CN101326972A - 一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法 - Google Patents

一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法。高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。它是通过CICC保存具有降解亚硝酸盐菌株在营养条件、生长条件和富集冻干条件下制备高菌数发酵剂，因而其产品安全，无副作用。经测定其菌数均大于≥1010CFU/g。20℃发酵300斤白菜10天发酵成熟，30℃发酵300斤白菜5天发酵成熟，混合发酵降解亚硝酸盐≥98％，酸菜风味好，产品品质优良。本发明能够使蔬菜发酵时间大大缩短到3～5天，可以用于工业化生产。

Description

一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法
(一)技术领域
本发明涉及一种发酵剂技术，具体涉及一种蔬菜直投发酵剂。
(二)背景技术
酸菜作为我国北方传统发酵食品，因其风味独特、营养易于吸收、口感清爽、酸味浓郁醇厚而广泛受到人们的欢迎。长期以来，东北地区由于受到地域限制形成了食用酸菜的生活习惯，虽然随着经济的发展和生活水平的提高，酸菜已从餐桌上逐步淡化，但是这种长期形成的饮食习惯难以被人们废除，而且以酸菜为主料烹制的许多菜肴，已构成我国北方地区饮食文化的一大特色。但是酸菜中含有导致癌症的亚硝酸类物质，使酸菜消费受到了极大的限制。东北地区，尤其是黑龙江省作为白菜生产基地，酸菜又是其消费的重要渠道，这就要求科技工作者能够开发出降低亚硝酸类物质的酸菜发酵剂，来迎合酸菜在我国消费的要求。
酸菜的生产目前以两种方式进行：一是家庭式的传统生产，二是工业化规模生产。家庭式酸菜传统生产采用自然发酵法；而工业化规模生产采用自然发酵和乳酸菌发酵两种方式。自然发酵周期长(一个月以上)、杂菌及其他有害物质污染无法控制、卫生质量难以保证。同时由于长时间浸泡发酵，破坏了蔬菜的纤维结构，使蔬菜变软、发粘，影响外观和口感。近年来，随着现代食品加工技术和食品生物技术研究和应用的不断发展，特别是喜爱酸菜的消费人群在国内外的迅速增加和消费范围的迅速扩大以及“楼道革命”的掀起，酸菜由家庭的传统生产向现代化、规模化、工厂化生产转化，由自然发酵向纯菌种发酵转化。
乳酸菌在蔬菜发酵过程中起着重要的作用。它们的各种次生代谢产物可以使食品的风味独特，香味浓郁。同时它们在生长过程中产酸和一些抗菌素，这些都抑制了腐败菌的生长，使产品更加安全健康。在现代发酵食品工业中，利用人工接菌发酵解决了传统加工方式带来的各种弊端，如发酵速度、产品质量不稳定等。但是由于发酵原料质量差异、发酵菌种的性质不稳定或降解亚硝酸盐能力弱，容易引发发酵蔬菜在发酵中亚硝酸盐含量超标，对人体健康造成一定的伤害，同时含亚硝酸盐废液的排放对环境有较大的危害。因此研制高效降解亚硝酸盐蔬菜发酵剂对酸菜工业和生态发展具有重要意义。
(三)发明内容
本发明的目的在于提供一种酸菜直投式发酵剂活菌数≥1010CFU/g，使蔬菜发酵时间大大缩短到3～5天，并能够在较短时间内快速降解亚硝酸盐＞90％以上，可以用于工业化生产的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂。
本发明的目的是这样实现的：它包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。
本发明的另一目的在于提供一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其步骤包括：
(1)增菌培养基：将筛选高效降解亚硝酸盐能力的菌株植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌四株菌在基础培养基上添加1～4％w/v碳源和0.5～1％w/v氮源构成增菌培养基，30～37℃培养40h；
(2)增菌条件：在上述优化基础上优化生长条件，pH 6.6～7.0，温度25～37℃，采用摇动和静止培养方式；
(3)富集条件：在增菌后菌体液基础上，通过4000～8000r/m，10～20min条件下离心浓缩增菌后的菌体；
(4)菌株冻干：将富集后的菌体先处于w/v25％浓乳糖液中预处理，然后与冻干保护剂v/v＝1∶1混合，置于冻干机内冻干；
(5)菌株配比：将四株菌进行等质量配比。冻干菌粉可直接以0.4‰添加量投入生产，也可以0.1‰接菌量在中间培养基中30℃活化12h后，以3％液态形式投入生产。
本发明关于高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法还包括这样一些技术特征：
1、所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖和乳糖，重量百分比为1-4％；
2、所述的氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨，重量百分比为0.5-1％；
3、所述的增菌培养基为：肠膜明串珠菌：4％蔗糖，0.5％蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，牛肉膏1g，酵母粉2g，氯化钠1g，水100ml，肠膜明串珠菌与增菌培养基的配比数值范围：2-3％；植物乳杆菌：2％蔗糖，2％葡萄糖，1％胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，植物乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；短乳杆菌：2％蔗糖，1％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，短乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；乳酸片球菌：1％蔗糖，1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g，吐温800.002ml，水100ml，乳酸片球菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；
4、所述的增菌条件中：肠膜明串珠菌：pH 7.0，温度30℃，90r/m摇动培养；植物乳杆菌：pH 6.8，温度30℃，静止培养；短乳杆菌：pH 6.6～6.8，温度30～37℃，90r/m摇动培养；乳酸片球菌：pH 7.0，温度30℃，静止培养；
5、所述的富集条件为：肠膜明串珠菌6000r/m，20min，植物乳杆菌8000r/m，15min，短乳杆菌8000r/m，15min，乳酸片球菌8000r/m，20min；四株菌沉淀得率分别为：肠膜明串珠菌21％，植物乳杆菌12％，短乳杆菌10％，乳酸片球菌15％；
6、所述的乳糖液与冻干保护剂包括脱脂乳、甘油和海藻糖，肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌和乳酸片球菌与乳糖液与冻干保护剂配比体积比1∶1为肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌：12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖；乳酸片球菌：12％脱脂乳+5％甘油+5％海藻糖。
本发明关于一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法的具体实施方案如下：
(1)高效降解亚硝酸盐乳酸菌株的筛选：以实验室保藏菌株和CICC购买的、并适用于酸菜生产的50多菌株为试验菌株，在20℃、28℃、37℃不同的温度条件下培养7天，筛选高效降解亚硝酸盐能力的菌株四株，分别为肠膜明串珠菌、植物乳杆菌、短乳杆菌、乳酸片球菌，降解亚硝酸盐比率≥85％。这四株乳酸菌均为酸菜发酵整个过程中的优势菌，适合酸菜的发酵。
(2)增菌培养基：将上述四株菌在基础培养基上添加1～4％碳源(葡萄糖、蔗糖、乳糖)和0.5～1％氮源(大豆蛋白胨、胰蛋白胨、蛋白胨)，30～37℃培养40h。以菌数为参照指标。增菌培养基为：
肠膜明串珠菌：4％蔗糖，0.5％蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，牛肉膏1g，酵母粉2g，氯化钠1g，水100ml。
植物乳杆菌：2％蔗糖，2％葡萄糖，1％胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml。
短乳杆菌：2％蔗糖，1％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml。
乳酸片球菌：1％蔗糖，1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g，吐温800.002ml，水100ml。
(3)增菌条件：在上述优化基础上优化生长条件，pH 6.6～7.0，温度25～37℃，采用摇动和静止培养方式。以菌数为参照指标。增菌条件为：
肠膜明串珠菌：pH 7.0，温度30℃，90r/m摇动培养。
植物乳杆菌：pH 6.8，温度30℃，静止培养。
短乳杆菌：pH 6.6～6.8，温度30～37℃，90r/m摇动培养。
乳酸片球菌：pH 7.0，温度30℃，静止培养。
(4)富集条件：在增菌后菌体液基础上，通过4000～8000r/m，10～20min条件下离心浓缩增菌后的菌体。以菌数、离心损失率和收得率为参照指标。富集条件为：肠膜明串珠菌6000r/m，20min，植物乳杆菌8000r/m，15min，短乳杆菌8000r/m，15min，乳酸片球菌8000r/m，20min。四株菌沉淀得率分别为：肠膜明串珠菌21％，植物乳杆菌12％，短乳杆菌10％，乳酸片球菌15％。
(5)菌株冻干：将富集后的菌体先处于25％(w/v)浓乳糖液中预处理，然后与冻干保护剂(1∶1，v/v)混合，置于冻干机内冻干。
肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌：12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖；乳酸片球菌：12％脱脂乳+5％甘油+5％海藻糖，存活率≥88％。肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌，乳酸片球菌菌数分别为：1.3×1010CFU/g，2.7×1010CFU/g，0.9×1010CFU/g，3×1010CFU/g。
(6)菌株配比：以降解亚硝酸盐效果、产酸、风味和感官品质为参考指标，将四株菌在上述冻干后菌数含量基础上进行适当配比。菌粉配比为肠膜明串珠菌∶植物乳杆菌∶短乳杆菌∶乳酸片球菌(1∶1∶1∶1，质量比)。冻干菌粉可直接以0.4‰添加量投入生产，也可以0.1‰接菌量在中间培养基中30℃活化12h后，以3％液态形式投入生产。
本发明提供了一种可以用于工业化生产高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂及其制备方法，它是通过CICC保存具有降解亚硝酸盐菌株在营养条件、生长条件和富集冻干条件下制备高菌数发酵剂，因而其产品安全，无副作用。经测定其菌数均大于≥1010CFU/g。20℃发酵300斤白菜10天发酵成熟，30℃发酵300斤白菜5天发酵成熟，混合发酵降解亚硝酸盐≥98％，酸菜风味好，产品品质优良。
(四)附图说明
图1为本发明制备流程示意图。
(五)具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步的说明：
本实施例试验菌株包括：植物乳杆菌(CICC6001)、肠膜明串珠菌(CICC 6055)、乳酸片球菌(CICC 10146)、短乳杆菌(CICC 20014)
将肠膜明串珠菌冻干菌粉在液体培养基中(这里是冻干菌粉)活化3代，保证其活力和纯度，加入到115℃，灭菌15min的增菌培养基(4％蔗糖，0.5％蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，牛肉膏1g，酵母粉2g，氯化钠1g，水100ml)中，于恒pH 7.0，恒温度30℃，90r/m摇动培养，40h后得到的菌液通过6000r/m，20min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在30℃与25％浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数肠膜明串珠菌冻干菌粉1.3×1010CFU/g。
将植物乳杆菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115℃，灭菌15min的增菌培养基(2％蔗糖，2％葡萄糖，1％胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml)中，于恒pH 6.8，温度30℃，静止培养，30h后得到的菌液通过8000r/m，15min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在30℃与25％浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数植物乳杆菌冻干菌粉2.7×1010CFU/g。
将短乳杆菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115℃，灭菌15min的增菌培养基(2％蔗糖，1％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml)中，于恒pH 6.6～6.8，温度30℃，90r/m摇动培养，40h后得到的菌液通过8000r/m，15min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在30℃与25％浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数短乳杆菌冻干菌粉0.9×1010CFU/g。
将乳酸片球菌冻干菌粉在液体培养基中活化3代，保证其活力和纯度，加入到115℃，灭菌15min的增菌培养基(1％蔗糖，1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g，吐温800.002ml，水100ml)中，于恒pH 7.0，温度30℃，静止培养，40h后得到的菌液通过8000r/m，20min离心得到沉淀，将菌泥沉淀首先在30℃与25％浓乳糖液混合60min，然后离心，沉淀与冻干保护剂(12％脱脂乳+5％甘油+5％海藻糖)等体积混合，在冻干机内冷冻干燥，得到高菌数乳酸片球菌冻干菌粉3×1010CFU/g。
将上述制备的四株冻干菌粉以等质量混合，制备成复合的发酵剂冻干菌粉可直接以0.4‰添加量投入生产，也可以0.1‰接菌量在中间培养基中30℃活化12h后，以3％液态形式投入生产。

Claims (8)

1、一种高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂，其特征在于它包括等质量混合的植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌的冻干菌粉。
2、一种制备如权利要求1所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于步骤包括：
(1)增菌培养基：将筛选高效降解亚硝酸盐能力的菌株植物乳杆菌、肠膜明串珠菌、乳酸片球菌和短乳杆菌四株菌在基础培养基上添加1～4％w/v碳源和0.5～1％w/v氮源构成增菌培养基，30～37℃培养40h；
(2)增菌条件：在上述优化基础上优化生长条件，pH 6.6～7.0，温度25～37℃，采用摇动和静止培养方式；
(3)富集条件：在增菌后菌体液基础上，通过4000～8000r/m，10～20min条件下离心浓缩增菌后的菌体；
(4)菌株冻干：将富集后的菌体先处于w/v25％浓乳糖液中预处理，然后与冻干保护剂v/v＝1∶1混合，置于冻干机内冻干；
(5)菌株配比：将四株菌进行等质量配比。冻干菌粉可直接以0.4‰添加量投入生产，也可以0.1‰接菌量在中间培养基中30℃活化12h后，以3％液态形式投入生产。
3、根据权利要求2所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的碳源包括葡萄糖、蔗糖和乳糖，重量百分比为1-4％。
4、根据权利要求3所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的氮源包括大豆蛋白胨、胰蛋白胨和蛋白胨，重量百分比为0.5-1％。
5、根据权利要求4所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的增菌培养基为：肠膜明串珠菌：4％蔗糖，0.5％蛋白胨，0.5％大豆蛋白胨，牛肉膏1g，酵母粉2g，氯化钠1g，水100ml，肠膜明串珠菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；植物乳杆菌：2％蔗糖，2％葡萄糖，1％胰蛋白胨，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，植物乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；短乳杆菌：2％蔗糖，1％大豆蛋白胨，2％葡萄糖，牛肉膏0.5g，氯化钠0.5g，酵母粉0.5g，吐温800.5ml，磷酸二氢钾0.2g，水100ml，短乳杆菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％；乳酸片球菌：1％蔗糖，1％葡萄糖，1％胰蛋白胨，酵母粉0.4g，牛肉膏0.6g，硫酸锰0.005g，硫酸镁0.01g，吐温800.002ml，水100ml，乳酸片球菌与增菌培养基的配比数值范围2-3％。
6、根据权利要求5所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的增菌条件中：肠膜明串珠菌：pH 7.0，温度30℃，90r/m摇动培养；植物乳杆菌：pH 6.8，温度30℃，静止培养；短乳杆菌：pH 6.6～6.8，温度30～37℃，90r/m摇动培养；乳酸片球菌：pH 7.0，温度30℃，静止培养。
7、根据权利要求6所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的富集条件为：肠膜明串珠菌6000r/m，20min，植物乳杆菌8000r/m，15min，短乳杆菌8000r/m，15min，乳酸片球菌8000r/m，20min；四株菌沉淀得率分别为：肠膜明串珠菌21％，植物乳杆菌12％，短乳杆菌10％，乳酸片球菌15％。
8、根据权利要求7所述的高效降解亚硝酸盐酸菜直投发酵剂的制备方法，其特征在于所述的乳糖液与冻干保护剂包括脱脂乳、甘油和海藻糖，肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌和乳酸片球菌与乳糖液与冻干保护剂配比体积比1∶1为肠膜明串珠菌，植物乳杆菌，短乳杆菌：12％脱脂乳+5％甘油+10％海藻糖；乳酸片球菌：12％脱脂乳+5％甘油+5％海藻糖。
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