CN104072513A - 一种防风草二内酯的制备方法及抗肿瘤应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，尤其涉及一种防风草二内酯的制备方法及抗肿瘤应用。制备方法包括以下步骤：（1）取防风草叶粗粉，90%的乙醇溶液连续逆流超声提取，得到提取液；（2）将提取液浓缩，再经氧化铝柱层析；（3）制备型液相色谱分离；（4）丙酮重结晶，得到高纯度的防风草二内酯结晶产品。采用本发明制备方法，工艺操作简便、得率高，污染小，适合高纯度防风草二内酯的生产。防风草二内酯具有抗肿瘤作用，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，利于提高生物利用度。
Description
技术领域
本发明公开了一种植物提取物的制备方法及应用，特别涉及一种防风草二内酯的制备方法及抗肿瘤应用。
背景技术
防风草二内酯（Ovatodiolide），分子式为C20H24O4，分子量为328.41，结构式为
防风草二内酯来源于唇形科(Labiatae) 防风草Anisomeles indica (L.)O.Ktze.的叶。防风草二内酯具有细胞毒活性，对KB细胞的IC50为0.6μg/mL；具有降压作用，抑制离体蛙心的收缩和Ca2+流，引起狗短暂的降压作用，但不抑制血管紧张素转换酶(ACE)。抑制心肌收缩，桔抗钙离子流。
目前，尚未见高含量防风草二内酯的制备方法及其抗肿瘤应用的相关专利报道。
发明内容
为满足临床需要，扩大用药品种，更好地治疗癌症，，提供一种防风草二内酯的制备方法及抗肿瘤应用。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：
一种防风草二内酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取：取防风草叶粉碎成粗粉，加入90%乙醇溶液，65℃下进行连续逆流超声提取，得到乙醇提取液；
（2）氧化铝柱层析：上述提取液浓缩至浸膏，加氧化铝拌匀、干燥后装柱，用氯仿-甲醇混合溶液洗脱，薄层检测，收集防风草二内酯流分，浓缩干燥得到防风草二内酯粗品；
（3）制备型液相色谱分离：上述粗品采用制备型液相色谱分离，紫外检测器在线监测，收集防风草二内酯组分，将洗脱液旋转蒸发浓缩，得防风草二内酯粗晶；
（4）重结晶：将防风草二内酯粗晶用丙酮重结晶，冷冻干燥得到高纯度防风草二内酯结晶。
步骤（1）所述乙醇溶液用量为药材的10-12倍（V/W）。
步骤（1）所述超声频率为70-100KHz。
步骤（1）所述提取时间为60-100min。
步骤（2）所述氧化铝为120目，氯仿-甲醇体积比为2:1，用量为柱体积的6倍。
步骤（3）所述制备型液相色谱的流动相为乙腈-0.2%乙二胺水溶液，体积比为33:67。
步骤（3）所述紫外检测波长为208nm。
步骤（4）所述丙酮为90-100%的丙酮水溶液。
所述制备的防风草二内酯，在其口服配方中添加肠吸收促进剂，包含中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。
采用本法制备防风草二内酯，工艺简便易操作，制备量大，产品得率高，而且低污染；添加肠吸收促进剂，有利于提高生物利用度。
下面将结合具体实施方式进一步说明本发明，但本发明要求保护的范围并不局限于下列实施方式。
具体实施方式
实施例1：
防风草二内酯的制备
取防风草叶1kg，粉碎成粗粉，从连续逆流超声提取设备头部进料口进料，从连续逆流超声提取设备尾部溶剂加入口加入10倍90%%乙醇溶液，65℃下进行连续逆流超声提取60min，超声频率为80KHz，得到提取液，提取液减压回收试剂得浸膏，向浸膏中加氧化铝（120目）拌匀、干燥后装柱，用6倍柱体积的氯仿-甲醇（2:1）混合溶液洗脱，薄层检测，收集防风草二内酯流分，浓缩干燥得到防风草二内酯粗品。以乙腈-0.2%乙二胺水溶液为流动相，体积比为33:67，色谱柱以C8键合相为填料，粒径为10μm，柱长为15cm、直径为4cm，将粗品加入流动相至刚好溶解，溶解后的溶液经0.45μm微滤膜过滤，得到样品溶液，六通阀进样，进样体积为25ml，控制流速为50ml/min，紫外在线检测，检测波长为208nm，收集目标成分，减压回收试剂得防风草二内酯粗晶，用丙酮重结晶，冷冻干燥得到高纯度防风草二内酯结晶，经HPLC检测，纯度97.2%。
实施例2：
防风草二内酯的抗肿瘤应用
1、材料
动物：昆明种小鼠，雌雄各半性，体重20±2g，由南京中医药大学提供。
细胞株：KB口腔表皮样癌细胞株（KB），由中国科学院上海药物研究所提供。
2、方法
取50只小鼠，每只小鼠接种KB瘤液，次日随机分成5组，每组10只，分别为生理盐水对照组（NS组）、阳性对照组、防风草二内酯低剂量组（1mg/kg）、中剂量组（2mg/kg）、高剂量组（4mg/kg）。接种24h后防风草二内酯给药组灌胃给药，连续7，阳性对照组试验期间腹腔注射2次，隔日给药。期间，每日观察小鼠的一般活动、皮毛、粪便等情况。最后一次给药24h后断颈处死，称重，并计算抑瘤率。
3、结果
本发明植物提取组合物对小鼠S180皮下荷瘤有明显的抑制作用，抑瘤率为68.32-76.82%，结果见表1。
抑瘤率（%）=（1-治疗组平均瘤重/空白对照组平均瘤重）×%
表1 本发明植物提取物对KB皮下荷瘤小鼠的抑瘤作用（n=10，±S）
| 组别 | 给药剂量（mg/kg） | 试验前体重（g） | 试验后体重（g） | 瘤重（g） | 抑瘤率（%） |
| 空白对照组 | — | 20.20±1.52 | 26.35±3.12 | 2.33±0.21 | — |
| 阳性对照组 | 30 | 20.20±1.52 | 24.75±3.18 | 1.08±0.19 | 53.65 |
| 防风草二内酯低剂量组 | 1 | 20.20±1.52 | 27.00±4.28 | 1.33±0.18 | 42.92 |
| 防风草二内酯中剂量组 | 2 | 20.20±1.52 | 27.43±2.95 | 0.96±0.33 | 58.80 |
| 防风草二内酯高剂量组 | 4 | 20.20±1.52 | 27.25±3.22 | 0.54±0.17 | 76.82** |
注：与阳性对照组相比，**P＜0.01。
Claims (10)
1. 一种防风草二内酯的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
（1）提取：取防风草叶粉碎成粗粉，加入90%乙醇溶液，65℃下进行连续逆流超声提取，得到乙醇提取液；
（2）氧化铝柱层析：上述提取液浓缩至浸膏，加氧化铝拌匀、干燥后装柱，用氯仿-甲醇混合溶液洗脱，薄层检测，收集防风草二内酯流分，浓缩干燥得到防风草二内酯粗品；
（3）制备型液相色谱分离：上述粗品采用制备型液相色谱分离，紫外检测器在线监测，收集防风草二内酯组分，将洗脱液旋转蒸发浓缩，得防风草二内酯粗晶；
（4）重结晶：将防风草二内酯粗晶用丙酮重结晶，冷冻干燥得到高纯度防风草二内酯结晶。
2. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（1）所述乙醇溶液用量为药材的10-12倍（V/W）。
3. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（1）所述超声频率为70-100KHz。
4. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（1）所述提取时间为60-100min。
5. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（2）所述氧化铝为120目，氯仿-甲醇体积比为2:1，用量为柱体积的6倍。
6. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（3）所述制备型液相色谱的流动相为乙腈-0.2%乙二胺水溶液，体积比为33:67。
7. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（3）所述紫外检测波长为208nm。
8. 根据权利要求1所述的防风草二内酯的制备方法，其特征在于步骤（4）所述丙酮为90-100%的丙酮水溶液。
9. 根据权利要求1~8所述方法制备的防风草二内酯，在其口服配方中添加肠吸收促进剂。
10. 根据权利要求4所述的防风草二内酯，其特征在于肠吸收促进剂包含中链脂肪酸盐、胆酸盐、鹅去氧胆酸盐、壳聚糖及其衍生物中的一种或几种。
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