CN103819551A - Orexin多肽的化学制备方法及用途 - Google Patents

Orexin多肽的化学制备方法及用途 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种orexin多肽的化学规模化合成方法，其包括下述步骤：（1）采用RinkAmideResin法合成线性粗肽制备树脂。（2）进入AA循环，将步骤（1）所得的反应产物，采用固相合成法，按序逐一合成，得到33个氨基酸的线性粗肽。（3）将步骤2所得的线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin粗肽溶液。（4）将步骤3所得的环化的orexin粗肽溶液经分离性HPLC纯化、转盐及冷冻干燥后，得到orexin多肽。（5）利用Kaiser检测法和HPLC-MS法，完成步骤4所得orexin多肽的结构和纯度测定。由于orexin多肽是正常存在于人体中的一种神经多肽，因此就开发成药品的角度而言，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势。

Description

Orexin多肽的化学制备方法及用途
技术领域
本发明涉及一种化学合成orexin多肽(orein-A)的制备方法，属于医药化学领域。
背景技术
 2008年统计数据显示全球手术量已达2.34亿，我国2009年手术例数即已突破2700万例，这些患者中75%以上需要进行全身麻醉。近年来，随着外科和监测技术的发展，手术死亡率已经大大下降。然而，随着人口老龄化，围术期死亡仍是一个重要的临床问题，欧洲最新的研究结果显示术后7天死亡率高达4%。研究显示，术后心脑损伤、肺部并发症的发生是导致围术期死亡的重要原因，而这些问题的发生都与麻醉药物具有一定关系。临床证据显示老年患者的麻醉后苏醒延迟，是增加围术期死亡率威胁患者生命的最重要因素。针对全麻苏醒期，尽管已有镇痛以及肌松的拮抗药物，但还没有任何一种针对全身麻醉药的拮抗剂问世。出现这一现象的主要原因是以往人们对于全麻觉醒的机制研究尚不深入，对于何种机制调控觉醒尚不明确，传统观念认为觉醒过程仅仅是全麻药物撤退后脑功能的被动复苏。基于这一理论，研发了针对苯二氮?类受体的竞争性抑制剂，如氟马希尼等。然而临床应用中，对于全身麻醉药物如七氟醚、异氟醚、丙泊酚等，苯二氮?类受体竞争性抑制剂毫无作用，并不能作为促醒药物应用。同时，这种屏蔽并非是全麻药物的彻底消退，更类似于一种“被动”等待，由于患者药物代谢差异，这种屏蔽很可能导致患者再度进入麻醉状态，一旦发生，将危及生命。因而，美国麻醉学会《ASA 2013麻醉后管理指南》明确指出“不推荐常规应用氟马西尼（苯二氮?类受体竞争性抑制剂）”作为全麻促觉醒药物。解决这一问题的出路在于寻找有效地特异性全麻药物拮抗剂，而目前尚无针对全身麻醉药的特异性拮抗剂问世。
Orexin-A 是存在于下丘脑的一种神经多肽，参与调节摄食、睡眠-觉醒周期、生殖、体温、血压、激素分泌和感觉等生理功能。1998年Yanagisawa等在大鼠下丘脑腹外侧发现了两种与食欲有关的神经肽，命名为orexin-A（食欲素-A）和orexin-B（食欲素-B）。一系列研究发现：orexin能在神经系统麻醉—觉醒调控中起到重要作用，orexin的激活可以逆转多种全麻药物的作用。
无法获得大量、高纯度的orexin多肽是制约含有orexin多肽药物发展的主要问题。Orexin多肽的化学合成存在的以下问题：（1）其结构含有33个氨基酸，肽序较长，合成难度较大；（2）其中多个疏水氨基酸和一些分子量较大的氨基酸，也增加合成难度；（3）结构中两对二硫键的正确环化是成药性的关键，也是化学合成的难点；（4）合成orexin多肽的纯度检测和质量控制。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型orexin多肽的化学合成方法，使用此方法可以得到g级、高纯度（>98%）的原料药，较好的解决了其成药性的问题，以克服现有技术的主要不足。
为达到以上目的，本发明是采取如下技术方案予以实现的：
一种orexin多肽化学合成方法，采用固相合成法合成线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin多肽溶液，采用HPLC-MS进行合成粗肽质量控制。
固相合成法合成线性粗肽是采用0.3~0.45mmol/g  Rink Amide Resin合成线性肽树脂，进入AA循环，逐一合成含有33氨基酸的线性粗肽多肽。
上述合成过程中，采用Kaiser检测法检测树脂上的游离氨基，判断缩合反应是否完全；采用HPLC-MS确认取样裂解得到粗肽的合成质量是否正确。
更具体地说，所述的orexin多肽化学合成方法包括以下步骤：
（A）采用Rink Amide Resin合成线性粗肽制备树脂，进入AA循环，采用固相合成法，按序逐一合成，得到33个氨基酸的线性粗肽；
（B）将步骤（A）所得的线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin多肽溶液；
（C） 将步骤（B）所得的环化的orexin粗肽溶液经分离性HPLC纯化、转盐及冷冻干燥后得到orexin多肽，利用Kaiser检测法和HPLC-MS法，完成上述合成步骤中所得产物的结构和纯度测定；
上述方法合成得到的orexin多肽可用于制备促进全身麻醉觉醒药物或促进全麻觉醒药物的前体化合物。
由于orexin多肽是正常存在于人体中的一种神经多肽，其具有毒副作用小，对正常生理功能干扰小等独特优势。orexin多肽类药物能够改变患者体内的orexin多肽的含量，对治疗麻醉苏醒延迟具有良好的疗效。
附图说明
图1为Orexin的HPLC色谱图；
图2为Orexin的MS谱图。
具体实施方式
本发明实施例所用原材料除Rink Amide Resin购于天津南开和成科技有限公司，其余均为现有技术，以下结合实施例对本发明作进一步的详细说明。
实施例1：Orexin-A多肽的固相合成
（1）称取10mmol树脂替代度为0.3~0.45mmol/g的Rink Amide Resin（产于天津南开和成科技有限公司）的原料倒入反应柱，加入300±20mL的DCM溶涨10min。待溶涨结束后，抽掉DCM液，加200±20mL的DBLK液(20%哌啶/DMF溶液)脱保护两次，两次脱保护之间用200±20mLDMF洗涤一次，每次约1min，抽调。脱保护完成后，用茚三酮检测显阳性，进入下一步反应。
（2）称取17.67±0.1g 的Fmoc-Leu-OH以及8.106±0.1g的HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴约5min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min后，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（1）得到的树脂被均匀吹起，反应温度为25-30℃，反应时间1-2h。反应完成后，取样茚三酮检测，显阴性，表明偶联反应完全，加入200±20 mL的DMF洗涤。
（3）称取19.875g±0.1g Fmoc-Thr(tBu)-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（2）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（4）称取17.670±0.1g Fmoc-Leu-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC于溶液中活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（3）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（5）称取17.670±0.1g Fmoc-Ile-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（4）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（6）称取14.865±0.1g Fmoc-Gly-OH 和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（5）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（7）称取16.45±0.1g Fmoc-Ala-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（6）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（8）称取16.45±0.1g Fmoc-Ala-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（7）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（9）称取30.985±0.1g Fmoc- His(Trt)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（8）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（10）称取29.835±0.1g Fmoc-Asn(Trt)-OH和8.106±0.1 g HOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（9）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（11）称取14.865±0.1g Fmoc-Gly-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（10）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（12）称取16.45±0.1g Fmoc-Ala-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（11）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（13）称取14.865±0.1g Fmoc-Gly-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（12）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（14）称取30.985±0.1g Fmoc-His(Trt)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（13）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（15）称取17.67±0.1g Fmoc-Leu-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（14）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（16）称取29.835±0.1g Fmoc-Leu-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（15）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（17）称取21.274±0.1g Fmoc-Glu(OtBu)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（16）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（18）称取22.975±0.1g Fmoc-Tyr(tBu)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（17）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（19）称取17.67±0.1g Fmoc-Leu-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（18）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（20）称取32.439±0.1g Fmoc-Arg(pbf)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（19）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（21）称取29.285±0.1g Fmoc-Cys(Trt)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（20）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（22）称取19.17±0.1g Fmoc-Ser(tBu)-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（21）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（23）称取20.70±0.1g Fmoc-Cys(Acm)-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（22）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（24）称取19.875±0.1g Fmoc-Thr(tBu)-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（23）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（25）称取23.425±0.1g Fmoc-Lys(Boc)-OH和8.106±0.1g HOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（24）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（26）称取30.535±0.1g Fmoc-Gln(Trt)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（25）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（27）称取32.439±0.1g Fmoc-Arg(pbf)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（26）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（28）称取29.285±0.1g Fmoc-Cys(Trt)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（27）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（29）称取29.835±0.1g Fmoc-Cys(Acm)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（28）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（30）称取20.573±0.1g Fmoc-Asp(OtBu)-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mLDMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（29）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（31）称取16.87±0.1g Fmoc-Pro-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（30）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（32）称取17.670±0.1g Fmoc-Leu-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（31）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（33）称取16.87±0.1g Fmoc-Pro-OH和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（32）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（34）称取6.125±0.1g pGlu和8.106±0.1gHOBt置烧杯中，加入200mL DMF溶解，待完全溶解后，将烧杯放入冰浴中冰浴2min入，然后再加入9.287±1mL DIC溶液活化5min，将反应液倒入反应柱中，调节好N2，使步骤（33）得到的树脂被均匀吹起，25-30℃反应，时间：2-3h。反应完成后，茚三酮检测显阴性则进入下一步。
（35）配置900ml裂解液（裂解试剂配比：TFA:苯甲硫醚:EDT:苯甲醚=90：5：3：2）置烧杯中冷冻30min。将步骤（34）所得产物74.0g的肽树脂缓缓加入到冷冻的裂解液中，室温裂解3h，过滤，将含多肽的裂解液缓缓加入到3.1L的冰乙醚中，静置30min后离心，室温放置10min，得固体产物则进入下一步。
（36）第一对二硫键的环化：将步骤（35）所得的产物研磨成粉末状，加入5.6L乙腈超声至浊状再加入 22.4L的纯化水超声至溶解（溶解浓度1mg/ml）。用碳酸氢钠调溶液PH至7.2，再加入稀释10倍的0.6ml的双氧水进行搅拌环化，分别于20、30min等取样采用HPLC观察是否有环肽生成，直至环化完成后浓缩，冻干，称重。
（37）第二对二硫键的环化：将第一对二硫键环化成功的产物称重、溶解于10%的醋酸（5-10mg/ 1ml）,并称取产物摩尔量的20-30倍的碘剂并将其溶解于甲醇中，将碘溶液慢慢加入溶有粗品的10%醋酸溶液至溶液淡黄色，反应3-4h，采用HPLC观察是否有环肽生成，最后加入抗坏血酸水溶液至溶液变成透明状则进入下一步。
（38）将步骤（37）所得产物纯化，冷冻干燥，即得orexin多肽。
（39）orexin多肽的纯度检测和质量控制：
①线性粗肽合成过程中的质量控制，采用灵敏的Kaiser检测法检测树脂上的游离氨基，作为判断缩合反应是否完全的主要方法。具体如下：取三个玻璃试管分别放入（a）5%茚三酮无水乙醇溶液(W/V)（b）新蒸苯酚的无水乙醇溶液（4:1,W/V）（c）吡啶；取少许充分洗涤并抽干的树脂置于小玻璃试管中，依次加入试剂a,b,c各2滴，105℃加热5分钟，观察树脂和溶液的颜色。树脂呈蓝色或浅红色，溶液为蓝色或无色，表明偶联反应未完全，须进行重新偶联；树脂为无色，溶液为浅黄色，表明偶联反应完全，可进行脱保护，进行下一个氨基酸的偶联。
②采用HPLC-MS作为中间片段肽的纯度测定和质量控制，具体如下：在肽树脂的合成过程中，当第18、26和33个氨基酸偶联结束且脱完Fmoc后，从反应柱中取出约2g肽树脂，用无水MeOH收缩2次，每次5min。真空减压干燥后，按上述裂解方法裂解。将所得粗肽减压干燥后，用HPLC检测片段肽的纯度并进行MS确认。检测条件：色谱以十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，以磷酸缓冲盐为流动相A，以乙腈溶液为流动相B，采用梯度洗脱；波长 215nm。
③采用DIONEX P680高效液相色谱仪，以梯度洗脱的方式完成样品纯化过程中的质量控制。分析条件：流动相，A相：0.1%TFA  B相：100%乙腈  波长：215nm；柱温：35℃；流速：1.000mL/min。
从图1可见，制备得到的Orexin纯度高达99%；Orexin的理论分子量为3561.5，根据图2质谱分析得到分子量为：（891.3 x4 – 4 = 3561.2）。
实施例2 ：腹腔注射orexin多肽，监测大鼠麻醉觉醒时间
（1）腹腔注射orexin多肽（本发明实施例1所得orexin多肽）前后对麻醉觉醒时间的比较。
雄性SD大鼠，体重280~320g，12只。实验方法：观察腹腔注射orexin多肽对大鼠异氟醚麻醉觉醒时间的影响。实验过程：实验首日，12只SD大鼠随机分为两组，对照组经腹腔注射溶剂（0.9%生理盐水0.5ml），实验组给予orexin多肽30μg/kg（用0.9%生理盐水溶解稀释成0.5ml），记录两组接受1.4%异氟醚麻醉后的觉醒时间。两组动物休息三日，第四日重复上述实验，对照组给予orexin多肽而实验组给予溶剂，并记录麻醉觉醒时间。
实验结果表明，腹腔注射orexin多肽能明显缩短大鼠接受异氟醚麻醉的觉醒时间 (P < 0.05)，结果见表1。
（2）腹腔注射orexin多肽（本发明实施例1所得orexin多肽）和orexin-A对麻醉觉醒时间影响的比较。
雄性SD大鼠24只，随机分为3组：对照组、orexin-A组、orexin多肽组。接受1.4%异氟醚麻醉后15min后，以上三组分别经过腹腔注射相应剂量生理盐水（0.1ml）、orexin-A 30μg/kg（用生理盐水溶解稀释成0.1ml）、orexin多肽30μg/kg（用生理盐水溶解稀释成0.1ml），并持续麻醉15min后结束麻醉，分别观察三组动物麻的醉觉醒时间。
腹腔注射orexin多肽和阳性对照药物orexin-A的比较，结果显示与对照组相比，两种药物均能明显缩短大鼠麻醉的觉醒时间有统计学意义(P < 0.05)且两组之间无显著差异，结果见表2。
（3）不同剂量的orexin多肽对大鼠麻醉觉醒时间的比较
雄性SD大鼠，随机分为3组：对照组、orexin多肽30μg/kg组（OXA-30）、orexin多肽100μg/kg组（OXA-100）。接受1.4%异氟醚麻醉后15min后，以上三组分别经过腹腔注射溶剂（NaCl，0.5ml）或相应剂量的orexin多肽 (0.5ml,用生理盐水溶解稀释成不同浓度)。分别观察三组动物的麻醉觉醒时间。 
实验结果表明，orexin多肽可以明显的减少大鼠觉醒时间(P < 0.05)，并且呈剂量依赖性效应，见表3。
Figure 85369DEST_PATH_IMAGE004
综合以上结果说明，外源性给予合成的orexin多肽可明显缩短提高大鼠的麻醉觉醒时间，与内源性活性物质orexin-A无差别，并具有剂量依赖的效应，用于治疗麻醉苏醒延迟具有很好的临床运用前景。

Claims (5)

1.一种orexin多肽化学合成方法，其特征在于采用固相合成法合成线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin多肽溶液，采用HPLC-MS进行合成粗肽质量控制。
2.根据权利要求1所述orexin多肽化学合成方法，其特征在于：采用0.3~0.45mmol/g  Rink Amide Resin合成线性肽树脂，进入AA循环，逐一合成含有33氨基酸的线性粗肽多肽。
3.根据权利要求1所述orexin多肽化学合成方法，其特征在于：采用Kaiser检测法检测树脂上的游离氨基，判断缩合反应是否完全；采用HPLC-MS确认取样裂解得到粗肽的合成质量是否正确。
4.根据权利要求1所述orexin多肽化学合成方法，其特征在于：
（A）采用Rink Amide Resin合成线性粗肽制备树脂，进入AA循环，采用固相合成法，按序逐一合成，得到33个氨基酸的线性粗肽；
（B）将步骤（A）所得的线性粗肽，先用双氧水氧化形成6和12位间的第一对二硫键，然后利用碘剂直接形成7和14位间的第二对二硫键，得环化的orexin多肽溶液；
（C） 将步骤（B）所得的环化的orexin粗肽溶液经分离性HPLC纯化、转盐及冷冻干燥后得到orexin多肽，利用Kaiser检测法和HPLC-MS法，完成上述合成步骤中所得产物的结构和纯度测定。
5.权利要求1至4任意之一所述合成方法得到的orexin多肽在制备促进全身麻醉觉醒药物或促进全麻觉醒药物的前体化合物中的应用。
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