CN112552376A - 一种纯化维拉卡肽的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种固相合成维拉卡肽的纯化方法，多肽药物制备技术领域。该方法先将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中；粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液、饱和氯化钠溶液析出，所得固体用水溶解后过滤，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度洗脱得到纯度大于99.00％的样品；样品用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％‑5％，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先梯度平衡，再梯度洗脱得到转盐样品；转盐样品减压浓缩，冷冻干燥得到维拉卡肽终产品。本发明方法大大提高了处理量，缩短了生产周期，适合工业化大规模生产，提高了产率，降低了生产成本。

Description

一种纯化维拉卡肽的方法
技术领域
本发明涉及多肽药物制备技术领域，特别涉及一种纯化维拉卡肽的方法。
背景技术
继发性甲状旁腺功能亢进(SHPT，简称继发性甲旁亢)，是指在慢性肾功能不全、肠吸收不良综合征、Fanconi综合征和肾小管酸中毒、维生素D缺乏或抵抗以及妊娠、哺乳等情况下，甲状旁腺长期受到低血钙、低血镁或高血磷的刺激而分泌过量的甲状旁腺激素(PTH)，以提高血钙、血镁和降低血磷的一种慢性代偿性临床表现，长期的甲状旁腺增生最终导致形成功能自主的腺瘤。
维拉卡肽是由KaiPharmaceuticals,Inc.开发的一种新颖的拟钙剂(calcimimeticagent)，能够抑制甲状旁腺激素的分泌。维拉卡肽可结合并激活甲状旁腺上的钙敏感受体，实现甲状旁腺激素水平的降低。维拉卡肽可以再进行血液透析的同事通过静脉给药，这对于每天都需要使用大量药物的慢性肾病患者来说是一个福音。因此，velcalcetide很有可能超过Sensipar。分析师预期维拉卡肽的年销售峰值出现在2023年，为10亿美元。所以，对维拉卡肽的纯化方法的研究具有重要的意义。
发明内容
本发明的目的在于解决现有技术一次性处理量较少、步骤繁琐、损耗过大且得到维拉卡肽纯度较低收率较低的技术问题，提供一种新的适用于维拉卡肽的纯化方法。
本发明的技术方案如下：一种纯化维拉卡肽的方法，包括以下步骤：
(1)将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中，得粗液；
(2)取粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液，样品在溶液中析出，再加入等体积的饱和氯化钠溶液促进样品析出，过滤得固体；
(3)将滤出的固体用水溶解，过滤，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度为20％-30％，检测波长为220nm进行HPLC线性洗脱，得到纯度大于99.00％，单杂小于0.1％的样品；
(4)所得样品，用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％-5％，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先以5％-5％的梯度平衡，后再以50％-50％的梯度洗脱得到转盐样品；
(5)将转盐后的样品进行减压浓缩，冷冻，极限真空干燥，得到维拉卡肽终产品。
以上所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其进一步优选的技术方案是：
(1)将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中，得粗液；
(2)取粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液，样品在溶液中析出，再加入等体积的饱和氯化钠溶液促进样品析出，过滤，保留固体；
(3)将滤出的固体用水溶解，经0.45um水系膜过滤后，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度为20％-30％，时间为60min，检测波长为220nm进行HPLC线性洗脱，得到纯度大于99.00％，单杂小于0.1％的样品；
(4)所得样品，用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％-5％，时间为15min，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先以5％-5％的梯度平衡15min，后再以50％-50％的梯度洗脱30分钟得到转盐样品；
(5)将转盐后的样品进行减压浓缩，冷冻，极限真空干燥，得到维拉卡肽终产品。
以上所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其进一步优选的技术方案是：步骤(1)中，维拉卡肽粗样溶于水中至溶解浓度50g/L。
步骤(3)中的洗脱梯度为：
Figure BDA0002880612720000031
步骤(4)中的洗脱梯度为：
Figure BDA0002880612720000032
Figure BDA0002880612720000041
步骤(5)中，将转盐样品在35±2℃下减压浓缩，浓度为30g/L，用0.22um有机系滤膜过滤，分装至冻干盘中，高度1.0-1.2cm，进行冷冻干燥。
步骤(5)中，所述的冻干操作步骤如下：
Figure BDA0002880612720000042
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明方法利用样品溶解性对粗肽进行预处理，以C18填料为固定相，加上酸性的体积百分浓度为0.2％的盐酸水体系进行一步纯化即可得到纯度大于99.00％的样品，且纯化步骤少，减少了样品的损失，最终纯化收率可达到80％以上。
具体实施方式
本发明实施例公开了一种纯化维拉卡肽的方法。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的产品及方法已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的产品及方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明提供的一种纯化维拉卡肽的方法进行详细说明。
实施例一，一种纯化维拉卡肽的方法，步骤如下：
(1)将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中，得粗液。分析结构式可得本品属于碱性肽，易溶于酸性溶液，由于裂解时用到了三氟乙酸，故粗肽中含有三氟乙酸，将其溶于水中，粗肽溶液则直接呈酸性，故本品可直接溶于水；
(2)取粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液，此时粗肽溶液极性减小，样品会在溶液中析出，再加入等体积的饱和氯化钠溶液促进样品析出，然后用滤纸过滤，保留固体。
(3)将滤出的固体用水溶解，经0.45um水系膜过滤后，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度为20％-30％，时间为60min，检测波长为220nm进行HPLC线性洗脱，即可得到纯度大于99.00％，单杂小于0.1％的样品。
(4)将上述所得合格样品，用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％-5％，时间为15min，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先以5％-5％的梯度平衡15min，后再以50％-50％的梯度洗脱30分钟得到转盐样品。
(5)将转盐后的样品进行减压浓缩，浓缩浓度至30g/L，预冻4h，再放入冻干机极限真空干燥，最终得到高纯度高质量的维拉卡肽。
实施例二：
1、样品溶解：将固相合成的粗肽用研钵碾碎后溶于水中，溶解浓度50g/L；
2、样品预处理：向粗肽溶液中加入等体积的乙腈，搅拌均匀后再加入等体积的饱和氯化钠溶液，用滤纸过滤后保留滤渣，将滤渣再溶于水，待完全溶解后再用0.45um水系滤膜过滤，收集滤液备用；
3、纯化：将处理好的粗肽溶液用高效液相色谱进行一步纯化，色谱条件如下：
流动相A：0.2％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 5×25cm
检测波长：220nm
流速：50ml/min
上样量：不大于3g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000061
Figure BDA0002880612720000071
收集纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，置于收集瓶中备用；
4、转盐：将合格后的样品转为盐酸盐
流动相A1：50mmol/L氯化铵溶液
A2：0.1％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 5×25cm
检测波长：220nm
流速：50ml/min
上样量：不大于5g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000072
Figure BDA0002880612720000081
收集目的样品于收集瓶中备用；
5、冻干
将转盐样品在35±2℃下减压浓缩，浓度约为30g/L，用0.22um有机系滤膜过滤，分装至冻干盘中，高度1.0-1.2cm，冻干曲线如下：
Figure BDA0002880612720000082
最终得到纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，收率达到80.5％。
实施例三：
1、样品溶解：将固相合成的粗肽用研钵碾碎后溶于水中，溶解浓度50g/L；
2、样品预处理：向粗肽溶液中加入等体积的乙腈，搅拌均匀后再加入等体积的饱和氯化钠溶液，用滤纸过滤后保留滤渣，将滤渣再溶于水，待完全溶解后再用0.45um水系滤膜过滤，收集滤液备用；
3、纯化：将处理好的粗肽溶液用高效液相色谱进行一步纯化，色谱条件如下：
流动相A：0.2％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 10×25cm
检测波长：220nm
流速：50ml/min
上样量：不大于12g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000091
收集纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，置于收集瓶中备用；
4、转盐：将合格后的样品转为盐酸盐
流动相A1：50mmol/L氯化铵溶液
A2：0.1％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 10×25cm
检测波长：220nm
流速：200ml/min
上样量：不大于20g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000101
收集目的样品于收集瓶中备用；
5、冻干
将转盐样品在35±2℃下减压浓缩，浓度约为30g/L，用0.22um有机系滤膜过滤，分装至冻干盘中，高度1.0-1.2cm，冻干曲线如下：
Figure BDA0002880612720000102
最终得到纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，收率达到83.4％。
实施例四：
1、样品溶解：将固相合成的粗肽用研钵碾碎后溶于水中，溶解浓度50g/L；
2、样品预处理：向粗肽溶液中加入等体积的乙腈，搅拌均匀后再加入等体积的饱和氯化钠溶液，用滤纸过滤后保留滤渣，将滤渣再溶于水，待完全溶解后再用0.45um水系滤膜过滤，收集滤液备用；
3、纯化：将处理好的粗肽溶液用高效液相色谱进行一步纯化，色谱条件如下：
流动相A：0.2％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 15×25cm
检测波长：220nm
流速：400ml/min
上样量：不大于27g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000111
收集纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，置于收集瓶中备用；
4、转盐：将合格后的样品转为盐酸盐
流动相A1：50mmol/L氯化铵溶液
A2：0.1％盐酸水溶液
B：乙腈
色谱柱：纳微 C18 10-200 15×25cm
检测波长：220nm
流速：400ml/min
上样量：不大于45g每针(以目的肽计算)
洗脱梯度：
Figure BDA0002880612720000121
收集目的样品于收集瓶中备用；
5、冻干
将转盐样品在35±2℃下减压浓缩，浓度约为30g/L，用0.22um有机系滤膜过滤，分装至冻干盘中，高度1.0-1.2cm，冻干曲线如下：
Figure BDA0002880612720000122
Figure BDA0002880612720000131
最终得到纯度大于99％，单杂小于0.1％的样品，收率达到85.7％。

Claims (7)

1.一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中，得粗液；
(2)取粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液，样品在溶液中析出，再加入等体积的饱和氯化钠溶液促进样品析出，过滤得固体；
(3)将滤出的固体用水溶解，过滤，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度为20％-30％，检测波长为220nm进行HPLC线性洗脱，得到纯度大于99.00％，单杂小于0.1％的样品；
(4)所得样品，用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％-5％，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先以5％-5％的梯度平衡，后再以50％-50％的梯度洗脱得到转盐样品；
(5)将转盐后的样品进行减压浓缩，冷冻，极限真空干燥，得到维拉卡肽终产品。
2.根据权利要求1所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，其步骤如下：
(1)将固相合成的维拉卡肽粗样溶于水中，得粗液；
(2)取粗肽溶液加入等体积的乙腈溶液，样品在溶液中析出，再加入等体积的饱和氯化钠溶液促进样品析出，过滤，保留固体；
(3)将滤出的固体用水溶解，经0.45um水系膜过滤后，用C18反相色谱柱，以0.2％盐酸为A相，乙腈为B相，梯度为20％-30％，时间为60min，检测波长为220nm进行HPLC线性洗脱，得到纯度大于99.00％，单杂小于0.1％的样品；
(4)所得样品，用C18反相色谱柱，以50mmol/L氯化铵溶液为A相，乙腈为B相，梯度为5％-5％，时间为15min，完成离子交换，再以0.1％盐酸水溶液进为A相，乙腈为B相，先以5％-5％的梯度平衡15min，后再以50％-50％的梯度洗脱30分钟得到转盐样品；
(5)将转盐后的样品进行减压浓缩，冷冻，极限真空干燥，得到维拉卡肽终产品。
3.根据权利要求1或2所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，步骤(1)中，维拉卡肽粗样溶于水中至溶解浓度50g/L。
4.根据权利要求1或2所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，步骤(3)中的洗脱梯度为：
Figure FDA0002880612710000021
5.根据权利要求1或2所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，步骤(4)中的洗脱梯度为：
Figure FDA0002880612710000022
Figure FDA0002880612710000031
6.根据权利要求1所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，将转盐样品在35±2℃下减压浓缩，浓度为30g/L，用0.22um有机系滤膜过滤，分装至冻干盘中，高度1.0-1.2cm，进行冷冻干燥。
7.根据权利要求1或6所述的一种纯化维拉卡肽的方法，其特征在于，步骤(5)中，所述的冻干操作步骤如下：
Figure FDA0002880612710000032
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