CN1205224C - 珍珠质基质蛋白及其编码基因与克隆方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种珍珠质基质蛋白与编码基因及其克隆方法和应用。珍珠质基质蛋白是具有序列表中序列2氨基酸残基序列的蛋白质，蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽。编码珍珠质基质蛋白的DNA序列是序列表中的序列1。本发明的珍珠质基质蛋白，可以广泛应用于提高珍珠的产量与质量、珍珠的体外培养、珍珠质作为新型生物材料及制备医用生物新材料的开发利用等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一种珍珠质基质蛋白与编码基因及其克隆方法和应用。
背景技术
珍珠是软体动物珍珠贝体内生物矿化的产物，它作为装饰品和医药及化妆品原料有着巨大的商业价值，近年来发现珍珠还有可能作为一种新型生物材料进一步开发利用。合浦珠母贝(Pinctada fucata)是世界上用于生产海水珍珠的最主要贝类，我国的海水珍珠几乎都为合浦珠母贝所产。目前，在珍珠的体外培养和珍珠质作为医用新材料的应用方面已取得一定进展，但由于蛋白质分离纯化水平的限制，阻碍了研究的进展，同时在矿化相关功能蛋白及其编码基因的分离鉴定方面进展也较缓慢。
发明内容
本发明的目的是提供一种珍珠质基质蛋白及其表达方法，该珍珠质基质蛋白的编码基因及其克隆方法。
一种珍珠质基质蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽。
一种体外表达上述珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤：
1)根据编码权利要求1所述蛋白的基因序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；
2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点；
3)利用设计的酶切位点将目的基因插入表达载体；
4)转化大肠杆菌；
5)表达、分离、纯化目的蛋白。
编码珍珠质基质蛋白的DNA序列，是序列表中序列1的DNA序列。
一种克隆上述珍珠质基质蛋白基因的方法，包括下述步骤：
1)构建合浦珠母贝外套膜cDNA文库；
2)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；
3)对所得到的阳性克隆进行序列分析；
本发明分离、鉴定出的珍珠质基质蛋白的编码基因及其编码的珍珠质基质蛋白，可以广泛应用于提高珍珠的产量与质量、珍珠的体外培养、珍珠质作为新型生物材料及制备医用生物新材料的开发利用等领域。
在饱和碳酸钙溶液中加入本发明珍珠质基质蛋白，可使碳酸钙结晶形成有序的文石晶体，而不是天然条件下形成的方解石晶体。由于其独特的晶体结构和机械强度，所形成的晶体可进一步开发成新型医用生物材料。
与其它珍珠质基质蛋白配合使用，本发明珍珠质基质蛋白可使碳酸钙在体外形成珍珠质样晶体，使珍珠的工业生产成为可能。
随着生物工程技术的发展，可通过控制本发明珍珠质基质蛋白编码基因在珍珠贝体内的表达周期，人为控制珍珠形成的时期，从而提高珍珠质量与产量。
具体实施方式
实施例1、克隆编码珍珠质基质蛋白的基因序列
克隆编码珍珠质基质蛋白的基因序列，包括以下步骤：
1)提取合浦珠母贝外套膜总RNA；
2)以Oligo(dT)为引物，提取mRNA；
3)将mRNA反转录成cDNA；
4)将cDNA连接到Uni-ZAP XR Vector上；
5)用Gigapack III Gold extract(Stratagene)进行包装，从而完成外套膜cDNA文库的构建；
6)根据合浦珠母贝珍珠质基质蛋白MSI31的信号肽序列合成简并引物；
7)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；
8)对所得到的阳性克隆进行序列分析；
9)所得序列经分析确定为序列表中的序列1。
实施例2、序列表中的序列1在体外的表达
本发明的第二个目的是提供一种体外表达珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤：
1)根据编码成熟蛋白的氨基酸序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；所设计引物的序列为：
上游引物：GCGGATCCGGCGGAGATGGTGAC；
下游因物：GCCTCGAGTTATTGCAAAAAAATGAATATC
2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点，其中，PCR的条件为50μl反应体系，加入含有目的基因的质粒1μl为模板，两种引物各50pmol，95℃变性后加入2U Taq DNA聚合酶，95℃变性45sec，54℃退火1min，72℃延伸1min，30个循环后于72℃延伸10min。
3)利用设计的酶切位点将目的基因插入pGEX一4T表达载体；
6)转化大肠杆菌；
7)表达、分离目的蛋白；
8)纯化目的蛋白。
经分析证实得到的蛋白质为碳端连接有序列表中序列3信号肽的序列2蛋白质。
序列表
<160>3
<210>1
<211>362
<212>DNA
<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)
<220>
<223>
<400>1
gcacgaggca gataaaaggt cggtgcccaa ccacagtcat gaaacccttt gttacactcg 60
caagcttgat cgtcttaatt gcctctgttt ctgccggcgg agatggtgac tatggcaaat 120
acggcggtgt cagttacgga cctggcatca accttggagg tggtagtcta agtgccggag 180
gaggtgttat cgggcttgga ggcgtcggag gtggtagtct aggtgccgga ggcgtcggcc 240
cagttggtgg aattaccata tggactcacc ttttcacctg gatatacctt tttcatggat 300
gtttgatatt catttttttg caataaatgg ccgggcacat acaaaaaaaa aaaaaaaaaa 360
aa 362
<210>2
<211>76
<212>PRT
<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)
<220>
<223>
<400>2
gly gly asp gly asp tyr gly lys tyr gly gly val ser tyr gly
1 5 10 15
pro gly ile asn leu gly gly gly ser leu ser ala gly gly gly
20 25 30
val ile gly leu gly gly val gly gly gly ser leu gly ala gly
35 40 45
gly val gly pro val gly gly ile thr ile trp thr his leu phe
50 55 60
thr trp ile tyr leu phe his gly cys leu ile phe ile phe leu
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gln
76
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<213>合浦珠母贝(Pinctada fucata)
<220>
<223>
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Met Lys Pro Phe Val Thr Leu Ala Ser Leu Ile Val Leu Ile Ala
1 5 10 15
Ser Val Ser Ala
19
Claims (11)
1、一种珍珠质基质蛋白，它具有序列表中序列2的氨基酸残基序列。
2、根据权利要求1所述的珍珠质基质蛋白，其特征在于：所述蛋白序列的碳端还连接有序列表中序列3的信号肽。
3、一种体外表达权利要求1所述珍珠质基质蛋白的方法，包括以下步骤：
1)根据编码权利要求1所述蛋白的基因序列的两端设计引物，在引物的两端分别加上BamHI和XhoI酶切位点；
2)通过PCR方法在含有目的基因的克隆中扩增该基因，使产物两端也加上酶切位点；
3)利用设计的酶切位点将目的基因插入表达载体；
4)转化大肠杆菌；
5)表达、分离、纯化目的蛋白。
5、一种编码如权利要求1所述珍珠质基质蛋白的DNA序列，为序列表中的序列1。
6、一种克隆权利要求5所述基因的方法，包括下述步骤：
1)构建合浦珠母贝外套膜cDNA文库；
2)通过PCR方法利用简并引物对cDNA文库进行筛选；
3)对所得到的阳性克隆进行序列分析。
7、权利要求1所述的蛋白质在提高珍珠质量与产量中的应用。
8、权利要求1所述的蛋白质在制备体外培养材料中的应用。
9、权利要求1所述的蛋白质在制备医用生物材料中的应用。
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