CN114680294A - 一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法。通过比例设定，对发酵菌液培养、优化、显著提升发酵菌液的产酸能力，制作冻干菌粉，对购买的冷鲜牛肉进行切片、配置腌制调料、滚揉腌制、菌粉发酵(发酵前不需要杀菌处理)、包装、杀菌制得乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品；发酵时间显著缩短，仅为6h；制得的发酵调理牛排颜色深红、香味浓郁、组织细腻、致密有弹性、咸淡适口，有独特的乳酸菌发酵风味，且TVB‑N和TBA含量远低于同类产品，延缓脂肪和蛋白质氧化的能力提升了31.26％，货架期延长了10‑15天，能保持冷鲜调理牛排原本滋味和品质，在食品发酵和储存领域具有广泛的实用性和开发价值。

Description

一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法
技术领域
本发明属于食品加工技术领域，具体涉及一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法。
背景技术
调理牛排是指将原料肉修整切片、滚揉腌制之后制作而成的肉制品。调理牛排因食用方便、包装精美、营养均衡而广受消费者的青睐。目前，我国主要以冷鲜调理牛排的形式在大型超市或专柜中出售。然而，冷鲜条件只能抑制微生物的生长繁殖，并未完全杀灭微生物，尤其是致病菌和腐败菌，在一定条件下，病原微生物又会生长繁殖，影响其货架期。据报道，生鲜调理牛排在0～4℃条件下货架期仅有2d，即使经过气调包装4℃保藏，货架期也仅为14d，货架期短已成为调理牛排发展的瓶颈。
目前，发酵肉制品局限于发酵香肠、发酵肉制品调料、发酵腌制腊肉领域，对新鲜肉制品进行发酵直接食用的研究制作较少，同时冷鲜调理牛排制品销售仍然局限于新鲜肉制品，在风味、口感、保藏上逐渐不能满足人们对食品各方面的要求，因此，亟需一种风味独特、营养丰富、货架期较长的发酵冷鲜调理牛排制品。
发明内容
针对目前发酵肉制品局限于发酵香肠、发酵肉制品调料、发酵腌制腊肉领域，对新鲜肉制品进行发酵用于食用的研究制作较少，同时冷鲜调理牛排制品风味、口感、货架期逐渐不能满足人们对食品各方面的要求问题；本发明旨在提供一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，通过对发酵菌液培养、优化、制作冻干菌粉，对购买的冷鲜牛肉进行切片、配制腌制调料、滚揉腌制、菌粉发酵(发酵前不需要杀菌处理)、包装、杀菌制得乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品，制得的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排呈牛肉玫瑰红色，香味浓郁，组织细腻、致密有弹性，咸淡适口，有独特的乳酸菌发酵风味，便于制作烹饪，且TVB-N和TBA含量远低于同类产品，货架期延长10-15d，能保持冷鲜调理牛排原本滋味和品质，健康方便，在食品发酵和储存领域具有广泛的实用性和开发价值。
本发明通过以下技术方案实现的：
本发明提供一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作方法，包括以下步骤：
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌乳亚种、清酒乳杆菌清酒亚种、植物乳杆菌植物亚种分别在营养琼脂培养基上活化培养，活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养后挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基进行第二次培养，培养后得到乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液；进行菌液优化，将三种菌液摇匀后混合得到菌种混合液，其中乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液的体积比1-2:1:1-2；然后再次将菌种混合液加入MRS液体培养基中，其中菌种混合液与MRS液体培养基的体积比为0.1-0.20:50，继续混合培养，培养至菌液的pH值为5.2-5.5和OD值为0.300-0.310时，即得终菌液；
优选的，步骤(1)中所述乳酸乳球菌乳亚种的菌株编号为20399，清酒乳杆菌清酒亚种的菌株编号为21858，植物乳杆菌植物亚种的菌株编号为20022。
优选的，步骤(1)中所述活化培养的温度为35～37℃，培养24h；所述第一次培养、第二次培养的温度均为35～37℃，时间为24h；所述继续混合培养的温度为35～37℃。
优选的，步骤(1)中所述乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液的体积比2:1:1；菌种混合液与MRS液体培养基的体积比体积比为0.15:50；所述培养至菌液的pH值为5.3，OD值为0.305。
优选的，步骤(1)中所述营养琼脂培养基配方(以1L计)：牛肉膏1g，酵母膏2g，蛋白胨5g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.3-7.4。
优选的，步骤(1)中所述MRS琼脂培养基配方(以1L计)：牛肉膏10g，鱼肉汁10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为6.2-6.4。
优选的，步骤(1)中所述MRS液体培养基配方(以1L计)：牛肉膏10g，鱼肉汁10g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为6.2-6.4。
(2)制作冻干菌粉：将(1)中得到的终菌液进行离心，取菌泥加入灭菌的MRS液体培养基重悬，获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液0.5-2份、蔗糖8-15份、脱脂乳8-15份、谷氨酸钠4-10份、甘油4-10份，充分混合，经预冷、真空冷冻干燥后，制得冻干菌粉；
优选的，步骤(2)中所述离心的条件为：10000-14000rpm离心8-15min；所述菌泥与MRS液体培养基的用量比为1g:10mL；所述混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL。
优选的，步骤(2)中所述MRS液体培养基灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；所述冻干菌粉包括混合菌液0.5-1份、蔗糖9-10份、脱脂乳9-10份、谷氨酸钠4-5份、甘油(食品级)4-5份；所述预冷的条件为-80℃预冷12～18h，所述真空冷冻干燥的时间10-14h。
(3)滚揉腌制：按照重量份数计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各0.5-3.5份、料酒3-7份、糖3-7份、食盐13-20份和水140-200份，充分溶解，搅拌至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制，得到腌制牛排；
优选的，步骤(3)中所述腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各1.5-2份、料酒4-5份、糖4-5份、食盐14-15份和水145-150份，充分溶解，搅拌9-11min混合均匀；所述腌制的时间为0.5-2.5h。
(4)将步骤(2)得到的冻干菌粉均匀分散于步骤(3)得到的腌制牛排表面，其中冻干菌粉与腌制牛排的质量比为0.05-0.2:200；然后拍打牛排至冻干菌粉分散融化，再将牛排用保鲜膜包装后进行发酵，发酵后再经真空包装、杀菌，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
优选的，步骤(4)所述冻干菌粉与腌制牛排的质量比为0.1:200；所述发酵的条件为：温度为35～37℃，湿度70％，时间5-8h。
优选的，步骤(4)所述真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s；所述杀菌的条件为：500-550MPa，维持8-15min。
通过实施本发明的技术方案，可以达到以下有益效果：
本发明提供一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法，制得的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排呈牛肉玫瑰红色，香味浓郁、组织细腻、致密有弹性、咸淡适口，有独特的乳酸菌发酵风味，便于制作烹饪；且TVB-N和TBA含量远低于同类产品，货架期延长10-15d，取得了显著的效果；同时能保持冷鲜调理牛排原本滋味和品质，健康方便，在食品发酵和储存领域具有广泛的实用性和开发价值。
附图说明
图1中A图为三种单菌液在不同时间下的pH值变化图；其中A1、A2、A3分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液、植物乳杆菌植物亚种菌液；B图为乳酸乳球菌乳亚种与清酒乳杆菌清酒亚种不同比例双混合菌液在不同时间下的pH值变化，其中B1、B2、B3、B4、B5分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液和清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比1:1、1:2、2:1、1:3、3:1混合得到的五种混合菌液；C图为乳酸乳球菌乳亚种与植物乳杆菌植物亚种不同比例双混合菌液在不同时间下的pH值变化，其中C1、C2、C3、C4、C5分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比为1:1、1:2、2:1、1:3、3:1混合得到的五种混合菌液；D图为植物乳杆菌植物亚种与清酒乳杆菌清酒亚种不同比例双混合菌液在不同时间下的pH值变化，其中D1、D2、D3、D4、D5分别为植物乳杆菌植物亚种菌液和清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体基本1:1、1:2、2:1、1:3、3:1混合得到的五种混合菌液；E图为乳酸乳球菌乳亚种、清酒乳杆菌清酒亚种与植物乳杆菌植物亚种不同比例三混合菌液在不同时间下的pH值变化，其中F1、F2、F3、F4、F5、F6、F7分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:2:1、2:1:2混合得到的七种混合菌液。
图2为挑选出八种发酵菌液在不同时间下的OD值图；其中A1为乳酸乳球菌乳亚种菌液、A2为清酒乳杆菌清酒亚种菌液、A3为植物乳杆菌植物亚种菌液、B3为乳酸乳球菌乳亚种菌液与清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比2:1混合得到的菌液、F1、F5、F6、F7分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比为1:1:1、2:1:1、2:2:1、2:1:2混合得到的四种混合菌液。
具体实施方式
下面结合实施例具体说明本发明，但是，本发明并不限于下述的实施例。
本发明采用的乳酸乳球菌乳亚种(中国工业微生物菌种保藏中心)、清酒乳杆菌清酒亚种(中国工业微生物菌种保藏中心)、植物乳杆菌植物亚种(中国工业微生物菌种保藏中心)、营养琼脂培养基、MRS琼脂培养基、MRS液体培养基、蔗糖、脱脂乳、谷氨酸钠、甘油(食品级)、花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精、料酒、糖、食盐和水均可通过公共渠道购买，工艺中所采用的设备和工具均为本领域常见的设备。
本发明中所选用的所有材料、试剂和仪器都为本领域熟知的，但不限制本发明的实施，其他本领域熟知的一些试剂和设备都可适用于本发明以下实施方式的实施。
条件优化：
根据菌液的pH值与OD值优化乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排发酵菌粉配方；
探究乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排制作方法中乳酸乳球菌乳亚种、清酒乳杆菌清酒亚种、植物乳杆菌植物亚种三种菌液按照不同比例混合后的pH和OD值制作的冻干菌粉对发酵牛排的影响。根据pH值和OD值初步筛选配方见图1和图2。通过图1中A图可以看出单菌液乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌菌液、植物乳杆菌菌液达到pH值范围时培养时间为16h，说明在pH值为5.3时，其产酸能力较差；图1中B、C、D图可以看出乳酸乳球菌乳亚种菌液与清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比1:1、1:2、2:1、1:3、3:1，乳酸乳球菌乳亚种菌液与植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比1:1、1:2、2:1、1:3、3:1，植物乳杆菌植物亚种菌液与清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比1:1、1:2、2:1、1:3、3:1混合得到的双混合菌液达到pH值5.3-5.5范围时培养时间为12h，说明在pH值为5.3时，产酸能力适中，其中乳酸乳球菌乳亚种菌液与清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比2:1，乳酸乳球菌乳亚种菌液与植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比2:1，植物乳杆菌植物亚种菌液与清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比2:1混合得到的双混合菌液产酸能力为双混合菌液中最好；图1中E图可以看出乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比1:1:1、1:1:2、1:2:1、1:2:2、2:1:1、2:2:1、2:1:2混合得到的三种菌混合菌液达到pH值5.3-5.5范围时培养时间为8h，说明在pH值为5.3时，产酸能力最好。根据产酸能力从大到小排序，筛选至第一个双混合菌液处。可以初步筛选出乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液按照体积比2:1:1、2:1:2、2:2:1、1:1:1，乳酸乳球菌乳亚种菌液和清酒乳杆菌清酒亚种菌液按照体积比2:1五种混合菌液，并对单菌液OD值进行检测。通过图2可以看出检测的8种菌液在0-20h内始终在对数生长期，说明在OD值为0.305时，生长能力较好。pH值下降，能够抑制有害菌的生长，延长调理牛排货架期，但pH过低后续会影响调理牛排口感。根据图1中E的pH值可以看出，产酸能力较强的F5、F6、F7在pH值5.3时培养时间为6h，图2中菌液在6h时生长曲线斜率最高，菌液生长能力最强，根据OD值即生长能力结合pH确定发酵时间为6h。
实施例表格中，乳、清、植分别为乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液的简写；其中乳:清:植＝2:1:1指代乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液体积比为2:1:1，其余比例含义相同。
冷鲜调理牛排腌制会添加食盐，乳酸菌能够耐受一定程度的盐，但过高的盐含量会抑制乳酸菌的生长，对乳酸菌协同发酵时牛排盐含量配方进行优化结果见表1。
表1：耐盐实验优化乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法
Figure BDA0003611892990000051
Figure BDA0003611892990000061
注：同行不同大写字母表示差异显著，同列不同小写字母表示差异显著
由表1可以看出在1.5％-3％盐含量时8种发酵菌液的OD值与0％盐含量时差异不显著(p＜0.05)，表明调理牛排添加1.5％盐含量不会影响发酵菌液生长能力，能够维持在较好的水平上。
根据发酵后冷鲜调理牛排品质评价优化发酵配方结果见表2。
表2：发酵牛排pH、水分含量、水分活度、TVB-N、TBA指标优化乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法
Figure BDA0003611892990000062
乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排后，水分活度和水分含量下降，表明乳酸菌作用能够降低水分含量和水分活度来抑制有害微生物生长，同时pH、TBA、TVB-N等新鲜度指标也呈现出下降趋势，表明乳酸菌发酵能够降低发酵牛排pH值，降低新鲜度指标含量，延缓脂肪和蛋白质氧化，进而延长货架期。其中三混合菌效果更好，可以优化得到乳:清:植＝2:1:1、2:1:2、2:2:1、1:1:1的四种三混合菌发酵剂的效果优于乳:清＝2:1、乳酸乳球菌乳亚种菌液、清酒乳杆菌清酒亚种菌液和植物乳杆菌植物亚种菌液。
根据发酵后冷鲜调理牛排质构品质优化发酵剂配方结果见表3。
表3：发酵牛排质构指标优化乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法
Figure BDA0003611892990000063
Figure BDA0003611892990000071
注：同列不同大写字母表示差异显著(p＜0.05)。
质构是模拟食用品质的指标，硬度、弹性和咀嚼性不宜太大或太小，适中的牛排更适合食用。根据表3可以看出从硬度、弹性、咀嚼性分析，乳:清:植＝2:1:1、2:1:2、2:2:1、1:1:1的四种三混合菌发酵剂制得的调理牛排硬度适中，同时更加弹滑，咀嚼性更好。
根据GB/T 22210-2008的感官评价相关要求，按照表4的发酵冷鲜调理牛排感官评分标准对发酵冷鲜调理牛排肉制品发酵剂配方的优化结果见表5。
表4：乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法感官评分表
Figure BDA0003611892990000072
Figure BDA0003611892990000081
表5：感官分析优化乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品的制作方法
Figure BDA0003611892990000082
注：同列不同大写字母表示差异显著(p＜0.05)。
从表5可以看出，相对于未发酵牛排，乳酸菌发酵后调理牛排香味、肌肉外观、色泽、咀嚼性得分更高，总分也更高，表明乳酸菌发酵的冷鲜调理牛排香味浓郁，色泽鲜红，组织细腻、致密有弹性，纹理细致，咸淡适口。乳:清:植＝2:1:1、2:1:2、2:2:1、1:1:1的四种三混合菌发酵剂发酵冷鲜调理牛排香味突出，外观细腻，色泽深红，容易咀嚼，其中乳:清:植＝2:1:1的发酵剂发酵的冷鲜调理牛排具有最高评分14.8，表明该发酵剂制得的冷鲜调理牛排感官品质最好。
根据感官分析、质构、Aw、pH、TBA、TVB-N等不同占比的指标对发酵冷鲜调理牛排的综合得分优化发酵配方结果如表6所示。
表6：乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排肉制品综合评分
Figure BDA0003611892990000083
Figure BDA0003611892990000091
根据表6可知，乳:清:植＝2:1:1作为发酵剂制作的冷鲜调理牛排综合评分最高，为9.44，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较低，水分活度和水分含量最适宜，香味更加浓郁，色泽鲜红，组织细腻、致密有弹性，纹理细致，咸淡适口。
根据乳:清:植＝2:1:1为发酵剂制作的发酵牛排储存期间成分指标、新鲜度指标优化冷鲜调理牛排货架期结果如表7所示。
表7：乳酸菌协同发酵与未发酵冷鲜调理牛排在0-35d内货架期指标变化
Figure BDA0003611892990000092
Figure BDA0003611892990000101
注：同行不同小写字母表示差异性显著(p＜0.05)
根据表7可知，乳:清:植＝2:1:1为发酵剂制作的发酵牛排游离态酚含量与未发酵相比增幅较大，结合态酚含量下降较快。乳酸菌发酵有助于结合态酚类物质的释放，并提高其生物活性，以及总酚类物质的释放，并在储藏期间保证酚类物质的活性。根据TVB-N、TBA、生物胺含量变化可知，三种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排货架期在35d左右，未发酵冷鲜调理牛排货架期为21d左右，三种乳酸菌最佳工艺发酵能够使调理牛排货架期延长10-15d。
实施例1：三种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)、清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)、植物乳杆菌植物亚种(LP，菌株编号20022)分别在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到三种菌液；进行菌液优化，按乳:清:植＝2:1:1比例吸取三种菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中E图中F5说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间最短，且继续产酸能力最强，图2中F5发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了按乳:清:植＝2:1:1比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5339，与0％时的0.6075差异不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量下降，分别为0.91和70.81，pH值为5.41，在正常范围内，TBA和TVB-N含量下降明显，TBA含量最低，表明对有害微生物生长的抑制能力最强，能够很好的延缓脂肪和蛋白质氧化，延长货架期；表3可以看出制得的牛排硬度适中，弹性和咀嚼性较好；表5可以看出制得的牛排发酵肉香味浓郁，外观较细致，色泽深红，肉质细腻容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为9.44，得分最高，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较低，水分活度和水分含量最适宜，香味更加浓郁，色泽鲜红，组织细腻、致密有弹性，纹理细致，咸淡适口。对真空包装的发酵冷鲜调理牛排货架期指标检测，评价货架期，表7为按乳:清:植＝2:1:1比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在不同储藏时期的理化品质和新鲜度指标变化，可以看出乳酸菌发酵牛排游离态酚含量与未发酵相比增幅较大，结合态酚含量下降较快。乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排货架期在35d左右，未发酵冷鲜调理牛排货架期为21d左右，该配方发酵能够使调理牛排货架期延长10-15d。
实施例2：三种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)、清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)、植物乳杆菌植物亚种(LP，菌株编号20022)分别在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到三种菌液；进行菌液优化，按乳:清:植＝2:1:2比例吸取三种菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中E图中F7说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间较短，且继续产酸能力较强，图2中F7发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了按乳:清:植＝2:1:2比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5355，与盐含量0％时的0.5963差异不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响。表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量分别为0.91和70.69，pH值为5.40，在正常范围内，TVB-N含量最低，为4.96mg/100g，TBA含量最低，表明对有害微生物生长的抑制能力较强，能够较好的延缓脂肪和蛋白质氧化，延长货架期；表3可以看出制得的牛排硬度较好，弹性和咀嚼性较好；表5可以看出制得的牛排发酵香味不明显，无异味，外观较细致，色泽深红，肉质较好，比较容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为9.04，得分较高；表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较低，水分活度和水分含量适宜，无异味，色泽鲜红，组织细腻、致密有弹性，纹理细致，咸淡适口。
实施例3：三种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)、清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)、植物乳杆菌植物亚种(LP，菌株编号20022)分别在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到三种菌液；进行菌液优化，按乳:清:植＝2:2:1比例吸取三种菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中E图中F6说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间较短，且继续产酸能力适中，图2中F6发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了按乳:清:植＝2:2:1比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5342，与0％时的0.5938差异不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量下降，分别为0.91和70.91，水分含量较低，pH值为5.42，在正常范围内，TBA和TVB-N含量分别为0.02mg/kg和5.35mg/100g，TBA含量较低，表明对有害微生物生长的抑制能力较强，能够较好的延缓脂肪和蛋白质氧化，延长货架期；；表3可以看出制得的牛排硬度较大，弹性和咀嚼性适中；表5可以看出制得的牛排发酵香味不明显，无异味，外观较细致，色泽深红，肉质较好，比较容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为7.76，得分较低，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较低，水分活度和水分含量适中，发酵香味不明显，色泽鲜红，外观细致、致密有弹性，肉质较好，咸淡适口。
实施例4：三种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)、清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)、植物乳杆菌植物亚种(LP，菌株编号20022)分别在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到三种菌液；进行菌液优化，按乳:清:植＝1:1:1比例吸取三种菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中E图中F1说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间较短，且继续产酸能力适中，图2中F1发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了按乳:清:植＝1:1:1比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5347，与0％时的0.5918差异较不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量下降，分别为0.91和70.90，pH值最低，为5.39，在正常范围内，TBA和TVB-N含量下降幅度适中，表明对有害微生物生长抑制能力适中，能够延缓脂肪和蛋白质氧化，延长货架期；表3可以看出制得的牛排硬度较小，弹性和咀嚼性最好；表5可以看出制得的牛排无发酵香味，淡淡酸味，为原切牛排纹理，色泽为黄褐色，肉质较好比较容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为8.80，得分较高，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较低，水分活度和水分含量适宜，无发酵香味，淡淡酸味，为原切牛排纹理，色泽为黄褐色，肉质较好比较容易咀嚼，咸淡适口。
对比实施例5：两种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)混合菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)、清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)分别在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到两种菌液；进行菌液优化，按乳:清＝2:1比例吸取两种菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中B中B3说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间长，且继续产酸能力适中，图2中B3发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了按乳:清＝2:1比例为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5285，与0％时的0.5919差异较不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量分别为0.92和71.09，pH值为5.47，在正常范围内，TBA和TVB-N含量分别为0.09mg/kg和7.58mg/100g，含量较高，表明对有害微生物生长的抑制能力较弱，能够延缓脂肪和蛋白质氧化，延长货架期；表3可以看出制得的牛排硬度最小，弹性和咀嚼性较差；表5可以看出制得的牛排无发酵香味，淡淡酸味，为原切牛排纹理，色泽为黄褐色，肉质粗糙可以咀嚼，表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为7.82，得分较低，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较高，水分活度和水分含量适宜，无发酵香味，淡淡酸味，为原切牛排纹理，色泽为黄褐色，肉质粗糙可以咀嚼。
对比实施例6：乳酸乳球菌乳亚种发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)菌液培养：将乳酸乳球菌亚种(LLSL，菌株编号20399)在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到菌液；进行菌液优化，吸取菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中A中A1说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间较长，且继续产酸能力较差，图2中A1发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了以乳酸乳球菌乳亚种为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5272，与0％时的0.5883差异较不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量较大，分别为0.93和71.39，pH值为5.53，超过正常范围且产酸能力差，TBA和TVB-N含量较高，表明对新鲜度指标的抑制能力差，对有害微生物生长的抑制能力较差，延缓脂肪和蛋白质氧化和延长货架期的能力较差；表3可以看出制得的牛排硬度最大，弹性和咀嚼性差；表5可以看出制得的牛排有强烈酸味，外观较粗糙且为黄褐色，色泽深红，肉质粗糙不容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为5.24，得分低，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较高，水分活度和水分含量较高，有强烈酸味，外观较粗糙且为黄褐色，肉质粗糙不容易咀嚼。
对比实施例7：清酒乳杆菌清酒亚种发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)菌液培养：将清酒乳杆菌清酒亚种(LS，菌株编号21858)在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到菌液；进行菌液优化，吸取菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中A中A2说明达到pH值5.3时所需要的发酵时间长，且继续产酸能力差，图2中A2发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放进真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示清酒乳杆菌清酒亚种为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5272，与0％时的0.5874差异较不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量最高，分别为0.93和71.82，pH值为5.57，超过正常范围且产酸能力差，TBA和TVB-N含量高，分别为0.11mg/kg和8.62mg/100g，表明对有害微生物生长的抑制能力差，延缓脂肪和蛋白质氧化及延长货架期的能力差；表3可以看出制得的牛排硬度过大，弹性和咀嚼性差；表5可以看出制得的牛排发酵无发酵香味，有淡淡酸味，外观较粗糙且为黄褐色，肉质粗糙不容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为6.72，得分较低，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较高，水分活度和水分含量较高，有淡淡酸味，外观较粗糙且为黄褐色，肉质粗糙不容易咀嚼。
对比实施例8：植物乳杆菌植物亚种发酵冷鲜调理牛排的制作
(1)菌液培养：将植物乳杆菌植物亚种(LP，菌株编号20022)在营养琼脂培养基上活化培养，培养温度为37℃，培养24h；活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养温度为37℃，时间为24h；培养后挑取单菌落种于MRS液体培养基进行第二次培养(接种量1g:100ml)，培养温度为37℃，时间为24h，培养后得到菌液；进行菌液优化，吸取菌液再次加入MRS液体培养基中(混合菌液与培养基体积比为0.15:50)，因为要求菌液产酸能力和生长能力最强，所以根据pH值5.3和OD值0.305优化筛选菌液，图1中A中A3说明达到pH值5.3时需要的发酵时间最长，继续产酸能力最差，图2中A3发现其在对数生长期，维持较好的生长能力，作为发酵剂制作冻干菌粉；
(2)制作冻干菌粉：将(1)中挑选的菌液调节菌种浓度为1.0×108CFU/mL在高速冷冻离心机中以12000rpm离心10min，称取菌泥重量，以1g:10mL的比例加入灭菌的MRS液体培养基重悬，灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液1份、蔗糖10份、脱脂乳10份、谷氨酸钠5份、甘油(食品级)5份，充分混合，-80℃预冷12h，置于真空冷冻干燥机干燥12h，制得冻干菌粉；
(3)滚揉腌制：按照重量计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各2份、料酒5份、糖5份、食盐15份和水150份，充分溶解，搅拌10min至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制1.5h；
(4)发酵：将步骤(3)得到的冷鲜调理牛排按照重量比0.1:200牛排加入冻干菌粉，混合均匀，拍打牛排至菌粉分散融化，将牛排用食品PE级保鲜膜包装后置于发酵器，在温度为37℃，湿度70％的条件下发酵6h，发酵后再经用规格为15cm×20cm的PE食品专用包装袋包装在真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s的条件下真空包装，将包装完成的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排肉制品置于超高压设备中在530MPa下杀菌处理，时间维持10min，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
(5)对步骤(4)中所制备的乳酸菌发酵冷鲜调理牛排进行品质评价：表1显示了植物乳杆菌植物亚种为发酵剂制备冻干菌粉发酵的冷鲜调理牛排在盐含量1.5％时OD值为0.5279，与0％时的0.5872差异较不显著(p＜0.05)，说明添加1.5％盐不会对发酵剂的生长能力产生影响；表2可以看出制得的牛排水分活度和水分含量最高，分别为0.93和71.82，pH值为5.59，超过正常范围且产酸能力差，TBA和TVB-N含量较高，表明对有害微生物生长的抑制能力差，延缓脂肪和蛋白质氧化及延长货架期的能力差；表3可以看出制得的牛排硬度大，弹性和咀嚼性差；表5可以看出制得的牛排无发酵香味，有淡淡酸味，外观较粗糙，色泽为黄褐色，肉质粗糙不容易咀嚼；表6可以看出制得的牛排在感官、质构、Aw、pH值、TBA、TVB-N的综合评价中得分为5.14，得分最低，表明其新鲜度指标TBA、TVB-N含量较高，水分活度和水分含量较高，有淡淡酸味，外观较粗糙且为黄褐色，肉质粗糙不容易咀嚼。
通过实施例可以看出，乳:清:植＝1-2:1:1-2时，其能取得良好的效果，尤其是在乳:清:植＝2:1:1时，其效果最优；最优结果与对比实施例5相比，TBA含量低0.08mg/kg，TVB-N含量低2.37mg/100g，硬度、弹性、咀嚼性适中，感官评分高4.4，综合评价总分高1.62，本发明在延缓脂肪和蛋白质氧化、降低新鲜度指标含量、提高食用和感官品质方面效果显著，相对比实施例5，延缓脂肪和蛋白质氧化、降低新鲜度指标含量的能力提升了31.26％，食用和感官品质最佳，将调理牛排的货架期延长了10-15d，取得了意想不到的显著效果；所以本发明并非是简单菌种的叠加，因为三菌混合也有不好的情况，如图1的E图中F2、F3、F4即乳:清:植＝1:1:2、1:2:1、1:2:2的三菌混合液，在pH值为5.3时需要的时间为10h，而图1中C3即乳:植＝2:1在pH值为5.3时需要的时间为8h，说明F2、F3、F4三菌混合的产酸能力低于C3双菌混合。如实施例4乳:清:植＝1:1:1制得的牛排感官评价中香味得分为2.8，低于单菌清制得牛排的3.0，说明乳:清:植＝1:1:1三菌混合制得的牛排发酵香味不如单菌清，咀嚼性得分为2.6，低于乳、清、植三种单菌制得的牛排，说明制得的牛排肉质粗糙，不容易咀嚼，同时实施例3乳:清:植＝2:2:1制得的牛排综合评分为7.76，低于对比实施例5中乳:清＝2:1制得的牛排，说明其在感官品质、产酸能力、降低新鲜度指标含量上优于对比实施例5，但质构品质不如对比实施例5；本发明是通过比例设定，显著提升发酵菌液的产酸能力，根据pH值5.3和OD值0.305筛选，确定发酵时间为6h，制得的发酵牛排肉制品感官评定更佳，呈牛肉玫瑰红色，香味浓郁，组织细腻、致密有弹性，咸淡适口，有独特的乳酸菌发酵风味，便于制作烹饪，且TVB-N和TBA含量远低于同类产品，货架期延长10-15d，能发挥冷鲜调理牛排原本滋味和品质，健康方便，在食品发酵和储存领域具有广泛的实用性和开发价值。
所述实施例为本发明的优选的实施方式，但本发明并不限于上述实施方式，在不背离本发明的实质内容的情况下，本领域技术人员能够做出的任何显而易见的改进、替换或变化均属于本发明的保护范围。

Claims (10)

1.一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将乳酸乳球菌乳亚种、清酒乳杆菌清酒亚种、植物乳杆菌植物亚种分别在营养琼脂培养基上活化培养，活化培养后分别接种于MRS琼脂培养基进行第一次培养，培养后挑取单菌落分别接种于MRS液体培养基进行第二次培养，培养后得到乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液；进行菌液优化，将三种菌液摇匀后混合得到菌种混合液，其中乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液的体积比1-2:1:1-2；然后再次将菌种混合液加入MRS液体培养基中，其中菌种混合液与MRS液体培养基的体积比为0.1-0.20:50，继续混合培养，培养至菌液的pH值为5.2-5.5和OD值为0.300-0.310时，即得终菌液；
(2)将(1)中得到的终菌液进行离心，取菌泥加入灭菌的MRS液体培养基重悬，获得混合菌液，混合菌液的菌种浓度为(0.9-1.1)×108CFU/mL；按照重量份数计，取混合菌液0.5-2份、蔗糖8-15份、脱脂乳8-15份、谷氨酸钠4-10份、甘油4-10份，充分混合，经预冷、真空冷冻干燥后，制得冻干菌粉；
(3)按照重量份数计，称取腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各0.5-3.5份、料酒3-7份、糖3-7份、食盐13-20份和水140-200份，充分溶解，搅拌至混合均匀，将切好的牛排放置于真空滚揉腌制机中腌制，得到腌制牛排；
(4)将步骤(2)得到的冻干菌粉均匀分散于步骤(3)得到的腌制牛排表面，其中冻干菌粉与腌制牛排的质量比为0.05-0.2:200；然后拍打牛排至冻干菌粉分散融化，再将牛排用保鲜膜包装后进行发酵，发酵后再经真空包装、杀菌，得到乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
2.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乳酸乳球菌乳亚种的菌株编号为20399、清酒乳杆菌清酒亚种的菌株编号为21858、植物乳杆菌植物亚种的菌株编号为20022；所述活化培养的温度为35～37℃，培养24h；所述第一次培养、第二次培养的温度均为35～37℃，时间为24h；所述继续混合培养的温度为35～37℃。
3.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(1)中所述乳酸乳球菌乳亚种培养液、清酒乳杆菌清酒亚种培养液和植物乳杆菌植物亚种培养液的体积比2:1:1；所述菌种混合液与MRS液体培养基的体积比体积比为0.15:50；所述培养至菌液的pH值为5.3，OD值为0.305。
4.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(1)中所述营养琼脂培养基配方，以1L计：牛肉膏1g，酵母膏2g，蛋白胨5g，NaCl 5g，琼脂15g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为7.3-7.4；
所述MRS琼脂培养基配方，以1L计：牛肉膏10g，鱼肉汁10g，酵母膏5g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为6.2-6.4；
所述MRS液体培养基配方，以1L计：牛肉膏10g，鱼肉汁10g，葡萄糖20g，醋酸钠5g，柠檬酸二铵2g，吐温80 0.1g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.28g，加蒸馏水定容至1000mL，pH为6.2-6.4。
5.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(2)中所述离心的条件为：10000-14000rpm离心8-15min；所述菌泥与MRS液体培养基的用量比为1g:10mL；所述混合菌液的菌种浓度为1.0×108CFU/mL。
6.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(2)中所述MRS液体培养基灭菌温度为121℃，灭菌时间为20min；所述冻干菌粉包括混合菌液0.5-1份、蔗糖9-10份、脱脂乳9-10份、谷氨酸钠4-5份、甘油4-5份；所述预冷的条件为-80℃预冷12～18h，所述真空冷冻干燥的时间10-14h。
7.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(3)中所述腌制调料包括花椒、五香粉、胡椒、淀粉、味精各1.5-2份、料酒4-5份、糖4-5份、食盐14-15份和水145-150份，充分溶解，搅拌9-11min混合均匀；所述腌制的时间为0.5-2.5h。
8.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(4)所述冻干菌粉与腌制牛排的质量比为0.1:200；所述发酵的条件为：温度为35～37℃，湿度70％，时间5-8h。
9.根据权利要求1所述的一种乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排的方法，其特征在于，步骤(4)所述真空包装真空度为0.08MPa，封口温度为200℃，封口时间为5s；所述杀菌的条件为：500-550MPa，维持8-15min。
10.根据权利要求1～9任意一项所述的方法制备的乳酸菌协同发酵冷鲜调理牛排。
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