CN102558338B - 一种合成利西拉来的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及固相合成多肽领域，特别涉及一种合成利西拉来的方法。该方法采用氨基树脂作为固相载体，首先在该树脂上偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH之后，采用Fmoc保护策略的固相接肽法进行后续氨基酸的逐步偶联，得到全保护的肽树脂，用裂解液进行切割，乙醚沉降、离心干燥后得到利西拉来粗品，再经过反相高效液相色谱法纯化、转盐，得到利西拉来。该方法操作简单，产品纯度高、收率好，达到产业化要求。
Description
技术领域
本发明涉及固相合成多肽领域，特别涉及一种合成利西拉来的方法。
背景技术
利西拉来是一种含44个氨基酸残基的线性多肽，它的分子式是：C215H347N61O65S，分子量：4858.55，CAS号为：320367-13-3。利西拉来的结构是基于exendin-4分子碳末端进行修饰，依次连接六个赖氨酸残基，氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。
利西拉来是一种用于治疗2型糖尿病治疗的多肽药物，目前在进行临床III期研究阶段，是由安托万-赛诺菲与Zealand制药研发的胰高血糖素样肽1(GLP-1)受体激动剂，利西拉来(lixisenatide)联合基础胰岛素治疗2型糖尿病患者，显著改善了血糖控制，降低糖化血红蛋白(HbAlc)水平，也无与利西拉来有关的特异性安全事件报道。
目前国外多采用基因重组制备利西拉来，但是特定的菌种不易得到，人力物力消耗较大，纯化困难，产品纯度较低，不适用于工业化大生产。因此，提供一种操作简便、环保、纯化方便、纯度较高的利西拉来合成方法，具有重要有意义。
发明内容
有鉴于此，本发明提供一种合成利西拉来的方法。该方法采用氨基树脂作为固相载体，首先在该树脂上偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH之后，采用Fmoc保护策略的固相接肽法进行后续氨基酸的逐步偶联，得到全保护的肽树脂，用裂解液进行切割，乙醚沉降、离心干燥后得到利西拉来粗品，再经过反相高效液相色谱法纯化、转盐，得到利西拉来。该方法操作简单，产品纯度高、收率好，达到产业化要求。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种合成利西拉来的方法，包括如下步骤：
步骤1：取Fmoc保护的氨基树脂与脱保护剂混合，脱保护后，获得氨基树脂；
步骤2：取侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH与氨基树脂通过偶联剂进行缩合，获得侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-氨基树脂；
步骤3：按照Fmoc固相合成法重复步骤1中脱保护与步骤2中氨基酸与树脂偶联的操作，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得肽树脂；所述氨基酸的α-氨基的保护基团为Fmoc；
步骤4：取所述肽树脂经裂解液裂解，脱除保护基团，经乙醚沉降、离心、干燥后获得利西拉来粗品，再经纯化、转盐后，即得；
所述具有保护基团的氨基酸中，赖氨酸的侧链保护基团为Boc，丝氨酸的侧链保护基团为tBu，天冬酰胺的侧链保护基团为Trt，色氨酸的侧链保护基团为Boc，谷氨酸的侧链保护基团为OtBu，精氨酸的侧链保护基团为Pbf，谷氨酰胺的侧链保护基团为Trt，天冬氨酸的侧链保护基团为OtBu，苏氨酸的侧链保护基团为tBu，组氨酸的侧链保护基团为Trt。
所述具有保护基团的氨基酸依次为侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Ala-OH、Fmoc-Gly-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Ser-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Pro-OH、Fmoc-Gly-OH、Fmoc-Gly-OH、侧链保护基团为Trt的Fmoc-Asn-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、Fmoc-Leu-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Trp-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Ile-OH、Fmoc-Phe-OH、Fmoc-Leu-OH、侧链保护基团为Pbf的Fmoc-Arg-OH、Fmoc-Val-OH、Fmoc-Ala-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Glu-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Glu-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Met-OH、侧链保护基团为Trt的Fmoc-Gln-OH、侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Leu-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Asp-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Ser-OH、Fmoc-Phe-OH、侧链保护基团为tBu的Fmoc-Thr-OH、侧链保护基团为OtBu的Fmoc-Glu-OH、Fmoc-Gly-OH、侧链保护基团为Trt的Fmoc-His-OH。
在本发明提供的一些实施例中，纯化为，取利西拉来粗品溶于水获得粗肽溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为6.5～7.0的磷酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度按照B％：12％～32％，将粗肽溶液进行梯度洗脱。
作为优选，A相的磷酸盐缓冲溶液浓度为20～50mmol/L。
用于溶解粗肽的水优选符合注射用水标准，更优选超纯水。乙腈的纯度级别优选色谱纯。
纯化时，可以选择以下规格色谱柱(柱子直径×长度)：50mm×250mm、150mm×250mm、300mm×250mm。
在本发明提供的一些实施例中，转盐为，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，以质量浓度0.1％～0.2％醋酸水溶液为A相；乙腈为B相，梯度按照B％：5％～35％，进行梯度洗脱。
A相醋酸水溶液的浓度优选0.2％。乙腈的纯度级别优选色谱纯。
转盐时，可以选择以下规格色谱柱(柱子直径×长度)：50mm×250mm、150mm×250mm、300mm×250mm。
在本发明提供的一些实施例中，脱保护剂为20％哌啶/二甲基甲酰胺溶液。
在本发明提供的一些实施例中，偶联剂为DIC、EDC、HONb、HOBt、HOAt、HATU、HBTU、TBTU、DIPEA、TMP、PYBOP或PYAOP中的一种或两者以上的混合物。
在本发明提供的一些实施例中，裂解液为三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚和苯酚的混合溶液。
作为优选，裂解液中三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚和苯酚的体积比为90～95∶1～4∶1～2∶1～2∶1～2。
作为优选，Fmoc保护的氨基树脂选自Rink Amide Resin，RinkAmide-BHA Resin，Rink Amide-MBHA Resin，Rink Amide-AM Resin，SieberResin，Sieber-AM Resin。
在本发明提供的一些实施例中，所述Fmoc保护的氨基树脂替代度为0.1～0.5mmol/g。
脱保护或缩合均经过Ninhydrin检测法检测。
本发明中所使用的名称缩写的全称如下：
Fmoc 9-芴甲氧羰基
Boc 叔丁氧羰基
tBu 叔丁基
DIC 二异丙基碳二亚胺
EDC 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐
HATU 2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸酯
HOBt 1-羟基苯并三唑
TBTU 苯并三唑四甲基脲四氟硼酸
DIPEA 二异丙基乙基胺
HOAt N-羟基-7-偶氮苯并三氮唑
TMP 2，4，6-三甲基吡啶
TFA 三氟乙酸
HBTU 苯并三氮唑-N，N，N′，N′-四甲基脲六氟磷酸盐
HONb N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺
PYBOP 六氟磷酸苯并三唑-1-基-氧基三吡咯烷基磷
PYAOP (3H-1，2，3-三唑并[4，5-b]吡啶-3-氧基)三-1-吡咯烷基鏻
六氟磷酸盐
Trt 三苯甲基
Pbf 2，2，4，6，7-五甲基二氢苯并呋喃-5-磺酰基
本发明提供一种合成利西拉来的方法。该方法采用氨基树脂作为固相载体，首先在该树脂上偶联Fmoc-Lys(Boc)-OH之后，采用Fmoc保护策略的固相接肽法进行后续氨基酸的逐步偶联，得到全保护的肽树脂，用裂解液进行切割，乙醚沉降、离心干燥后得到利西拉来粗品，再经过反相高效液相色谱法纯化、转盐，得到利西拉来。该方法操作简单，产品纯度高、收率好，达到产业化要求。
具体实施方式
本发明公开了一种合成利西拉来的方法，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
本发明提供的一种合成利西拉来的方法中所用原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例，进一步阐述本发明：
实施例1
制备Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide Resin：
称取替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Rink Amide Resin 10g，投入至固相反应柱，DMF洗涤树脂两次(100ml+50ml)，DMF 50ml浸泡树脂45分钟，使树脂充分溶胀，加入20％的哌啶/DMF溶液40ml，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt1.01g、DIC 1.39ml，用40ml DMF溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时。Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂三次(50m×6)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶DIC的摩尔比例是1∶1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOAt 1.02g、HATU 2.85g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOAt∶HATU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml*6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、TMP1.98ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶TMP的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的3倍。
制备侧链全保护的利西拉来-Rink Amide Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、DIC 1.39ml，加入50ml DMF溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶DIC的比例是1∶1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的3倍。之后重复以上偶联步骤，依次完成第39位赖氨酸到第一位组氨酸的保护氨基酸的连接，之后加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)，DCM洗涤树脂6次(50ml×6)，MeOH收缩树脂三次，每次用MeOH 50ml，每次收缩5min。树脂经过真空干燥得到侧链全保护的利西拉来肽树脂27.5g，树脂增重17.5g。
制备利西拉来粗肽：
称取侧链全保护的利西拉来-Rink Amide Resin 27.5克，投入圆底烧瓶中。配置裂解液275毫升，其中三氟乙酸∶苯甲硫醚∶乙二硫醇∶苯甲醚、苯酚＝90∶1∶2∶1∶1.5(体积比)。裂解液在冰箱中预冻1小时之后投入至之前盛有利西拉来-Rink Amide Resin的圆底烧瓶中，室温搅拌反应2小时。反应液过滤，用20ml TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢倒入体积为2750毫升的冰冻乙醚中(乙醚提前冰冻)，此时出现白色沉淀，3000转/分离心5分钟，得到的固体乙醚洗涤两次，之后将固体真空干燥得到利西拉来三氟乙酸盐粗肽15.3g。
制备利西拉来精肽：
样品处理：粗肽用水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
纯化：纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：物质量浓度为50mmol/L磷酸溶液用三乙胺调pH至6.7；B相：乙腈，流速80ml/min，梯度：B％：12％～32％，检测波长：280nm。进样量为2.0g。纯化过程：将色谱柱用60％乙腈-水冲洗干净后平衡上样，上样量为2.0g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液于水温不超过40℃条件下减压旋蒸浓缩至约120mg/ml后备用。
转盐：转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：50mm×250mm。流动相：A相：质量浓度0.1％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈，流速80ml/min，检测波长280nm，梯度：B％：5％～35％。进样量为2.0g。转盐过程：将色谱柱用65％的乙腈-水冲洗干净后上样，上样量为200ml样品溶液。线性梯度洗脱45min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液合并旋蒸浓缩至约80mg/ml后转至合适大小西林瓶，然后进行冷冻干燥，即可得到纯度大于99.5％的利西拉来。
实施例2
制备Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin：
称取替代度为0.15mmol/g的Fmoc-Rink Amide-BHA Resin 20g，投入至固相反应柱，DMF洗涤树脂两次(180ml+100ml)，然后用DMF浸泡60分钟，使树脂充分溶胀，加入20％的哌啶/DMF溶液80ml，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(100ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 7.03g，DIC 2.78ml，用80mlDMF溶解，Fmoc-Lys(Boc)-OH、DIC溶液倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂三次(100m×6)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-BHAResin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶DIC的摩尔比例是1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide Resin摩尔数的5倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOAt 1.02g、HATU 2.85g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOAt∶HATU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-BHA Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-BHA Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHAResin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml*6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、TMP1.98ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶TMP的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-BHA Resin摩尔数的3倍。
制备侧链全保护的利西拉来-Rink Amide-BHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHAResin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、DIC 1.39ml，加入50ml DMF溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-BHAResin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶DIC的比例是1∶1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-BHA Resin摩尔数的3倍。之后重复以上偶联步骤，依次完成第39位赖氨酸到第一位组氨酸的保护氨基酸的连接，之后加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)，DCM洗涤树脂6次(50ml×6)，MeOH收缩树脂三次，每次用MeOH 50ml，每次收缩5min。树脂经过真空干燥得到侧链全保护的利西拉来肽树脂27.5g，树脂增重17.5g。
制备利西拉来粗肽：
称取侧链全保护的利西拉来-Rink Amide-BHA Resin 27.5克，投入圆底烧瓶中。配置裂解液275毫升，其中三氟乙酸∶苯甲硫醚∶乙二硫醇∶苯甲醚、苯酚＝95∶2∶1.5∶2∶1(体积比)。裂解液在冰箱中预冻1小时之后投入至之前盛有利西拉来-Rink Amide-BHA Resin的圆底烧瓶中，室温搅拌反应2小时。反应液过滤，用20ml TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢倒入体积为2750毫升的冰冻乙醚中(乙醚提前冰冻)，此时出现白色沉淀，3000转/分离心5分钟，得到的固体乙醚洗涤两次，之后将固体真空干燥得到利西拉来三氟乙酸盐粗肽15.3g。
规模化制备利西拉来精肽：
样品处理：粗肽用水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150mm×250mm。流动相：A相：20mmol/L磷酸溶液用三乙胺调pH至6.7；B相：乙腈，流速：550ml/min，梯度：B％：12％～32％，检测波长：280nm。进样量为20g。纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为20g。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液于水温不超过40℃条件下减压旋蒸浓缩至约80mg/ml后备用。
转盐：转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：150mm×250mm。流动相：A相：质量浓度0.2％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈，流速：550ml/min，检测波长：280nm，梯度：B％：5％～35％。进样量为16g。转盐过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1600ml样品溶液。线性梯度洗脱60min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液合并旋蒸浓缩至约80mg/ml后转至合适大小西林瓶，然后进行冷冻干燥，即可得到纯度大于99.5％的利西拉来。
实施例3
制备Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin：
称取替代度为0.25mmol/g的Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin 10g，投入至固相反应柱，DMF洗涤树脂两次(100ml+50ml)，DMF 50ml浸泡树脂45分钟，使树脂充分溶胀，加入20％的哌啶/DMF溶液40ml，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、DIC 1.39ml，用40ml DMF溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时。Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂三次(50m×6)，得到Fmoc-Lys(Boc)-RinkAmide-MBHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶DIC的摩尔比例是1∶1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-RinkAmide-MBHA Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOAt 1.02g、HATU 2.85g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOAt∶HATU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、DIPEA2.62ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶DIPEA的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin摩尔数的3倍。
制备Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHAResin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml*6)。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、HBTU 2.84g、TMP 1.98ml，加入DMF 50ml溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHA Resin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶HBTU∶TMP的比例是1∶1∶1∶2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin摩尔数的3倍。
制备侧链全保护的利西拉来-Rink Amide-MBHA Resin：
向得到的Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-RinkAmide-MBHA Resin中加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，用DMF洗涤6次。称取Fmoc-Lys(Boc)-OH 3.52g、HOBt 1.01g、DIC1.39ml，加入50ml DMF溶解，冰浴下缓慢搅拌3分钟，倒入固相反应柱中与树脂混合，室温反应2小时，Ninhydrin法检测反应完成，抽掉反应液，DMF洗涤树脂两次(50ml×2)，DCM洗涤树脂两次(50ml×2)，得到Fmoc-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Lys(Boc)-Rink Amide-MBHAResin。以上操作中所用到的Fmoc-Lys(Boc)-OH∶HOBt∶DIC的比例是1∶1∶1.2，其中Fmoc-Lys(Boc)-OH摩尔数是Fmoc-Rink Amide-MBHA Resin摩尔数的3倍。之后重复以上偶联步骤，依次完成第39位赖氨酸到第一位组氨酸的保护氨基酸的连接，之后加入20％的哌啶/DMF溶液，反应10分钟，抽干反应液，DMF洗涤树脂6次(50ml×6)，DCM洗涤树脂6次(50ml×6)，MeOH收缩树脂三次，每次用MeOH 50ml，每次收缩5min。树脂经过真空干燥得到侧链全保护的利西拉来肽树脂27.5g，树脂增重17.5g。
制备利西拉来粗肽：
称取侧链全保护的利西拉来-Rink Amide-MBHA Resin 27.5克，投入圆底烧瓶中。配置裂解液275毫升，其中三氟乙酸∶苯甲硫醚∶乙二硫醇∶苯甲醚、苯酚＝93∶4∶1∶1.5∶2(体积比)。裂解液在冰箱中预冻1小时之后投入至之前盛有利西拉来-Rink Amide-MBHA Resin的圆底烧瓶中，室温搅拌反应2小时。反应液过滤，用20ml TFA洗涤树脂，合并滤液。
将滤液缓慢倒入体积为2750毫升的冰冻乙醚中(乙醚提前冰冻)，此时出现白色沉淀，3000转/分离心5分钟，得到的固体乙醚洗涤两次，之后将固体真空干燥得到利西拉来三氟乙酸盐粗肽15.3g。
大规模制备利西拉来精肽：
样品处理：粗肽用水溶解，使样品完全溶解后用滤膜过滤，收集滤液备用。
纯化条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：300mm×250mm。流动相：A相：35mmol/L磷酸溶液用三乙胺调pH至6.7；B相：乙腈，流速：2200ml/min，梯度：B％：12％～32％，检测波长：280nm。进样量为75g。纯化过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后平衡上样，上样量为75g。线性梯度洗脱120min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液于水温不超过40℃条件下减压旋蒸浓缩至约80mg/ml后备用。
转盐：转盐条件：色谱柱：以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相的色谱柱，柱子直径和长度为：300mm×250mm。流动相：A相：质量浓度0.2％醋酸水溶液；B相：色谱纯乙腈，流速：2200ml/min，检测波长：280nm。梯度：B％：6％～36％。进样量为48-60g。转盐过程：将色谱柱用50％以上的乙腈冲洗干净后上样，上样量为1600ml样品溶液。线性梯度洗脱90min，收集目的峰，将收集的利西拉来溶液合并旋蒸浓缩至约80ml/g后转至合适大小西林瓶，然后进行冷冻干燥，即可得到纯度大于99.5％的的利西拉来。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (8)
1.一种合成利西拉来的方法，其特征在于，包括如下步骤：
步骤1：取Fmoc保护的氨基树脂与脱保护剂混合，脱保护后，获得氨基树脂；
步骤2：取侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-OH与氨基树脂通过偶联剂进行缩合，获得侧链保护基团为Boc的Fmoc-Lys-氨基树脂；
步骤3：按照Fmoc固相合成法重复步骤1中脱保护与步骤2中氨基酸与树脂偶联的操作，将具有侧链保护基团的氨基酸从肽链碳端到氮端依次偶联，获得肽树脂；所述氨基酸的α-氨基的保护基团为Fmoc；
步骤4：取所述肽树脂经裂解液裂解，脱除保护基团，经乙醚沉降、离心、干燥后获得利西拉来粗品，再经纯化、转盐后，即得；
所述Fmoc保护的氨基树脂选自Rink Amide Resin，Rink Amide-BHAResin，Rink Amide-MBHA Resin；
所述具有保护基团的氨基酸中，赖氨酸的侧链保护基团为Boc，丝氨酸的侧链保护基团为tBu，天冬酰胺的侧链保护基团为Trt，色氨酸的侧链保护基团为Boc，谷氨酸的侧链保护基团为OtBu，精氨酸的侧链保护基团为Pbf，谷氨酰胺的侧链保护基团为Trt，天冬氨酸的侧链保护基团为OtBu，苏氨酸的侧链保护基团为tBu，组氨酸的侧链保护基团为Trt；
所述偶联剂为DIC、HOAt、HATU、HBTU或TMP中的一种或两者以上的混合物。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述纯化为，取利西拉来粗品溶于水获得粗肽溶液，以十八烷基硅烷键合硅胶为固定相，以pH值为6.5～7.0的磷酸盐缓冲溶液为A相，乙腈为B相，梯度按照B%：12%～32%，将粗肽溶液进行梯度洗脱。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述转盐为，固定相为十八烷基硅烷键合硅胶，以质量浓度0.1%～0.2%醋酸水溶液为A相；乙腈为B相，梯度按照B%：5%～35%，进行梯度洗脱。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱保护剂为20%哌啶/二甲基甲酰胺溶液。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液为三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚和苯酚的混合溶液。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述裂解液中三氟乙酸、苯甲硫醚、1，2-乙二硫醇、苯甲醚和苯酚的体积比为90～95:1～4:1～2:1～2:1～2。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Fmoc保护的氨基树脂替代度为0.1～0.5mmol/g。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述脱保护或所述缩合均经过Ninhydrin检测法检测。
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