶中,定容。精密称取各个梯度对照品溶液20μl以进样浓度为横坐标、峰面积为纵坐标绘制标准曲线。标准曲线方程为y=1.5803x+4.2938,R2=0.9975。
1.2.1.4待测样品制备
准确称取粉碎过筛后的样品0.2g,置于圆底烧瓶中,加入30%甲醇50mL,称定重量,回流提取30min。冷却至室温,称重,用30%甲醇补足损失的重量,摇匀,滤纸过滤。收集滤液过0.45μm微孔滤膜,待用。
1.2.2槲皮素含量检测
1.2.2.1槲皮素色谱条件
采用C18色谱柱(150mm×4.6mm,5μm);流动相:0.2%磷酸缓冲液-甲醇(40:60);流速:1.0mL/min;检测波长:375nm。
1.2.2.2槲皮素对照品溶液的制备
取槲皮素对照品适量,精密称定,加甲醇制成每1ml含0.3mg的溶液,即得。
1.2.1.3槲皮素标准曲线制作
精密量取对照品溶液0.5、1、1.5、2、2.5、3mL于10mL量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,进样20μl。分别以峰面积为纵坐标,进样浓度为横坐标,得到线性回归方程,y=1328.6x-408.5,R2=0.9988。
1.2.2.4待测样品制备
取待测样品粉末(过60目)约0.5g,精密称定,加入50%甲醇50ml于锥形瓶中,密塞,浸渍2h,然后超声60min,摇匀,过滤,用50%甲醇定容至50ml,再经0.45μm微孔滤膜过滤,即得。
1.2.3姜黄素含量检测
1.2.3.1姜黄素色谱条件
色谱柱:C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:乙腈-0.1%醋酸溶液(48:52),流速:1.0ml/min,紫外检测波长:430nm;柱温:35℃;进样量:20μl。在上述色谱条件下,理论板数以姜黄素峰计不低于4 000。
1.2.3.2姜黄素对照品溶液的制备
取姜黄素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,制成每1ml含姜黄素0.1mg的溶液。
1.2.3.3姜黄素标准曲线制作
分别精密量取姜黄素对照品溶液2、6、10、14、18、22μl,注入高效液相色谱仪。分别以峰面积的积分值为纵坐标,对照品的浓度为横坐标,进行线性回归,得到姜黄素回归方程,y=8724.2x-105.303,
R2=0.9986。
1.2.3.4待测样品制备
取待测物样品约0.2g,精密称定,置具塞锥形瓶中,精密加入甲醇10ml,称定重量,加热回流30分钟,放冷,再称定重量,用甲醇补足减失的重量,摇匀,离心,精密量取上清液2ml,置20ml量瓶中,加甲醇稀释至刻度,摇匀,即得。
1.2.4二氢杨梅素含量检测
1.2.3.1二氢杨梅素色谱条件
色谱柱:C18(250mm×4.6mm,5μm);流动相:甲醇-0.03%磷酸溶液,流速:0.8ml/min,梯度洗脱(0min,甲醇-0.03%磷酸溶液比例12:88;25min比例65:35,30~40min,12:88);紫外检测波长:290nm;柱温:35℃;进样量:2μl。
1.2.3.2二氢杨梅素对照品溶液的制备
取二氢杨梅素对照品适量,精密称定,加甲醇溶解,制成每1ml含姜黄素5mg的溶液。
1.2.3.3二氢杨梅素标准曲线制作
分别精密量取二氢杨梅素对照品溶液1、3、5、7、9、11μl,注入高效液相色谱仪。分别以峰面积的积分值为纵坐标,对照品的浓度为横坐标,进行线性回归,得到甘草酸回归方程,y=0.6327x+235.78,R2=0.9996。
1.2.3.4待测样品制备
取待测物样品约0.5g,精密称定,置于10ml容量瓶中,用30%甲醇定容,100kHz超声提取30min,冷却,过0.45μm滤膜,即得。
2结果与分析
2.1二氢杨梅素、姜黄素、葛根素、槲皮素含量对比
各产品中二氢杨梅素、姜黄素、葛根素、槲皮素含量见表74。
表74葛根素、槲皮素、姜黄素、二氢杨梅素含量对比(mg/g)
从上表可以看出,实施例39的产品中葛根素、槲皮素、姜黄素、二氢杨梅素等4种有效物质的含量均高于对比例13的产品,其中,实施例39的产品二氢杨梅素含量是对比例13的产品4.05倍,姜黄素是对比例13的产品的3.35倍,葛根素是对比例13的产品的2.51倍,槲皮素是对比例13的产品的2.14倍。从此可以看出,经过酶解+微生物发酵,体系中四种有效物质均有了大幅提高,提供了本发明提供的解酒护肝组合物物质基础的支持。
本发明的发明人还发现,若将纤维素酶替换为等量的半纤维素酶,将酸性蛋白酶替换为等量的碱性蛋白酶;或者将实施例37-39中或乳杆菌替换为其他的乳杆菌;以上方法得到的产品的解酒护肝效果或者有效成分含量均不如实施例37-39中制备的产品。
以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。
Claims (3)
1.一种制备治疗气血两虚证的发酵中药的方法,其特征在于,该方法包括:
(1)将中药进行粉碎,并将粉碎后的物料与水混合,得到混合液;
其中,所述中药的原料药为人参、黄精、枸杞子、当归、陈皮、西红花、茯苓和甘草;
相对于100重量份的人参,黄精的含量是75-100重量份,枸杞子的含量是50-83.5重量份,当归的含量是50-83.5重量份,茯苓的含量是33-37.5重量份,西红花的含量是25-67重量份,陈皮的含量是37.5-50重量份,甘草的含量是12.5-25重量份;
(2)将所述混合液与酶制剂接触,以进行酶解,得到酶解液;
相对于100重量份的人参,所述酶制剂的含量为11-22.5重量份;
所述酶制剂为纤维素酶、果胶酶和酸性蛋白酶;
相对于100重量份的人参,纤维素酶的含量是3.75-5重量份,果胶酶的含量是3.75-5重量份,酸性蛋白酶的含量是3.75-12.5重量份;
(3)将所述酶解液进行活性成分的提取,得到提取清液;
(4)向所述提取清液中加入发酵剂进行发酵,得到发酵液;
相对于100重量份的人参,所述发酵剂的含量为1.0-1.9重量份;
所述发酵的方法为:先将芽孢杆菌接种至所述提取清液中进行第一发酵,得到第一发酵液;将乳酸菌和可选的芽孢杆菌接种至所述第一发酵液,进行第二发酵,得到第二发酵液;将酵母菌接种至第二发酵液,进行第三发酵,得到第三发酵液;
其中,所述发酵剂为重量用量比为0.5:0.18-0.22:0.48-0.52:0.38-0.42:0.48-0.52的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌和马克思克鲁维酵母;或者,所述发酵剂为重量用量比为0.3:0.18-0.22:0.28-0.32:0.28-0.32:0.48-0.52:0.18-0.22:0.18-0.22的枯草芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、长双歧杆菌、发酵乳杆菌、马克思克鲁维酵母和酿酒酵母;或者,所述发酵剂为重量用量比为0.4:0.38-0.42:0.48-0.52:0.48-0.52:0.58-0.62的枯草芽孢杆菌、凝结芽孢杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌和酿酒酵母;
其中,凝结芽孢杆菌的保藏编号为CICC 24625;枯草芽孢杆菌的保藏编号为CICC10167;植物乳杆菌的保藏编号为CICC 20330;嗜热链球菌的保藏编号为CICC 20370;保加利亚乳杆菌的保藏编号为CICC 20254;长双歧杆菌的保藏编号为CICC 6203;发酵乳杆菌的保藏编号为CICC 22537;马克思克鲁维酵母的保藏编号为CICC 32015;酿酒酵母的保藏编号为CICC 1059。
2.根据权利要求1所述的方法,其中,所述粉碎后的物料的粒径范围在0.0125-0.38mm;
和/或,所述酶解的条件包括:pH为4-5,温度为45-65℃,时间为60-180min;
和/或,所述提取的温度为85-102℃,提取的时间为30-90min;
和/或,该方法还包括往所述发酵液中加入加工辅料,并干燥得到中药发酵粉。
3.根据权利要求1或2所述的方法制备得到的治疗气血两虚证的发酵中药。
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