CN112759628A - 一种布美诺肽的合成方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种固相合成布美诺肽的方法，属于多肽合成领域。本发明方法包括如下步骤：选用Wang Resin从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护布美诺肽；采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys和Asp的侧链保护基；在偶联剂存在条件下进行树脂上环化；在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到布美诺肽粗肽。本发明技术方案与现有技术相比，避免了液相方式成环时所发生的分子间偶联，最终目标肽纯度达到90％以上，纯化总收率达到55％以上，精肽纯度达到99％以上。
Description
技术领域
本发明涉及多肽药物合成领域，涉及一种固相合成布美诺肽的方法。
背景技术
布美诺肽，英文名：bremelanotide。肽序列为：
AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH
布美诺肽，又称布雷默浪丹，PT 141，是一种黑素皮质素受体-4(MC4r)激动剂，通过激活大脑中的内源性途径来调节性欲和性反应，帮助伴有低活跃性性欲障碍况的绝经前女性保持正常性欲，该多肽为美国Palatin Technologies制药公司研发的一种治疗女性性功能障碍的新药，目前已完成临床III期研究，已于2019年6月21日获FDA批准上市。布美诺肽相比氟班色林有很大优势，不需要禁酒，没有低血压、眩晕等不良反应，仅有轻微恶心反应，起效迅速，3分钟起效，疗效持续8个小时，目前中国也未批准任何治疗HSDD的药物上市，因此布美诺肽有着广阔的市场前景。
目前，布美诺肽的合成方法主要为固相合成法。公开专利文献CN200610086841.4采用逐步合成的方法， 肽树脂合成结束后， 选择性脱除Asp及Lys的保护基， 之后在树脂上成环，最后以HF裂解，因为HF的剧烈腐蚀性而导致该方法无法大规模使用，其实施例公布的精肽收率为30～35％；公开专利文献CN200710048824.6同样采用选择性脱保护的方法，但其所选择的的脱保护方法在脱除Asp及Lys侧链保护基的同时也会脱除His的保护基，其实施例公布的粗肽收率为80％；公开专利文献CN200910131598.7布雷默浪丹的固相合成方法中将对羟基苯甲酸连接在 RinkAmide Resin之后，采用普通氨基酸原料逐步合成，合成结束后以TFA裂解， 在液相条件下成环，但是该方法在进行液相成环时容易发生分子间偶联，产生二聚体，三聚体等多聚物，严重降低合成收率。
发明内容
本发明为了解决现有固液合成过程中所存在的杂质多，纯度和收率低，操作步骤繁琐，废液过量，不利于工业化生产的技术问题，提供一种新的固相合成布美诺肽的方法。
本发明的目的是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种布美诺肽的固相合成方法，包括如下步骤：
（1）选用Wang Resin从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护布美诺肽；
（2）采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys和Asp的侧链保护基；
（3）在偶联剂存在条件下进行树脂上环化；
（4）在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到布美诺肽粗肽。
本发明所述的布美诺肽的固相合成方法，其进一步优选的技术方案是：
(a)选用Wang Resin作为固相载体，依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下， 依次偶联Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-D-Phe-OH，Fmoc-His(Boc)-OH， Fmoc-Asp(Oall)OH， Fmoc-Nle-OH， 偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/N-甲基吗啉进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(Oall)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Alloc)-Wang Resin；
(b)采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys侧链保护基Alloc，Asp侧链保护基Oall，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-Wang Resin；
(c)在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得： AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg (pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle- Wang Resin；
(d)在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得： AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH；以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH溶解， 溶液调酸后得布美诺肽粗肽；布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：本发明方法避免了液相方式成环时所发生的分子间偶联，最终目标肽纯度达到 90％以上，纯化总收率达到 55％以上，精肽纯度达到 99％以上。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种布美诺肽的固相合成方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种布美诺肽的固相合成方法进行详细说明。
实施例1：一种布美诺肽的固相合成方法，该方法包括如下步骤：
（1）选用Wang Resin从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护布美诺肽；
（2）采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys和Asp的侧链保护基；
（3）在偶联剂存在条件下进行树脂上环化；
（4）在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到布美诺肽粗肽。
实施例2，的一种布美诺肽的固相合成方法：
步骤（1）选用Wang Resin作为固相载体，依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-D-Phe-OH， Fmoc-His(Boc)-OH， Fmoc-Asp(Oall)OH， Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/N-甲基吗啉进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(Oall)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Alloc)-Wang Resin。
步骤（2）：采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys侧链保护基Alloc，Asp侧链保护基Oall，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-Wang Resin。
步骤（3）：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得： AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg (pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle- Wang Resin。
步骤（4）：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得： AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH；以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH溶解， 溶液调酸后得布美诺肽粗肽； 布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
实施例3，一种布美诺肽的固相合成方法实验：
布美诺肽肽树脂的制备
称取称取Wang树脂20.00g(Sub=0.50mmol/g)加入到固相反应器中，加入200mLDCM溶胀树脂0.5h。抽干溶剂，加入Fmoc-Lys(Alloc)-OH 13.59g，HOBT4.45g，DIC 5.1mL，50mLDMF溶液，冰浴活化10分钟，活化温度不超过10摄氏度，活化液加入反应器后加入0.366g的DMAP，搅拌反应5h。（取小样收样，经紫外分光光度法测定Fmoc-Lys(Alloc)-Wang树脂的Sub=0.418mmol/g。）抽干，加入DMF 250mL洗涤3次，加入N-甲基吗啉/乙酸酐溶液（1：1）300mL，封闭0.5h。加入DMF 250mL洗涤6次。加入200mL v/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应30min。抽干，加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。称取Fmoc -Trp(Boc)-OH15.81g，HOBt 4.45g，DIC5.1mL，加入DMF80mL溶解，冰浴活化10min。将活化后的溶液加入到反应器中，反应至茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。重复以上步骤，按照氨基酸序列Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-D-Phe-OH， Fmoc-His(Boc)-OH， Fmoc-Asp(Oall)OH， Fmoc-Nle-OH进行偶联反应。再次加入200mL v/v 20%哌啶/DMF溶液脱保护，反应30min。抽干，加入DMF 250mL洗涤6次。茚检结果呈阳性。加入9.45ml醋酸酐和10.98ml N-甲基吗啉进行乙酰化反应30min，茚检检测结果呈阴性后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。
将5.78 g四(三苯基膦)钯，5.89 g二甲胺基甲硼烷和80 ml DMF加入到固相反应器中反应1 h后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。再将1.35g HOBT，5.20 g PyBop，3.49ml DIEA和80 ml DMF加入到固相反应器中反应2 h后，抽干。加入DMF洗涤3次，每次200mL。
偶联结束后，DCM与甲醇交替洗涤3次，每次400mL，真空干燥，得到布美诺肽肽树脂。
裂解：配制200mL裂解试剂为TFA:TA EDT:苯甲醚 = 90:5:3:2，冰浴条件下加入肽树脂，0.5h后恢复至室温继续反应2h，反应结束后，加入无水乙醚沉淀。离心沉淀4次，每次加入乙醚500mL。干燥后所得产品即为布美诺肽粗肽，将粗肽送至纯化，经纯化，冻干，得布美诺肽精肽。粗肽得到10.98g，粗肽经对照品定量为8.5g，总收率58%，纯度99.0% 。
Claims (5)
1.一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于：该方法包括如下步骤：
选用Wang Resin从碳端到氮端依次按照顺序偶联所有氨基酸，固相合成全保护布美诺肽；
采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys和Asp的侧链保护基；
在偶联剂存在条件下进行树脂上环化；
在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护得到布美诺肽粗肽。
2.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于：步骤（1）的具体方法是：选用Wang Resin作为固相载体，依照布美诺肽序列，在偶联剂存在条件下，依次偶联Fmoc-Lys(Alloc)-OH，Fmoc-Trp(Boc)-OH，Fmoc-Arg(pbf)-OH， Fmoc-D-Phe-OH， Fmoc-His(Boc)-OH， Fmoc-Asp(Oall)OH， Fmoc-Nle-OH，偶联完成后脱除Fmoc保护基，以乙酸酐/N-甲基吗啉进行乙酰化，得AC-Nle-Asp(Oall)-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys(Alloc)-Wang Resin。
3.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于：步骤（2）的具体方法是：采用四(三苯基膦)钯作为催化剂，选择性脱除Lys侧链保护基Alloc，Asp侧链保护基Oall，得AC-Nle-Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys-Wang Resin。
4.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于：步骤（3）的具体方法是：在偶联剂存在条件下进行树脂上环化，得： AC-Nle-[Asp-His(Boc)-D-Phe-Arg(pbf)-Trp(Boc)-Lys]cycle- Wang Resin。
5.根据权利要求1所述的一种布美诺肽的固相合成方法，其特征在于：步骤（4）的具体方法是：在裂解剂存在条件下，将肽树脂裂解及侧链脱保护，得： AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH；以乙腈/水将AC-Nle-[Asp-His-D-PheArg-Trp-Lys]cycle-OH溶解， 溶液调酸后得布美诺肽粗肽； 布美诺肽粗肽经过纯化，冻干，得布美诺肽精肽。
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