CN111961626A

CN111961626A - 一株清酒乳杆菌菌株及其在食品加工中的应用

Info

Publication number: CN111961626A
Application number: CN202010877222.7A
Authority: CN
Inventors: 祝超智; 李珊珊; 赵改名; 崔文明; 焦阳阳; 李佳麒; 银峰; 白雪原; 张桂艳; 苏世龙; 王晗
Original assignee: Henan Agricultural University
Current assignee: Henan Agricultural University
Priority date: 2020-08-27
Filing date: 2020-08-27
Publication date: 2020-11-20
Anticipated expiration: 2040-08-27
Also published as: CN111961626B

Abstract

本申请属于食品加工技术领域，具体涉及一株清酒乳杆菌菌株及其在食品加工中的应用专利申请事宜。该菌株的分类名称为：清酒乳杆菌HNF4，保藏编号为：CCTCC NO：M2020338。云南腊肉是我国一种地域性较强的传统发酵风味肉制品，不仅具有独特的风味与口感，而且具有悠久的历史与深厚的文化底蕴。本申请中，发明人以云南自然发酵腊肉为原料，以菌株的安全性、生产适应性及对产品品质的影响等为指标，筛选获得了一株产酸能力强，且具有较好耐盐性和耐亚硝酸盐性好的清酒乳杆菌菌株，基于此菌株，可为云南腊肉的工业化生产及标准化肉制品发酵剂的制备奠定一定技术基础。

Description

一株清酒乳杆菌菌株及其在食品加工中的应用

技术领域

本申请属于食品加工技术领域，具体涉及一株清酒乳杆菌菌株及其在食品加工中的应用专利申请事宜。

背景技术

发酵肉制品属于一种高盐、低水分的发酵加工类肉制品，具有储存期长、风味独特、营养价值高等特点。它是一种在自然条件下，经微生物发酵、或微生物代谢酶作用下，发生一系列生物化学及物理变化而形成的肉制品。

现阶段，我国发酵肉制品类发展相对较慢，其主要原因之一在于缺少自主产权的发酵剂，进而导致肉制品产品品种单一，并且加工过程控制程度较低，产品质量难以稳定等。也因此，筛选、制备适合于肉制品发酵的优良菌株并制备发酵剂，是提高发酵肉制品品质的重要前提保障，也是实现发酵肉制品的产业化、规模化重要前提。

发酵食品加工中，乳酸菌是最为常用的一类发酵菌。而乳酸菌也是最早从发酵肉制品中分离出的微生物之一，与产品品质有密切的关系。已有研究普遍认为，乳酸菌可降低产品pH值，赋予产品特殊的发酵风味，对于改善组织质构、促进色泽与风味的形成具有重要作用。同时，某些乳酸菌能产细菌素，抑制腐败菌和致病菌生长繁殖，甚至还有某些乳酸菌具有降低产品中生物胺、降低胆固醇、抗氧化等作用。但基于生物学常识而言，显然并非所有乳酸菌都适合作为肉制品发酵菌株，不同种甚至同一种的不同菌株间特性的差异都会使产品品质产生极大的差别。因此，基于不同食品、不同品质要求，筛选、获得最适的发酵菌株，仍是发酵类食品、尤其是发酵肉制品的重要基础工作之一。

发明内容

本申请目的在于提供一株清酒乳杆菌菌株，从而为相关发酵肉制品的加工、制造奠定一定技术基础。

本申请所采取的技术方案详述如下。

一株清酒乳杆菌菌株，其分类名称为：清酒乳杆菌HNF4，Lactobacillus sakeiHNF4，已于2020年7月21日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址为：中国武汉的武汉大学，2020年8月5日经检验，证明存活，保藏编号为：CCTCC NO：M2020338。

所述清酒乳杆菌菌株在食品加工中应用，用于发酵类肉制品加工应用，具体例如，用于腊肉制备。

云南腊肉是我国一种地域性较强的传统发酵风味肉制品，不仅具有独特的风味与口感，而且具有悠久的历史与深厚的文化底蕴。本申请中，发明人以云南自然发酵腊肉为原料，以菌株的安全性、生产适应性及对产品品质的影响等为指标，筛选获得了一株产酸能力强，且具有较好耐盐性和耐亚硝酸盐性好的清酒乳杆菌菌株，基于此菌株，可为云南腊肉的工业化生产及标准化肉制品发酵剂的制备奠定一定技术基础。

附图说明

图1为菌株24小时的产酸能力；

图2为菌株对不同浓度NaCl的耐受性，注：同一浓度有不同小写字母表示菌株间差异显著（P<0.05），下同；

图3为菌株对不同浓度NaNO₂的耐受性；

图4为菌株L12在不同温度条件下的生长能力；

图5为菌株L12在不同pH值条件下的生长能力；

图6为菌株L12生长曲线及产酸曲线；

图7为菌株L12形态；

图8为分离株16S rDNA序列系统进化树。

具体实施方式

下面结合实施例对本申请做进一步的解释说明。在介绍具体实施例前，就下述实施例中部分实验背景情况简要介绍说明如下。

材料：

云南腊肉，从云南当地某农家购买；

试剂：

MRS琼脂、MRS肉汤、琼脂、牛肉浸粉、蛋白胨、酵母提取物等，均为本领域常用试剂或培养基，不再赘述；

菌株鉴定时所采用细菌DNA提取试剂盒，北京天根试剂公司产品；

实验设备：

TGradient梯度PCR仪，德国Biometra公司；

EC3-310凝胶成像系统，美国UVP公司；

DYY-12电泳仪，北京市六一仪器厂；

ECLIPSE 80i共聚焦荧光显微镜，日本尼康公司。

实施例1

前期研究过程中，发明人认为云南腊肉作为一种地域性较强发酵肉制品，具有一种特殊风味性，为确定其中优势发酵菌株，发明人对其中的发酵菌株进行了初步筛选，本实施例就相关筛选过程简要介绍如下。

（一）菌株的初步分离

参考GB 4789.35-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》，遵循无菌操作；

称取样品25 g，剪碎，加入225 mL无菌生理盐水，用均质机均质，并用无菌生理盐水依次做10倍稀释；

选择3个适宜稀释度，分别取200 μL稀释液涂布于MRS+3%碳酸钙（质量分数）培养基平板上，37℃培养24～48 h。

（二）纯化

挑选有明显溶钙圈且符合乳酸菌菌落形态的菌落，反复划线培养，以进行纯化。

（三）初步筛选和鉴定

对纯化好的菌株进行革兰氏染色及过氧化氢酶试验，选取革兰氏阳性、过氧化氢酶阴性、且不形成芽孢的菌株作为初筛菌株；

同时，采用生化鉴定试剂盒进行糖醇发酵实验，参考《常见细菌系统鉴定手册》对菌株进行初步鉴定。

经过初步筛选和鉴定，最终确定了20株菌株，并分别编号为L1、L2、L3、L4、L5、L6、L7、L8、L9、L10、L11、L12、L13、L14、L15、L16、L17、L18、L19、L20，以便进一步筛选、鉴定。

实施例2

在实施例1的初筛基础上，由于获得菌株较多，为便于后续应用，因此根据实际性能需要，需进一步筛选、确定最佳菌株。本申请中，根据实际的肉制品发酵加工需要，以产酸能力、发酵性能、NaCl和NaNO2耐受性等为评价指标，对初步筛选所得菌株进行了进一步复筛；对复筛所得菌株进一步进行了16S rDNA 分子生物学鉴定，以确定最终筛选所得菌株的分类学地位。具体过程简介如下。

（一）具体测定评价指标

产酸能力测定：将初筛菌株的菌液接种于液体培养基（MRS肉汤）中，37℃下培养24 h，测定pH；

发酵性能测定：参考现有常规操作，进行葡萄糖产气试验、H₂S产生检测试验、精氨酸产氨试验、过氧化氢产生检测试验；

不同温度条件下的生长能力测定：将初筛菌株的菌液接种于液体培养基（MRS肉汤）中，分别在10℃、20℃、30℃、40℃、50℃条件下培养24 h，测定菌液的OD₆₀₀；

不同pH条件下的生长能力测定：将初筛菌株的菌液分别接种于pH为3.0、4.0、5.0、6.0、7.0液体培养基（MRS肉汤）中，37℃条件下培养24 h，测定菌液的pH；

NaCl和NaNO₂耐受性、生长曲线和产酸曲线：参考现有常规操作进行即可。

实验过程中，实验结果（重复3次）表示为平均值±标准差；采用SPSS16.0统计软件进行统计学分析，数据间的分析采用单因素方差分析（one way ANOVA）和Duncan多重比较法，显著性水平均设定为P小于0.05；生长曲线及产酸曲线的结果使用Origin Pro 8.0进行作图。

（二）16S rDNA 分子生物学鉴定

按照细菌DNA提取试剂盒说明书进行DNA 提取，并以所得DNA 为模板，用细菌16S rDNA通用引物27F和1492R作为上下游引物进行PCR扩增；对PCR产物经凝胶电泳分析后，送北京六合华大基因科技有限公司（武汉分公司）测序，应用BLAST程序，将测序结果在GenBank基因数据库中进行同源性比较以鉴定菌种归属。

（三）具体复筛结果

（1）菌株的产酸能力

对初筛所得20株菌株产酸能力测定结果如图1所示。

乳酸菌菌株的产酸性能是决定加工发酵肉制品成功与否及安全性的重要因素。而由图1可知，除L2、L16和L18外，所有菌株在24小时pH均达到4.0以下。在此基础上，进一步选取产酸能力较强菌株，即24小时pH≤3.9的9株菌进行后续试验。

（2）菌株的发酵性能

初步确定的9株菌株的发酵特性如下表1所示。

表1 ，菌株的发酵特性

注：“-”表示反应呈阴性；“+”表示反应呈阳性。

菌株的发酵特性决定其是否能作为肉制品发酵菌株，即：如果筛选的菌株若具有产H₂S、产H₂O₂、精氨酸产氨、葡萄糖产气等特性，就会严重影响产品的质构、风味、色泽等，使产品品质降低。而由表1可知，上述9株菌均不具有以上特性，符合要求，也即，均初步满足肉制品发酵需要。

（3）菌株对NaCl和NaNO₂的耐受性

发酵肉制品中食盐的添加量一般为质量分数2%~3%，在一些特殊的产品如色拉米香肠的加工中，食盐添加量更高。同时，随着发酵的进行，水分含量的降低，食盐含量也会相对提高，所以肉制品发酵用菌株应当具有较好的NaCl耐受性。另一方面，由于发酵肉制品中通常会添加适量亚硝酸盐以促进发色、增加风味、和抑制杂质微生物的作用，尤其是用来抑制肉毒梭状芽孢杆菌，因此，筛选所用菌株对于NaNO₂的耐受性也是十分必要的（国标中对亚硝酸盐在食品中的添加量有明确的规定，本申请中亚硝酸钠的最大量为150 mg/kg）。

具体NaCl耐受性测定结果如图2所示。可以看出，不同菌株对NaCl的耐受性存在显著性差异（P<0.05）。而当NaCl添加量达到6%时，菌株生长受到不同程度的抑制，其中L12的耐受性最好（2.54→1.94），L9的耐盐性最差（2.37→1.31）。

而NaNO₂测定结果表明（如图3所示），当NaNO₂添加量为150 mg/kg 时，除L19菌株外，其他菌株的OD值均还在2.0以上；其中L12和L14菌株的耐受性最好，OD值分别为2.32、2.36，这说明当NaNO₂胁迫时，菌株自身有较好的调节能力。

综合考虑上述指标，初步选择符合发酵肉制品标准基本要求且产酸较好、NaCl和NaNO₂耐受性最好的菌株即L12为目标菌株，以便进行下一步生长特性评价和菌种的鉴定。

（4）菌株在不同温度、不同pH条件下的生长能力

对L12菌株在不同温度、不同pH条件下生长情况进行测定，结果如图4、图5所示。

发酵肉制品的发酵温度一般为15℃～40℃。而由图4可知，不同温度条件下菌株的生长能力存在显著性差异（P<0.05），在15℃～40℃均能较好的生长，且在25℃~45℃条件下的生长情况没有显著性差异，生长适应性较强。

而随着发酵的进行，发酵肉制品的pH一般会不断降低，所以要求菌株对酸有一定程度的耐受性。由图5可知，菌株在不同pH值条件下的生长存在显著性差异（P<0.05）。菌株在pH4.0时能较好的生长，因此适合作为肉制品发酵剂潜在菌株。

（5）菌株的生长曲线和产酸曲线

菌株的生长速度和产酸速度快对于菌株能否在肉制品中的快速定植、生长及产酸，以及能否抑制其他腐败微生物的生长、保证产品的质量，具有十分重要的技术意义。菌株L12的生长曲线和产酸曲线如图6所示。可以看出，0-2 h内为延滞期，时间较短，在此期间内，生长速度和产酸速度较慢；2-7 h内为对数生长期，此阶段OD₆₀₀由0.19增加至2.25。此外，该菌株主要在对数生长期产酸。基于这些生长特性，可以初步判定，L12菌株可以满足实际的肉制品发酵加工需要。

（四）具体菌种鉴定

在上述复筛基础上，结合形态学和分子生物学方法，发明人对于L12菌株所属分类学地位进行了最终确定，具体而言：

形态学方面：菌株L12呈乳白色圆形菌落，直径1-2 cm，表面光滑凸起；镜检结果如图7所示，为革兰氏阳性杆菌，无鞭毛、无芽孢；

分子生物学方面：经16S rDNA测序，得到L12菌株的16S rDNA序列；基于BLAST序列的同源性比对，以及利用MEGA 6.06构建的系统发育树（如图8所示），可以确定L12菌株归属于清酒乳杆菌（Lactobacillus sakei）。

基于上述生长性能测定和该菌株的原始来源，发明人认为，筛选所得的清酒乳杆菌菌株，可以用于发酵肉制品发酵菌剂制备，对于提高发酵肉制品工艺水平、确保发酵肉制品品质具有十分重要的技术意义，同时也为其他菌株的筛选提供了一定借鉴和参考。

Claims

1.一株清酒乳杆菌菌株，其特征在于，该菌株的分类名称为：清酒乳杆菌HNF4，Lactobacillus sakei HNF4，已于2020年7月21日提交中国典型培养物保藏中心进行保藏，保藏地址为：中国武汉的武汉大学，2020年8月5日经检验，证明存活，保藏编号为：CCTCCNO：M2020338。

2.权利要求1所述所述清酒乳杆菌菌株在食品加工中应用。

3.如权利要求2所述清酒乳杆菌菌株在食品加工中应用，其特征在于，用于发酵类肉制品加工应用。

4.如权利要求3所述清酒乳杆菌菌株在食品加工中应用，其特征在于，用于腊肉制备。