CN113416668A - 一株降低亚硝酸盐含量的短乳杆菌及其方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)JYX2，保藏编号CGMCCNo.20191。本发明还公开了一种用所述短乳杆菌JYX2降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量的方法，包括步骤：将短乳杆菌JYX2菌液接种在发酵蔬菜体系中进行发酵，发酵体系的液体中短乳杆菌JYX2的终浓度为106～108CFU/mL；使得所述蔬菜与所述液体的重量体积比是1:1～2g/mL本发明菌株及其方法能显著降低蔬菜发酵过程中亚硝酸盐的含量，降低硫化物的含量，提高酯类、腈类的含量，提高有机酸的含量，缩短发酵时间。

Description

一株降低亚硝酸盐含量的短乳杆菌及其方法和应用
技术领域
本发明属于食品技术领域，具体涉及一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)及利用该短乳杆菌降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量的方法及应用。
背景技术
泡菜起源于3000多年前的周朝，是中国传统的发酵蔬菜食品，以鲜酸可口、质地脆嫩的特点享誉世界。泡菜是以新鲜蔬菜作为原料，利用乳酸菌产酸，并伴有微弱的酒精发酵与醋酸发酵，辅以盐和其它香辛料，置于密封厌氧环境下泡制而成的一种发酵制品。微生物的发酵作用是泡菜成熟的关键，起发酵关键作用的是乳杆菌属、明串珠菌属、片球菌属等。
目前泡菜的工业化生产主要通过高盐发酵，此法不但会产生大量高盐废水，还会影响人体健康，为此泡菜低盐发酵是大势所趋。但泡菜低盐发酵过程中更容易导致亚硝酸盐的积累。亚硝酸盐广泛存在于整个生物圈，是自然界氮元素的主要重要组成之一。亚硝酸盐会导致组织缺氧，与胺类化合物形成对人体有很强的致癌、致畸作用的N－亚硝胺化合物。所以，泡菜中亚硝酸盐的积累大大增加了后期亚硝胺的形成几率，如何抑制低盐泡菜中亚硝酸盐的积累是保证产品安全和绿色生产的关键。
目前，宋小娟等人(牛干巴中降胆固醇、降亚硝酸盐乳酸菌的分离筛选及其发酵性能[J].宋小娟,何腊平,李翠芹,朱秋劲,范劲.食品工业科技.2016(09))从牛干巴中筛选出了具有降解亚硝酸盐能力的乳酸菌；其中降解亚硝酸盐能力最强的菌株NR7在培养12h后对100μg/mL的亚硝酸盐的降解率为36.44％，24h后为95.82％。张晓娟等人(四川泡菜降解亚硝酸盐优良功能菌种的筛选、鉴定及其性能初探[J].张晓娟,夏珊,陈洁,徐坤,李昕然,刘松青.中国调味品.2016(07))从四川泡菜中筛选出具有6株降亚硝酸盐能力的菌株，菌株X2在蔬菜汁发酵中降解亚硝酸盐能力最强，96h亚硝酸盐降解率达到89.82％。
发明内容
本发明提供一株短乳杆菌及利用该短乳杆菌降低发酵蔬菜中亚硝酸盐含量的方法，以解决低盐泡菜中亚硝酸盐容易积累，食用后影响人体健康的问题。
为了达到上述目的，本发明提供了一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)JYX2，其特征在于，保藏编号CGMCC No.20191。
所述短乳杆菌JYX2在以下任一项中的应用：
(1)降解亚硝酸盐；
(2)降低硫化物的含量；
(3)提高酯类、腈类的含量；
(4)提高有机酸的含量。
其中，所述有机酸包括酒石酸、乙酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸。
所述短乳杆菌JYX2降解亚硝酸盐的方法，包括以下步骤：
将菌株浓度为108～1010CFU/mL的短乳杆菌JYX2菌液作为发酵剂，按蔬菜与所述发酵剂重量体积比1:1～2g/mL的比例接种发酵，使发酵体系中所述短乳杆菌JYX2的终浓度为106～108CFU/mL，于18～20℃下发酵14～16天。
其中，所述发酵剂的制备方法包括：将短乳杆菌JYX2单菌落接种至MRS肉汤培养基中，36～38℃、耗氧、180～200转下振荡培养16～18h；重复培养一次后于8000～10000r/min转速下离心8～10min并收集菌体，用质量分数为0.85％氯化钠溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
本发明的有益效果是：本发明短乳杆菌JYX2相较于现有技术具有更强的降解亚硝酸盐能力，培养24h后，对亚硝酸盐的降解率达到98.72％，36h后达到99.88％。可有效降低发酵蔬菜中亚硝酸盐的含量，具有广泛的应用前景。
不仅如此，本发明短乳杆菌JYX2接种发酵还能提高泡菜中的酯类、腈类等风味成分的含量，同时能大大降低含硫化物等产生的刺激性气味的含量，改善泡菜的风味，更能促进发酵酒石酸、乙酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸等有机酸的产生，提高泡菜的酸味和回味，降低其苦味，有助于改善泡菜的风味品质。
保藏说明
本发明涉及的生物材料样品的保藏信息：参据的微生物(株)为JYX2，分类名为短乳杆菌(Lactobacillus brevis)，于2020年7月6日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.20191。地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所。
附图说明
图1是不同pH条件下短乳杆菌JYX2的生长曲线；
图2是不同亚硝酸盐浓度下短乳杆菌JYX2的生长曲线；
图3是短乳杆菌JYX2对亚硝酸盐的降解曲线；
图4是本发明对比例和实施例pH值随发酵时间变化曲线；
图5是本发明对比例和实施例亚硝酸盐含量随发酵时间变化曲线；
图6是本发明对比例和实施例酸度随发酵时间变化曲线；
图7是本发明对比例和实施例盐度随发酵时间变化曲线；
图8是为本发明对比例1和2和实施例2和3的挥发性风味物质含量。
具体实施方式
下面通过具体实施实例对本发明做进一步说明。
本发明的提供了一株短乳杆菌JYX2，分类名为短乳杆菌(Lactobacillusbrevis)，于2020年7月6日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC)保藏，保藏编号为CGMCC No.20191。
上述短乳杆菌分离自东北酸菜，采用细菌通用引物27F/1492R进行16SrDNA序列鉴定，为短乳杆菌。
所述JYX2菌株的保藏方法：从MRS琼脂培养基平板上挑选生长良好的单菌落接种至5mL MRS肉汤培养基，36～38℃、耗氧、静置培养24h，取0.6mL培养液加入到含有1.2mL体积分数60％甘油的冻存管中，于-80℃冰箱保藏。
所述短乳杆菌JYX2菌液的制备方法为：挑取短乳杆菌JYX2单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，36～38℃、耗氧、摇床180～200转培养16-18h，得菌液A；然后取200μL所述菌液A接种至20mL MRS肉汤培养基中，36～38℃、耗氧、摇床180～200转培养16-18h，得菌液B；将所述菌液B置
于8000～10000r/min离心8～10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
其中，所述MRS肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉8.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、1.0g/L的吐温80，25℃的pH值为5.7±0.2。
短乳杆菌JYX2接种发酵泡菜能显著降低泡菜发酵过程中亚硝酸盐的最高含量，加速泡菜发酵过程中亚硝酸盐的降解。此外短乳杆菌接种发酵能提高泡菜中的酯类，腈类等风味成分的含量，在萝卜泡菜中能大大降低含硫化合物的含量，改善泡菜的风味。接种发酵酒石酸，乙酸，柠檬酸等有机酸的产生。此外还能提高泡菜的酸味和回味，降低其苦味，有助于改善泡菜的风味品质。
实施例1：
本发明提供了一株短乳杆菌JYX2，保藏号为CGMCC No.20191。该菌株分离自东北酸菜。
为了鉴定该菌株，采用细菌基因组DNA快速抽提试剂盒(生工生物工程(上海)股份有限公司)提取基因组DNA，采用细菌通用引物27F：5'-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3'和1492R：5'-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3'进行16SrDNA序列扩增，引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。PCR反应体系为：2×Taq PCRMasterMix(TIANGEN)12.5μL、27f和1492r引物各1μL、ddH2O 8.5μ、DNA模板2μL。PCR反应程序：94℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃90s，循环30次；72℃10min。扩增产物通过1％琼脂糖凝胶电泳，180V电压30min检验，扩增产物委托生工生物工程(上海)股份有限公司进行测序。将测序结果通过BLAST程序进行比对，结果如表1所示。菌株JYX2被鉴定为短乳杆菌。
Figure BDA0003106620450000041
表1筛选菌株JYX2的16S rRNA比对结果
所述JYX2菌株的保藏方法：从MRS琼脂培养基平板上挑选生长良好的单菌落接种至5mL MRS肉汤培养基，37℃、耗氧、静置培养24h，取0.6mL培养液加入到含有1.2mL体积分数60％甘油的冻存管中，于-80℃冰箱保藏。
所述短乳杆菌JYX2菌液的制备方法为：挑取短乳杆菌JYX2单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液A；然后取200μL所述菌液A接种至20mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
所述MRS肉汤培养基成分为：蛋白胨10.0g/L、牛肉浸粉8.0g/L、酵母浸粉4.0g/L、葡萄糖20.0g/L、磷酸氢二钾2.0g/L、柠檬酸氢二铵2.0g/L、乙酸钠5g/L、硫酸镁0.2g/L、硫酸锰0.04g/L、吐温801.0g/L，25℃的pH值为5.7±0.2。
为表征该菌株的耐酸和耐亚硝酸盐特性，采用全自动生长曲线分析仪(芬兰，FP-1100-C)测定菌株JYX2在不同pH和不同亚硝酸盐浓度条件下的生长情况，具体步骤如下：挑取短乳杆菌JYX2单菌落，接种至2mL的MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，随后取10μL菌液接种至300μL的MRS肉汤培养基中，然后放入全自动生长曲线分析仪37℃测定24h。结果如图1和图2所示，结果表明JYX2在4.5-6.0的环境中长势良好，在pH为3.5-4.5的环境中仍能生长，在pH小于3.5的环境中生长受到严重抑制，表明JYX2有较好的耐酸性能，可以应用于泡菜的生产。高浓度亚硝酸盐对JYX2的生长有明显的抑制作用，0.8mg/mL的亚硝酸盐含量就能明显抑制JYX2的生长。JYX2对于亚硝酸盐的降解率不断升高，在培养8-10h时，JYX2对亚硝酸盐的降解率达到最高。培养24h后，JYX2对亚硝酸盐的降解率达到98.72％，36h后达到99.88％。由此可以表明JYX2对亚硝酸盐有着较好的降解作用。
实施例2：
一种利用短乳杆菌JYX2降低发酵卷心菜中亚硝酸盐含量的方法，包括步骤：
S1、原料预处理：
挑选新鲜的卷心菜，去除老叶，洗净，晾干水分，切成2cm左右的块状；
S2、制作卷心菜泡菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将22g食盐溶解于1500mL水，得NaCl溶液，NaCl和水的重量体积比是1:67～69g/mL；将所述NaCl溶液与109CFU/mL的短乳杆菌JYX2菌液混合，制得腌制液，使所述腌制液中短乳杆菌JYX2的终浓度为107CFU/mL；将1500mL所述腌制液、步骤S1所述卷心菜730g置于所述灭菌容器中，20℃水封放置发酵15天，得卷心菜泡菜；
其中，所述短乳杆菌JYX2发酵剂菌液的制备方法为：挑取短乳杆菌JYX2单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液A；然后取200μL所述菌液A接种至20mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
实施例3：
一种利用短乳杆菌JYX2降低发酵白萝卜中亚硝酸盐含量的方法，包括步骤：
S1、原料预处理：
挑选新鲜的白萝卜，洗净，晾干水分，切成2cm左右的块状；
S2、制作白萝卜泡菜：
将容器洗净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将36g食盐溶解于1200mL水，得NaCl溶液，白萝卜泡菜中NaCl和水重量体积比是1:32～34g/mL；将所述NaCl溶液与109CFU/mL的短乳杆菌JYX2菌液混合，制得腌制液，使所述腌制液中短乳杆菌JYX2的终浓度为107CFU/mL；将1200mL所述腌制液、步骤S1所述白萝卜1200g置于所述灭菌容器中，20℃水封放置发酵15天，得白萝卜泡菜；
其中，所述短乳杆菌JYX2发酵剂菌液的制备方法为：挑取短乳杆菌JYX2单菌落，接种至2mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液A；然后取200μL所述菌液A接种至20mL MRS肉汤培养基中，37℃、耗氧、摇床200转培养16-18h，得菌液B；将所述菌液B置于10000r/min离心10min后收集菌体，将菌体用质量分数为0.85％氯化钠水溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
对比例1：
自然发酵制备卷心菜泡菜步骤：
S1、原料预处理：
挑选新鲜的卷心菜，去除老叶，洗净，晾干水分，切成2cm左右的块状；
S2、制作卷心菜泡菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将22g食盐溶解于1500mL水，得NaCl溶液；将1500mL所述盐水、步骤S1所述卷心菜730g置于所述灭菌容器中，20℃水封放置发酵15天，得卷心菜泡菜；
对比例2：
自然发酵制备白萝卜泡菜步骤：
S1、原料预处理：
挑选新鲜的白萝卜，洗净，晾干水分，切成2cm左右的块状；
S2、制作白萝卜泡菜：
将容器清洗干净，沸水灭菌20min，得灭菌容器；将36g食盐溶解于1200mL水，得NaCl溶液；将1200mL所述盐水、步骤S1所述白萝卜1200g置于所述灭菌容器中，20℃水封放置发酵15天，得白萝卜泡菜；
对本发明实施例及对比例制备的泡菜的理化性质、挥发性风味物质、有机酸以及电子舌进行了测定。
1.理化指标
如图4-7所示，利用pH计测定pH，盐度利用盐度计进行测定，总可滴定酸度(TTA)的测定使用0.1M/L氢氧化钠进行滴定，以1％酚酞-乙醇溶液为指示剂，直到溶液出现浅粉色。亚硝酸盐含量的测定利用GB5009.33-2016所述比色法。结果如图5所示，对比例的亚硝酸盐含量在发酵第5d降至最低，与之相比，实施例的亚硝酸盐含量在发酵第3d就降至最低。同时实施例的亚硝酸盐最高含量仅为5.8ug/mL，而对比例亚硝酸盐最高含量为26.6ug/mL。以上结果表明JYX2接种发酵能有效降低泡菜发酵过程中的亚硝酸盐含量。在泡菜发酵过程中pH不断降低，7d之后逐渐趋于平稳。同时实施例pH降低速度快于对比例，表明接种JYX2发酵可以降低泡菜的生产时间。总酸在泡菜发酵过程中总体呈现上升趋势，实施例的总酸含量增加快于对比例，这与pH的变化是一致的。
2.挥发性风味物质
利用气相色谱-质谱联用仪测定了自然发酵和接种发酵卷心菜和白萝卜泡菜中挥发性风味物质含量，结果如表3所示。
与对比例2相比，实施例3所得的萝卜泡菜醛类物质含量更高，醛类物质的阈值较低，更容易产生风味；硫化物含量更低，硫化物作为泡菜的一个重要风味物质，具有类似腐烂洋葱和硫磺的刺激性气味，JYX2的接种发酵有利于降低泡菜中泡菜产品中的刺激性气味，增加适口性。
实施例2所制备的泡菜酯类含量高于对比例1，酯类被认为是发酵食品风味的重要来源，通过醇类和脂肪酸的酯化作用，在低浓度下也能产生花香和果香，对泡菜风味有显著贡献；腈类化合物是发酵十字花科植物中的重要风味化合物，在香气方面与醛类化合物相似，对泡菜的风味有一定的贡献。
Figure BDA0003106620450000071
Figure BDA0003106620450000081
表2泡菜中挥发性风味物质(ug/mL)
4、有机酸
利用高压液相色谱测定了分析对比例和实施例所制备泡菜的有机酸含量，结果如表4所示。泡菜中的有机酸以酒石酸为主，其次是乳酸和乙酸。与对比例相比，接种JYX2发酵更有助于有机酸的产生，尤其是酒石酸，乙酸，柠檬酸和琥珀酸的产生。相比于对比例2，实施例3中的卷心菜泡菜乳酸的含量更高。因此接种发酵为增加泡菜的风味做出贡献。
Figure BDA0003106620450000091
表3泡菜中有机酸含量(g/L)
5、电子舌分析
采用TS-5000Z型味觉分析系统(Insent，Japan)进行对比例1和实施例2的泡菜进行电子舌检测，结果如表5所示。酸味作为泡菜中重要的滋味成分，与对比例相比，实施例所制备的泡菜酸味和回味更强，苦味降低。因此，接种JYX2发酵能够改善泡菜的滋味品质。
Figure BDA0003106620450000092
表4泡菜电子舌分析
其中：“*”表示具有实施例2与对比例1有显著性差异，p＜0.05；“#”表示具有实施例3与对比例2有显著性差异，p＜0.05。
以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明披露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一株短乳杆菌(Lactobacillus brevis)JYX2，其特征在于，保藏编号CGMCCNo.20191。
2.一种权利要求1所述短乳杆菌JYX2在以下任一项中的应用：
(1)降解亚硝酸盐；
(2)降低硫化物的含量；
(3)提高酯类、腈类的含量；
(4)提高有机酸的含量。
3.根据权利要求2所述短乳杆菌JYX2的应用，其特征在于，所述有机酸包括酒石酸、乙酸、柠檬酸、乳酸和琥珀酸。
4.一种权利要求1所述短乳杆菌JYX2降解亚硝酸盐的方法，其特征在于，包括以下步骤：
将菌株浓度为108～1010CFU/mL的短乳杆菌JYX2菌液作为发酵剂，按蔬菜与所述发酵剂重量体积比1:1～2g/mL的比例接种发酵，使发酵体系中所述短乳杆菌JYX2的终浓度为106～108CFU/mL，于18～20℃下发酵14～16天。
5.根据权利要求4所述短乳杆菌JYX2降解亚硝酸盐的方法，其特征在于，所述发酵剂的制备方法包括：将短乳杆菌JYX2单菌落接种至MRS肉汤培养基中，36～38℃、耗氧、180～200转下振荡培养16～18h；重复培养一次后于8000～10000r/min转速下离心8～10min并收集菌体，用质量分数为0.85％氯化钠溶液稀释，制备成108～1010CFU/mL的菌悬液。
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