CN104560802A - 一种肉灌制品发酵菌株及发酵剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种清酒乳杆菌菌株(Lactobacillus？sake)，于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC？No.9742。本发明还提供了一种含有所述菌株的肉灌制品发酵剂及其在肉灌制品发酵中的应用。应用该发酵剂来腌制生产发酵香肠制品，能缩短生产周期，有效抑制有害微生物生长；与商品发酵剂相比，提高了游离氨基酸含量，增加了产品的营养价值、口感和风味，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及发酵技术领域，具体的，涉及一种肉灌制品发酵菌株及发酵剂。
背景技术
发酵香肠制品起源于欧洲的地中海区域，以碎肉和脂肪为原料，添加盐、硝酸盐/亚硝酸盐、糖和香料等辅料进行混合，最后灌装入肠衣中进行发酵和干燥。这样的加工过程中发生了复杂的物理、化学反应，再加上微生物的作用，最终赋予了产品特殊的可切片性能、紧致度、色泽和风味。发酵香肠制品具有风味独特、营养丰富、色泽美观和保质期长的特点，是公认的高档肉制品，一直是欧美发达国家的主流肉类产品之一，拥有巨大的产销量。随着我国人民生活水平的提高，市场迫切需要一些风味独特且具有一定保健作用的新型高档肉制品，发酵香肠可以满足这种消费需求。
发酵剂对于控制发酵香肠制品的生产周期、安全性、以及口感和质量起着关键作用。目前以科汉森、罗地亚和丹尼斯克公司为代表的商品发酵剂生产商已在国际上取得了垄断性的市场地位，而国内商品发酵剂领域的研究远落后于欧美国家，这也导致了国内生产发酵香肠的厂家寥寥无几，规模较小。由于优良性状菌株的选育是发酵剂制造领域的关键，因此筛选优良菌株，开发商品发酵剂，缩短发酵肉制品生产周期，提高产品口感和营养价值，是国内发酵香肠制品生产发展亟待解决的重要科技问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种能够用提高肉灌制品发酵速度、风味、口感和营养价值的肉灌制品发酵菌株及发酵剂。
本发明所提供的(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742已于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其简称为CGMCC，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101，保藏编号为CGMCC No.9742。
本发明的发明人从贵州荔波县传统发酵酸肉中，通过筛选、纯化分离出一株具有优良发酵特性的清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742，经过BIOMERIEUX公司VITEK 2型全自动微生物鉴定仪生理生化鉴定、补充理化试验和16S rDNA序列测定，鉴定该菌株为：清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)。对该菌株的形态及理化鉴定结果见表1和表2。
一般的，在本领域中，选做发酵剂的乳酸菌主要为乳杆菌属和片球菌属，其作用是通过对糖的发酵产酸而降低pH值，这对香肠干燥成熟、特有风味形成及食用安全性极为有利。pH值的降低可以抑制致病菌的生长、改善产品色泽、促进亚硝酸的分解。清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742符合上述条件。
本发明提供了一种肉灌制品发酵剂，含有权利要求1所述的清酒乳杆菌菌株。
可选的，所述发酵剂的组成成分包括清酒乳杆菌菌株的浓缩菌体和冻干保护剂。
本发明所提供的发酵剂还可以含有发酵可接受的载体，例如海藻糖、碳酸钙、聚乙烯吡咯烷酮、谷氨酸钠、维生素C和硫酸锰等。
可选的，所述发酵剂中清酒乳杆菌菌株的含量为109-1011CFU/g，优选的，为了获得更好的发酵效果，所述发酵剂中，清酒乳杆菌菌株的含量为1010CFU/g。
可选的，所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10：1。最为优选的，所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为1:1。
可选的，所述冻干保护剂的组成成分包括脱脂乳、甘油和蔗糖，其中，每100ml质量浓度为8-15％的脱脂乳中添加有2-4g甘油和3-5g蔗糖。
可选的，该方法包括：首先在培养基中培养清酒乳杆菌菌株，再离心获得浓缩菌体，将所述浓缩菌体与冻干保护剂接触混匀后冷冻干燥，获得发酵剂。
可选的，所述培养基为MRS肉汤培养基，培养基的pH为6.0-6.4；培养温度为25-35℃。
其中，所述MRS肉汤培养基的组成成分为(1L)：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g。
可选的，所述离心的温度为2-5℃，离心转速为3500-5500rpm，离心时间为10-20min。
本发明还提供了所述发酵剂在肉灌制品发酵中的应用，包括：将已经添加了调味剂和添加剂的肉馅与所述发酵剂按照每1000g肉馅中添加0.08-0.12g发酵剂的比例搅拌混匀后灌装，在30℃、湿度90±3％的条件下发酵2天进行第一发酵，第一发酵结束后再在15℃、湿度80±3％的条件下发酵18天进行第二发酵获得产品。经过上述发酵过程后，所述肉灌制品的pH值可以达到4.9-5.0。
优选的情况下，本发明中所述的肉灌制品为香肠。
本发明从贵州荔波县传统发酵酸肉中，通过筛选、纯化分离出一株具有优良发酵特性的清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742，将该菌株加入冻干保护剂采用冷冻干燥方法可制备为干粉发酵剂，应用该干粉发酵剂来腌制生产快速发酵香肠制品，能缩短生产周期，有效抑制有害微生物生长；与商品发酵剂相比，提高了游离氨基酸含量，增加了产品的营养价值、口感和风味，具有良好的应用前景。
附图说明
图1为30℃下各菌株的产酸曲线图；
图中1为MRS肉汤培养基、2为清酒乳杆菌、3为戊糖片球菌、4为植物乳杆菌、5为清酒乳杆菌CGMCC No.9742的产酸曲线。
图2为商品发酵剂和清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742发酵剂在发酵香肠中的产酸曲线；
图中1为商品发酵剂，2为CGMCC No.9742发酵剂。
具体实施方式
下面将通过具体实施方式对本发明进行详细说明。需要理解的是以下实施例的给出进是为了起到说明的目的，并不是用于对本发明的范围进行限制。本领域的技术人员在不背离本发明的宗旨和精神的情况下，可以对本分发明进行各种修改和替换。
以下实施例中：
MRS平板培养基的组成成分为(1L)：蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温801.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，琼脂15.0g。
营养肉汤培养基的组成成分为(1L)：蛋白胨10.0g，牛肉粉3.0g，氯化钠5.0g，葡萄糖1.0g。
MRS肉汤培养基的组成成分为(1L)：蛋白胨10.0g，牛肉粉10.0g，酵母粉5.0g，葡萄糖20.0g，硫酸镁0.1g，醋酸钠5.0g，柠檬酸铵2.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸锰0.05g，吐温801.0g。
实施例1
本实施例用于说明清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742菌株的筛选。
1.备选菌株获取过程
从贵州省荔波县农贸市场，购买农家散户自制的传统发酵酸肉产品。从肉样中无菌称取25g样品，加入225mL无菌生理盐水中，均质8min，进行不同浓度稀释。然后将不同稀释度菌悬液接种于MRS平板培养基中，在30℃培养箱中培养48h后，分别从最高稀释度的培养平板上随机挑取10个菌落，转接到MRS肉汤培养基中，筛选得到乳酸菌70株。
2.备选菌株可用性测定
将筛选得到的乳酸菌株三次分纯后，对纯化的菌株进行形态学、耐盐性、耐亚硝酸盐性、蛋白酶活性、脂肪酶活性、葡萄糖同型/异型发酵等理化测定，选择满足以下条件的菌株进行下一步发酵性能测定：(ⅰ)革兰氏染色镜检为阳性；(ⅱ)耐受6％氯化钠和0.015％亚硝酸钠；(ⅲ)同型或兼性异型发酵。
3.备选菌株发酵性能测定
将待测菌株活化后，分别接种于150mL的MRS肉汤培养基中，接种量为106CFU。30℃培养48h，连续测定pH值，时间间隔为2h。比较菌株产酸速率，选择前12h时间段内pH下降速率最快者(见图1)，即为本发明菌株(清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCCNo.9742)。
4.备选菌株种属鉴定
将纯化的乳酸菌株，采用16S rDNA序列测定(测序引物27F：5′-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；(SEQ ID NO.1所示的序列)1492R：5′-TACGGYTACCTTGTTACGACTT-3′(SEQ ID NO.2所示的序列))，经鉴定该菌株属于清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)。
5、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742的形态学和产酶特性鉴定
按照文献(凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定与实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.)中所介绍的方法和BIOMERIEUX公司VITEK 2型全自动微生物鉴定仪操作手册中所提供的方法对清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742进行形态学和产酶特性鉴定，结果列于表1。
表1
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 革兰氏染色 | + | 脂肪酶 | - |
| 菌体形态 | 杆状 | 尿素酶 | - |
| 耐6％氯化钠 | + | α-葡糖苷酶 | - |
| 耐亚硝酸钠 | + | α-甘露糖苷酶 | - |
| 产粘性物质 | - | L-脯氨酸芳胺酶 | - |
| 蛋白酶 | - | 甘氨酸芳胺酶 | - |
| 丙氨酸-苯丙氨酸-脯氨酸芳酶 | + | β-D-岩藻糖苷酶 | - |
| L-吡咯烷酮芳胺酶 | - | 苯丙氨酸芳胺酶 | + |
| 酪氨酸芳胺酶 | + | 鸟氨酸脱羧酶 | - |
6、清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742的理化试验
按照文献(凌代文，东秀珠.乳酸细菌分类鉴定与实验方法[M].北京：中国轻工业出版社，1999.)中所介绍的方法和BIOMERIEUX公司VITEK 2型全自动微生物鉴定仪操作手册中所提供的方法对清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742进行理化试验(碳水化合物产酸)，结果列于表2。
表2
| 试验项目 | 结果 | 试验项目 | 结果 |
| 葡萄糖 | + | 山梨醇 | - |
| 甘露醇 | - | 苹果酸盐 | + |
| 麦芽糖 | + | 核糖 | + |
| 半乳糖 | + | 海藻糖 | + |
| 松三糖 | - | 七叶苷 | - |
| 蔗糖 | + | 2-酮基-D-葡萄糖盐 | - |
| 5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-葡萄糖苷 | - | 柠檬酸盐 | + |
实施例2清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742的发酵培养
1、发酵培养基的确定
将所得清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742菌株分别在营养肉汤培养基和MRS肉汤培养基中进行培养，观察其生长情况，确定出最适培养基为MRS肉汤培养基。
2、培养条件的确定
将菌株在不同温度(20-35℃)，不同培养基起始pH值(5.5-7.0)的条件下恒温培养，
定时取样测定菌株的活菌数，确定了清酒乳杆菌(Lactobacillussake)CGMCC No.9742的适宜培养温度和pH值。
温度25-35℃，培养基pH值6.2-6.4，摇床培养16-24h后离心收获菌体。
实施例3本实施例用于说明发酵剂的制备
将清酒乳杆菌(Lactobacillus sake)CGMCC No.9742菌株接种于pH值为6.2的MRS肉汤培养基中，接种量为106CFU。于30℃温度下培养20h，然后经4℃、5000rpm、离心15min后，与等质量的冻干保护剂(每100ml质量浓度为10％的脱脂乳中添加有2g甘油，3g蔗糖。)混合，-20℃预冻2h后，置于真空冷冻干燥机中，进行真空干燥(冷阱温度-45℃，真空度10～20Pa)22～24h，菌粉含水量降至2.5～3％时停止干燥，即得到干粉形式的发酵剂，发酵剂中清酒乳杆菌菌株的含量为1010CFU/g。
实施例4本实施例用于说明干粉发酵剂的应用
本实施例的发酵香肠由下述方法制得：
(1)原料肉选取：
检疫合格肉和脂肪用作发酵香肠的原料，没有致病微生物或化学性污染，修整去筋、腱、血块和腺体。
(2)切丁：将肉和脂肪切成边长为2cm的立方体。
(3)冷冻：切丁后的肉和脂肪在-18℃冷冻。
(4)斩拌：斩拌初期温度是3℃，斩拌速度为3000rpm/min，使瘦肉与脂肪颗粒混合均匀，斩拌结束温度不超过5℃，时间为2min。
(5)加入香辛料和添加剂：
发酵香肠加入：猪肉500g，牛肉300g，猪背脂肪200g，氯化钠20g，黑胡椒2g，白胡椒2g，葡萄糖10g，亚硝酸钠0.1g，异VC钠0.5g，三聚磷酸盐3g，干红葡萄酒12g，鲜蒜5g，水20g。
(6)搅拌：采用真空搅拌机，确保肉馅中气泡少，粘着性好。
(7)加入发酵剂：将实施例3中制备的发酵剂按每千克肉馅中添加0.1g的比例加入肉馅中。
(8)灌装：采用真空灌肠机，可使香肠饱满，发酵均匀。
(9)发酵成熟：发酵成熟在两个分开的恒温间进行：第一个恒温间温度30℃，湿度90±3％，2天，使产品充分发酵；第二个恒温间温度15℃，湿度80±3％，18天，最终产品pH值为4.9～5.0。
(10)发酵过程中取样检测pH值绘制产酸曲线(根据《肉与肉制品pH测定GB/T 9695.5-2008》中所提供的方法)，结果见图2。取样检测产品中游离氨基酸含量的变化情况(根据李平兰，沈清武，等.微生物酶与肉组织酶对干发酵香肠中游离氨基酸的影响[J].食品与发酵工业，2005，31(5)：134-138.中所提供的方法)，结果列于表3。
本实施例的方法制得的快速发酵香肠：生产周期缩短(从通常50天以上降低到20天左右)；对产品中沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、志贺氏菌、大肠菌群的分析表明，满足《GB 2726-2005熟肉制品卫生标准》中的相关规定；经过微生物的发酵，蛋白质分解产生大量游离氨基酸，与原料肉相比，氨基酸总含量提高了55％以上，18种氨基酸含量提高了36-70％(见表3)，使肉制品变得易于消化、吸收，其营养性和保健性得到进一步增强，风味和口感也更佳。
对比例1
采用与实施例4相同的方法制备发酵香肠，不同的是，将发酵剂更换为商品发酵剂(意大利SACCO公司的复配型发酵剂LyocarniPRO-MIX 5，含清酒乳杆菌、类植物乳杆菌和木糖葡萄球菌)。取样检测pH值绘制产酸曲线(检测方法同实施例4)，结果见图2。取样检测产品中游离氨基酸含量的变化情况(检测方法同实施例4)，结果列于表3。
表3
与对比例1所制备的发酵香肠相比，本发明发酵剂制备的发酵香肠产酸曲线与商品发酵剂无显著性差异(见图2)；而最终成熟产品的游离氨基酸总含量提高了10％以上，18种氨基酸含量提高了7％～16％(见表3)。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种清酒乳杆菌菌株(Lactobacillus sake)，于2014年9月28日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9742。
2.一种肉灌制品发酵剂，其特征在于，含有权利要求1所述的清酒乳杆菌菌株。
3.根据权利要求2所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂的组成成分包括清酒乳杆菌菌株的浓缩菌体和冻干保护剂。
4.根据权利要求3所述的发酵剂，其特征在于，所述发酵剂中清酒乳杆菌菌株的含量为109-1011CFU/g。
5.根据权利要求3或4所述的发酵剂，其特征在于，所述浓缩菌体与冻干保护剂的质量比为0.1-10：1。
6.根据权利要求5所述的发酵剂，其特征在于，所述冻干保护剂的组成成分包括脱脂乳、甘油和蔗糖，其中，每100ml质量浓度为8-15％的脱脂乳中添加有2-4g甘油和3-5g蔗糖。
7.权利要求2-6所述的发酵剂的制备方法，其特征在于，该方法包括：首先在培养基中培养清酒乳杆菌菌株，再离心获得浓缩菌体，将所述浓缩菌体与冻干保护剂接触混匀后冷冻干燥，获得发酵剂。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：所述培养基为MRS肉汤培养基，培养基的pH为6.0-6.4；培养温度为25-35℃。
9.根据权利要求7或8所述的制备方法，其特征在于，所述离心的温度为2-5℃，离心转速为3500-5500rpm，离心时间为10-20min。
10.权利要求2-6所述的发酵剂在肉灌制品发酵中的应用，包括：将已经添加了调味剂和添加剂的肉馅与所述发酵剂按照每1000g肉馅中添加0.08-0.12g发酵剂的比例搅拌混匀后灌装，在30℃、湿度90±3％的条件下发酵2天进行第一发酵，第一发酵结束后再在15℃、湿度80±3％的条件下发酵18天进行第二发酵获得产品。
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