CN103884808B - 一种齐考诺肽及其杂质的检测方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种用于有效分离和分析齐考诺肽及其杂质的高效液相色谱（HPLC）方法。
Description
技术领域
本发明涉及一种用于有效分离和分析齐考诺肽及其杂质的高效液相色谱（HPLC）方法。
背景技术
齐考诺肽(Ziconotide)是一种钙离子通道抑制剂，具有镇痛的作用。齐考诺肽对那些使用阿片类及非甾体类镇痛剂无效的严重慢性疼痛患者会产生显著的镇痛作用，而且不会让人上瘾和产生抗药性。
专利CN101709082中提及了一种固相合成齐考诺肽的制备工艺。在齐考诺肽的化学合成过程中，存在几个关键的中间步骤，所以在最终产品中可能残留相应的中间体，因此建立分离分析方法对其中间体及杂质进行质量控制是非常必要的。
齐考诺肽及其杂质的结构如下：
1）齐考诺肽
Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2,[二硫键（Disulfidebridges）:1-16,8-20,15-25]
2）杂质A
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
2）杂质B
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
3）杂质C
D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
4）杂质D
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-γ-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
5）杂质E
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
6）杂质F
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2[二硫键:1-16,8-20,15-25]
从以上各化合物结构来看，其结构非常相似，而从极性角度考虑，又有部分杂质与齐考诺肽存在较大的极性差异，因此要想在同一色谱柱上实现各组分的完全有效分离是非常困难的。
无疑，上述化合物在采用不同的色谱条件时，均可以单独的分离检测，但选用多个色谱条件分别分离检测在人力物力上都存在极大的浪费。因此，有必要寻找一种既能有效分离相似结构化合物又能有效检出弱极性物质的色谱条件。本发明人通过大量研究，发现了适宜的色谱条件，可有效的分离分析以上各化合物。
发明内容
本发明提供了一种分离分析齐考诺肽及各杂质的高效液相色谱法，从而实现对齐考诺肽与其中间体及杂质的分离和分析测定。
本发明所说的用高效液相色谱法分析分离齐考诺肽杂质及其最终产品的方法，是选用柱色谱法，以缓冲液与有机溶剂不同比例配制的流动相A、流动相B为流动相，梯度洗脱。用该方法可以快速有效的分离分析齐考诺肽和中间体及各杂质。
在一个实施方案中，所述方法中使用的流动相的流速为流速为0.8-1.2ml/min。在一个优选的实施方案中，所述流动相的流速为1.0ml/min。
在一个实施方案中，所述方法中使用的色谱柱的填料为十八烷基键合硅胶填料。
在一个实施方案中，所述有机溶剂选自下列化合物：甲醇、乙醇、乙腈和异丙醇。在一个优选的实施方案中，所述有机溶剂为乙腈与甲醇。在一个更优选的实施方案中，所述有机溶剂为乙腈。
在一个实施方案中，所述缓冲液选自：磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠和磷酸氢二铵缓冲液。在一个优选的实施方案中，所述缓冲液为磷酸二氢钾和磷酸二氢钠。在一个更优选的实施方案中，所述缓冲液为磷酸二氢钾。
在一个实施方案中，所述缓冲液的pH为6-7。在一个优选的实施方案中，所述缓冲液的pH为6.2-6.8。在另一个优选的实施方案中，所述缓冲液的pH为6.5。
在一个实施方案中，所述pH是使用三乙胺或磷酸调节。
在一个实施方案中，所述缓冲液的浓度为2-50mmol/L。在一个优选的实施方案中，所述缓冲液的浓度为10-30mmol/L。在另一个优选的实施方案中，所述缓冲液的浓度为20mmol/L。
在一个实施方案中，所述流动相A为含有0-15％（体积比）上述有机溶剂的缓冲液溶液。在一个优选的实施方案中，所述流动相A为含乙腈/缓冲液(10:90)（体积比）的溶液。在一个更优选的实施方案中，所述流动相A为含乙腈/磷酸二氢钾缓冲液(10:90)（体积比）的溶液。
在一个实施方案中，所述流动相B为含有40–60％（体积比）上述缓冲液的有机溶液。在一个优选的实施方案中，所述流动相B为含缓冲液/乙腈(50:50)的溶液。在一个更优选的实施方案中，所述流动相B为含磷酸二氢钾缓冲液/乙腈(50:50)（体积比）的溶液。
本发明的梯度可以根据流动相A、流动相B各自所含的缓冲液、有机溶剂比例不同而改变。其改变的最终依据是：
0-25分钟时，两相混合后流动相中的有机溶剂比例为5%-20％；在一个优选的实施方案中，两相混合后流动相中的有机溶剂比例为11.5-18%，例如11.5%、12%、13.6%、14%、16%和18%。在另一个优选的实施方案中，两相混合后流动相中的有机溶剂比例为14-16%。在另一个优选的实施方案中，在0-25分钟期间，流动相中的有机溶剂的比例可以是变化的，例如匀速增加的；或者可以是不变的；
在25-40分钟时间段内，逐渐增加流动相中的有机溶剂比例至25％-35％，保持10分钟。在一个优选的实施方案中，流动相中的有机溶剂比例增加至27-32.5%，例如27%、28%和32.5%。在另一个优选的实施方案中，流动相中的有机溶剂比例增加至28%。在另一个优选的实施方案中，在25-40分钟期间，流动相中的有机溶剂比例是匀速增加的。
然后在50-55分钟时间段内，将有机溶剂比例逐渐降回5-15％。在一个优选的实施方案中，流动相中的有机溶剂比例降低至11.5-14%，例如11.5%、12%、14%和15%。在另一个优选的实施方案中，流动相中的有机溶剂比例降低至14%。在另一个优选的实施方案中，在50-55分钟分钟期间，流动相中的有机溶剂比例是匀速降低的。
在一个优选的实施方案中，当流动相A为0.01M磷酸二氢钾水溶液(pH＝6.5):乙腈＝90:10，流动相B为0.01M磷酸二氢钾水溶液(pH＝6.5):乙腈＝50:50时，可表述为下表1所示。
根据如上梯度程序，取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质溶解稀释配制成供试样品溶液，设置流速为0.8-1.2ml/min，检测波长为230nm，柱温为40度，取供试样品溶液注入液相色谱仪，可以有效测定其相关杂质。在一个优选的实施方案中，所述流速为1.0ml/min。
在一个优选的实施方案中，本发明提供了一种用于洗脱齐考诺肽及各杂质的洗脱缓冲液试剂盒，包括前述的流动相A和流动相B。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细说明，但应理解本发明的范围非仅限于这些实施例的范围。
具体实施方式：
对比实施例1
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(250mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相:
乙腈:0.01M磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调pH＝6.5)＝15:85
取齐考诺肽及其杂质，采用流动相溶解稀释配制成供试样品溶液，浓度为1mg/mL。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，见下表2。
从表2中可以看出，该条件下，杂质D和杂质F保留时间过长，无法有效检出，增大乙腈比例又会导致杂质B及齐考诺肽保留时间过小。故该方法无法有效检出齐考诺肽杂质。
实施例1
1.仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(250mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.01M磷酸二氢钾水溶液:乙腈＝90:10(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.01M磷酸二氢钾水溶液:乙腈(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)＝50:50，流动相的梯度见下表3。
取齐考诺肽及其各中间体、杂质，采用0分钟时的流动相溶解配制成供试样品溶液，浓度为1mg/mL。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为室温，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表4。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为48.3min，该方法可有效检出各杂质。
实施例2
1.仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：0℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.01M磷酸二氢钾水溶液(三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.01M磷酸二氢钾水溶液:乙腈=40:60(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，见下表5。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表6。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为39.6min，该方法可有效检出各杂质。
实施例3
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.01M磷酸二氢钠水溶液:乙腈=85:15(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.01M磷酸二氢钠水溶液:乙腈=50:50(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，见下表7。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表8。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为39.9min，该方法可有效检出各杂质。
实施例4
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.01M磷酸氢二钠水溶液:乙腈=90:10(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.01M磷酸氢二钠水溶液:乙腈=60:40(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，见下表9。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表10。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为50.5min，该方法可有效检出各杂质。
实施例5
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.05M磷酸氢二钠水溶液:乙腈=90:10(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.05M磷酸氢二钠水溶液:乙腈=50：50(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，见下表11。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表12。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为37.5min，该方法可有效检出各杂质。
实施例6
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.002M磷酸二氢钠水溶液：乙腈=90:10(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，流动相B为0.002M磷酸二氢钠水溶液：乙腈=50:50(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝6.5)，见下表13。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表14。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为38.5min，该方法可有效检出各杂质。
实施例7
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.02M磷酸二氢钠水溶液(三乙胺调pH＝6.0)，流动相B为乙腈，见下表15。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表16。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为40.3min，该方法可有效检出各杂质。
实施例8
仪器条件
高效液相色谱仪：Waters2695
色谱柱：KromasilC18(150mm×4.6mm)；
流速：1.0ml/min
柱温：40℃
进样体积：20μl
流动相：流动相A为0.02M磷酸二氢钠水溶液：乙腈=90:10(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝7.0)，流动相B为0.02M磷酸二氢钠水溶液：乙腈=50:50(缓冲液和乙腈混合充分后，三乙胺调pH＝7.0)，见下表17。
取齐考诺肽及其杂质，采用适宜介质稀释溶解配制成供试样品溶液。设置流速为1.0ml/min，检测波长为230nm，柱温为40℃，取供试样品溶液20μl注入液相色谱仪，测定结果见表18。
该条件下，保留时间最长的色谱峰保留时间为41.6min，该方法可有效检出各杂质。
Claims (26)
1.一种分离和分析齐考诺肽及各杂质的方法，包括：
在柱色谱法中，将分别以缓冲液与有机溶剂按不同比例配制的流动相A和流动相B按不同比例混合作为流动相，梯度洗脱含齐考诺肽及各杂质的样品，
其中所述流动相A为含有0-15体积％有机溶剂的缓冲液溶液，所述流动相B为含有40-60体积％缓冲液的有机溶液；其中所述齐考诺肽及各杂质结构如下：
1)齐考诺肽
Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2,二硫键:1-16,8-20,15-25；
2)杂质A
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asn-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
2)杂质B
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-D-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
3)杂质C
D-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
4)杂质D
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-γ-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
5)杂质E
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-D-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
6)杂质F
H-Cys-Lys-Gly-Lys-Gly-Ala-Lys-Cys-Ser-Arg-Leu-Met-Tyr-Asp-Cys-Cys-D-Thr-Gly-Ser-Cys-Arg-Ser-Gly-Lys-Cys-NH2，二硫键:1-16,8-20,15-25；
其中所述柱色谱法的色谱柱填料为十八烷基键合硅胶填料；所述有机溶剂选自下列化合物：甲醇、乙醇、乙腈、异丙醇，所述缓冲液的pH为6-7；所述梯度为：
在0-25分钟时间段内，流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例为5-20％，在此期间有机溶剂的比例可以是变化的，或者可以是不变的；
在25-40分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例增加至25％-35％，并保持10分钟；
在50-55分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例降回5-15％。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相的流速为0.8-1.2ml/min。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述流动相的流速为1.0ml/min。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂为乙腈或甲醇。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述有机溶剂为乙腈。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液指磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、磷酸二氢铵、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠或磷酸氢二铵水溶液。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液为磷酸二氢钾或磷酸二氢钠水溶液。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液为磷酸二氢钾水溶液。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液的pH为6.2-6.8。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液的pH为6.5。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为2mmol/L-50mmol/L。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为10-30mmol/L。
13.根据权利要求11所述的方法，其中所述缓冲液的浓度为20mmol/L。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述流动相A为含有0–15％的所述有机溶剂的缓冲液溶液；所述流动相B为含有45-60％的权利要求6所述的缓冲液的有机溶液。
15.根据权利要求14所述的方法，其中所述流动相A为乙腈:缓冲液＝10:90的溶液，流动相B为含缓冲液:乙腈＝50:50的溶液。
16.根据权利要求1所述的方法，其中在0-25分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例为11.5-18％。
17.根据权利要求16所述的方法，其中在0-25分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例为11.5％、12％、13.6％、14％、16％或18％。
18.权利要求16所述的方法，其中在0-25分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例为14-16％。
19.根据权利要求1所述的方法，其中在0-25分钟时间段内，在此期间有机溶剂的比例是匀速增加的。
20.根据权利要求1所述的方法，其中在25-40分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例增加至27-32.5％。
21.根据权利要求20所述的方法，其中在25-40分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例增加至27％、28％或32.5％。
22.根据权利要求20所述的方法，其中在25-40分钟时间段内，所述流动相A和流动相B混合后的流动相中有机溶剂比例增加至28％。
23.根据权利要求1所述的方法，其中在50-55分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例降回11.5-14％。
24.权利要求1所述的方法，其中在50-55分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例降回11.5％、12％、14％或15％。
25.根据权利要求24所述的方法，其中在50-55分钟时间段内，改变流动相A和流动相B的混合比例逐渐将有机溶剂比例降回14％。
26.根据权利要求1、20-25任一项所述的方法，其中所述增加或降回均为匀速增加或降回。
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2012
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