CN104829695B - 一种纯化阿拉瑞林的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种利用混合模式色谱分离材料纯化阿拉瑞林的方法,主要解决了现有纯化工艺收率低、成本较高的技术问题。纯化阿拉瑞林包括如下步骤:1)在阿拉瑞林粗品中加入体积百分比为5%的乙腈水溶液或甲醇,分离使用固定相为RPLC/IEX的色谱柱,其中体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相,进行梯度洗脱纯化,收集目的峰值的肽溶液;2)将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐;3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥,得粉末状成品肽。本发明主要用于工业化纯化阿拉瑞林。
Description
技术领域
本发明属于反相HPLC技术领域,尤其是涉及一种批量化产业化纯化阿拉瑞林的方法。
背景技术
阿拉瑞林,中文名称为醋酸阿拉瑞林,又名丙氨瑞林,英文名称AlarelinAcetate,多肽序列为pGlu-His-Trp-Ser-Tyr-D-Ala-Leu-Arg-Pro-NHC2H5,分子式C56H78N16O12,分子量为1167.30,结构式如下:
本品为人工合成的促性腺激素释放激素(GnRH)的九肽类似物,用药初期可刺激垂体释放促黄体生成素(LH)和促卵泡素(FSH)引起卵巢源性甾体激素短暂升高;重复用药可抑制垂体释放LH 和FSH使血中的雌二醇水平下降达到药物去卵巢的作用这种抑制作用可用于治疗子宫内膜异位症等激素依赖性疾病。现有的阿拉瑞林纯化方法,是采用多次纯化,纯化过程中多次使用到溶剂,造成成本过高,并且收率一般在40~50%。
发明内容
本发明的目的在于提供一条适于大规模工业化生产阿拉瑞林的纯化方法,主要解决现有纯化工艺收率低且成本较高的技术问题。
为实现上述目的,本发明的技术方案如下:一种纯化阿拉瑞林的方法,包括如下步骤:
1)在阿拉瑞林粗品中加入体积百分比为5%的乙腈水溶液或甲醇,分离使用固定相为RPLC/IEX的色谱柱,其中体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相,进行梯度洗脱纯化,收集目的峰值的肽溶液;
2) 将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐;
3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥,得粉末状成品肽。
本发明充分利用色谱原理采用色谱泵在线上样。阿拉瑞林粗品的HPLC纯度为50~60%。梯度洗脱纯化时,B相占A相和B相总量的体积百分比为35-85%,检测波长为220nm。
所述的HPLC转盐法,A相为阿拉瑞林三氟乙酸溶液,B相为色谱纯乙腈,C相为体积百分比0.5%的醋酸水溶液,检测波长为220nm。
本发明的有益效果是:本发明提出的一条适于产业化阿拉瑞林的纯化工艺方法,在HPLC法纯化过程中使用固定相为RPLC/IEX的色谱柱,并用HPLC转盐法交换转盐,不仅能得到HPLC纯度大于99.0%的精肽,而且可以大大提高收率,降低成本,从而达到大规模工业化生产的目的。
具体实施方式
实施例1
1.样品处理:在阿拉瑞林氧化液中加入体积百分比5%乙腈水溶液超声至液体澄清,用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
2.纯化:
色谱柱:以RPLC/IEX的色谱柱为固定相的色谱柱;
柱子直径和长度为:5cm×25cm;
流动相:体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相;
流速:60-80ml/min;
检测波长:220nm;
纯化过程: 所述百分比为体积百分比
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 65%A+35%B |
2 | 10~35min | 100%C |
3 | 35~75min | 65%A+35%B~15%A+85%B |
4 | 75~85min | 40%A+60%B |
5 | 85~95min | 65%A+35%B |
线性梯度洗脱,收集目的峰,将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
3.转盐:流动相:A相为阿拉瑞林三氟乙酸溶液,B相为色谱纯乙腈,C相为体积百分比0.5%的醋酸水溶液,检测波长为220nm。所述百分比为体积百分比;
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 5%B+95%C |
2 | 10~35min | 100%A |
3 | 35~45min | 100%C |
4 | 45~105min | 5%B+95%C~95%B+5%C |
5 | 105~115min | 5%B+95%C |
4.将转盐后所得的所有肽溶液,进行减压浓缩至1g/50ml,浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的阿拉瑞林,纯化收率78.2%。
实施例2
1.样品处理:在阿拉瑞林氧化液中加入少许甲醇超声至液体澄清,用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
2.纯化
色谱柱:以RPLC/IEX的色谱柱为固定相的色谱柱;
柱子直径和长度为:10cm×25cm;
流动相:体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相;
流速:180-220ml/min;
检测波长:220nm;
纯化过程: 所述百分比为体积百分比
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 65%A+35%B |
2 | 10~35min | 100%C |
3 | 35~75min | 65%A+35%B~15%A+85%B |
4 | 75~85min | 40%A+60%B |
5 | 85~95min | 65%A+35%B |
线性梯度洗脱,收集目的峰,将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
3.转盐:流动相:A相为阿拉瑞林三氟乙酸溶液,B相为色谱纯乙腈,C相为体积百分比0.5%的醋酸水溶液,检测波长为220nm。所述百分比为体积百分比。
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 5%B+95%C |
2 | 10~35min | 100%A |
3 | 35~45min | 100%C |
4 | 45~105min | 5%B+95%C~95%B+5%C |
5 | 105~115min | 5%B+95%C |
4.将转盐后所得的所有肽溶液,进行减压浓缩至1g/50ml,浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的阿拉瑞林,纯化收率77.8%。
实施例3
1.样品处理:在阿拉瑞林氧化液中加入少许甲醇超声至液体澄清,用孔径为0.45um滤膜过滤后收集滤液备用。
2.纯化
色谱柱:以RPLC/IEX的色谱柱为固定相的色谱柱;
柱子直径和长度为:15cm×25cm;
流动相:体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相;
流速:650-850ml/min;
检测波长:220nm;
纯化过程: 所述百分比为体积百分比
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 65%A+35%B |
2 | 10~35min | 100%C |
3 | 35~75min | 65%A+35%B~15%A+85%B |
4 | 75~85min | 40%A+60%B |
5 | 85~95min | 65%A+35%B |
线性梯度洗脱,收集目的峰,将收集好的肽溶液放置收集瓶中备用。
3.转盐:流动相:A相为阿拉瑞林三氟乙酸溶液,B相为色谱纯乙腈,C相为体积百分比0.5%的醋酸水溶液,检测波长为220nm。所述百分比为体积百分比。
洗脱步骤 | 洗脱时间 | 洗脱液 |
1 | 0~10min | 5%B+95%C |
2 | 10~35min | 100%A |
3 | 35~45min | 100%C |
4 | 45~105min | 5%B+95%C~95%B+5%C |
5 | 105~115min | 5%B+95%C |
4.将转盐后所得的所有肽溶液,进行减压浓缩至1g/50ml,浓缩温度不超过37℃,然后冷冻干燥得纯度大于99.0%的阿拉瑞林,纯化收率77.5%。
Claims (5)
1.一种纯化阿拉瑞林的方法,其特征在于包括如下步骤:
1)在阿拉瑞林粗品中加入体积百分比为5%的乙腈水溶液或甲醇,分离使用固定相为RPLC/IEX的色谱柱,其中体积百分比0.1%的三氟乙酸水溶液为A相,体积百分比0.1%的三氟乙酸乙腈溶液为B相,样品粗品溶液为C相,进行梯度洗脱纯化,收集目的峰值的肽溶液;
2) 将纯化后的高纯度肽溶液采用HPLC转盐法交换转成醋酸盐;
3)将最终的高纯度肽溶液减压旋蒸浓缩冷冻干燥,得粉末状成品肽。
2.根据权利要求1所述的一种纯化阿拉瑞林的方法,其特征在于:所述步骤1)在阿拉瑞林粗品中加入体积百分比为5%的乙腈水溶液。
3.根据权利要求1所述的一种纯化阿拉瑞林的方法,其特征在于:所述步骤1)阿拉瑞林粗品HPLC纯度为50~60%。
4.根据权利要求1所述的一种纯化阿拉瑞林的方法,其特征在于:所述步骤1)梯度洗脱纯化时,B相占A相和B相总量的体积百分比为35-85%,检测波长为220nm。
5.根据权利要求1所述的一种纯化阿拉瑞林的方法,其特征在于:所述的步骤2)HPLC转盐法,流动相:A相为阿拉瑞林三氟乙酸溶液,B相为色谱纯乙腈,C相为体积百分比0.5%的醋酸水溶液,检测波长为220nm。
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