CN114426936A - 一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌及其在发酵香肠中的应用 - Google Patents

一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌及其在发酵香肠中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌，菌株的分类名称为：清酒乳杆菌GYX‑6，Lactobacillus sakei GYX‑6，已于2021年11月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCC NO.23702；富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉和阿拉伯胶以质量比2：1，pH 4.0时，注入雨生红球藻虾青素‑‑乙醇溶液，充分复合以得到虾青素纳米颗粒，将该清酒乳杆菌及其它5种乳酸菌和虾青素纳米颗粒复配制得的发酵香肠，色泽红润，亚硝酸盐含量低，富含益生乳酸菌、多肽和虾青素，且亚硝酸盐含量和过氧化物指标均符合国家标准GB/T 23493‑2009，具有抗氧化等功能。

Description

一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌及其在发酵香肠中的应用
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，尤其涉及一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌及其在发酵香肠中的应用。
背景技术
乳酸菌是最早应用于肉品发酵剂的菌属，在肉制品发酵剂中的地位举足轻重，在发酵肉制品中有着重要作用。其可在发酵过程中生成乳酸，从而迅速降低环境的pH，调节酸度，还可产生乳酸菌素等抗菌物质，从而达到抑制腐败菌和致病菌等有害微生物生长的目的。因此，筛选分离出优良乳酸菌使其能在肉制品发酵过程中发挥一定作用是一项非常重要的工作。发酵肉制品是指在一定控制条件下，利用微生物或酶的发酵作用，使原料肉及各种辅料经过一系列变化，赋予肉类典型特性、改善其感官特性并确保其中微生物数量，使其能够放置较长时间。
亚硝酸钠是肉制品中应用历史悠久、应用范围广泛的添加剂之一，在保持香肠色泽的同时可抑制腐败菌的生长繁殖。亚硝酸盐也存在着一些安全隐患，与肉中胺类物质反应能形成N-亚硝胺，尤其是在胃液中特别容易合成，会诱发消化系统癌变，对人体健康造成威胁。鉴于其安全性问题，寻找安全高效的降硝方法一直备受人们关注。目前并未发现有单独的物质可以完全替代亚硝酸钠的全部功效，因此低硝肉制品品质改良物的复配将成为研究重点，筛选安全、高效的、可降解亚硝酸盐的乳酸菌具有一定的可行性和现实意义。
虾青素(3,3′-二羟基-4,4′-二酮基-β,β′-胡萝卜素)是一种脂溶性胡萝卜素，具有巨大的潜在健康效益，广泛存在于藻类和甲壳类动物体内。为了提高虾青素在食品中的稳定性和生物利用度，研究了几种策略，包括乳液、脂质体、纳米分散体和微囊化等技术。一些乳化技术通常需要较高的机械能，对于食品行业来说会增加一定的成本，又或者使用一些具有毒性的稳定剂，安全性能有待提高。近年来，食品级蛋白质因其天然来源、无毒且高营养价值而在提高脂溶性活性物质的生物利用度方面得到广泛的应用，如乳清蛋白、玉米醇溶蛋白，β-乳球蛋白，大豆蛋白，明胶，酪蛋白。通常虾青素与蛋白质或牛奶等富含脂肪成分的食品等一起服用时，生物利用度更高，所以乳蛋白能够较好地用来稳定虾青素。虾青素作为食品配料成分具备双重功能，一方面可以提供诱人的微红色；另一方面可以增强生物活性，因此在功能性食品的开发方面具有很大的潜力。
乳脂肪球膜蛋白是包裹在原料奶中脂肪球周围的膜蛋白。乳脂肪球膜的各组分具有两亲性，可用来作为天然的乳化剂，主要成分为特异性膜蛋白和磷脂，其中蛋白质含量在25％～70％，主要包括有嗜乳脂蛋白，黏液素，黄嘌呤氧化还原酶，乳凝集素。此外，乳脂肪球膜蛋白具有比β-乳球蛋白和酪蛋白更高的分子量(48～225kDa)。高分子量的蛋白质比低分子量的蛋白质具有更高的表面蛋白覆盖率，故而乳脂肪球膜蛋白对脂溶性功能物质运载效率比低分子量蛋白质要高。另外，乳脂肪球膜蛋白具有一定的抵抗胃部消化能力，具有制备递送载体的优良特性。蛋白质基通常需要涂上一层其他化合物，以提高稳定性和封装效率，大多情况下会与多糖复合以达到更佳效果。阿拉伯胶作为一种两亲性多糖，是一种携带羧基的弱聚电解质，可以通过静电相互作用与带正电的粒子交联。因较高的溶解性和较低的粘度，容易导致其与大分子间的粘合，故常被用作食品乳化剂和稳定剂。
发明内容
本发明的目的在于提供一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌及其在发酵香肠中的应用，虾青素纳米颗粒可降低发酵香肠的亚硝酸盐含量，并与清酒乳杆菌发挥协同作用降亚硝酸盐效果更强，虾青素纳米颗粒的加入使得发酵香肠的红度增加，可以弥补乳酸菌发酵造成的亚硝酸盐降低而导致的红度降低，且乳酸菌发酵造成的乳脂肪球膜蛋白和乳清蛋白的水解可使得体系多肽含量增加，制得的香肠色泽红润、亚硝酸盐含量低、多肽含量高、富含虾青素以及抗氧化能力强。
本发明解决其技术问题采用的技术方案是：
一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌，菌株的分类名称为：清酒乳杆菌GYX-6，Lactobacillus sakei GYX-6，已于2021年11月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNO.23702。
本发明还提供上述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用。
进一步的，所述发酵香肠的制备工艺为：
(1)将鸭脯肉按肥瘦比2:8的比例混合并充分绞碎成肉馅，以鸭脯肉的质量计，加入盐2～4％、复合磷酸盐0.1％、硝盐0.01％、绵白糖1～3.2％、料酒2～3.5％、味精0.2～0.4％、白胡椒粉0.1～0.4％、五香粉0.1～0.2％、虾青素纳米颗粒1～5％，再按4～6％的接种量添加乳酸菌，4℃腌制3～5h；
(2)在30℃发酵1、3、5或7天，发酵结束后，在50℃下干燥3～4h；
(3)真空包装后4℃下保藏。
进一步的，所述乳酸菌包括体积比为1:1:1:1:1:1的清酒乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及戊糖片球菌。
进一步的，所述清酒乳杆菌为清酒乳杆菌GYX-6。
进一步的，所述虾青素纳米颗粒是按照如下步骤制备而成：
(1)富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉与阿拉伯胶以质量比2：1复配，pH为4.0的条件下，制备得到蛋白-多糖复合物；
(2)向蛋白-多糖复合物中注入雨生红球藻虾青素-乙醇溶液，使雨生红球藻虾青素的浓度为60μmol/L，以500rpm暗黑搅拌1h，复合制备而得。
进一步的，所述富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉是Hilmar 7500乳清蛋白粉，蛋白含量为70％。
进一步的，所述雨生红球藻虾青素-乙醇溶液是按照如下步骤制备：
(1)称取雨生红球藻粉，加入到pH值为6.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，浓度比范围为10～20mg:1mL，加入0.2～0.6mg/mL蜗牛酶，于35℃酶解4h；
(2)灭酶处理后，将残渣按照5～20mg：1mL加入无水乙醇，置于50℃水浴锅中提取1h，收集上清液，重复三次，得虾青素备用液；
(3)再将虾青素备用液进行冻干处理，取虾青素冻干品溶解于食品级乙醇中，制备雨生红球藻虾青素-乙醇溶液。
有益效果：
(1)本发明中的清酒乳杆菌具有高效降解亚硝酸盐的能力，并具有较好的耐酸耐胆盐及抑菌特性。
(2)发酵香肠中加入虾青素纳米颗粒，虾青素纳米颗粒可降低发酵香肠的亚硝酸盐含量，并与清酒乳杆菌发挥协同作用降亚硝酸盐效果更强；虾青素纳米颗粒的加入使得发酵香肠的红度增加，可以弥补乳酸菌发酵造成的亚硝酸盐降低而导致的红度降低；虾青素纳米颗粒使用富含乳脂肪球膜蛋白的乳清粉与阿拉伯胶包埋制备，在香肠发酵过程中，随着乳酸菌对于乳脂肪球膜蛋白及乳清蛋白的水解，虾青素缓释可保证其抗氧化功能得到有效发挥，抑制发酵香肠的脂质氧化和增加香肠的色泽；另一方面，乳脂肪球膜蛋白与乳清蛋白在乳酸菌不断水解下会产生多肽，对乳酸菌的生长有益生作用；再者，虾青素包埋使用的富含乳脂肪球膜的乳清粉和阿拉伯胶，本身具有乳化和稳定作用，可以改善发酵香肠的质构，富含乳脂肪球膜的乳清蛋白粉还具有提高发酵香肠色泽的功效。
(3)本发明提供的添加虾青素纳米颗粒的发酵香肠乳酸菌总数高于未添加虾青素纳米颗粒组，虾青素保留率高于未包封的游离虾青素组；本发明提供的乳酸菌发酵香肠，亚硝酸盐含量和色泽低于自然发酵香肠；本发明提供的添加虾青素纳米颗粒的乳酸菌发酵香肠亚硝酸盐含量低于自然发酵香肠，色泽优于自然发酵香肠，多肽含量和抗氧化性能高于自然发酵香肠。
附图说明
图1为菌株P1、Y1显微镜下的形态特征(放大倍数为100倍)；
图2是5株菌24h内亚硝酸钠降解率(A)、P1 16S rDNA基因测序结果(B)、菌株Y116S rDNA基因测序结果(C)；
图3是菌株生长曲线(A)、产酸特性(B)、P1耐酸特性(C)、Y1耐酸特性(D)、P1耐胆盐特性(E)和Y1耐胆盐特性(F)；
图4是P1对大肠杆菌(左)和金黄色葡萄球菌(右)生长的影响(A)、Y1对大肠杆菌(左)和金黄色葡萄球菌(右)生长的影响(B)、菌株耐胃液(C)和肠液(D)能力；
图5是发酵香肠的pH(A)、色泽(B)、乳酸菌数(C)、虾青素保留率(D)、DPPH清除能力(E)和羟自由基清除能力(F)；
图6是发酵香肠的亚硝酸盐含量(A)、多肽含量(B)和过氧化值(C)。
具体实施方式
下面通过具体的实施例对本发明作出进一步说明，应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干变型和改进，这些也应视为属于本发明的保护范围。
实施例1降亚硝酸盐乳酸菌的筛选
(1)降亚硝酸盐乳酸菌菌株的分离纯化及菌落形态特征
取泡菜汁0.1mL，用0.90％无菌生理盐水进行梯度稀释，稀释浓度为10-1-10-6CFU/mL；固体状的香肠和咸鱼进行剪碎处理并且于无菌生理盐水中浸泡24h，取滤液用无菌生理盐水进行十倍梯度稀释，稀释浓度为10-1-10-6CFU/mL。处理后的样品涂布培养48h后，出现较多菌落，但菌落形态较为单一。将单菌落进行反复划线纯化后分离出5株菌，对其编号分别为P1、P2、Y1、Y2、C，5株菌的菌落形态大小和革兰氏染色结果如下表1和图1所示，5株菌均呈现革兰氏阳性且为杆状以及过氧化氢酶阴性，可初步判定这5株菌为乳酸菌。
表1从香肠、咸鱼、泡菜分离出的5株菌菌落的形态
Figure BDA0003451291350000051
(2)乳酸菌降亚硝酸盐能力测定
将培养24h后的菌液离心(4℃，10000×g，5min)，取2mL，不经沉淀过滤，进行重氮化反应后观察培养基的颜色。每隔6h测定24h内培养基中NaNO2含量以及菌株NaNO2降解率，计算公式为：
Figure BDA0003451291350000052
R：亚硝酸盐降解率，％；C0：培养基中NaNO2初始含量，mg/L；C1：不同培养时刻培养基中NaNO2含量，mg/L。将初步鉴定为乳酸菌的5株菌37℃培养24h，进行盐酸萘乙二胺实验。其中P1、Y1的颜色最浅，P2、Y2的颜色次之，C的颜色最深。所以菌株C所在培养基中剩余NaNO2含量最多，菌株P1、Y1所在培养基中剩余NaNO2更少。进一步进行定量实验，每6h测定培养基中NaNO2含量，计算降解率。结果如图2(A)所示，培养6h时，5株菌降解率均较低。之后5株菌NaNO2降解率整体变化趋势为增加，可能是因为乳酸菌在代谢过程中产生了亚硝酸还原酶和代谢产物乳酸，从而降低了亚硝酸盐含量。培养至12h时后，P1、Y1的降解率均高于P2、Y2、C，培养至18h时，P1、Y1降解率分别达到72.29±2.71％、65.06±7.45％；培养至24h时，Y1降解率最高，达92.16±1.97％，P1降解率次之，为86.96±1.34％。其余3株菌降解率在55.00-69.00％之间，降解效果较差，所以选择菌株Y1、P1进行后续实验。
(3)乳酸菌菌株的16S rDNA序列鉴定
菌株活化两代后，取1mL培养过夜的菌液离心(23℃，8000×g，1min)，收集菌体，进行全基因组提取。引物序列为：16s rDNA-27F：5’-AGAGTT TGATCCTGGCTCAG-3’；16s rDNA-1492R：5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’。
扩增反应体系与条件如表2所示。
表2 16S rDNA反应体系
Figure BDA0003451291350000061
PCR反应条件为：94℃，7min；94℃，35s；55℃，1min；72℃，90s×30个循环；72℃，5min；4℃保存。测序结果利用NCBI数据库中的Blast软件比对，采用MEGA-X软件构建系统发育树。
菌株16S rDNA测序结果如图2(B)、(C)所示，将菌株P1、Y1的16S rDNA序列在数据库中比对后发现与菌株P1、Y1基因序列相似度较高的菌株分别为布氏乳杆菌、清酒乳杆菌。菌株P1与Lactobacillus buchneri strain ZZU 20在同一条分支上，分支节点为67％，相似度较高，所以将菌株P1确定为布氏乳杆菌。菌株Y1与Lactobacillus sakei subsp.sakeistrain JUL0153在同一条分支上，分支节点为44％，所以将菌株Y1确定为清酒乳杆菌。
实施例2乳酸菌的生理和益生特性
(1)生长曲线及产酸能力测定
生长曲线如图3(A)所示，菌株P1培养3h后菌液开始愈发浑浊，OD600nm值开始迅速增加，15h后进入稳定期。而菌株Y1的对数生长期为6-15h，21h后进入稳定期。产酸能力如图3(B)所示，开始产酸时，2菌株的pH值均为5.69±0.01，随着菌株生长，2株菌产酸速率加快。但P1产酸速度更快且产酸能力更强，这是因为P1更早的进入对数期之后代谢速度加快，从而使其菌液的pH值快速下降，最终培养24h后pH值可降至4.27±0.02。菌株Y1产酸较慢，培养24h后pH为4.37±0.03。
(2)不同酸度下生长情况测定
菌株P1、Y1在不同酸度的MRS培养基中生长情况如图3(C)、(D)所示，在pH＝3的条件下，Y1、P1菌液的OD600nm值变化非常平缓，不能生长。在pH＝4时，Y1不能生长，P1生长受到抑制但也能正常生长。在pH＝5时，菌株Y1、P1均能正常生长，且P1此时生长情况最好，活力最高。由此可见，菌株P1的酸耐受性更强。
(3)不同胆盐浓度下生长情况测定
菌株P1、Y1在不同胆盐浓度下的生长情况如图3(E)、(F)所示，结果显示，胆盐浓度为0.03％时，菌株Y1、P1的生长情况均较好；当胆盐浓度达到0.05％时，Y1生长受到明显抑制，但菌液浓度还有所增加，而菌株P1生长良好；当胆盐浓度达到0.10％时，P1生长能力明显减弱，但活性较低；胆盐浓度为0.20％、0.30％时，2株菌不能生长。人体肠道胆盐浓度范围为0.03％-0.30％，所以2株菌具有一定胆盐耐受能力，但P1胆盐耐受性更强。
(4)抑菌能力测定
筛选得到的菌株P1、Y1对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的抑菌效果如图4(A)、(B)所示，平板上方的3个孔为同一菌株对指示菌的抑菌圈，最下方为添加生理盐水的空白对照组。菌株P1的抑菌圈直径分别为14.71±0.57mm，12.19±0.23mm，Y1的抑菌圈直径分别为11.02±0.18mm，8.16±0.28mm，对照组无抑菌圈出现。由此可见，2株菌对大肠杆菌的抑菌效果更明显，P1的抑菌能力更强。
(5)人工模拟胃肠道耐受性测定
食物在胃里的停留时间一般为1-3h，在肠道内停留的时间一般为2-6h，胃液的强酸环境以及肠液中的胰蛋白酶对菌株的生长会产生不利影响，所以对目的菌株进行耐胃液、肠液试验以检验菌株是否能在胃肠道中生长。菌株P1、Y1胃液耐受性结果如图4(C)所示，Y1、P1在胃液中培养后活菌数极显著下降(P<0.01)，但培养2h后活菌数仍达到106CFU/mL。
菌株Y1、P1对人工肠液的耐受性结果如图4(D)所示，结果显示，培养至4h时活菌数一直极显著下降(P<0.01)。在肠液中培养6h后Y1、P1的存活率分别约为8.62％，31.02％，活菌数分别为7.46±0.01lg CFU/mL、7.94±0.01lg CFU/mL，所以2株菌具有较好的肠液耐受性。
实施例3虾青素纳米颗粒的制备
(1)雨生红球藻虾青素的提取
称取一定量雨生红球藻粉，加入到pH值为6.0的0.2mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，浓度比为20:1(mg/mL)，加入0.4mg/mL蜗牛酶，于35℃酶解4h。灭酶处理后，将残渣按照5:1(mg/mL)加入无水乙醇，置于50℃水浴锅中提取1h，收集上清液，重复三次，用0.45μm针头式过滤器过滤备用。
(2)虾青素纳米颗粒的制备
虾青素备用液进行冻干处理后，取一定量虾青素备用液溶解于食品级乙醇中，制备雨生红球藻虾青素-乙醇溶液。采用蛋白含量为70％的Hilmar 7500乳清蛋白粉，作为富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉，将Hilmar 7500乳清蛋白粉和阿拉伯胶质量比为2:1，pH4.0条件下制备蛋白-多糖复合物，注入雨生红球藻虾青素，使虾青素在运载体系中的浓度为60μmol/L，以500rmp暗黑搅拌1h，使虾青素与载体材料充分复合，置于4℃中冷藏备用。
实施例4特色发酵香肠的制备
参照国家食品风险评估中心的《可用于食品的菌种名单》，我们选择清酒乳杆菌加入到香肠中进行后续发酵香肠的制备。
(1)自然发酵香肠的制备
鸭脯肉缓慢解冻，剔除皮、脂肪和筋腱后，用水清洗干净，切成1cm3大小的肉丁状，按肥瘦比2:8的比例混合并将其充分绞碎成肉馅。以鸭脯肉质量计，加入盐4％，复合磷酸盐0.1％，硝盐0.01％，绵白糖3.2％，料酒3.5％，味精0.4％，白胡椒粉0.4％，五香粉0.2％，4℃腌制3～5h。肉糜绞制完成后，利用灌肠机及塑料肠衣将配料均匀的肉糜灌装成型，灌肠时不宜过紧或过松，过紧可能会引起煮制时肠衣胀破，过松可能会使香肠肉馅中残留空气，导致紧实度下降。保证每根香肠质量为(100±5)g，于30℃发酵1、3、5、7d。发酵结束后，在50℃条件下干燥3～4h；真空包装后4℃下保藏。
(2)添加游离虾青素和虾青素纳米颗粒的发酵香肠制备
虾青素备用液进行冻干处理后，取一定量虾青素备用液溶解于食品级乙醇中，制备雨生红球藻虾青素-乙醇溶液。在富含乳脂肪球膜蛋白的乳清粉和阿拉伯胶质量比为2:1，pH 4.0条件下，注入雨生红球藻虾青素-乙醇溶液，使雨生红球藻虾青素在运载体系中的浓度为60μmol/L，以500rmp暗黑搅拌1h，使虾青素与载体材料充分复合，置于4℃中冷藏备用。
同实施例4的第(1)部分，与之不同的是，以鸭脯肉的质量计，组分还包含以2％的质量比分别加入的虾青素冻干品和上述制得的虾青素包封率高、抗氧化性能和稳定性强的虾青素纳米颗粒，再经腌制、发酵等过程制备得到添加游离虾青素和虾青素纳米颗粒的发酵香肠。
(3)乳酸菌发酵香肠的制备
同实施例4的第(1)部分，与之不同的是，将乳酸菌活化3次，待生长至稳定期混匀，在添加完盐、复合磷酸盐、硝盐等组分后，按MRS培养基与鸭脯肉之比为6％(v/m)添加乳酸菌，再经腌制、发酵等过程进行特色发酵香肠的制备，其中，乳酸菌由体积比为1:1:1:1:1:1的清酒乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌组成，清酒乳杆菌为清酒乳杆菌GYX-6。
(4)添加游离虾青素和虾青素纳米颗粒的乳酸菌发酵香肠制备
同实施例4的第(1)部分，与之不同的是，以鸭脯肉的质量计，组分还包含以2％的质量比分别加入的虾青素冻干品和上述制得的虾青素包封率高、抗氧化性能和稳定性强的虾青素纳米颗粒，并将活化3次且生长至稳定期的乳酸菌按6％(v/m)的比例加入上述香肠中，再经腌制、发酵等过程制备富含虾青素的乳酸菌发酵香肠，其中，乳酸菌由体积比为1:1:1:1:1:1的清酒乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、戊糖片球菌组成，清酒乳杆菌为清酒乳杆菌GYX-6。
(5)pH值
取2g发酵香肠样品，用剪刀剪碎后，加入18mL蒸馏水，混合均匀，静置1h后，取上清液用pH计测定，每组样品测定三次，结果如图5(A)所示。
(6)色泽
鸭肉香肠的颜色测定通过WSC-S测色色差计，采用L*a*b*系统进行测定，结果如图5(B)所示，乳酸菌发酵导致香肠的红度降低。
(7)质构
去除肠衣，将香肠切成2.5cm厚，直径约2.0cm的薄片。CT-3型质构仪测定参数：测定模式TPA，探头TA39，目标50mm，出发点负载10g，测试速度5mm/s，返回速度5mm/s，循坏次数为两次。测定指标：弹性、硬度、咀嚼性和胶着性。结果如表3所示，添加虾青素纳米颗粒组和乳酸菌发酵的香肠硬度均高于自然发酵组。
表3不同发酵香肠的质构
Figure BDA0003451291350000101
(8)乳酸菌总数
根据GB 4789.35-2016测定乳酸菌总数，结果如图5(C)所示，虾青素或虾青素纳米颗粒的加入对乳酸菌总数几乎没有影响，而在加入乳酸菌发酵时，虾青素和虾青素纳米颗粒与乳酸菌的相互作用使得香肠的乳酸菌总数变大，其中虾青素纳米颗粒与乳酸菌协同作用的乳酸菌总数变化巨大，这可能是乳脂肪球膜蛋白与乳清蛋白在乳酸菌不断水解下会产生多肽，对乳酸菌的生长有益生作用。
(9)发酵香肠的虾青素保留率
用下列公式计算虾青素保留率：
Figure BDA0003451291350000102
其中，Mi为溶液中虾青素的初始含量，Mt为各时间点虾青素的残留含量，结果如图5(D)所示。在发酵期间1、3、5、7d内，虾青素纳米颗粒的虾青素保留率要高于游离虾青素，乳酸菌发酵组与未添加乳酸菌组没有显著差异。
(10)发酵香肠的抗氧化性能
DPPH清除能力、羟自由基按照南京建成生物工程研究所的试剂盒说明书进行，结果如图5(E)、(F)所示，虾青素的加入使得发酵香肠的抗氧化性提升，虾青素纳米颗粒在贮藏期间的抗氧化性高于游离虾青素组。
(11)亚硝酸盐含量
根据GB 5009.33-2016测定香肠的亚硝酸盐含量。如图6(A)所示，乳酸菌发酵香肠的亚硝酸盐含量低于未接种菌株的发酵香肠，且在发酵第7天时符合国家标准GB 2760，含量低于30mg/kg。其中亚硝酸盐具备着色功能，所以乳酸菌发酵香肠的色泽也低于未接种的自然发酵组，同实施例4的第(6)部分，而虾青素和虾青素纳米颗粒添加组的乳酸菌发酵香肠色泽优于自然发酵组。除此以外，虾青素发酵组的亚硝酸盐含量低于自然发酵组，故而虾青素和乳酸菌的协同作用既可降低亚硝酸盐，又能增加红度。
(12)多肽含量
十克发酵香肠加50mL5％TCA，研磨后的肉浆在5000r/min下离心30min，将上清液转移到分液漏斗中与等体积乙醚混匀，然后收集下层去除TCA的制备液并定容到50mL，0.45μm滤膜抽滤。最后采用常量双缩脲反应进行测定，使用谷胱甘肽绘制标准曲线。结果如图6(B)所示，乳酸菌发酵酶解乳脂肪球膜蛋白，导致添加虾青素纳米颗粒的发酵香肠的多肽含量高于游离虾青素组发酵香肠。
(13)过氧化值
参照GB 5009.227-016《食品安全国家标准食品中过氧化值的测定》。结果如图6(C)所示，随着乳酸菌对于乳脂肪球膜蛋白及乳清蛋白的水解，虾青素缓释可保证其抗氧化功能得到有效发挥，抑制发酵香肠的脂质氧化，故而虾青素纳米颗粒和乳酸菌的加入使得体系的POV值有效降低。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求为保护范围。

Claims (8)

1.一种降亚硝酸盐的清酒乳杆菌，其特征在于：菌株的分类名称为：清酒乳杆菌GYX-6，Lactobacillus sakei GYX-6，已于2021年11月1日提交中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏编号为：CGMCCNO.23702。
2.权利要求1所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用。
3.根据权利要求2所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述发酵香肠的制备工艺为：
（1）将鸭脯肉按肥瘦比2:8的比例混合并充分绞碎成肉馅，以鸭脯肉的质量计，加入盐2~4%、复合磷酸盐0.1%、硝盐0.01%、绵白糖1~3.2%、料酒2~3.5%、味精0.2~0.4%、白胡椒粉0.1~0.4%、五香粉0.1~0.2%、虾青素纳米颗粒1~5%，再按4~6%的接种量添加乳酸菌，4 ℃腌制3~5h；
（2）在30 ℃发酵1、3、5或7 天，发酵结束后，在50 ℃下干燥3~4 h；
（3）真空包装后4 ℃下保藏。
4.根据权利要求3所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述乳酸菌包括体积比为1:1:1:1:1:1的清酒乳杆菌、嗜酸乳杆菌、瑞士乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌以及戊糖片球菌。
5.根据权利要求4所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述清酒乳杆菌为权利要求1所述的清酒乳杆菌GYX-6。
6.根据权利要求3所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述虾青素纳米颗粒是按照如下步骤制备而成：
（1）富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉与阿拉伯胶以质量比2：1复配，pH为4.0的条件下，制备得到蛋白-多糖复合物；
（2）向蛋白-多糖复合物中注入雨生红球藻虾青素-乙醇溶液，使雨生红球藻虾青素的浓度为60 μmol/L，以500 rpm暗黑搅拌1h，复合制备而得。
7.根据权利要求6所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述富含乳脂肪球膜蛋白的乳清蛋白粉是Hilmar 7500乳清蛋白粉，蛋白含量为70%。
8.根据权利要求6所述的降亚硝酸盐的清酒乳杆菌在发酵香肠中的应用，其特征在于：所述雨生红球藻虾青素-乙醇溶液是按照如下步骤制备：
（1）称取雨生红球藻粉，加入到pH值为6.0的0.2 mol/L乙酸-乙酸钠缓冲溶液中，浓度比范围为10~20 mg:1 mL，加入0.2~0.6 mg/mL蜗牛酶，于35 ℃酶解4 h；
（2）灭酶处理后，将残渣按照5~20 mg:1 mL加入无水乙醇，置于50 ℃水浴锅中提取1h，收集上清液，重复三次，得虾青素备用液；
（3）再将虾青素备用液进行冻干处理，取虾青素冻干品溶解于食品级乙醇中，制备雨生红球藻虾青素-乙醇溶液。
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