KR100381912B1 - 마늘파쇄액을 이용한 젖산균을 함유하는 김치발효용미생물제재 및 김치조성물 - Google Patents

마늘파쇄액을 이용한 젖산균을 함유하는 김치발효용미생물제재 및 김치조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 젖산균을 함유하는 김치제조용 미생물제재로서 보다 상세하게는 동결보호제로 마늘파쇄액을 사용함으로써 김치제조시 부원료로서 기능함과 동시에 발효를 위한 미생물의 보존성 개선을 위한 스타터의 동결보조제의 주재로 하고, 또한 김치발효에 적용되는 우수한 젖산균주를 선발하고 이를 미생물제제화함으로써 냉장 및 동결저장시 장기보존이 가능한 김치제조용 미생물제재에 관한 것이다.
상기 우수한 젖산균주로 본 발명은 산예민성 변이주로 락토바실러스 플란타룸 KFRI813-20(KFCC 11205) 또는 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235-19(KFCC 1120 7)를 포함하며 또한 미생물제제용 젖산균주로 류코노스톡 메센테로이드 서브. 메센테로이드 KFRI819(KFCC 11209), 락토바실러스 플란타룸 KFRI813(KFCC 11206), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235(KFCC 11208)에서 선택된 적어도 하나를 김치발효용 미생물제재에 포함할 수 있다.

Description

마늘파쇄액을 이용한 젖산균을 함유하는 김치발효용 미생물제재 및 김치조성물{kimchi Starter with Lactic Acid Bacteria in the Cryoprotective Garlic Paste and The Kimchi Composite}
본 발명은 젖산균을 함유하는 김치제조용 미생물제재로서 보다 상세하게는 동결보호제로 마늘파쇄액을 사용함으로써 김치제조시 부원료로서 기능함과 동시에 발효를 위한 미생물의 보존성 개선을 위한 스타터의 동결보조제의 주재로 하고, 또한 김치발효에 적용되는 우수한 젖산균주를 선발하고 이를 미생물제제화함으로써 냉장 및 동결저장시 장기보존이 가능한 김치제조용 미생물제재에 관한 것이다.
우리 고유의 전통 발효식품인 김치는 배추 또는 무를 주원료로 한 야채 젖산발효식품으로서 감칠맛과 상쾌한 신맛 등이 잘 조화된 맛과 씹을 때의 신선한 조직감을 가지고 있고, 주요 재료가 야채이기 때문에 비타민, 무기질이 풍부하고 젖산 등 유기산은 식욕을 촉진시키기 때문에 주요한 부식의 위치를 차지하고 있고, 특히 야채가 귀했던 겨울철의 경우 김장의 형태로서 중요한 역할을 해 왔다.
김치는 자연발효식품으로 상품화에 있어서 품질균일화 및 보존성이 가장 중요하며, 특히 김치는 원료의 생산시기 및 품종에 따라 가공적성과 발효숙성 조건이 달라지고, 유통 중 계속 발효가 진행되어 품질이 변하는 특징이 있다. 그러므로 상품김치의 품질균일화 및 품질유지를 위하여 자연발효식품이 아닌 인위적으로 발효능과 김치품질이 우수한 젖산균 균주를 분리 선발하여 김치제조시 첨가할 수 있는 김치스타터의 개발과 함께 산업적으로 안정적으로 공급할 수 있도록 하는 미생물 제제화의 필요성이 대두되어진다.
현재까지 김치관련 미생물이나 김치발효에 관련된 연구는 김치에서 분리한 젖산균 또는 내산성 변이주를 개발하거나 김치의 보존성 연장을 위하여 Bacterioc in 생산균주를 김치스타터 균주로 개발하고자 하는 노력이 진행중이며, 또한 기능성 김치를 제조하기 위해 기존의 김치에 서식하지 못하는 비피도박테리움 속의 젖산균을 김치스타터 균주로 개발(국내공개특허 2000-8938)하고자 하나 상기 김치스타터 균주를 김치제조업체에 산업적으로 안정되게 공급할 수 있는 미생물제제화 방법은 구체적으로 제시하고 있지 못하고 있는 실정이다.
따라서 본 발명은 김치제조용 미생물제제를 개발함에 있어 우선 김치와 유사한 환경의 저온살균 김치배지를 개발하고 이를 이용하여 김치의 미생물 천이현상에 따른 발효단계별 우수 균주로 선정된 젖산균 균주와 이들 중 김치의 보존성을 증진하기 위하여 김치발효 전체 단계나 후기단계에 왕성하게 성장하는 균주로부터 선별된 신규한 산예민성 변이주를 김치스타터 균주로 선발함과 함께, 상기 균주들의 미생물제제화을 위하여 김치품질에 영향을 미치지 않는 신규한 동결보호제를 개발하여 김치제조업체에 산업적으로 안정되게 공급할 수 있는 김치제조용 미생물제제를 제공함을 목적으로 한다.
또한 본 발명의 또다른 목적으로는 상기 김치제조용 미생물제제를 이용하여 제조된 우수한 품질의 김치제품을 제공하는데 있다.
도 1은 본 발명의 김치제조용 미생물제제의 제조공정도.
도 2는 본 발명의 김치제조용 미생물제제를 이용한 김치제조공정도.
본 발명은 젖산균을 함유하는 김치발효용 미생물제재로서 미생물제재에 동결보호제(cryoprotective reagent)로 마늘파쇄액을 포함함을 특징으로 한다.
김치제조시 젖산균 스타터의 첨가방법으로 액체배지에서 활발하게 자란 젖산균주를 액상의 세포현탁액으로 제조하여 사용하는 것은 균주의 활성이 높은 장점이 있는 반면에 김치제조시 매번 준비해야 하는 번거로움이 있다. 본 발명의 동결보호제는 상기한 문제없이 젖산균주의 생존율을 높이면서 장기간 보관이 가능하도록 마늘파쇄액을 사용한다. 마늘파쇄액은 김치에 첨가되는 주요한 부재료임과 동시에 김치제조용 미생물제제화에 매우 유용함이 본 발명에 의해 입증되었으며, 실제 상기 마늘 파쇄액을 동결건조제로 젖산균에 적용한 결과 4℃에서 28일, -20℃에서 168일, -70℃에서 1년 이상의 기간경과 후에도 생균수의 변화가 거의 없이 생육활성이 유지됨을 확인하였다.
상기 본 발명에 적용가능한 마늘파쇄액은 통상적으로 시판되는 마늘을 파쇄기를 사용하여 소정 크기로 파쇄한 상태의 것으로서 5∼15%의 것이 젖산균의 보존성 측면에서 바람직하다. 다만 마늘의 파쇄정도에 대하여는 그 크기 등에 있어 특별한 제한을 가하는 것을 요하지는 아니하고 당업자의 필요에 따라 선정하여 적용하는 것이 가능하다. 상기 제조된 마늘파쇄액은 소정의 배지에서 배양한 젖산균의 배양액에 멸균한 상태로 첨가하고 이를 농축시켜 동결건조하는 과정을 통해 김치발효를 위한 미생물제제의 제조시 동결보호제로 제공된다.
본 발명은 또한 김치발효용 미생물제재를 포함한다. 상기 미생물제재로는 락토바실러스 플란타룸 KFRI813-20(KFCC 11205, 2000.8.28, 한국종균협회), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235-19(KFCC 11207, 2000.8.28, 한국종균협회)에서 선택된 적어도 하나의 산예민성 변이주를 포함함을 특징으로 한다.
상기 산예민성 변이주는 김치의 보존성을 증진시키기 위한 것으로 김치발효 전체 기간이나 후기단계에 왕성하게 성장하는 균주로부터 pH 4.8 정도 이하에서 증식할 수 없는 것 중에서 선발되었다. 상기 산예민성 변이주는 단독으로 또는 혼합하여 사용하여도 좋고, 바람직하기로는 타 젖산균 균주와 혼합하여 김치제조용 미생물 스타터로 사용한다.
상기 산예민성 변이주와 함께 미생물스타터로 사용되는 젖산균 균주로는 바람직하기로는 류코노스톡 메센테로이드 서브. 메센테로이드 KFRI819(KFCC 11209, 2000.8.28, 한국종균협회), 락토바실러스 플란타룸 KFRI813(KFCC 11206, 2000.8.2 8, 한국종균협회), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235(KFCC 11208, 2000.8.28, 한국종균협회)에서 선택된 적어도 하나를 포함한다. 상기에서 류코노스톡 메센테로이드 서브. 메센테로이드 KFRI819(KFCC 11209)(Leu. mesenteroides sub. mesenteroi des KFRI 819) 균주는 김치발효의 초기에 우세한 균주이며, 락토바실러스 플란타룸 KFRI813(KFCC 11206)(L. plantarum KFRI 813) 균주는 김치발효의 후기에 우세하고, 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235(KFCC 11208)(L. maltaromicus KFRI 235) 균주는 김치발효 전체 기간 중에 우세한 균주이다. 또한 본 발명에서는 상기 균주 이외의 다른 젖산균을 사용하는 것을 제한하는 것은 아니다. 따라서 상기 균주 이외에도 1에 해당된다.
다만 상기 기탁한 3개의 균주는 배추김치와 무김치에서 우수한 생육활성을 보여주고 pH 4.2이하에서는 생육활성이 없는 것으로 김치제조시 미생물 스타터로 사용하기에 매우 적합한 특징이 있다.
상기 구성의 미생물제재는 일반김치에 첨가하거나 또는 저온살균법에 의하여 감균된 김치에 첨가하여 사용할 수 있다. 이하 본 발명의 내용을 구체적인 실시예로서 본 발명 마늘 파쇄액을 이용한 김치제조용 미생물제제 및 이를 이용한 김치의 제조방법을 보다 상세히 설명하기로 한다. 다만 하기 실시예는 본 발명을 설명하기 위한 것으로 본 발명의 권리범위를 제한하는 것은 아니다.
<실시예 1> 저온 살균 김치배지 제조 및 선발 젖산균의 김치발효 특성
본 발명에서 사용한 김치배지는 다음과 같이 제조하였다. 즉, 양질의 배추 및 무를 다듬은 후 천일염으로 절인 후 세척하여 탈수시킨 원재료 100g에 대하여 파 3.1g, 고춧가루 1.8g, 마늘 1.5g, 생강 0.4g, 물 2.9g을 잘 혼합한 후 최종 염농도를 2.5%가 되도록 하였다. 제조된 김치를 18×28cm의 진공포장용 폴리에칠렌 필름에 약 300 g씩 넣어 진공도가 약 90%되게 포장한 후 배추김치는 최소한 70℃, 무김치는 65℃에서 20분간 열처리한 후 즉시 냉각하여 각각 배추김치배지와 무김치배지로 사용하였다. 상기 김치배지는 김치와 유사한 환경을 제공하고 배양 온도 15℃이하에서는 장기간 배양시 미생물의 생육이 일어나지 않아 김치관련 미생물의 생리학적 특성 및 김치발효특성을 조사하는 도구로 이용할 수 있으며, 또한 미생물스타터 첨가 김치를 제조할 경우 미생물이 감균된 원료 김치로 이용할 수 있다.
김치제조용 미생물제제의 대상 젖산균주(류코노스톡 메센테로이드 서브. 메센테로이드 KFRI819(KFCC 11209, 이하 KFRI819로 약칭하기로 한다), 락토바실러스 플란타룸 KFRI813(KFCC 11206, 이하 KFRI813로 약칭하기로 한다), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235(KFCC 11208, 이하 KFRI235로 약칭하기로 한다)를 위에서 개발된 배추김치배지와 무김치배지에 접종하여 각 균주의 발효중 pH, 산도 및 젖산균수의 변화를 조사하였다.
pH의 경우 배추김치배지에서 KFRI 813은 발효 초기 5.76에서 발효 9일째에 4.28, 발효 29일에는 3.58로 감소하였고 KFRI 819는 발효 초기 5.60에서 발효 9일째에 4.05, 발효 29일에는 3.57로 감소하였고 KFRI 235는 발효 초기 5.73에서 발효 9일째 5.46, 발효 29일째 3.87로 떨어졌다. 무김치배지에서는 KFRI 813의 경우, 발효 초기 5.97에서 발효 29일에는 3.79로 감소하였고 KFRI 819는 발효 초기 6.05에서 발효 29일에는 5.80으로 감소하였고 KFRI 235는 발효 초기 5.99에서 발효 29일째 5.97로 감소하였다.
총 산도의 경우 배추김치배지에서 KFRI 813은 발효 초기 0.19에서 발효 9일째에 0.35, 발효 29일에는 0.82로 증가하였고 KFRI 819는 발효 초기 0.21에서 발효 9일째에 0.46, 발효 29일에는 0.84로 증가하였고 KFRI 235는 발효 초기 0.20에서 발효 9일째 0.26, 발효 29일째 0.54로 증가했다. 무김치배지에서 KFRI 813은 발효 초기 0.10에서 발효 29일에는 0.46으로 증가하였으나 KFRI 819는 발효 초기 0.09에서 발효 29일에도 0.12로, KFRI 235는 발효 초기 0.11에서 발효 29일째 0.11로 거의 일정하게 나타났다.
전체적으로 모든 균주에 있어서 배추김치배지에서 보다 무김치배지에서 pH의 감소 및 산도의 증가가 늦은 것으로 나타났다. 젖산균수의 경우 결과는 표 1과 같다.
KFRI 813은 배추김치배지에서 발효 9일째에 4.0×109cfu/ml로 균수가 급증하였으나 무김치배지의 경우에는 서서히 증가하여 발효 29일에 3.0×109cfu/ml 수준으로 증가하였다. KFRI 819는 배추김치배지에서는 균수가 빠른 속도로 증가하여 발효 15일째에 3.5×109cfu/ml로 균수가 증가하였으나 무김치배지에서는 매우 서서히 증가하여 발효 29일째에도 균수가 5.5×106cfu/ml 수준의 낮은 균수를 나타내었다. 또한 KFRI 235는 배추김치배지, 무김치배지 모두에서 발효가 서서히 진행되다가 발효 22일에 최대균수에 도달하였으며 발효 29일째에 배추김치배지의 경우 5.5×108cfu/ml 수준이었으나 무김치배지에서는 5.0×106cfu/ml 수준으로 감소하였다. 젖산균수의 경우 모든 균주에 있어 배추김치배지에서 균의 증식이 무김치배지에서보다 활발히 이루어짐을 알 수 있었다.
선발 젖산균 3균주 (KFRI 813, KFRI 819, KFRI 235)의 산예민성을 조사하기 위하여, 우선 젖산과 초산을 1:2의 비율로 혼합한 용액을 이용하여 pH를 5.8, 5.0, 4.8, 4.5, 4.2로 달리한 MRS 아가평판배지에 접종하여 30℃에서 15일간 배양하면서 생균수를 측정한 결과는 표 2와 같다. KFRI 813, KFRI 819는 pH 5.0에서 pH 4.5의 범위에서 pH 미조정 배지와 비슷한 수준의 균수를 나타내었고, KFRI 235는 pH 5.0에서 pH 4.8의 범위에서 pH 미조정 배지와 비숫하였으나 pH 4.5에서는 급격한 감소를 보였다. 그리고, pH 4.2 이하에서는 모든 선발 젖산균이 거의 증식할 수 없었다.
<표 1> 선발 젖산균을 접종하여 10℃에서 발효시킨 배추김치배지와 무김치배지에서 젖산균수의 변화
발효기간(일) 젖산균수(단위: cfu/ml)
KFRI 813 KFRI 819 KFRI 235
배추김치배지 무김치배지 배추김치배지 무김치배지 배추김치배지 무김치배지
0 2.2×106 1.8×106 2.2×106 1.8×106 1.3×106 1.9×106
4 1.3×108 1.4×106 1.8×108 1.8×108 1.8×107 9.0×105
9 4.0×109 5.3×106 4.8×108 3.3×106 1.1×107 4.4×106
15 3.8×109 2.7×108 3.5×109 1.3×107 1.2×108 4.8×106
22 2.8×109 9.6×108 2.1×109 4.2×106 6.7×108 4.1×108
29 2.6×109 3.0×109 1.8×109 5.5×106 5.5×108 5.0×106
<표 2> pH 5.8, 5.0, 4.8, 4.5 및 4.2로 조절된 MRS 액체배지에 30℃로 배양시
선발 젖산균의 생균수 변화
저장기간(일)
균주 pH 0 1 2 3 4 5
KFRI813 5.8* 2.3×105 6.6×109 3.9×109 1.1×109 3.0×107 3.0×107
5.0 2.4×105 3.8×109 4.1×109 3.6×109 9.5×107 8.0×107
4.8 2.1×105 9.6×108 3.9×109 2.7×109 1.8×109 7.4×108
4.5 2.2×105 1.8×107 1.1×109 1.4×109 1.3×109 1.3×109
4.2 2.1×105 5.3×105 1.2×106 1.9×106 3.9×106 4.0×106
KFRI819 5.8* 1.5×105 5.0×109 3.9×109 1.2×108 2.6×106 5.0×105
5.0 1.5×105 3.6×109 4.1×109 2.6×109 4.4×108 1.8×106
4.8 1.5×105 1.2×109 2.2×109 2.3×109 1.4×109 2.8×108
4.5 1.5×105 1.2×107 1.2×109 1.6×109 1.3×109 1.3×109
4.2 1.5×105 4.0×105 1.6×106 2.4×106 2.0×106 2.2×106
KFRI235 5.8* 1.2×105 3.7×108 1.9×108 2.4×108 1.5×108 8.9×107
5.0 1.3×105 7.9×107 3.1×108 3.2×108 1.2×108 1.1×108
4.8 1.5×105 9.6×106 1.6×108 1.5×108 1.6×108 1.5×108
4.5 1.1×105 6.7×105 3.5×106 9.8×107 9.9×107 1.1×108
4.2 1.3×105 1.3×105 1.3×105 1.2×105 1.2×105 1.1×105
* pH 미조정 MRS 배지
<실시예 2> 선발 젖산균로부터 산예민성 변이주 개발
KFRI 819 균주는 김치발효 초기에 자라는 균주이나 KFRI 813와 KFRI 235 균주는 각각 김치발효 후기와 전체 발효기간동안 생육하는 균주로서 김치보존성 향상을 위하여 본 실시예에서는 김치제조용 미생물스타터 균주로서 산예민성 변이주를 선발하였다.
돌연변이처리는 대장균 변이처리법을 변형하여 다음과 같이 실시하였다. MRS 액체배지에 2% 접종하여 30℃에서 KFRI 813와 KFRI 235는 각각 2시간과 6시간 동안 배양한 다음 3000rpm에서 10분간 원심분리를 한 후, 구연산 완충용액(pH 5.5)으로 2회 세척한 균체에 나이트로소구아니딘(nitrosoguanidine)용액(NTG, 2.5mg/ml)을 10ml 첨가하여 2시간 동안 처리하였다. NTG 처리 후, 원심분리를 하여 구연산 완충용액(pH 5.5)으로 2회 세척한 다음 MRS 평판배지에 도말하여 사멸율이 90%이상 되도록 하였다. 변이 처리된 젖산균들을 pH 5.8, 5.0, 4.8, 4.5 및 4.2로 달리한 MRS 평판배지에 배양하여 변이주를 선발하였다. 그 결과, 변이 처리된 젖산균들 중에서 KFRI 813와 KFRI 235 균주에서 산예민성 변이주가 각각 1균주 선발되었다. 이들 변이주의 산예민성을 실시예 1과 같은 방법으로 4℃, 10℃, 20℃ 및 30℃에서 실시하였으며 30℃의 결과는 표 3과 같다. KFRI 813의 산예민성 변이주(이하 KFRI 813-20라 약칭함)는 온도 및 pH에 매우 민감하였으며, 30℃를 제외하고는 pH 4.8 이하에서 증식이 불가능한 것으로 확인되었으며, KFRI 235의 산예민성 변이주(이하 KFRI 235-19라 약칭함)는 pH 5.0에서는 자라지만 pH 4.8 이하에서는 증식이 거의 불가능한 것으로 확인되었다.
<표 3> pH 5.8, 5.0, 4.8, 4.5 및 4.2로 조절된 MRS 액체배지에 30℃로 배양시 산예민성 변이주의 생균수 변화
젖산균수 (단위: cfu/ml)
균주 pH 0일 1일 2일 3일 4일 5일
KFRI813-20 5.8* 1.4×105 8.2×107 7.3×107 6.4×106 7.5×106 6.5×106
5.0 1.4×105 3.5×105 2.8×106 3.9×107 1.3×108 3.1×107
4.8 1.3×105 1.3×105 1.4×105 2.9×105 7.6×105 4.6×106
4.5 1.5×105 7.8×104 3.9×104 3.6×103 3.5×103 1.0×103
4.2 1.5×105 1.4×104 1.0×100 1.0×100 1.0×100 1.0×100
KFRI235-19 5.8* 1.1×105 1.2×107 3.0×107 1.7×107 2.5×107 2.8×107
5.0 1.6×105 3.2×106 5.2×106 6.5×106 7.8×106 1.5×107
4.8 1.6×105 4.7×105 2.3×106 6.1×106 3.5×106 9.6×106
4.5 1.5×105 2.6×105 2.8×105 2.3×105 2.8×105 3.0×105
4.2 1.5×105 1.0×104 1.0×100 1.0×100 1.0×100 1.0×100
<실시예 3> 김치제조용 미생물제제화를 위한 동결보존제의 선정
동결보호제로서 대조구로 일반적으로 유가공 미생물에 사용되는 탈지분유 등을 사용하고 실험구로 김치원료의 하나인 마늘파쇄액을 사용하여 다음과 같이 처리된 젖산균 생균과 혼합하여 저장기간 중 생균수 변화를 조사하였다.
미생물제제화 방법으로 도 1에 나타낸 바와 같이 실시예 1의 선발 젖산균을 보관용 stab culture로부터 MRS 액체배지에 접종하여 30℃에서 KFRI 813과 KFRI 819는 24시간, KFRI 235는 48시간 배양시켜 활성화시킨 후 동일 배지에 대하여 1% 접종하여 동일조건으로 배양한 후, 균주를 원심분리(3,000rpm, 10분, 4℃)한 후 균체만 취하여 배양액의 1/10의 각 처리구별로 121℃에서 15분간 멸균한 동결보호제를 첨가하여 10배 농축시켰다. 이러한 생균 농축물을 그대로 -70℃에서 직접 동결저장하거나 또는 동결 건조후 -70℃에서 저장 중 생균수를 MRS 고체배지에서 30℃에서 48시간 배양하여 조사하였으며, 그 결과는 각각 표 4, 표 5 및 표 6과 같다.
상기 선발 젖산균 3균주는 84일간 실험한 결과, 모든 처리구에서 생균수가 일정하게 유지되는 것으로 나타났으며, 특히 김치원료인 10% 마늘파쇄액은 다른 처리구와 같은 생존율을 보여 김치제조용 미생물제제화를 위한 우수한 동결보호제 소재로 판단되었다. 마늘파쇄액외 다른 동결보호제는 주로 유가공 관련 물질이기 때문에 김치품질에 좋지 않는 영향을 줄 것으로 판단되었다.
<표 4> 여러 가지 동결보호제를 사용하여 -70℃에서 직접동결 및 동결건조후 저장시 KFRI 813의 생균수 변화
저장조건 및저장기간(일) 젖산균수 (단위 : cfu/ml)
탈지분유 (10%) 탈지분유(10%)+ 유당(12%) 탈지분유(10%)+ 설탕(12%) 탈지분유(5%)+ 설탕(8%)+젤라틴(1.5%) 마늘파쇄액(10%)
직접 동결 저장 0 6.0×109 9.2×109 7.9×109 6.5×109 6.0×109
7 6.1×109 6.6×109 6.8×109 5.8×109 3.7×109
14 3.7×109 6.6×109 6.8×109 5.2×109 4.6×109
28 5.5×109 6.0×109 5.2×109 5.4×109 5.1×109
56 3.6×109 4.7×109 3.9×109 4.6×109 4.3×109
84 5.3×109 4.8×109 4.0×109 4.2×109 4.4×109
동결 건조 저장 0 6.0×109 6.4×109 6.7×109 6.5×109 2.8×109
7 4.9×109 5.5×109 5.0×109 5.2×109 3.1×109
14 3.7×109 5.8×109 4.4×109 3.9×109 3.0×109
28 3.9×109 9.2×109 5.9×109 4.3×109 1.8×109
56 4.2×109 6.0×109 6.5×109 4.7×109 1.4×109
84 3.9×109 5.4×109 4.9×109 5.9×109 2.6×109
<표 5> 여러 가지 동결보호제를 사용하여 -70℃에서 직접동결 및 동결건조후
저장시 KFRI819의 생균수 변화
저장조건 및저장기간(일) 젖산균수 (단위 : cfu/ml)
탈지분유 (10%) 탈지분유(10%)+ 유당(12%) 탈지분유(10%)+ 설탕(12%) 탈지분유(5%)+ 설탕(8%)+ 젤라틴(1.5%) 마늘파쇄액(10%)
직접 동결 저장 0 7.3×109 9.7×109 9.2×109 6.4×109 5.0×109
7 6.6×109 5.7×109 5.7×109 5.0×109 3.5×109
14 5.3×109 4.9×109 5.0×109 4.9×109 5.0×109
28 6.9×109 6.7×109 6.4×109 5.9×109 4.6×109
56 6.3×109 6.5×109 7.8×109 4.4×109 4.5×109
84 6.7×109 6.9×109 6.8×109 5.7×109 4.2×109
동결 건조 저장 0 4.0×109 7.0×109 5.4×109 4.5×109 2.9×109
7 5.3×109 6.1×109 6.2×109 6.6×109 3.0×109
14 4.8×109 6.0×109 5.9×109 6.1×109 3.2×109
28 5.4×109 4.1×109 6.4×109 4.8×109 4.4×109
56 6.3×109 3.8×109 3.4×109 5.0×109 2.0×109
84 6.3×109 1.4×109 7.0×109 6.1×109 3.0×109
<표 6> 여러 가지 동결보호제를 사용하여 -70℃에서 직접동결 및 동결건조후
저장시 KFRI235의 생균수 변화
저장조건 및저장기간(일) 젖산균수 (단위 : cfu/ml)
탈지분유 (10%) 탈지분유(10%)+ 유당(12%) 탈지분유(10%)+ 설탕(12%) 탈지분유(5%)+ 설탕(8%)+ 젤라틴(1.5%) 마늘파쇄액 (10%)
직접 동결 저장 0 5.9×109 6.0×109 8.7×109 8.0×109 1.4×108
7 6.0×109 6.1×109 8.3×109 6.5×109 9.8×107
14 5.7×109 4.3×109 7.7×109 5.6×109 1.7×108
28 4.3×109 3.5×109 4.7×109 5.2×109 3.8×108
56 2.6×109 4.5×109 3.1×109 4.3×109 3.6×108
84 3.1×109 5.4×109 6.3×109 5.1×109 1.0×108
동결 건조 저장 0 5.9×109 6.0×109 9.8×108 8.0×109 2.0×107
7 6.9×109 4.6×109 7.5×108 5.2×109 3.0×107
14 5.4×109 5.1×109 6.9×108 6.6×109 2.4×107
28 4.2×109 9.2×109 5.9×108 6.2×109 1.5×107
56 3.7×109 4.5×109 5.7×108 5.2×109 3.4×107
84 8.8×109 5.1×109 5.8×108 8.8×109 5.5×107
<실시예 4> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 선발 젖산균의 -70℃에서 장기저장중 생균수 변화
실시예 3에서 선정된 동결보호제로 10% 마늘파쇄액을 사용하여 선발 젖산균 3균주와 혼합하여 -70℃에서 직접동결 또는 동결 건조후 장기 저장하면서 생균수를 측정한 결과는 표 7, 표 8, 표 9와 같다. 이때 대조구 동결보호제로서 !0% 탈지분유를 사용하였다. KFRI 813 균주와 KFRI 819 균주는 직접동결 또는 동결 건조 처리구 모두 1년간 생균수가 거의 일정한 것으로 나타났다. 반면, KFRI 235는 직접동결 저장한 경우 1년간 초기와 같은 수준의 생균수를 유지하였으나, 동결건조 후 저장한 경우에는 저장 140일 이후 생균수가 감소하기 시작하였다. 이상의 결과, 10% 마늘파쇄액은 10% 탈지분유 등 다른 처리구와 마찬가지로 김치제조용 미생물 제제화시 동결보호제로 사용하여 -70℃에서 1년 이상 장기 저장이 가능하였으므로 김치제조용 미생물제제의 동결보호제로 적합하였으며 저장방법으로는 동결건조후 저장보다는 직접동결저장 방법이 더 우수하였고 시간과 비용, 에너지 등을 절약할 수 있음을 확인하였다.
<표 7> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 KFRI 813의 -70℃에서 장기저장중 생균수 변화
저장조건 및 저장기간(일) 젖산균수 (단위: cfu/ml)
탈지분유(10%) 마늘파쇄액(10%)
직접동결저장 0 6.0×109 6.0×109
171421285684112140210238266294365 6.2×1096.1×1093.7×1095.2×1095.5×1093.6×1095.3×1095.6×1095.6×1098.5×1097.6×1097.2×1095.1×1096.7×109 -3.7×1094.6×109-5.1×1094.3×1094.4×109--5.5×1093.7×1094.4×1094.2×1095.5×109
동결건조 저장 0171421285684112140210238266294365 6.0×1093.4×1094.9×1093.7×1093.7×1093.9×1094.2×1093.9×1093.5×1094.5×1094.7×1094.2×1093.9×1092.8×1095.0×109 2.8×109-3.1×1093.0×109-1.8×1091.4×1092.6×109--2.3×1091.9×1092.1×1092.6×1093.4×109
<표 8> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 KFRI 819의 -70℃에서 장기저장중 생균수 변화
저장조건 및 저장기간(일) 젖산균수 (단위 : cfu/ml)
탈지분유(10%) 마늘파쇄액(10%)
직접동결저장 0 7.3×109 5.0×109
1 7.4×109
7 6.6×109 3.5×109
14 5.3×109 5.0×109
21 6.9×109
28 6.9×109 4.6×109
56 6.3×109 4.5×109
84 6.7×109 4.2×109
112 5.5×109
140 4.6×109
210 4.8×109 3.3×109
238 3.0×109 2.1×109
266 4.3×109 3.0×109
294 3.2×109 2.0×109
365 4.1×109 3.0×109
동결건조저장 0 4.0×109 2.9×109
7 5.3×109 3.0×109
14 4.8×109 3.2×109
21 4.3×109
28 5.4×109 4.4×109
56 6.3×109 2.0×109
84 6.3×109 3.0×109
112 5.4×109
140 8.7×109
210 4.3×109 2.7×109
238 2.1×109
266 2.6×109
<표 9> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 KFRI 235의 -70℃에서 장기 저장중 생균수 변화
저장조건 및 저장기간(일) 젖산균수 (단위: cfu/ml)
탈지분유(10%) 마늘파쇄액(10%)
직접동결저장 0 5.9×109 1.4×108
1 6.9×109
7 6.0×109 9.8×107
14 5.7×109 1.7×108
21 4.4×109
28 4.3×109 3.8×108
56 2.6×109 3.6×108
84 3.1×109 1.0×108
112 4.9×109
140 4.4×109
210 4.5×109 9.4×109
238 4.5×109 5.6×109
266 4.8×109 6.4×109
294 4.4×109
365 4.4×109 1.8×109
동결건조저장 0 5.9×109 2.0×107
1 5.9×109
7 6.9×109 3.0×107
14 5.4×109 2.4×107
21 5.5×109
28 4.2×109 1.5×107
56 3.7×109 3.4×107
84 8.8×109 5.5×107
112 4.1×109
140 4.7×109
210 9.5×107
238 9.4×107
266 7.2×107
294 6.4×107
365 3.1×107
<실시예 5> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 선발 젖산균의 동결저장 온도별 생균수 변화
실시예 3과 4에서 김치제조시 첨가하는 젖산균주의 생존율을 높이면서 장기간 보존 가능한 미생물 제제를 제조하기 위해 -70℃의 직접냉동 및 냉동건조후 저장 조건에서 젖산균주의 생균수를 측정하였다. 그러나 산업적으로 응용하기 위해서는 -70℃ 보다 비용을 절감할 수 있는 냉동 및 냉장 온도의 선정이 요구되어, -20℃와 4℃에서 각 젖산균 균주들의 저장시 생균수 변화를 측정한 결과는 표 10과 표 11과 같다. 이때 동결보호제로는 이제까지의 실험을 통해 동결보호제로 가장 적합하다고 선정된 멸균한 10% 마늘파쇄액을 사용하였다. 10배 농축한 균체는 멸균한 배지병에 적당량씩 나누어 4℃와 -20℃에 각각 냉장 및 직접냉동 보관하면서 저장 기간별로 젖산균의 생균수를 조사하였다.
-20℃의 경우에, 3 균주 모두 저장 168일까지 생균수의 뚜렷한 감소를 보이지 않았다. 4℃의 경우, 저장 28일 까지 생균수의 감소의 뚜렷한 감소를 보이지 않았으며, KFRI 813 균주는 초기에 5.21×1010cfu/ml에서 저장 84일 경과후 1010cfu/ml 이하로 감소하였으며, KFRI 819 균주는 초기의 4.26×1010cfu/ml에서 56일 이후 1010cfu/ml 이하로 감소하였으며, KFRI 235 균주는 초기 4.20×1010cfu/ml에서 28일 경과후 3.2×109cfu/ml로 생균수가 감소하였다.
<표 10> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 -20℃에서 직접동결저장중 선발 젖산균의 생균수 변화
저장기간(일) 젖산균수(단위: cfu/ml)
KFRI 813 KFRI 819 KFRI 235
0 6.4×1010 5.9×1010 4.0×1010
14 3.9×1010 4.5×1010 7.3×1010
28 4.8×1010 4.8×1010 3.3×1010
56 4.8×1010 4.9×1010 2.1×1010
84 4.4×1010 4.8×1010 2.4×1010
112 3.0×1010 4.0×1010 1.7×1010
140 1.3×1010 4.1×1010 1.2×1010
168 7.0×109 2.7×1010 1.7×1010
196 1.4×109 5.0×109 1.0×1010
224 6.0×108 2.3×108 4.7×108
252 3.4×108 3.9×108 7.8×107
280 1.9×107 6.0×108 7.7×107
<표 11> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액 사용시 4℃에서 냉장저장중 선발 젖산균의
생균수 변화
저장기간(일) 젖산균수(단위: cfu/ml)
KFRI 813 KFRI 819 KFRI 235
0 5.2×1010 4.3×1010 4.2×1010
7 6.4×1010 5.7×1010 2.9×1010
14 5.6×1010 5.6×1010 2.0×1010
21 4.3×1010 3.8×1010 1.2×1010
28 4.9×1010 1.5×1010 3.2×109
56 1.4×1010 1.7×109 9.5×108
84 4.2×109 2.2×107 9.1×105
112 2.5×109 2.5×104 2.6×105
140 9.7×108 6.9×104 1.1×104
168 3.2×108
196 7.0×106
224 2.3×106
252 6.0×105
280 4.0×105
상기의 실시예 2, 3, 4의 결과를 요약하면, 선발 젖산균 3균주의 MRS 액체배지에서 대량 배양후 회수된 균체에 동결보호제로 마늘파쇄액을 사용하여 4℃, -20℃, -70℃에서 냉장 및 직접 동결저장하였을 때 각각 28일, 168일, 1년 이상의 기간동안 생균수의 변화가 거의 없이 생육활성이 유지되었다. 이와 같은 결과로부터 본 발명에 사용되는 마늘 파쇄액은 김치부재료이면서 김치제조용 미생물제제화를 위한 우수한 동결보호제 소재로 사용될 수 있음을 재확인하였다.
<실시예 6> 김치제조용 미생물제제를 사용한 김치제조
본 실시예에서는 상기 실시예 3, 4, 5에서 나타난 동결보호제중에서 김치에 첨가되는 주요 부재료이면서 김치 제조용 미생물 제제화에 유용한 것으로 판명된 10% 마늘 파쇄액을 사용하여 호상의 미생물 제제를 다량으로 제조한 후 -70℃에서 직접동결저장중인 미생물제제를 첨가하여 실시예 1에서 제시한 표준 배합비의 김치를 도 2의 공정에 따라 제조하였다. 즉 배추김치에 선정 젖산균 3균주의 미생물제제를 0.5% 수준으로 단일 또는 혼합 접종하여 10℃ 저온 숙성시키면서 pH, 총산도, 젖산균수의 측정과 관능검사를 실시한 결과는 표 12와 같다.
김치 제조용 미생물 제제를 첨가한 경우 발효기간에 관계없이 pH, 총산도 및 젖산균 수는 발효 기간별로 미생물 제제 첨가구나 첨가하지 않은 대조구와 유의적인 차이가 없었다. pH의 경우, 김치제조 직후 pH 6.08∼6.28에서 발효 26일에는 3.89∼3.99로 낮아졌고 총산도는 발효초기에 0.15∼0.19%에서 발효 26일에 0.68∼0.82%로 증가하였다. 젖산균 수는 발효 7일에 최고 109cfu/ml수준으로 증가하였다가 발효 26일에 108cfu/ml 이하로 감소하였다. 김치관능검사에 익숙한 패널요원 12명 이상을 사용한 관능검사 결과는 김치 발효 중기 및 말기에 미생물 제제를 첨가하지 않은 대조구 일반김치에 비하여 미생물 제제 첨가구가 높은 점수로 평가되었으며, 특히 김치발효 중기 및 말기에 KFRI 813, KFRI 819, KFRI 235의 3균주 혼합처리구가 우수하였다.
<표 12> 동결보호제로 10% 마늘파쇄액을 이용한 김치제조용 미생물제제를 첨가하여 제조한 김치의 10℃ 발효 숙성중 품질특성
발효일수 시료* pH 총산도 젖산균수 관능검사
냄새 맛 텍스쳐 기호도
제조직후 대조구 6.11 0.186 1.39×106 5.57 3.57 6.57 4.57
A 6.21 0.178 2.47×106 4.57 4.29 6.29 4.71
B 6.08 0.171 2.60×106 5.14 4.43 5.14 4.57
C 6.10 0.156 1.84×107 5.43 4.29 5.71 4.57
D 6.23 0.149 3.48×106 5.71 5.14 5.14 5.29
E 6.28 0.156 1.39×107 5.43 3.71 5.43 4.29
F 6.25 0.163 1.39×107 5.43 4.57 5.71 4.43
G 6.22 0.178 6.60×106 6.00 3.29 5.29 3.83
7일 대조구 4.46 0.505 1.55×109 5.67 4.50c 5.50 5.17
A 4.54 0.401 1.38×109 4.83 4.50c 5.83 4.50
B 4.43 0.460 1.38×109 4.71 5.29abc 6.00 5.43
C 4.49 0.475 1.04×109 6.71 6.29abc 6.29 6.00
D 4.60 0.371 1.69×109 5.67 5.00bc 5.67 5.00
E 4.35 0.557 1.71×109 6.67 6.83ab 6.17 6.67
F 4.57 0.423 1.87×109 5.43 5.29abc 5.86 5.29
G 4.35 0.557 1.93×109 6.71 7.14a 7.00 7.29
26일 대조구 3.95 0.765 2.71×108 5.00 3.71b 4.14c 3.43b
A 3.93 0.743 2.77×108 4.86 4.29ab 6.43ab 4.43ab
B 3.90 0.743 2.16×108 4.43 4.57ab 5.43abc 4.00ab
C 3.99 0.735 5.45×108 5.29 5.00ab 5.86abc 4.86ab
D 3.89 0.676 3.97×108 4.29 5.14ab 7.57a 5.29ab
E 3.93 0.772 9.45×107 5.29 4.86ab 5.29bc 4.71ab
F 3.99 0.772 1.94×108 5.14 5.57ab 6.43ab 5.57ab
G 3.94 0.817 1.12×108 6.71 6.43a 6.86ab 6.29a
*(대조구: 미생물제제 무첨가, A: KFRI 813, B: KFRI 819, C: KFRI 235, D: KFRI 813＋KFRI 819, E: KFRI 813 ＋ KFRI 235, F: KFRI 819 ＋ KFRI 235, G: KFRI 813 ＋ KFRI 819 ＋ KFRI 235)
<실시예 7> 김치제조용 선발 젖산균 및 산예민성 변이주의 첨가에 의한 김치제조
상기 실시예 2에서 개발된 산예민성 변이주를 단일 혹은 다른 선정 젖산균과 혼합하여 실시예 6과 같은 방법으로 김치에 접종하여 10℃에서 22일간 발효중 여러가지 김치발효 특성을 조사하였으며, 발효 6일째에 측정된 pH, 산도 및 관능적 특성에 대한 결과는 표 13과 같다.
KFRI 235는 발효 9일째에 109cfu/ml에 도달한 후 다소 감소한 반면, 산예민성 변이주 KFRI 235-19를 단독 또는 KFRI 813와 KFRI 819와의 혼합처리시에 105- 106cfu/ml 수준을 유지하였으며, 이때, KFRI 813 및 KFRI 819는 발효 초에 감소하다가 단독 처리구와 비슷한 수준으로 증가하였다. 이러한 결과는 산예민성 변이주 KFRI 235-19는 김치 미생물에 의해서 성장이 정지상태로 유지되면서, 김치미생물과 함께 KFRI 813 및 KFRI 819의 성장 지연에 영향을 주는 것으로 판단되었다. 또한, 각 처리구별 배추김치의 적숙기에 관능검사를 실시한 결과, 전체적으로 김치의 기호도면에 있어서 가장 좋다고 평가된 처리구는 KFRI 819와 산예민성 변이주인 KFRI 235-19의 혼합처리구로 나타났다.
<표 13> 선발 젖산균과 산예민성 변이주를 첨가하여 10℃에서 6일간 발효한 김치의 관능적 특성
처리구* pH 산도(%) 관능적 특성
냄새 맛 조지감 종합적 기호도
대조구 4.44 0.43 5.44ab 6.22 4.13bc 4.70abc
813 4.37 0.51 5.00b 5.57 4.30bc 4.70abc
819 4.35 0.49 4.96b 5.33 3.88c 4.25ab
235 4.20 0.57 5.35b 5.78 5.22ab 5.35abc
235-19 4.20 0.51 5.83ab 5.17 5.09ab 5.35abc
813+819 4.20 0.55 5.21b 5.33 4.63abc 4.92abc
813+235 4.08 0.34 5.79ab 5.21 5.17ab 5.33abc
813+235-19 4.28 0.50 5.13b 5.09 4.13bc 4.44bc
819+235 4.24 0.55 5.38b 5.71 5.00ab 5.08abc
819+235-19 4.20 0.51 6.39a 5.70 5.44a 5.61a
813+819+235 4.18 0.52 5.34ab 5.74 5.13ab 5.39ab
813+819+235-19 4.27 0.50 5.71ab 5.88 4.71abc 5.04abc
*대조구: 미생물제제 무첨가, 813 : KFRI 813, 819 : KFRI 819, 235: KFRI 235, 235-19 : KFRI 235-19
<실시예 8> 김치제조용 미생물제제와 자연의 김치젖산균과의 혼합비율별 김치제조
일반 김치에 미생물제제를 접종할 경우, 접종량(김치에 존재하는 초기 균수보다 1/10 적게, 동량으로, 또는 10배 많게 첨가하였을 경우)에 따른 효과를 알아보기 위해서, 상기 실시예 2에서 개발된 산예민성 변이주를 단독 또는 다른 선발 젖산균과 혼합하여 실시예 6과 같은 방법으로 김치에 접종하여 10℃에서 14일간 발효중 여러 가지 김치발효 특성을 조사하였으며, 발효 6일째에 측정된 pH, 산도 및 관능적 특성에 대한 미생물제제 첨가전의 김치의 초기 젖산균수와 미생물제제의 혼합비율의 영향을 조사한 결과는 표 14와 같다.
김치발효 초기의 pH는 5.73∼5.97 이었고, 발효 7일째에는 4.00∼4.25로 급격히 감소하였으며, 그 이후에도 계속 감소하여 발효 14일에는 3.75∼3.90으로 나타났다. 산도는 발효 초기에는 0.24∼0.28 이었으나, 발효 7일째에는 0.65∼0.81로 급격히 증가하였고 그 이후에도 계속 증가하여 발효 14일에는 0.83∼0.95로 나타났다. 젖산균의 경우에 김치에 존재하는 초기 균수보다 10배 많이 첨가하였을 경우 109수준에 도달하는 기간이 발효 4일로 김치에 동량을 첨가하거나 김치보다 적게 첨가된 경우보다 균수 증가속도가 빠른 것으로 나타났으나 김치에 동량을 첨가하거나 김치보다 적게 첨가된 경우에는 별 다른 차이가 없었다. 관능검사 결과, 김치에 균수를 동량으로 첨가하였을 경우 KFRI 813-20, KFRI 819, KFRI 235의 혼합처리구가 관능검사 결과 가장 좋은 것으로 평가되었다.
<표 14> 선발 젖산균과 산예민성 변이주를 첨가하여 10℃에서 6일간 발효한 김치의 관능적 특성
접종량 관능적 특성
pH 산도(%) 냄새 맛 조직감 종합적 기호도
0 대조구 4.17 0.72 4.92 4.67 5.54 5.25
105cfu/ml 813+819+235 4.17 0.73 5.58 4.92 5.58 5.58
813-20+819+235 4.00 0.81 5.17 4.92 5.71 5.50
813-20 4.18 0.72 5.63 4.92 5.38 5.25
106cfu/ml 813+819+235 4.11 0.75 5.25 5.21 5.21 5.54
813-20+819+235 4.18 0.74 5.71 5.33 6.08 6.04
813-20 4.25 0.71 6.13 5.83 6.08 5.71
107cfu/ml 813+819+235 4.00 0.79 5.67 5.17 5.33 5.67
813-20+819+235 4.10 0.80 5.29 5.63 6.04 5.42
813-20 4.14 0.65 5.17 4.92 5.75 5.38
*대조구: 미생물제제 무첨가, 813 : KFRI 813, 819 : KFRI 819, 235: KFRI 235, 235-19 : KFRI 235의 산예민성 변이주
본 발명에 의하면 동결보호제로 마늘파쇄액을 이용한 미생물제재는 김치제조시 김치품질에 영향을 미치지 않아 김치제조에 적합하고, 장기보존이 가능하여 김치제조업체에 산업적으로 안정되게 공급할 수 있는 장점을 제공한다. 또한 본 발명에 의한 젖산균과 산예민성 변이주 또는 이들의 미생물제제를 단일 또는 혼합하여 제조한 김치는 대조구인 일반김치보다 품질면에서 매우 우수한 효과를 제공한다.

Claims (5)

  1. 젖산균을 함유하는 김치발효용 미생물제재에 있어서, 미생물제재에 동결보호제로 마늘파쇄액을 포함함을 특징으로 하는 김치발효용 미생물제재.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 미생물제재는 락토바실러스 플란타룸 KFRI813-20(KF CC 11205), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235-19(KFCC 11207)에서 선택된 적어도 하나의 산예민성 변이주를 포함함을 특징으로 하는 김치발효용 미생물제재.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 상기 미생물 제재에 류코노스톡 메센테로이드 서브. 메센테로이드 KFRI819(KFCC 11209), 락토바실러스 플란타룸 KFRI813(KFCC 11 206), 락토바실러스 말타로미쿠스 KFRI235(KFCC 11208)에서 선택된 적어도 하나를 포함함을 특징으로 하는 김치발효용 미생물제재.
  4. 제 1항 또는 제 2항의 선택된 어느 하나의 미생물제재를 일반김치에 첨가하여 발효시킨 김치조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항의 선택된 어느 하나의 미생물제재를 저온살균법에 의하여 감균된 김치에 첨가하여 발효시킨 김치조성물.
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